第三章細(xì)胞工程70年代末，德國科學(xué)家米爾赫(G.Melehers)等成功地把兩種不同的植物——馬鈴薯和西紅柿的體細(xì)胞融合在一起，獲得具有以上兩種植物遺傳特性的新品種。融合后的雜種細(xì)胞不僅能分裂，而且能分化，發(fā)育成一株完整的植株。新品種的問世，這一成就的意義是巨大的，無疑是對大自然的挑戰(zhàn)。圖中的“白菜—甘藍(lán)〞是用細(xì)胞工程的方法培育出來的蔬菜新品種，它具有生長期短、耐熱性強(qiáng)和易于貯存等優(yōu)點(diǎn)。無菌操作細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞融合細(xì)胞拆合無菌操作無菌室、超凈臺(tái)器具、培養(yǎng)基生物材料試驗(yàn)人員細(xì)胞培養(yǎng)定義：動(dòng)植物和微生物細(xì)胞在體外無菌條件下，在適宜的培養(yǎng)環(huán)境和人工配制的培養(yǎng)基中進(jìn)行生長、分裂和繁殖溫度、濕度、pH、光照、氧氣、二氧化碳細(xì)胞融合又稱體細(xì)胞雜交〔somatichybridization〕或細(xì)胞雜交〔cellhybridization〕，是指在誘導(dǎo)劑或促融劑作用下，兩個(gè)或兩個(gè)以上的品種細(xì)胞或同種生物不同類型細(xì)胞或原生質(zhì)相互接觸，從而發(fā)生膜融合、胞質(zhì)融合和核融合形成雜種細(xì)胞的現(xiàn)象。

異核體雜種細(xì)胞細(xì)胞融合步驟細(xì)胞標(biāo)記抗藥性、營養(yǎng)缺陷型、溫度敏感型、紫外敏感型制備原生質(zhì)植物和微生物誘導(dǎo)細(xì)胞融合同種細(xì)胞可自發(fā)融合，異種細(xì)胞須誘導(dǎo)篩選雜合細(xì)胞須在融合體再生后，進(jìn)行幾代的自然別離、選擇細(xì)胞拆合通過物理或化學(xué)方法將細(xì)胞核質(zhì)分開，然后將不同來源的細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核重新組合，重建成核質(zhì)雜交細(xì)胞。多利羊1.開展歷史:20世紀(jì)初，人們不知道神經(jīng)纖維是由神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)向外突出形成的，還是由神經(jīng)細(xì)胞周圍的其他細(xì)胞融合而成的。生物學(xué)家們就這個(gè)問題展開了劇烈的爭論。1907年，美國生物學(xué)家哈里森(Harrison)從蝌蚪的脊索中別離出神經(jīng)組織，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培養(yǎng)。蝌蚪的神經(jīng)組織存活了好幾周，并且從神經(jīng)細(xì)胞中長出了神經(jīng)纖維。哈里森的實(shí)驗(yàn)不僅解決了神經(jīng)纖維的起源問題，而且開創(chuàng)了動(dòng)物組織培養(yǎng)的先河。此后，在許多科學(xué)家的不懈努力下，動(dòng)物組織培養(yǎng)不斷改進(jìn)并逐漸開展成為動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)。二、動(dòng)物細(xì)胞工程及其應(yīng)用2、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用和概念：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng):指從動(dòng)物有機(jī)體中取出相關(guān)的組織,將它分散成單個(gè)細(xì)胞,然后,放在適宜的培養(yǎng)基中,讓這些細(xì)胞生長和增殖?！叭硕蟥暊幾h〔一〕細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)施無菌操作室培養(yǎng)與觀察室制備區(qū)域儲(chǔ)藏區(qū)域清洗與滅菌區(qū)域〔二〕細(xì)胞的培養(yǎng)合成培養(yǎng)基根本培養(yǎng)基模擬細(xì)胞在體內(nèi)生存生長的環(huán)境條件，設(shè)計(jì)出類似體外環(huán)境而適宜細(xì)胞在體外生存的各種培養(yǎng)基，主要成分包括氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)鹽等，添加血清后稱為“完全培養(yǎng)基〞無血清培養(yǎng)基不添加血清即可維持細(xì)胞在體外較長時(shí)間生長繁殖的合成培養(yǎng)基，含根底培養(yǎng)基和添加組分添加組分：幫助細(xì)胞附著和貼壁的胞外基質(zhì)細(xì)胞生長代謝所需營養(yǎng)成分促細(xì)胞生長增殖的生長因子酶抑制劑環(huán)境因素?zé)o污染無毒無菌溫度溫度不超過39℃時(shí)，細(xì)胞代謝強(qiáng)度和溫度成正比

pH多數(shù)哺乳動(dòng)物最適pH為

氣體

O2

、CO2

滲透壓過高或過低會(huì)使細(xì)胞皺縮、腫脹或破裂

幼齡動(dòng)物取動(dòng)物器官和組織剪碎組織胰蛋白酶處理細(xì)胞培養(yǎng)單個(gè)細(xì)胞動(dòng)物組織細(xì)胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質(zhì)，將細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)起來形成具有一定彈性和韌性的組織和器官。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程〔分解彈性纖維〕細(xì)胞懸浮液胰蛋白酶10代細(xì)胞原代培養(yǎng)50代細(xì)胞傳代培養(yǎng)細(xì)胞株無限傳代細(xì)胞系單個(gè)細(xì)胞加培養(yǎng)液取材組織細(xì)胞的別離原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)純化凍存和復(fù)蘇

細(xì)胞融合是正常的生命活動(dòng)

受精作用〔三〕動(dòng)物細(xì)胞融合顯微鏡下細(xì)胞融合的過程通過施加化學(xué)、生物或物理等誘導(dǎo)細(xì)胞融合的因素，提高不同基因型細(xì)胞的融合頻率并使之形成單核雜種細(xì)胞單個(gè)細(xì)胞制備細(xì)胞融合生物方法：仙臺(tái)病毒化學(xué)方法：PEG物理方法：電場刺激融合細(xì)胞篩選藥物敏感性營養(yǎng)缺陷型溫度敏感性基因缺陷互補(bǔ)融合細(xì)胞篩選互補(bǔ)法鑒定營養(yǎng)缺陷、抗性細(xì)胞學(xué)鑒定熒光標(biāo)記生化分析鑒定基因產(chǎn)物、次生代謝物分子生物學(xué)鑒定熒光標(biāo)記示意圖動(dòng)物細(xì)胞融合〔總結(jié)〕2.誘導(dǎo)融合的方法：1.自然條件下的細(xì)胞融合現(xiàn)象3.融合的具體過程：先是細(xì)胞質(zhì)融合，細(xì)胞核的融合是在第一次有絲分裂時(shí)完成的。仙臺(tái)病毒紫外線喪失感染活性（不感染細(xì)胞）保留融合活性（誘導(dǎo)細(xì)胞融合）干細(xì)胞是一類具有自我更新和增殖分化能力的細(xì)胞，具有再生為組織、器官的潛能三、植物細(xì)胞工程在離體條件下，利用人工培養(yǎng)基對植物器官、組織、原生質(zhì)體等進(jìn)行離體培養(yǎng)，使其按照人們的設(shè)計(jì)，定向長成完整的植株，已到達(dá)改進(jìn)品種或創(chuàng)造新物種，或獲得有用物質(zhì)的過程植物細(xì)胞工程的核心：利用細(xì)胞全能性，人為定向調(diào)控細(xì)胞生長細(xì)胞全能性：一個(gè)活細(xì)胞具有發(fā)育成一個(gè)完整個(gè)體的潛能1902年，G.Haberlandt首次提出1958年，Steward將胡蘿卜韌皮細(xì)胞培養(yǎng)出植株植物細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)基無機(jī)營養(yǎng)成分：

大量元素N、P、K、Ca、Mg、S

微量元素Fe、B、Mn、Cu、Mo、Zn、Co有機(jī)營養(yǎng)成分：

含N物質(zhì)：包括維生素和氨基酸碳源：2-5%的蔗糖溶液，調(diào)節(jié)滲透壓維生素：VB1、VB6、煙酸、也算、泛酸、生物素激素：生長素，細(xì)胞分裂素和赤霉素天然有機(jī)添加物：椰汁、番茄汁等，促進(jìn)細(xì)胞和組織增殖分化瓊脂起支持作用培養(yǎng)基種類MS培養(yǎng)基無機(jī)鹽濃度較高，使用廣泛B5培養(yǎng)基銨濃度低，適合雙子葉尤其是木本植物White培養(yǎng)基無機(jī)鹽濃度低，適于生根N6培養(yǎng)基成分較簡單，KNO3和(NH4)2SO4含量高Nitsch培養(yǎng)基在MS培養(yǎng)基根底上改進(jìn)培養(yǎng)基的配制先配成母液，使用時(shí)稀釋注意防止產(chǎn)生沉淀鐵鹽要單獨(dú)配制大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)物環(huán)境條件

溫度

大多數(shù)植物組培溫度為23-28℃

濕度濕度過低使培養(yǎng)基喪失水分，濕度過高易污染光照

愈傷增殖期黑暗或弱光培養(yǎng)；分化階段需要光照

滲透壓0.1-0.2MPa

氣體

pH

愈傷組織：離體的植物器官、組織或細(xì)胞，在培養(yǎng)一段時(shí)間以后，通過細(xì)胞分裂，形成一種排列疏松無規(guī)那么、高度液泡化、無定形態(tài)的薄壁細(xì)胞組成的組織。離體的植物器官、組織或細(xì)胞脫分化〔又叫去分化〕愈傷組織〔排列疏松而無規(guī)那么，高度液泡化的呈無定形狀態(tài)的薄壁細(xì)胞〕再分化根或芽等器官植物體植物組織培養(yǎng)的根本過程切取形成層誘導(dǎo)愈傷組織的形成試管苗的形成培養(yǎng)室移栽脫分化再分化無菌接種①葉片接種到培養(yǎng)基上②產(chǎn)生愈傷組織③愈傷組織增殖④愈傷組織開始分化⑤愈傷組織分化出芽⑥培養(yǎng)基中的試管苗植物組織培養(yǎng)過程示意圖原生質(zhì)別離原生質(zhì)純化原生質(zhì)活力測定去壁原生質(zhì)的別離機(jī)械法酶促法原生質(zhì)的純化

植物材料經(jīng)處理后，混合液中除了完整、未損傷的原生質(zhì)，還包含未去壁的細(xì)胞、破碎的原生質(zhì)、細(xì)胞器等，需要去除雜質(zhì)獲得完整原生質(zhì)過濾離心漂浮原生質(zhì)的活力測定形態(tài)識(shí)別形態(tài)、滲透壓相差顯微鏡觀察細(xì)胞質(zhì)流動(dòng)、細(xì)胞核熒光顯微鏡法〔FDA法〕活細(xì)胞發(fā)出黃綠色熒光FDA：熒光素二乙酸酯酚藏花紅染色法死細(xì)胞染色伊凡藍(lán)染色法死細(xì)胞染色植物體細(xì)胞雜交應(yīng)用研究

植物細(xì)胞器移植植物細(xì)胞器移植是指：從不同植物細(xì)胞中別離得到細(xì)胞器，再將其導(dǎo)入受體原生質(zhì)中的過程。原生質(zhì)攝取細(xì)胞器的機(jī)制：內(nèi)吞融合脂質(zhì)體包裝后融合細(xì)胞器別離機(jī)械法勻漿過濾離心從原生質(zhì)體中別離細(xì)胞器攝入夾層離心法PEG誘導(dǎo)法脂質(zhì)體包裝細(xì)胞器移植概況細(xì)胞核移植葉綠體移植：

1973年卡爾遜白化煙草原生質(zhì)與煙草的葉綠體混合——綠色煙草葉綠體+雞卵細(xì)胞混合——雞卵細(xì)胞成活7d線粒體移植細(xì)胞重建

在融合因子介導(dǎo)下，使細(xì)胞質(zhì)體與完整細(xì)胞合并，構(gòu)成核質(zhì)雜種植物染色體工程染色體加倍同源多倍體較二倍體形態(tài)更大，代謝活動(dòng)增強(qiáng)秋水仙素破壞紡錘絲形成1.人工誘導(dǎo)植物多倍體的意義

多倍體(polyploidy):植物的性狀比原來的二倍體氣孔、花、果實(shí)和種子比二倍體者為大，葉肉較厚，莖稈也較粗壯

三倍體無子西瓜的培育過程單倍體育種單倍體只有一套染色體，每個(gè)基因都能顯示相應(yīng)的性狀，易發(fā)現(xiàn)新產(chǎn)生的突變，可用于研究基因功能及基因劑量效應(yīng)獲得純合二倍體

花藥培養(yǎng)花粉培養(yǎng)異源種屬花粉誘導(dǎo) 植物單倍體育種:由于單倍體只有一套染色體，染色體上的每個(gè)基因都能顯示相應(yīng)的性狀，所以極易發(fā)現(xiàn)所產(chǎn)生的突變，尤其是隱性突變，在表型上可以直接表現(xiàn)出來，所以單倍體是研究基因或基因效應(yīng)、進(jìn)行染色體遺傳分析的理想實(shí)驗(yàn)材料 1〕克服雜種別離，縮短雜交育種年限 2〕排除顯、隱性基因干擾，提高選擇效率 3〕單倍體是誘變育種的良好材料 4〕能克服遠(yuǎn)緣雜交的不孕性，創(chuàng)造生物新類型 5〕利用單倍體對栽培品種進(jìn)行純化3、單倍體育種的優(yōu)越性花藥培養(yǎng)

花粉、藥隔、藥壁、花絲花粉培養(yǎng)將花粉從花藥中別離出來，以單個(gè)花粉粒作為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)選擇適宜的培養(yǎng)基、嚴(yán)格控制培養(yǎng)條件異源種屬花粉誘導(dǎo)

親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的花粉不易使母本卵細(xì)胞受精，又能刺激卵細(xì)胞單性發(fā)育，由此產(chǎn)生單倍體玉米、野生稻給普通水稻授粉白菜型油菜給甘藍(lán)型油菜授粉無性快繁步驟：無菌母株獲得不定芽增殖完整植株形成再生植株訓(xùn)化再生植株鑒定試管苗大規(guī)模培養(yǎng)培育脫毒作物微莖尖培養(yǎng)珠心組織培養(yǎng)熱處理懸浮培養(yǎng)將細(xì)胞或小塊愈傷組織在無菌培養(yǎng)液中進(jìn)行體外生長、發(fā)育能產(chǎn)生大量均一細(xì)胞，增殖速度快植物組織培養(yǎng)大量生產(chǎn)紫草素現(xiàn)在已有胡蘿卜、芹菜、柑橘、咖啡、棉花、玉米、水稻、橡膠等幾十種植物的人工種子試種成功，但由于本錢較高，中國尚未應(yīng)用于生產(chǎn)。

紫草紫草素

愈傷組織植物體細(xì)胞雜交和動(dòng)物細(xì)胞融合的比較比較項(xiàng)目植物體細(xì)胞雜交動(dòng)物細(xì)胞融合細(xì)胞融合原理細(xì)胞膜的流動(dòng)性細(xì)胞膜的流動(dòng)性細(xì)胞融合方法去除細(xì)胞壁后誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合使細(xì)胞分散后誘導(dǎo)細(xì)胞融合誘導(dǎo)方法物理（離心、振蕩、電刺激）化學(xué)（PEG）物理、化學(xué)方法（同左）滅活的病毒請問：動(dòng)物細(xì)胞與植物細(xì)胞之間可以實(shí)現(xiàn)雜交嗎？如果理論上可行，請?jiān)O(shè)計(jì)出具體實(shí)驗(yàn)方案。眼蟲（含葉綠體）三、微生物細(xì)胞工程及應(yīng)用應(yīng)用微生物細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞水平的研究和生產(chǎn)包括微生物細(xì)胞的培養(yǎng)、遺傳性狀的改變、微生物細(xì)胞的直接利用、微生物代謝產(chǎn)物的獲取微生物細(xì)胞融合早在1958年，岡田善雄發(fā)現(xiàn)，用紫外線滅活的仙臺(tái)病毒可以誘發(fā)艾氏腹水瘤細(xì)胞融合產(chǎn)生多核體。1976年巨大芽抱桿菌、枯草桿菌、裂殖酵母等原生質(zhì)體融合取得成功，構(gòu)巢曲霉和煙曲霉、婁地青霉和產(chǎn)黃青霉等真菌種間原生質(zhì)體融合也獲得成功。微生物細(xì)胞融合工藝菌種選擇擴(kuò)大培養(yǎng)大量菌體細(xì)胞①高滲溶液(SMM液、DP液)②脫壁酶(蝸牛酶、溶菌酶)原生質(zhì)體融合劑(PEG)原生質(zhì)體融合去融合劑融合原生質(zhì)體培養(yǎng)基細(xì)胞壁再生菌落繁殖融合體篩選影響微生物細(xì)胞融合的因素一、菌株的遺傳性狀需要有選擇標(biāo)記，標(biāo)記主要通過誘變獲得需先測定各個(gè)標(biāo)記的自發(fā)回復(fù)突變率，假設(shè)回復(fù)突變率過高，那么不宜作為選擇標(biāo)記二、制備原生質(zhì)體的菌齡對數(shù)期細(xì)胞的細(xì)胞壁中肽聚糖的含量最低，對溶菌酶也最敏感。三、細(xì)胞的前處理

細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的差異細(xì)菌G+溶菌酶去壁G-EDTA+溶菌酶、EDTA+溶菌酶+Gly真菌蝸牛酶，是多酶體系，含纖維素酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶、α-淀粉酶、酯酶生產(chǎn)蛋白質(zhì)藥物白介素、干擾素、胰島素生產(chǎn)限制性內(nèi)切酶

生防菌哈茨木霉菌T-22株系生物肥料固氮菌植物激素赤霉素環(huán)境治理二噁英、海洋浮油含糖廢液的利用酵母木質(zhì)纖維的利用白腐真菌采礦