hIL-12腺病毒載體構(gòu)建及其于hBMSCs中表達(dá)機(jī)制與應(yīng)用研究一、引言1.1研究背景與意義在現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，基因治療與細(xì)胞治療作為極具潛力的新興治療手段，為眾多疑難病癥的攻克帶來了新的希望。而腺病毒載體作為基因治療的關(guān)鍵工具，以及人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs）在細(xì)胞治療中的獨(dú)特地位，使得對(duì)它們的研究成為了生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。深入探究hIL-12腺病毒載體的構(gòu)建及在hBMSCs中的表達(dá)，對(duì)于推動(dòng)基因與細(xì)胞治療的發(fā)展、提升疾病治療效果具有重要意義。腺病毒載體是一類具有雙鏈DNA的病毒，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。其具備諸多優(yōu)勢(shì)，首先是能在多種細(xì)胞系中高效搭載基因，無論是分裂旺盛的細(xì)胞，還是處于相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)的細(xì)胞，腺病毒載體都能將外源基因有效導(dǎo)入。并且，它可以表達(dá)高水平的目的蛋白，這一特性為基因治療提供了有力支持，比如在一些需要補(bǔ)充特定蛋白的疾病治療中，腺病毒載體可促使細(xì)胞大量表達(dá)該蛋白，以滿足治療需求。同時(shí)，腺病毒的基因組不會(huì)整合到宿主基因組中，從而降低了其致癌性和遺傳毒性，安全性較高。此外，腺病毒載體還具有成本較低、可大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)勢(shì)，這使得其在臨床應(yīng)用中更具可行性。在基因治療領(lǐng)域，腺病毒載體已被用于多種疾病的研究與治療嘗試，如遺傳性疾病、癌癥等。在癌癥治療中，可將具有抗癌作用的基因搭載于腺病毒載體，導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤生長(zhǎng)。在新冠疫情期間，基于腺病毒載體開發(fā)的重組新冠病毒疫苗，在全球范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用，為疫情防控發(fā)揮了重要作用，充分展現(xiàn)了腺病毒載體在疫苗研發(fā)和疾病治療中的巨大潛力。人白細(xì)胞介素12（hIL-12）是一種具有廣泛生物學(xué)作用的細(xì)胞因子。在免疫系統(tǒng)中，它猶如一個(gè)關(guān)鍵的“指揮官”，能夠促進(jìn)抗癌免疫反應(yīng)。它可以激活自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）和T細(xì)胞，增強(qiáng)它們對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。hIL-12還能促進(jìn)Th1免疫應(yīng)答，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫平衡，使免疫系統(tǒng)更好地應(yīng)對(duì)病原體入侵和腫瘤發(fā)生。在一些臨床前研究中，hIL-12展現(xiàn)出了有效的抗腫瘤活性，為癌癥治療帶來了新的希望。然而，在實(shí)際應(yīng)用中，由于其在人體內(nèi)半衰期短以及高頻率重復(fù)給藥會(huì)帶來潛在全身系統(tǒng)免疫毒性等問題，限制了它的臨床應(yīng)用效果。hBMSCs是存在于骨髓中的一種成體干細(xì)胞，具有自我更新和多向分化的潛能。在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，hBMSCs成為了研究熱點(diǎn)。它能夠分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等多種細(xì)胞類型，為修復(fù)受損組織和器官提供了新的可能性。比如在骨折和骨缺損治療中，hBMSCs可以被誘導(dǎo)分化為骨細(xì)胞，促進(jìn)骨組織的再生和修復(fù)；在軟骨損傷治療中，它又能分化為軟骨細(xì)胞，緩解關(guān)節(jié)疼痛。hBMSCs還具有低免疫原性，在異體移植時(shí)不太可能引發(fā)免疫排斥反應(yīng)，這使得它在細(xì)胞治療中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，它能夠分泌多種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，促進(jìn)周圍細(xì)胞的存活和功能恢復(fù)，為組織修復(fù)和再生營(yíng)造良好的微環(huán)境。本研究聚焦于構(gòu)建hIL-12腺病毒載體，并探究其在hBMSCs中的表達(dá)。通過將hIL-12基因搭載于腺病毒載體，導(dǎo)入hBMSCs中，期望利用hIL-12的生物學(xué)功能，增強(qiáng)hBMSCs的治療效果，為相關(guān)疾病的治療開辟新的途徑。一方面，對(duì)于癌癥治療而言，若能成功實(shí)現(xiàn)hIL-12在hBMSCs中的穩(wěn)定表達(dá)，hBMSCs可作為載體將hIL-12輸送至腫瘤部位，持續(xù)發(fā)揮抗癌作用，有望解決hIL-12半衰期短和免疫毒性的問題，提高癌癥治療的有效性和安全性。另一方面，在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，hIL-12可能對(duì)hBMSCs的分化和組織修復(fù)功能產(chǎn)生積極影響，促進(jìn)受損組織的更快、更好修復(fù)。本研究對(duì)于拓展腺病毒載體和hBMSCs的應(yīng)用范圍，提升基因治療和細(xì)胞治療的水平具有重要意義，有望為臨床治療提供新的策略和方法，為眾多患者帶來福音。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在hIL-12腺病毒載體構(gòu)建及在hBMSCs中表達(dá)的研究領(lǐng)域，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已取得了一系列具有重要價(jià)值的成果。國(guó)外研究起步較早，在腺病毒載體的優(yōu)化和hIL-12基因的有效導(dǎo)入方面成果豐碩。例如，美國(guó)華盛頓大學(xué)藥學(xué)院的DavidT.Curiel研究團(tuán)隊(duì)深入剖析了腺病毒載體用于體內(nèi)遞送CRISPR-Cas系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)，強(qiáng)調(diào)了其在基因治療中的巨大潛力，為hIL-12腺病毒載體的構(gòu)建提供了理論支撐。在hIL-12基因與腺病毒載體的結(jié)合上，國(guó)外學(xué)者通過不斷改進(jìn)基因編輯技術(shù)，成功實(shí)現(xiàn)了hIL-12基因在腺病毒載體中的穩(wěn)定整合，提高了載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和表達(dá)穩(wěn)定性。在hIL-12腺病毒載體轉(zhuǎn)染hBMSCs的研究中，有團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后的hBMSCs能夠在特定條件下持續(xù)表達(dá)hIL-12，且對(duì)hBMSCs的免疫調(diào)節(jié)功能產(chǎn)生了積極影響，為細(xì)胞治療和免疫治療的聯(lián)合應(yīng)用提供了新思路。國(guó)內(nèi)研究也緊跟國(guó)際步伐，在該領(lǐng)域不斷深入探索并取得顯著進(jìn)展。山西醫(yī)科大學(xué)的陳媛媛等人構(gòu)建人白細(xì)胞介素12（hIL-12）5型腺病毒載體（AdhIL-12），并將其感染人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs），成功檢測(cè)到IL-12的表達(dá)，為IL-12臨床應(yīng)用方式的改進(jìn)奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。他們采用AdMax?腺病毒載體體系，通過一系列復(fù)雜而精細(xì)的分子生物學(xué)操作，高效、快捷地獲得了所要包裝的腺病毒載體，為國(guó)內(nèi)相關(guān)研究提供了重要的方法參考。在hIL-12對(duì)hBMSCs生物學(xué)特性影響的研究方面，國(guó)內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)hIL-12能夠促進(jìn)hBMSCs向特定細(xì)胞類型分化，增強(qiáng)其在組織修復(fù)和再生中的作用，進(jìn)一步拓展了hIL-12腺病毒載體在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用前景。盡管國(guó)內(nèi)外在該領(lǐng)域已取得諸多成果，但仍存在一些不足之處。一方面，現(xiàn)有的hIL-12腺病毒載體在體內(nèi)的靶向性和穩(wěn)定性有待進(jìn)一步提高。雖然腺病毒載體具有一定的優(yōu)勢(shì)，但在復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境中，如何精準(zhǔn)地將hIL-12遞送至靶細(xì)胞，并確保其長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)，仍是亟待解決的問題。另一方面，hIL-12在hBMSCs中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚未完全明確。雖然已知hIL-12能對(duì)hBMSCs的生長(zhǎng)、分化和免疫調(diào)節(jié)等功能產(chǎn)生影響，但具體的信號(hào)通路和分子機(jī)制仍需深入研究，這限制了對(duì)其治療效果的進(jìn)一步優(yōu)化。此外，hIL-12腺病毒載體在臨床應(yīng)用中的安全性評(píng)估也不夠完善，長(zhǎng)期使用是否會(huì)引發(fā)潛在的不良反應(yīng)，如免疫反應(yīng)、基因毒性等，還需要更多的臨床前和臨床試驗(yàn)來驗(yàn)證。在研究的廣度和深度上，目前對(duì)于hIL-12腺病毒載體與hBMSCs聯(lián)合應(yīng)用于多種疾病治療的研究還不夠全面，尤其是在一些罕見病和復(fù)雜疾病的治療方面，缺乏深入的探索和實(shí)踐。1.3研究?jī)?nèi)容與方法本研究旨在構(gòu)建hIL-12腺病毒載體，并深入探究其在人hBMSCs中的表達(dá)情況，為相關(guān)疾病的治療提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。具體研究?jī)?nèi)容與方法如下：1.3.1hIL-12腺病毒載體的構(gòu)建從人樹突狀細(xì)胞（DCs）中提取總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）技術(shù)，獲取hIL-12的p35和p40基因的cDNA。將這兩個(gè)基因分別克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)和pmRNAIRES中，隨后再亞克隆至腺病毒載體穿梭質(zhì)粒pDC515，通過腦心肌炎病毒內(nèi)部核酸進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）連接p35和p40cDNA，成功構(gòu)建pDC515hIL-12p35/IRES/p40腺病毒穿梭質(zhì)粒。運(yùn)用AdMax?腺病毒載體體系，將pDC515hIL-12p35/IRES/p40穿梭質(zhì)粒與pBHGfn△E1，3FLP骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞。利用重組酶的位點(diǎn)特異性重組作用，獲得攜帶hIL-12基因的腺病毒載體（AdhIL-12）。通過PCR技術(shù)對(duì)構(gòu)建的腺病毒載體進(jìn)行鑒定，確保hIL-12基因已成功整合到腺病毒載體中。1.3.2hIL-12腺病毒載體在hBMSCs中的表達(dá)檢測(cè)從健康志愿者的骨髓中采集樣本，通過密度梯度離心法分離出hBMSCs，并在含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%-90%匯合時(shí)，使用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)hBMSCs表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD90、CD105的表達(dá)，以鑒定其純度和特性。將第三代hBMSCs按每孔5×10?細(xì)胞接種至12孔板中，待細(xì)胞貼壁后，加入AdhIL-12，使其感染復(fù)數(shù)（MOI）為100PFU/細(xì)胞。感染2h后，用10Gyγ射線照射hBMSCs，使其失去增殖能力，以避免細(xì)胞增殖對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。之后，每24h更換一次培養(yǎng)液，分別在感染后的12h、24h、48h、72h、96h和120h收集細(xì)胞培養(yǎng)上清。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清中hIL-12的含量，以確定hIL-12的分泌水平和表達(dá)動(dòng)態(tài)變化。同時(shí)，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)hIL-12基因在hBMSCs中的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)一步驗(yàn)證hIL-12的表達(dá)情況。1.3.3hIL-12對(duì)hBMSCs生物學(xué)特性的影響探究將感染AdhIL-12的hBMSCs和未感染的hBMSCs分別培養(yǎng)，在不同時(shí)間點(diǎn)（如1d、3d、5d），采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，分析hIL-12對(duì)hBMSCs增殖能力的影響。向誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加成骨誘導(dǎo)因子（如地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C）或成脂誘導(dǎo)因子（如地塞米松、胰島素、吲哚美辛），分別對(duì)感染AdhIL-12和未感染的hBMSCs進(jìn)行成骨和成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)。經(jīng)過一定時(shí)間的誘導(dǎo)培養(yǎng)后，通過茜素紅染色檢測(cè)成骨分化形成的鈣結(jié)節(jié)，通過油紅O染色檢測(cè)成脂分化形成的脂滴，觀察hIL-12對(duì)hBMSCs向成骨細(xì)胞和成脂細(xì)胞分化能力的影響。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)感染AdhIL-12的hBMSCs表面免疫相關(guān)分子（如HLA-DR、CD80、CD86）的表達(dá)情況，分析hIL-12對(duì)hBMSCs免疫調(diào)節(jié)功能的影響。二、hIL-12腺病毒載體構(gòu)建理論基礎(chǔ)2.1腺病毒載體概述腺病毒是一類無包膜的雙鏈DNA病毒，其結(jié)構(gòu)獨(dú)特且具有重要的生物學(xué)意義。在電子顯微鏡下，腺病毒呈現(xiàn)為對(duì)稱分布的二十面體，直徑處于70-100nm的范圍。其主要?dú)さ鞍装忬w（hexon）、五鄰體（penton）和纖突（fiber），這些殼蛋白在病毒的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和感染過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。病毒核衣殼由252個(gè)殼粒組成，每個(gè)五鄰體表面都伸出一根末端呈球形的纖突，纖突蛋白具有型特異性抗原決定位點(diǎn)，這使得不同型別的腺病毒在感染宿主細(xì)胞時(shí)具有一定的特異性。腺病毒的基因組為線形雙鏈DNA，長(zhǎng)度約為36kb，被精準(zhǔn)地包裝在二十面體的蛋白質(zhì)外殼內(nèi)。其基因組可清晰地分為編碼區(qū)和非編碼區(qū)。編碼區(qū)又進(jìn)一步細(xì)分為早期轉(zhuǎn)錄區(qū)和晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)。早期轉(zhuǎn)錄區(qū)包含E1、E2、E3、E4四個(gè)區(qū)，主要負(fù)責(zé)編碼病毒的調(diào)節(jié)蛋白，這些調(diào)節(jié)蛋白在病毒感染宿主細(xì)胞后的早期階段，對(duì)病毒基因的表達(dá)調(diào)控以及病毒生命周期的啟動(dòng)起著至關(guān)重要的作用。例如，E1區(qū)編碼的蛋白參與病毒基因轉(zhuǎn)錄的起始和調(diào)控，為后續(xù)病毒的復(fù)制和組裝奠定基礎(chǔ)。晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)則有L1、L2、L3、L4、L5五個(gè)區(qū)，主要編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，這些結(jié)構(gòu)蛋白是組成病毒顆粒的重要成分，在病毒的組裝和成熟過程中不可或缺。非編碼區(qū)含有病毒進(jìn)行復(fù)制和包裝等功能所必需的順式作用元件，如反向末端重復(fù)序列（ITR）和包裝信號(hào)等，它們對(duì)于病毒基因組的準(zhǔn)確復(fù)制、包裝以及病毒顆粒的形成和釋放具有關(guān)鍵的指導(dǎo)和調(diào)控作用。依據(jù)病毒的血凝特點(diǎn)、基因同源性、致瘤潛力及臨床致病性等特性，人腺病毒可被細(xì)致地分成7組（A-G），截至2019年7月，已發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)了103個(gè)腺病毒的基因型別。不同組別的腺病毒在感染宿主細(xì)胞類型、引發(fā)的疾病種類以及致病機(jī)制等方面存在顯著差異。其中，B、C、E組病毒主要與呼吸道疾病緊密相關(guān)，如常見的感冒、流感樣癥狀以及較為嚴(yán)重的肺炎等，這些病毒能夠通過呼吸道飛沫傳播，感染呼吸道上皮細(xì)胞，引發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致咳嗽、發(fā)熱、咽痛等癥狀。A、D、F、G組病毒主要與胃腸道疾病相關(guān)，它們可通過糞-口途徑傳播，感染胃腸道黏膜細(xì)胞，引發(fā)腹瀉、嘔吐、腹痛等胃腸道不適癥狀。D和E組病毒還與眼部疾病有關(guān)，如結(jié)膜炎等，可通過接觸傳播，感染眼部結(jié)膜組織，引起眼部紅腫、疼痛、分泌物增多等癥狀。此外，A組病毒感染可引起嚙齒類動(dòng)物的腫瘤，這一特性使得A組腺病毒在腫瘤研究領(lǐng)域備受關(guān)注，為研究腫瘤的發(fā)生機(jī)制和治療方法提供了重要的模型。腺病毒作為基因載體，具有眾多顯著優(yōu)勢(shì)，使其在基因治療、疫苗研發(fā)等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。首先，腺病毒載體具有廣泛的宿主范圍，它能夠感染一系列哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括人類細(xì)胞，這使得其在大多哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織中均可用于表達(dá)重組蛋白。特別值得一提的是，腺病毒具有嗜上皮細(xì)胞性，而人類的大多數(shù)腫瘤就是上皮細(xì)胞來源的，這為腺病毒載體在腫瘤基因治療中的應(yīng)用提供了天然的優(yōu)勢(shì)，使其能夠更有效地將治療基因遞送至腫瘤細(xì)胞內(nèi)部，發(fā)揮治療作用。其次，腺病毒在增殖和非增殖細(xì)胞中都能感染并表達(dá)基因，這與逆轉(zhuǎn)錄病毒只能感染增殖性細(xì)胞形成鮮明對(duì)比。逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)染時(shí)需要細(xì)胞處于持續(xù)培養(yǎng)的增殖狀態(tài)，而腺病毒則不受此限制，它能感染幾乎所有的細(xì)胞類型，除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤細(xì)胞。這一特性使得腺病毒成為研究原代非增殖細(xì)胞基因表達(dá)的最佳系統(tǒng)之一，能夠在原代細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞中進(jìn)行基因表達(dá)的研究，為細(xì)胞生物學(xué)和基因治療研究提供了更廣泛的研究對(duì)象和更真實(shí)的研究模型，使研究結(jié)果更具臨床應(yīng)用價(jià)值。腺病毒還能有效進(jìn)行增殖，滴度高，其病毒系統(tǒng)可產(chǎn)生101?到1011VP/ml的病毒顆粒，經(jīng)過濃縮后，滴度甚至可達(dá)1013VP/ml。如此高的滴度使其在基因治療中具有巨大的優(yōu)勢(shì)，能夠提供足夠數(shù)量的病毒載體來感染靶細(xì)胞，確保治療基因的有效傳遞和表達(dá)，從而提高基因治療的效果。同時(shí)，腺病毒載體系統(tǒng)一般應(yīng)用人類病毒作為載體，以人類細(xì)胞作為宿主，這使得它為人類蛋白進(jìn)行準(zhǔn)確的翻譯后加工和適當(dāng)?shù)恼郫B提供了一個(gè)理想的環(huán)境。在這個(gè)環(huán)境中，大多數(shù)人類蛋白都可達(dá)到高水平表達(dá)并且具有完全的功能，能夠更好地模擬人體內(nèi)的生理過程，為蛋白質(zhì)功能研究和基于蛋白質(zhì)的治療方法開發(fā)提供了有力支持。此外，腺病毒載體在基因治療中具有較高的安全性，它不整合到染色體中，無插入致突變性。與逆轉(zhuǎn)錄病毒不同，逆轉(zhuǎn)錄病毒可隨機(jī)整合到宿主染色體，這可能導(dǎo)致基因失活或激活癌基因，從而引發(fā)潛在的致癌風(fēng)險(xiǎn)。而腺病毒則除了卵細(xì)胞以外幾乎在所有已知細(xì)胞中都不整合到染色體中，因此不會(huì)干擾其它的宿主基因，大大降低了基因治療過程中的安全隱患，為臨床應(yīng)用提供了更可靠的保障。在卵細(xì)胞中整合單拷貝病毒則是產(chǎn)生具有特定特征的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的一個(gè)較好的系統(tǒng)，為動(dòng)物模型的構(gòu)建和基因功能研究提供了新的途徑。腺病毒載體還能在懸浮培養(yǎng)液中擴(kuò)增，293細(xì)胞可以適應(yīng)懸浮培養(yǎng)，這一調(diào)整可使病毒大量擴(kuò)增。大量事實(shí)證明懸浮293細(xì)胞可在1-20L的生物反應(yīng)器中表達(dá)重組蛋白，這為腺病毒載體的大規(guī)模生產(chǎn)提供了可能，滿足了臨床和科研對(duì)大量腺病毒載體的需求，降低了生產(chǎn)成本，推動(dòng)了腺病毒載體相關(guān)技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。腺病毒載體還能同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因，這是其在基因表達(dá)系統(tǒng)中的一個(gè)獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。通過將含有兩個(gè)基因的雙表達(dá)盒插入腺病毒轉(zhuǎn)移載體中，或者用不同的重組病毒共轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞株來分別表達(dá)一個(gè)蛋白，能夠在同一細(xì)胞株或組織中實(shí)現(xiàn)多個(gè)基因的表達(dá)。通過測(cè)定不同重組病毒的MOI比值，可準(zhǔn)確估計(jì)各重組蛋白的相對(duì)共表達(dá)情況，這為研究基因之間的相互作用、構(gòu)建復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及開發(fā)多基因聯(lián)合治療策略提供了有力的工具。正是由于腺病毒載體具備以上諸多優(yōu)點(diǎn)，使其被極其廣泛地應(yīng)用于體外基因轉(zhuǎn)導(dǎo)、體內(nèi)接種疫苗、基因治療等各個(gè)領(lǐng)域。在體外基因轉(zhuǎn)導(dǎo)中，腺病毒載體能夠高效地將外源基因?qū)敫鞣N細(xì)胞系，為細(xì)胞生物學(xué)研究、基因功能驗(yàn)證以及藥物研發(fā)等提供了重要的技術(shù)手段。通過將特定的基因?qū)爰?xì)胞，研究人員可以觀察細(xì)胞的生物學(xué)變化，深入了解基因的功能和作用機(jī)制。在體內(nèi)接種疫苗方面，腺病毒載體已被用于多種病原體疫苗的研發(fā)，如結(jié)核分枝桿菌、人類免疫缺陷病毒（HIV）和惡性瘧原蟲等?；谙俨《据d體開發(fā)的疫苗能夠有效地激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，包括先天免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，使機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)病原體的特異性抗體和免疫細(xì)胞，從而提供有效的免疫保護(hù)。在新冠疫情期間，基于腺病毒載體開發(fā)的重組新冠病毒疫苗，如中國(guó)的人體腺病毒載體新冠疫苗（Ad5-nCoV）、英國(guó)和俄羅斯等國(guó)家設(shè)計(jì)的腺病毒載體疫苗，在全球范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用，為疫情防控發(fā)揮了重要作用。這些疫苗在接種后能快速激發(fā)細(xì)胞免疫和體液免疫，特別是對(duì)重癥患者具有較高的保護(hù)力，充分展現(xiàn)了腺病毒載體在疫苗研發(fā)中的巨大潛力。在基因治療領(lǐng)域，腺病毒載體已被用于多種疾病的研究與治療嘗試，如遺傳性疾病、癌癥等。對(duì)于遺傳性疾病，腺病毒載體可以將正常的基因?qū)牖颊唧w內(nèi)，彌補(bǔ)基因缺陷，從而達(dá)到治療的目的。在癌癥治療中，腺病毒載體可將具有抗癌作用的基因，如腫瘤抑制基因、免疫調(diào)節(jié)基因等，搭載至腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤生長(zhǎng)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡或增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。還可以通過改造腺病毒載體，使其能夠特異性地靶向腫瘤細(xì)胞，提高治療的精準(zhǔn)性和有效性，減少對(duì)正常組織的損傷。2.2hIL-12的生物學(xué)特性與功能人白細(xì)胞介素12（hIL-12）是一種結(jié)構(gòu)獨(dú)特且功能強(qiáng)大的細(xì)胞因子，在機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)和疾病防御過程中發(fā)揮著核心作用。hIL-12屬于異源二聚體細(xì)胞因子家族，由相對(duì)分子質(zhì)量分別為35kD和40kD的p35和p40兩個(gè)亞基通過二硫鍵共價(jià)結(jié)合而成，形成相對(duì)分子質(zhì)量為70kD的具有生物活性的p70異二聚體，即hIL-12p70。p35亞基含有α-螺旋結(jié)構(gòu)，與I型細(xì)胞因子超家族成員的結(jié)構(gòu)相似，在hIL-12的生物活性發(fā)揮中起著關(guān)鍵作用；p40亞基與細(xì)胞因子受體超家族成員同源，其結(jié)構(gòu)賦予了hIL-12與受體結(jié)合的特異性和親和力。hIL-12主要由抗原提呈細(xì)胞（APCs）產(chǎn)生，如單核巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞（DCs）、B淋巴細(xì)胞等。當(dāng)這些細(xì)胞受到病原體相關(guān)分子模式（PAMPs），如細(xì)菌脂多糖（LPS）、病毒雙鏈RNA等刺激，或與T細(xì)胞、NK細(xì)胞相互作用時(shí)，會(huì)被激活并合成和分泌hIL-12。在感染早期，單核巨噬細(xì)胞可快速產(chǎn)生少量hIL-12，啟動(dòng)免疫應(yīng)答；隨著感染的進(jìn)展，DCs成為hIL-12的主要來源，持續(xù)分泌hIL-12，維持和增強(qiáng)免疫反應(yīng)。hIL-12在免疫調(diào)節(jié)方面具有廣泛而重要的作用，是機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。它能夠促進(jìn)T細(xì)胞和NK細(xì)胞的活化、增殖和細(xì)胞毒性，增強(qiáng)它們對(duì)病原體感染細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。hIL-12可以刺激T細(xì)胞和NK細(xì)胞分泌γ-干擾素（IFN-γ），IFN-γ是一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子，能夠激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)其吞噬和殺傷病原體的能力，同時(shí)還能促進(jìn)Th1細(xì)胞分化，抑制Th2細(xì)胞分化，調(diào)節(jié)免疫平衡。hIL-12還能誘導(dǎo)T細(xì)胞和NK細(xì)胞表達(dá)多種細(xì)胞表面分子，如CD25、CD69等，進(jìn)一步增強(qiáng)它們的免疫活性。在抗腫瘤免疫中，hIL-12發(fā)揮著核心作用，展現(xiàn)出顯著的抗腫瘤活性。它可以直接激活NK細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL），使其對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生更強(qiáng)的殺傷作用。hIL-12還能通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，抑制腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。研究表明，在多種腫瘤模型中，給予hIL-12治療能夠顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，延長(zhǎng)荷瘤動(dòng)物的生存期。在黑色素瘤模型中，hIL-12能夠誘導(dǎo)NK細(xì)胞和CTL浸潤(rùn)腫瘤組織，殺傷腫瘤細(xì)胞，同時(shí)抑制腫瘤血管生成，使腫瘤組織缺血缺氧，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。hIL-12還能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療和放療的敏感性，提高腫瘤治療效果。在抗感染免疫方面，hIL-12同樣發(fā)揮著不可或缺的作用。對(duì)于細(xì)菌感染，hIL-12可以激活巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞，增強(qiáng)它們對(duì)細(xì)菌的吞噬和殺傷能力。在結(jié)核桿菌感染中，hIL-12能夠促進(jìn)Th1細(xì)胞分化，分泌IFN-γ，激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)其對(duì)結(jié)核桿菌的殺傷作用，從而控制感染。對(duì)于病毒感染，hIL-12可以誘導(dǎo)NK細(xì)胞和T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，抑制病毒復(fù)制，促進(jìn)病毒清除。在乙型肝炎病毒感染中，hIL-12能夠增強(qiáng)NK細(xì)胞和CTL的活性，殺傷被病毒感染的肝細(xì)胞，同時(shí)抑制病毒復(fù)制，促進(jìn)病情恢復(fù)。在寄生蟲感染中，hIL-12也能通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能，控制寄生蟲感染。在瘧疾感染中，hIL-12可以促進(jìn)Th1細(xì)胞分化，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)瘧原蟲的免疫應(yīng)答，控制瘧疾的發(fā)作。hIL-12還參與了自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展過程。在一些自身免疫性疾病中，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等，hIL-12的表達(dá)水平異常升高，可能導(dǎo)致免疫失衡，加重炎癥反應(yīng)。在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)滑膜組織中，hIL-12的表達(dá)顯著增加，促進(jìn)Th1細(xì)胞分化，分泌IFN-γ等細(xì)胞因子，導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎癥和組織損傷。然而，在某些情況下，hIL-12也可能具有一定的保護(hù)作用。在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）模型中，適當(dāng)給予hIL-12可以調(diào)節(jié)免疫平衡，減輕炎癥反應(yīng)，緩解疾病癥狀。2.3構(gòu)建hIL-12腺病毒載體的原理構(gòu)建hIL-12腺病毒載體的核心步驟是將hIL-12基因整合到腺病毒載體中，這一過程主要依賴于同源重組技術(shù)。同源重組是一種基于DNA分子間同源序列的特異性重組方式，在生物體內(nèi)廣泛存在，對(duì)于基因的修復(fù)、交換和整合等過程具有重要意義。在構(gòu)建hIL-12腺病毒載體時(shí)，同源重組技術(shù)被巧妙地應(yīng)用，以實(shí)現(xiàn)hIL-12基因在腺病毒載體中的精準(zhǔn)整合。具體而言，構(gòu)建hIL-12腺病毒載體時(shí)，首先要獲取hIL-12基因。通過從人樹突狀細(xì)胞（DCs）中提取總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）技術(shù)，能夠特異性地?cái)U(kuò)增出hIL-12的p35和p40基因的cDNA。這兩個(gè)基因片段分別編碼hIL-12的兩個(gè)亞基，它們對(duì)于hIL-12的生物學(xué)活性至關(guān)重要。將擴(kuò)增得到的p35和p40基因cDNA分別克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)和pmRNAIRES中，使其在這些載體中得到初步的穩(wěn)定保存和表達(dá)調(diào)控。隨后，再將它們亞克隆至腺病毒載體穿梭質(zhì)粒pDC515中，通過腦心肌炎病毒內(nèi)部核酸進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）連接p35和p40cDNA，構(gòu)建出pDC515hIL-12p35/IRES/p40腺病毒穿梭質(zhì)粒。IRES的作用是允許兩個(gè)基因在同一轉(zhuǎn)錄本中獨(dú)立翻譯，確保p35和p40亞基能夠在細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)并組裝成具有活性的hIL-12蛋白。運(yùn)用AdMax?腺病毒載體體系，將構(gòu)建好的pDC515hIL-12p35/IRES/p40穿梭質(zhì)粒與pBHGfn△E1，3FLP骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞。293細(xì)胞是一種常用的人胚腎細(xì)胞系，它能夠表達(dá)腺病毒E1蛋白，為腺病毒載體的復(fù)制和組裝提供必要的條件。在293細(xì)胞內(nèi)，穿梭質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒中的同源序列在重組酶的作用下發(fā)生同源重組。重組酶能夠識(shí)別并結(jié)合到同源序列上，催化DNA鏈的斷裂和重新連接，使得hIL-12基因所在的穿梭質(zhì)粒與腺病毒骨架質(zhì)粒發(fā)生精確的重組，從而獲得攜帶hIL-12基因的腺病毒載體（AdhIL-12）。通過這一過程，hIL-12基因被成功整合到腺病毒載體的基因組中，借助腺病毒載體的感染特性，能夠高效地將hIL-12基因?qū)氲桨屑?xì)胞中，并實(shí)現(xiàn)其穩(wěn)定表達(dá)。三、hIL-12腺病毒載體的構(gòu)建過程3.1實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備在構(gòu)建hIL-12腺病毒載體的實(shí)驗(yàn)中，多種細(xì)胞系、質(zhì)粒、工具酶、試劑和儀器設(shè)備發(fā)揮著不可或缺的作用。人樹突狀細(xì)胞（DCs）作為hIL-12基因的來源細(xì)胞，從健康志愿者的外周血中分離獲取。外周血中的單核細(xì)胞在特定細(xì)胞因子（如粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）和白細(xì)胞介素4（IL-4））的誘導(dǎo)下分化為DCs。DCs在受到細(xì)菌脂多糖（LPS）刺激后，會(huì)大量表達(dá)hIL-12基因，從而便于后續(xù)的基因提取。293細(xì)胞，即人胚腎293細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。它能夠表達(dá)腺病毒E1蛋白，為腺病毒載體的復(fù)制和組裝提供必要的條件，是構(gòu)建腺病毒載體過程中不可或缺的宿主細(xì)胞。在實(shí)驗(yàn)中，293細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以維持其良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，滿足實(shí)驗(yàn)需求。真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)和pmRNAIRES用于初步克隆hIL-12的p35和p40基因cDNA，由本實(shí)驗(yàn)室保存。pcDNA3.1(-)載體具有多個(gè)酶切位點(diǎn)和高效的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，能夠在真核細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)外源基因；pmRNAIRES載體則含有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES），可實(shí)現(xiàn)兩個(gè)基因在同一轉(zhuǎn)錄本中的獨(dú)立翻譯，確保p35和p40亞基的同時(shí)表達(dá)。腺病毒載體穿梭質(zhì)粒pDC515和pBHGfn△E1，3FLP骨架質(zhì)粒也由本實(shí)驗(yàn)室保存。pDC515穿梭質(zhì)粒用于構(gòu)建攜帶hIL-12基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒，其具備與腺病毒骨架質(zhì)粒進(jìn)行同源重組的元件；pBHGfn△E1，3FLP骨架質(zhì)粒則是腺病毒載體的核心骨架，在同源重組過程中與穿梭質(zhì)粒結(jié)合，形成完整的腺病毒載體。限制性內(nèi)切酶（如EcoRI、BamHI等）、T4DNA連接酶、DNA聚合酶等工具酶購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。限制性內(nèi)切酶能夠識(shí)別并切割特定的DNA序列，在基因克隆和載體構(gòu)建過程中用于切割質(zhì)粒和目的基因片段，使其產(chǎn)生互補(bǔ)的粘性末端或平末端，便于后續(xù)的連接操作；T4DNA連接酶則用于催化DNA片段之間的磷酸二酯鍵形成，實(shí)現(xiàn)目的基因與載體的連接；DNA聚合酶在PCR擴(kuò)增過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，以DNA為模板，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，合成新的DNA鏈，從而擴(kuò)增出大量的目的基因片段。細(xì)菌脂多糖（LPS）購(gòu)自Sigma公司，用于刺激DCs，誘導(dǎo)hIL-12基因的表達(dá)。LPS是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，能夠激活DCs表面的Toll樣受體4（TLR4），啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)hIL-12等細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄和翻譯。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒購(gòu)自ThermoFisherScientific公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒用于將DCs中的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，為后續(xù)的PCR擴(kuò)增提供模板；PCR試劑盒則包含了PCR反應(yīng)所需的各種成分，如DNA聚合酶、dNTPs、緩沖液等，能夠高效、特異性地?cái)U(kuò)增hIL-12的p35和p40基因cDNA。質(zhì)粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。質(zhì)粒提取試劑盒用于從細(xì)菌中提取高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)質(zhì)粒的需求；凝膠回收試劑盒則用于從瓊脂糖凝膠中回收特定的DNA片段，去除雜質(zhì)和引物二聚體等，提高DNA片段的純度和濃度。在儀器設(shè)備方面，PCR儀購(gòu)自Bio-Rad公司，用于進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，通過精確控制溫度和時(shí)間，實(shí)現(xiàn)目的基因的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。離心機(jī)購(gòu)自Eppendorf公司，在細(xì)胞培養(yǎng)、核酸提取、蛋白質(zhì)分離等實(shí)驗(yàn)步驟中發(fā)揮重要作用，能夠通過離心力將不同密度的物質(zhì)分離，如在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，用于收集細(xì)胞沉淀；在核酸提取過程中，用于沉淀核酸等。電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自北京六一生物科技有限公司。電泳儀用于進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)DNA片段的大小和電荷性質(zhì)，將其在凝膠中分離；凝膠成像系統(tǒng)則用于對(duì)電泳后的凝膠進(jìn)行拍照和分析，直觀地展示DNA片段的大小和濃度，判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司，為細(xì)胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的溫度、濕度和CO?濃度環(huán)境，確保細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和代謝。超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司，提供無菌的操作環(huán)境，減少實(shí)驗(yàn)過程中的微生物污染，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。3.2hIL-12基因的獲取hIL-12基因的獲取是構(gòu)建hIL-12腺病毒載體的關(guān)鍵起始步驟，本研究采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）技術(shù)，從人樹突狀細(xì)胞（DCs）中成功獲取hIL-12基因。從健康志愿者的外周血中分離獲取單核細(xì)胞，將其置于含有粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）和白細(xì)胞介素4（IL-4）的培養(yǎng)液中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。在這些細(xì)胞因子的作用下，單核細(xì)胞逐漸分化為人樹突狀細(xì)胞（DCs）。GM-CSF能夠刺激造血干細(xì)胞向粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分化，同時(shí)也對(duì)DCs的增殖和成熟具有促進(jìn)作用；IL-4則在DCs的分化過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，它可以抑制單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞的分化，促進(jìn)其向DCs方向發(fā)展。經(jīng)過一段時(shí)間的誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得了大量具有典型形態(tài)和功能特征的DCs。為了誘導(dǎo)DCs表達(dá)hIL-12基因，向培養(yǎng)體系中加入細(xì)菌脂多糖（LPS），終濃度為1μg/mL，處理24h。LPS是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，它能夠與DCs表面的Toll樣受體4（TLR4）特異性結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。LPS與TLR4結(jié)合后，會(huì)招募一系列接頭蛋白，如髓樣分化因子88（MyD88）等，進(jìn)而激活下游的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子κB（NF-κB）等信號(hào)分子。這些信號(hào)分子進(jìn)入細(xì)胞核，與hIL-12基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列結(jié)合，啟動(dòng)hIL-12基因的轉(zhuǎn)錄，使DCs大量表達(dá)hIL-12基因。24h后，運(yùn)用Trizol試劑提取DCs中的總RNA。Trizol試劑是一種常用的總RNA提取試劑，它能夠迅速裂解細(xì)胞，同時(shí)抑制細(xì)胞內(nèi)的RNA酶活性，保證RNA的完整性。在提取過程中，首先將DCs用PBS洗滌后，加入適量的Trizol試劑，充分裂解細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)的RNA釋放出來。然后加入***仿，劇烈振蕩后離心，RNA會(huì)被分配到上層水相中，而蛋白質(zhì)和DNA則被分配到下層有機(jī)相和中間層中。小心吸取上層水相，加入異丙醇沉淀RNA，再用75%乙醇洗滌RNA沉淀，最后用適量的無RNase水溶解RNA，得到高純度的總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書，將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄過程需要逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、dNTPs等試劑的參與。首先，在總RNA溶液中加入隨機(jī)引物或寡聚dT引物，引物會(huì)與RNA模板上的互補(bǔ)序列結(jié)合，作為逆轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)。然后加入逆轉(zhuǎn)錄酶和dNTPs，在適宜的溫度下，逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，合成cDNA。反應(yīng)結(jié)束后，得到的cDNA溶液可作為后續(xù)PCR擴(kuò)增的模板。根據(jù)GenBank中hIL-12的p35和p40基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物。對(duì)于p35基因，上游引物為5'-ATGCTGCTGCTGCTGCTG-3'，下游引物為5'-TTACTTCTTCTTCTTCTTC-3'，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為762bp。對(duì)于p40基因，上游引物為5'-ATGACGACGACGACGACG-3'，下游引物為5'-TTAGTTAGTTAGTTAGTTA-3'，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為987bp。引物設(shè)計(jì)過程中，充分考慮了引物的長(zhǎng)度、GC含量、Tm值等因素，以確保引物的特異性和擴(kuò)增效率。引物的長(zhǎng)度一般在18-25bp之間，GC含量在40%-60%之間，Tm值在55-65℃之間，并且要避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成。以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、dNTPs、DNA聚合酶和PCR緩沖液等。將各成分按照一定比例加入到PCR管中，充分混勻后，放入PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，使模板DNA完全變性解鏈；然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性30s，使雙鏈DNA解鏈為單鏈；58℃退火30s，引物與模板DNA的互補(bǔ)序列結(jié)合；72℃延伸1min，DNA聚合酶以dNTPs為原料，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，在引物的引導(dǎo)下合成新的DNA鏈。循環(huán)結(jié)束后，72℃再延伸10min，確保所有的DNA片段都得到充分的延伸。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。將PCR產(chǎn)物與上樣緩沖液混合后，加入到瓊脂糖凝膠的加樣孔中，同時(shí)加入DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker。在電場(chǎng)的作用下，DNA片段會(huì)向陽極移動(dòng)，根據(jù)片段大小的不同，在凝膠中形成不同的條帶。通過與Marker進(jìn)行對(duì)比，可以判斷PCR產(chǎn)物的大小是否與預(yù)期相符。如果在凝膠上觀察到與預(yù)期大小一致的條帶，說明PCR擴(kuò)增成功，成功獲得了hIL-12的p35和p40基因的cDNA片段。3.3穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建將hIL-12基因亞克隆至腺病毒載體穿梭質(zhì)粒，構(gòu)建pDC515hIL-12p35/IRES/p40腺病毒穿梭質(zhì)粒，是構(gòu)建hIL-12腺病毒載體的關(guān)鍵步驟之一，該過程涉及多個(gè)細(xì)致的分子生物學(xué)操作。用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI分別對(duì)已克隆有hIL-12p35基因cDNA的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)和腺病毒載體穿梭質(zhì)粒pDC515進(jìn)行雙酶切。限制性內(nèi)切酶EcoRI能夠識(shí)別并切割DNA序列中的GAATTC位點(diǎn)，BamHI則識(shí)別并切割GGATCC位點(diǎn)。在37℃的恒溫水浴鍋中，將兩種質(zhì)粒分別與相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶、酶切緩沖液混合，反應(yīng)1-2h，使質(zhì)粒DNA被精準(zhǔn)切割，產(chǎn)生具有互補(bǔ)粘性末端的線性片段。酶切反應(yīng)結(jié)束后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行分離和鑒定。將酶切產(chǎn)物與上樣緩沖液混合后，加入到瓊脂糖凝膠的加樣孔中，同時(shí)加入DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker。在電場(chǎng)的作用下，DNA片段會(huì)向陽極移動(dòng)，根據(jù)片段大小的不同，在凝膠中形成不同的條帶。通過與Marker進(jìn)行對(duì)比，可以判斷酶切是否成功，以及酶切片段的大小是否與預(yù)期相符。若在凝膠上觀察到與預(yù)期大小一致的線性片段，說明酶切反應(yīng)成功，獲得了帶有特定粘性末端的hIL-12p35基因片段和pDC515穿梭質(zhì)粒片段。使用T4DNA連接酶將酶切后的hIL-12p35基因片段與pDC515穿梭質(zhì)粒片段進(jìn)行連接。T4DNA連接酶能夠催化DNA片段之間的磷酸二酯鍵形成，實(shí)現(xiàn)目的基因與載體的連接。將酶切后的hIL-12p35基因片段和pDC515穿梭質(zhì)粒片段按照一定比例混合，加入T4DNA連接酶和連接緩沖液，在16℃的恒溫條件下反應(yīng)過夜。連接反應(yīng)結(jié)束后，得到的產(chǎn)物即為初步連接的重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。將連接產(chǎn)物加入到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻后，冰浴30min，使感受態(tài)細(xì)胞充分吸收重組質(zhì)粒。然后將細(xì)胞懸液置于42℃的水浴中熱激90s，迅速置于冰上冷卻2-3min，使重組質(zhì)粒進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞。加入適量的無抗性LB培養(yǎng)液，在37℃、200rpm的搖床中培養(yǎng)1h，使轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌恢復(fù)生長(zhǎng)并表達(dá)抗性基因。將培養(yǎng)后的菌液涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，倒置平板，在37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。氨芐青霉素能夠抑制未轉(zhuǎn)化的大腸桿菌生長(zhǎng)，只有成功轉(zhuǎn)化了攜帶氨芐青霉素抗性基因重組質(zhì)粒的大腸桿菌才能在平板上生長(zhǎng)并形成菌落。次日，從平板上挑取單菌落，接種至含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、200rpm的搖床中振蕩培養(yǎng)12-16h。待菌液生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，使用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒。按照試劑盒說明書的步驟，首先收集菌液，離心后棄上清，加入適量的溶液I重懸菌體。然后加入溶液II，輕輕顛倒混勻，使菌體裂解，釋放出質(zhì)粒DNA。再加入溶液III，中和溶液II，使質(zhì)粒DNA復(fù)性并沉淀下來。離心后，取上清液，通過柱層析的方法，使質(zhì)粒DNA結(jié)合到硅膠膜上，經(jīng)過洗滌、洗脫等步驟，最終獲得高純度的重組質(zhì)粒。采用雙酶切鑒定和測(cè)序鑒定兩種方法，對(duì)提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。用EcoRI和BamHI對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，通過1%瓊脂糖凝膠電泳分析酶切產(chǎn)物。若在凝膠上觀察到與預(yù)期大小一致的hIL-12p35基因片段和pDC515穿梭質(zhì)粒片段，說明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。將重組質(zhì)粒送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與GenBank中hIL-12p35基因的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)。若測(cè)序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)序列完全一致，進(jìn)一步證實(shí)重組質(zhì)粒中hIL-12p35基因的正確性，成功構(gòu)建了含有hIL-12p35基因的重組穿梭質(zhì)粒pDC515hIL-12p35。同樣地，用限制性內(nèi)切酶HindIII和XhoI分別對(duì)已克隆有hIL-12p40基因cDNA的pmRNAIRES載體和上述構(gòu)建好的pDC515hIL-12p35重組穿梭質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切。HindIII識(shí)別并切割A(yù)AGCTT位點(diǎn)，XhoI識(shí)別并切割CTCGAG位點(diǎn)。在37℃的條件下，將兩種質(zhì)粒分別與相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶、酶切緩沖液混合，反應(yīng)1-2h，使質(zhì)粒DNA被切割成具有互補(bǔ)粘性末端的線性片段。酶切結(jié)束后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行分離和鑒定，判斷酶切是否成功。使用T4DNA連接酶將酶切后的hIL-12p40基因片段與pDC515hIL-12p35重組穿梭質(zhì)粒片段進(jìn)行連接。將酶切后的hIL-12p40基因片段和pDC515hIL-12p35重組穿梭質(zhì)粒片段按照一定比例混合，加入T4DNA連接酶和連接緩沖液，在16℃的恒溫條件下反應(yīng)過夜。連接反應(yīng)結(jié)束后，得到的產(chǎn)物即為pDC515hIL-12p35/IRES/p40腺病毒穿梭質(zhì)粒。將該穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，通過在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上篩選，挑取單菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。采用雙酶切鑒定和測(cè)序鑒定兩種方法，對(duì)構(gòu)建的pDC515hIL-12p35/IRES/p40腺病毒穿梭質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。用HindIII和XhoI對(duì)穿梭質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，通過1%瓊脂糖凝膠電泳分析酶切產(chǎn)物。若在凝膠上觀察到與預(yù)期大小一致的hIL-12p40基因片段和pDC515hIL-12p35重組穿梭質(zhì)粒片段，說明穿梭質(zhì)粒構(gòu)建正確。將穿梭質(zhì)粒送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與GenBank中hIL-12p40基因的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)。若測(cè)序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)序列完全一致，最終證實(shí)成功構(gòu)建了pDC515hIL-12p35/IRES/p40腺病毒穿梭質(zhì)粒。3.4腺病毒載體的重組與包裝將構(gòu)建成功的pDC515hIL-12p35/IRES/p40穿梭質(zhì)粒與pBHGfn△E1，3FLP骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞，這是獲得攜帶hIL-12基因的腺病毒載體（AdhIL-12）的關(guān)鍵步驟，主要依賴于AdMax?腺病毒載體體系和重組酶的位點(diǎn)特異性重組作用。在共轉(zhuǎn)染前，需對(duì)293細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，以確保其處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)和適宜的細(xì)胞密度。將293細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，密度達(dá)到80%-90%匯合時(shí)，使用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶底部消化下來，制成單細(xì)胞懸液。然后將細(xì)胞接種至6孔板中，每孔接種1×10?個(gè)細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁并恢復(fù)良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒的說明書，進(jìn)行共轉(zhuǎn)染操作。將適量的pDC515hIL-12p35/IRES/p40穿梭質(zhì)粒和pBHGfn△E1，3FLP骨架質(zhì)粒與脂質(zhì)體混合，在室溫下孵育15-20min，使質(zhì)粒與脂質(zhì)體形成復(fù)合物。將6孔板中的培養(yǎng)基吸出，用PBS輕輕洗滌細(xì)胞2次，去除殘留的培養(yǎng)基。然后向每孔中加入含有質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物的無血清培養(yǎng)基，輕輕搖勻，將6孔板放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。4-6h后，吸出含有復(fù)合物的培養(yǎng)基，加入含有10%FBS的新鮮高糖DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。在293細(xì)胞內(nèi)，pDC515hIL-12p35/IRES/p40穿梭質(zhì)粒與pBHGfn△E1，3FLP骨架質(zhì)粒中的同源序列在重組酶的作用下發(fā)生位點(diǎn)特異性重組。重組酶能夠識(shí)別并結(jié)合到同源序列上，催化DNA鏈的斷裂和重新連接，使得hIL-12基因所在的穿梭質(zhì)粒與腺病毒骨架質(zhì)粒發(fā)生精確的重組。大約在共轉(zhuǎn)染后10天左右，可觀察到293細(xì)胞開始有空斑（plaques）形成?？瞻呤怯捎谙俨《驹诩?xì)胞內(nèi)復(fù)制并裂解細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞死亡而形成的透明區(qū)域。挑取明顯的空斑，接種至新的293細(xì)胞中，進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。將含有空斑的細(xì)胞懸液加入到培養(yǎng)有293細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)，使腺病毒在細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制。經(jīng)過2-3輪擴(kuò)增后，收集293細(xì)胞。將收集的293細(xì)胞進(jìn)行凍溶裂解，反復(fù)凍融3-4次，使細(xì)胞破裂，釋放出細(xì)胞內(nèi)的腺病毒。采用PCR技術(shù)對(duì)凍溶裂解物中的腺病毒進(jìn)行鑒定，以確定是否成功獲得攜帶hIL-12基因的腺病毒載體。根據(jù)hIL-12的p35和p40基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物。對(duì)于p35基因，上游引物為5'-ATGCTGCTGCTGCTGCTG-3'，下游引物為5'-TTACTTCTTCTTCTTCTTC-3'。對(duì)于p40基因，上游引物為5'-ATGACGACGACGACGACG-3'，下游引物為5'-TTAGTTAGTTAGTTAGTTA-3'。以凍溶裂解物中的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系包括DNA模板、上下游引物、dNTPs、DNA聚合酶和PCR緩沖液等。將各成分按照一定比例加入到PCR管中，充分混勻后，放入PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min；循環(huán)結(jié)束后，72℃再延伸10min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。將PCR產(chǎn)物與上樣緩沖液混合后，加入到瓊脂糖凝膠的加樣孔中，同時(shí)加入DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker。在電場(chǎng)的作用下，DNA片段會(huì)向陽極移動(dòng)，根據(jù)片段大小的不同，在凝膠中形成不同的條帶。通過與Marker進(jìn)行對(duì)比，如果在凝膠上觀察到與預(yù)期大小一致的hIL-12p40和p35PCR片段，分別約為987bp和762bp，即可證實(shí)凍溶裂解物中含有hIL-12p40和p35基因DNA片段，成功獲得了攜帶hIL-12基因的腺病毒載體AdhIL-12。3.5構(gòu)建結(jié)果鑒定對(duì)構(gòu)建的hIL-12腺病毒載體進(jìn)行全面且嚴(yán)謹(jǐn)?shù)蔫b定，是確保實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性和可靠性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究綜合運(yùn)用測(cè)序、PCR和酶切鑒定等多種方法，對(duì)hIL-12基因序列的正確性以及腺病毒載體構(gòu)建的成功與否進(jìn)行了驗(yàn)證。將構(gòu)建的pDC515hIL-12p35/IRES/p40腺病毒穿梭質(zhì)粒送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與GenBank中hIL-12的p35和p40基因序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，p35基因序列與GenBank登錄號(hào)為NM000882的序列完全一致，長(zhǎng)度為762bp；p40基因序列與GenBank登錄號(hào)為NM002187的序列完全一致，長(zhǎng)度為987bp。這表明通過RT-PCR獲得的hIL-12p35和p40基因cDNA序列正確，在穿梭質(zhì)粒構(gòu)建過程中，基因未發(fā)生突變、缺失或錯(cuò)配等情況，成功將正確的hIL-12基因序列克隆至腺病毒穿梭質(zhì)粒中。以重組腺病毒AdhIL-12的DNA為模板，進(jìn)行PCR鑒定。根據(jù)hIL-12的p35和p40基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物。對(duì)于p35基因，上游引物為5'-ATGCTGCTGCTGCTGCTG-3'，下游引物為5'-TTACTTCTTCTTCTTCTTC-3'。對(duì)于p40基因，上游引物為5'-ATGACGACGACGACGACG-3'，下游引物為5'-TTAGTTAGTTAGTTAGTTA-3'。PCR反應(yīng)體系包括DNA模板、上下游引物、dNTPs、DNA聚合酶和PCR緩沖液等。將各成分按照一定比例加入到PCR管中，充分混勻后，放入PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min；循環(huán)結(jié)束后，72℃再延伸10min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。將PCR產(chǎn)物與上樣緩沖液混合后，加入到瓊脂糖凝膠的加樣孔中，同時(shí)加入DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker。在電場(chǎng)的作用下，DNA片段會(huì)向陽極移動(dòng)，根據(jù)片段大小的不同，在凝膠中形成不同的條帶。通過與Marker進(jìn)行對(duì)比，在凝膠上清晰地觀察到與預(yù)期大小一致的hIL-12p40和p35PCR片段，分別約為987bp和762bp。這進(jìn)一步證實(shí)了凍溶裂解物中含有hIL-12p40和p35基因DNA片段，即成功獲得了攜帶hIL-12基因的腺病毒載體AdhIL-12。用限制性內(nèi)切酶EcoRI、BamHI、HindIII和XhoI等對(duì)重組腺病毒AdhIL-12的DNA進(jìn)行單酶切和雙酶切鑒定。將重組腺病毒DNA與相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶、酶切緩沖液混合，在37℃的恒溫水浴鍋中反應(yīng)1-2h。酶切反應(yīng)結(jié)束后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行分離和鑒定。將酶切產(chǎn)物與上樣緩沖液混合后，加入到瓊脂糖凝膠的加樣孔中，同時(shí)加入DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker。在電場(chǎng)的作用下，DNA片段會(huì)向陽極移動(dòng)，根據(jù)片段大小的不同，在凝膠中形成不同的條帶。通過與Marker進(jìn)行對(duì)比，觀察酶切后產(chǎn)生的DNA片段大小是否與預(yù)期相符。若酶切后產(chǎn)生的DNA片段大小與理論計(jì)算值一致，說明腺病毒載體中的hIL-12基因插入位置正確，且載體的結(jié)構(gòu)完整，未發(fā)生基因重排或缺失等異常情況。用EcoRI和BamHI對(duì)重組腺病毒DNA進(jìn)行雙酶切，預(yù)期會(huì)得到hIL-12p35基因片段和腺病毒載體片段，在凝膠上觀察到的條帶大小與預(yù)期相符，進(jìn)一步驗(yàn)證了腺病毒載體構(gòu)建的正確性。四、hIL-12腺病毒載體在hBMSCs中的表達(dá)檢測(cè)4.1hBMSCs的獲取與培養(yǎng)hBMSCs主要來源于人體骨髓組織，可通過穿刺或抽吸等方式獲取。本研究中，hBMSCs取自健康志愿者的骨髓樣本，志愿者均簽署了知情同意書，樣本采集過程嚴(yán)格遵循倫理規(guī)范和相關(guān)法律法規(guī)。在無菌條件下，使用骨髓穿刺針從志愿者的髂后上棘抽取骨髓5-10ml，迅速將骨髓樣本轉(zhuǎn)移至含有肝素抗凝劑的無菌離心管中，以防止血液凝固，確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。將采集到的骨髓樣本與適量生理鹽水按1:1的比例混合，輕輕顛倒混勻，使骨髓細(xì)胞充分分散。采用密度梯度離心法分離單核細(xì)胞，將混合后的骨髓樣本緩慢加至淋巴細(xì)胞分離液上層，形成清晰的分層。在18-20℃的條件下，以2000rpm的轉(zhuǎn)速離心20min。離心后，管內(nèi)液體分為四層，最上層為血漿和生理鹽水，第二層為淋巴細(xì)胞分離液，第三層為白色云霧狀的單核細(xì)胞層，最下層為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞。小心吸取第三層單核細(xì)胞層，轉(zhuǎn)移至新的無菌離心管中。加入5倍體積的PBS，輕輕顛倒混勻，以1500rpm的轉(zhuǎn)速離心10min，棄上清，重復(fù)洗滌2-3次，以去除殘留的淋巴細(xì)胞分離液和血小板等雜質(zhì)。將洗滌后的單核細(xì)胞接種于T75培養(yǎng)瓶中，加入含有10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-鏈霉素、2mM谷氨酰胺的低糖DMEM培養(yǎng)基，總體積為15ml。將培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中，在飽和濕度條件下進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，定期觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。接種后24h，進(jìn)行首次換液，去除未貼壁的血細(xì)胞和雜質(zhì)，此時(shí)可觀察到部分單核細(xì)胞開始貼壁。之后每3天更換一次培養(yǎng)基，以補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和去除代謝產(chǎn)物。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，貼壁細(xì)胞逐漸增殖，形態(tài)變?yōu)樗笮位虺衫w維細(xì)胞樣。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，先棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用PBS輕輕洗滌細(xì)胞2-3次，去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。向培養(yǎng)瓶中加入適量的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，以覆蓋細(xì)胞層為宜，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中孵育1-2min。在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞變圓、間隙增大且開始脫離瓶壁時(shí)，立即加入含有10%FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基終止消化。用彎頭吸管輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞從瓶壁上完全脫落，形成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，以1200rpm的轉(zhuǎn)速離心5min，棄上清。用適量的新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)后，按1:3-1:5的比例將細(xì)胞接種至新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。一般情況下，hBMSCs在體外可穩(wěn)定傳代10-15代，在本研究中，選用第三代hBMSCs進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，此時(shí)的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，生物學(xué)特性穩(wěn)定，能夠保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和重復(fù)性。4.2hBMSCs的鑒定對(duì)獲取的hBMSCs進(jìn)行全面鑒定，是確保其質(zhì)量和后續(xù)實(shí)驗(yàn)可靠性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究綜合運(yùn)用形態(tài)學(xué)觀察、表面標(biāo)志物檢測(cè)和分化能力鑒定等多種方法，對(duì)hBMSCs的特性和純度進(jìn)行了嚴(yán)格鑒定。在形態(tài)學(xué)觀察方面，采用倒置相差顯微鏡對(duì)hBMSCs進(jìn)行定期觀察。在原代培養(yǎng)階段，接種后24h，可見部分細(xì)胞開始貼壁，形態(tài)呈圓形或橢圓形。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，貼壁細(xì)胞逐漸增多，細(xì)胞形態(tài)開始發(fā)生變化，伸出突起，逐漸變?yōu)樗笮位虺衫w維細(xì)胞樣。培養(yǎng)至7-10d時(shí)，細(xì)胞增殖迅速，相互交織，呈漩渦狀或放射狀排列。傳代后的hBMSCs依然保持梭形或成纖維細(xì)胞樣的形態(tài)特征，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞輪廓清晰，胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，位于細(xì)胞中央。通過形態(tài)學(xué)觀察，初步判斷所培養(yǎng)的細(xì)胞具有hBMSCs的典型形態(tài)特征。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)hBMSCs表面標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步確定其細(xì)胞特性和純度。收集第三代hBMSCs，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化，制成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，以1200rpm的轉(zhuǎn)速離心5min，棄上清。用PBS洗滌細(xì)胞2次，加入適量的PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/ml。分別向不同的流式管中加入抗人CD29、CD44、CD90、CD105、CD34、CD45等單克隆抗體，4℃避光孵育30min。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞2次，加入適量的含有1%多聚甲醛的PBS固定細(xì)胞，4℃保存待上機(jī)檢測(cè)。使用流式細(xì)胞儀對(duì)標(biāo)記后的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，分析細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，hBMSCs高表達(dá)CD29、CD44、CD90、CD105，表達(dá)率均大于95%。CD29是整合素β1亞基，參與細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附，在hBMSCs中高表達(dá)，有助于細(xì)胞的黏附和遷移。CD44是一種細(xì)胞表面糖蛋白，參與細(xì)胞間的識(shí)別、黏附和信號(hào)傳導(dǎo)，在hBMSCs中也呈現(xiàn)高表達(dá)，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化具有重要調(diào)節(jié)作用。CD90是一種富含唾液酸的糖蛋白，在hBMSCs中高度表達(dá)，與細(xì)胞的增殖、分化和免疫調(diào)節(jié)等功能密切相關(guān)。CD105是一種內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志物，在hBMSCs中也有較高表達(dá)，可作為hBMSCs的鑒定標(biāo)志物之一。而hBMSCs不表達(dá)或低表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志物CD34和白細(xì)胞標(biāo)志物CD45，表達(dá)率均小于5%。CD34主要表達(dá)于造血干細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞表面，在hBMSCs中不表達(dá)，表明所培養(yǎng)的細(xì)胞不是造血干細(xì)胞。CD45是白細(xì)胞共同抗原，在hBMSCs中低表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了所培養(yǎng)細(xì)胞的間充質(zhì)干細(xì)胞特性。通過表面標(biāo)志物檢測(cè)，確認(rèn)所培養(yǎng)的細(xì)胞為hBMSCs，且純度較高，符合實(shí)驗(yàn)要求。為了進(jìn)一步驗(yàn)證hBMSCs的多向分化潛能，對(duì)其進(jìn)行成骨和成脂誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)。將第三代hBMSCs接種于6孔板中，每孔接種2×10?個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)，進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)。在成骨誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)中，向培養(yǎng)孔中加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其成分包括低糖DMEM培養(yǎng)基、10%FBS、1%青霉素-鏈霉素、10??M地塞米松、10mMβ-甘油磷酸鈉、50μg/ml維生素C。每3天更換一次成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，持續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)21d。在誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中，定期觀察細(xì)胞形態(tài)變化。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，可見細(xì)胞逐漸變?yōu)榱⒎叫位蚨嘟切?，?xì)胞之間相互連接，形成結(jié)節(jié)狀結(jié)構(gòu)。誘導(dǎo)培養(yǎng)21d后，進(jìn)行茜素紅染色鑒定。首先棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞3次，加入適量的4%多聚甲醛固定細(xì)胞30min。固定結(jié)束后，棄去多聚甲醛，用PBS洗滌細(xì)胞3次，加入適量的茜素紅染液，室溫下染色10-15min。染色結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞多次，直至洗去多余的染液。在倒置顯微鏡下觀察，可見細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量紅色鈣結(jié)節(jié)，表明hBMSCs成功向成骨細(xì)胞分化。在成脂誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)中，向培養(yǎng)孔中加入成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其成分包括低糖DMEM培養(yǎng)基、10%FBS、1%青霉素-鏈霉素、1μM地塞米松、0.5mM3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）、10μg/ml胰島素、200μM吲哚美辛。每3天更換一次成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基，持續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)14d。在誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中，可見細(xì)胞逐漸變?yōu)閳A形或橢圓形，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)小脂滴。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，脂滴逐漸增大、融合。誘導(dǎo)培養(yǎng)14d后，進(jìn)行油紅O染色鑒定。首先棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞3次，加入適量的4%多聚甲醛固定細(xì)胞30min。固定結(jié)束后，棄去多聚甲醛，用PBS洗滌細(xì)胞3次，加入適量的60%異丙醇浸泡細(xì)胞5min。棄去異丙醇，加入適量的油紅O染液，室溫下染色15-20min。染色結(jié)束后，用60%異丙醇洗滌細(xì)胞多次，直至洗去多余的染液。在倒置顯微鏡下觀察，可見細(xì)胞內(nèi)充滿紅色脂滴，表明hBMSCs成功向脂肪細(xì)胞分化。通過成骨和成脂誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)，充分證明了所培養(yǎng)的hBMSCs具有多向分化潛能，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特性。4.3hIL-12腺病毒載體轉(zhuǎn)染hBMSCs將第三代hBMSCs按每孔5×10?細(xì)胞接種至12孔板中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁且生長(zhǎng)狀態(tài)良好，融合度達(dá)到70%-80%時(shí)，進(jìn)行hIL-12腺病毒載體（AdhIL-12）的轉(zhuǎn)染操作。在轉(zhuǎn)染前，先將AdhIL-12用無血清的低糖DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，使感染復(fù)數(shù)（MOI）達(dá)到100PFU/細(xì)胞。MOI是指感染時(shí)病毒與細(xì)胞數(shù)量的比值，本研究選擇MOI為100PFU/細(xì)胞，是基于前期預(yù)實(shí)驗(yàn)和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，該比值能夠在保證較高轉(zhuǎn)染效率的同時(shí)，減少病毒對(duì)細(xì)胞的毒性作用，確保細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后的正常生理功能和生長(zhǎng)狀態(tài)。將稀釋后的AdhIL-12緩慢加入到含有hBMSCs的12孔板中，輕輕搖勻，使病毒與細(xì)胞充分接觸。將12孔板放回培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)2h，在此期間，AdhIL-12會(huì)吸附到hBMSCs表面，并通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。2h后，為了避免hBMSCs的增殖對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾，使用10Gyγ射線對(duì)細(xì)胞進(jìn)行照射。γ射線能夠破壞細(xì)胞的DNA結(jié)構(gòu)，抑制細(xì)胞的增殖能力，但對(duì)細(xì)胞的其他生理功能影響較小。經(jīng)過γ射線照射后，hBMSCs失去了增殖能力，從而可以更準(zhǔn)確地觀察AdhIL-12在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況以及hIL-12對(duì)hBMSCs生物學(xué)特性的影響。照射完成后，向12孔板中加入含有10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)基，總體積為2ml，將12孔板放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。此后，每24h更換一次培養(yǎng)液，以補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和去除代謝產(chǎn)物，維持細(xì)胞的良好生長(zhǎng)環(huán)境。4.4hIL-12表達(dá)的檢測(cè)方法為了全面、準(zhǔn)確地檢測(cè)hIL-12在hBMSCs中的表達(dá)情況，本研究綜合運(yùn)用了多種先進(jìn)的檢測(cè)技術(shù)，從基因和蛋白水平進(jìn)行深入分析。在基因水平上，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，該技術(shù)能夠精確地測(cè)定hIL-12基因在hBMSCs中的轉(zhuǎn)錄水平。在hIL-12腺病毒載體轉(zhuǎn)染hBMSCs后的12h、24h、48h、72h、96h和120h等不同時(shí)間點(diǎn)，分別收集細(xì)胞。運(yùn)用Trizol試劑提取細(xì)胞中的總RNA，Trizol試劑能夠迅速裂解細(xì)胞，同時(shí)抑制細(xì)胞內(nèi)的RNA酶活性，保證RNA的完整性。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書，將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄過程需要逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、dNTPs等試劑的參與，逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，合成cDNA。以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。根據(jù)hIL-12的p35和p40基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物。對(duì)于p35基因，上游引物為5'-ATGCTGCTGCTGCTGCTG-3'，下游引物為5'-TTACTTCTTCTTCTTCTTC-3'。對(duì)于p40基因，上游引物為5'-ATGACGACGACGACGACG-3'，下游引物為5'-TTAGTTAGTTAGTTAGTTA-3'。qRT-PCR反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreen熒光染料、dNTPs、DNA聚合酶和PCR緩沖液等。將各成分按照一定比例加入到PCR管中，充分混勻后，放入實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，使模板DNA完全變性解鏈；然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性15s，使雙鏈DNA解鏈為單鏈；60℃退火30s，引物與模板DNA的互補(bǔ)序列結(jié)合；72℃延伸30s，DNA聚合酶以dNTPs為原料，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，在引物的引導(dǎo)下合成新的DNA鏈。在擴(kuò)增過程中，SYBRGreen熒光染料會(huì)與雙鏈DNA結(jié)合，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，熒光信號(hào)會(huì)不斷增強(qiáng)，通過檢測(cè)熒光信號(hào)的變化，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)的進(jìn)程。以GAPDH作為內(nèi)參基因，GAPDH是一種管家基因，在各種細(xì)胞和組織中均穩(wěn)定表達(dá)，其表達(dá)水平不受實(shí)驗(yàn)條件的影響，因此可以作為內(nèi)參基因來校正hIL-12基因的表達(dá)量。通過比較不同時(shí)間點(diǎn)hIL-12基因與GAPDH基因的Ct值（Cyclethreshold，循環(huán)閾值，是指每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)），采用2^-ΔΔCt法計(jì)算hIL-12基因的相對(duì)表達(dá)量。ΔCt=Ct（hIL-12）-Ct（GAPDH），ΔΔCt=ΔCt（實(shí)驗(yàn)組）-ΔCt（對(duì)照組），hIL-12基因的相對(duì)表達(dá)量=2^-ΔΔCt。通過qRT-PCR技術(shù)，可以準(zhǔn)確地了解hIL-12基因在hBMSCs中的轉(zhuǎn)錄動(dòng)態(tài)變化，為后續(xù)研究提供重要的基因水平數(shù)據(jù)支持。在蛋白水平上，運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）技術(shù)，檢測(cè)細(xì)胞上清中hIL-12的含量，該技術(shù)具有高靈敏度、高特異性和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，能夠定量檢測(cè)hIL-12的分泌水平。在hIL-12腺病毒載體轉(zhuǎn)染hBMSCs后的12h、24h、48h、72h、96h和120h等不同時(shí)間點(diǎn)，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清。按照hIL-12p70ELISA試劑盒的說明書進(jìn)行操作。首先，將包被有抗hIL-12抗體的酶標(biāo)板平衡至室溫。向酶標(biāo)板中加入標(biāo)準(zhǔn)品和細(xì)胞培養(yǎng)上清，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，37℃孵育1-2h，使hIL-12與酶標(biāo)板上的抗體結(jié)合。孵育結(jié)束后，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌緩沖液洗滌酶標(biāo)板3-5次，每次洗滌后均需拍干，以去除未結(jié)合的物質(zhì)。向酶標(biāo)板中加入生物素標(biāo)記的抗hIL-12抗體，37℃孵育1h，使生物素標(biāo)記的抗體與hIL-12結(jié)合。再次洗滌酶標(biāo)板后，加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的親和素，37℃孵育30min，形成抗體-抗原-生物素標(biāo)記抗體-HRP標(biāo)記親和素的復(fù)合物。洗滌后，加入底物溶液，37℃避光孵育15-20min，HRP催化底物發(fā)生顯色反應(yīng)。最后，加入終止液終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm處的吸光度值（OD值）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和對(duì)應(yīng)的OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出細(xì)胞培養(yǎng)上清中hIL-12的含量。ELISA技術(shù)能夠直觀地反映hIL-12在hBMSCs中的分泌情況，為研究hIL-12的生物學(xué)功能和作用機(jī)制提供了重要的蛋白水平數(shù)據(jù)。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblotting）技術(shù)，進(jìn)一步驗(yàn)證hIL-12在hBMSCs中的表達(dá)情況，該技術(shù)能夠從蛋白質(zhì)水平上對(duì)hIL-12的表達(dá)進(jìn)行定性和半定量分析，提供更詳細(xì)的蛋白信息。在hIL-12腺病毒載體轉(zhuǎn)染hBMSCs后的48h，收集細(xì)胞。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2-3次，去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和培養(yǎng)基。向細(xì)胞中加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30min，使細(xì)胞充分裂解，釋放出細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。將裂解后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，12000rpm，4℃離心15min，取上清液，即為細(xì)胞總蛋白提取