TrxR抑制劑AA1：肝癌治療新曙光——抗肝癌活性及機制深度剖析一、引言1.1研究背景與意義肝癌，作為全球范圍內(nèi)嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率長期居高不下。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，肝癌的新發(fā)病例數(shù)達到90.6萬，死亡病例數(shù)約83萬，在所有癌癥相關(guān)死亡原因中位居第二。在中國，肝癌的形勢更為嚴峻，由于乙肝病毒（HBV）的高感染率等因素，我國肝癌的發(fā)病率和死亡率均占全球的一半以上。肝癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，錯過了手術(shù)切除等根治性治療的最佳時機。目前，肝癌的治療手段主要包括手術(shù)切除、肝移植、局部消融、介入治療、靶向治療和免疫治療等。手術(shù)切除和肝移植是潛在的根治性治療方法，但僅適用于早期肝癌患者，且肝移植面臨供體短缺、免疫排斥等問題。對于中晚期肝癌患者，介入治療如經(jīng)動脈化療栓塞（TACE）是常用的治療方法之一，但療效有限且易復(fù)發(fā)。近年來，靶向治療和免疫治療的出現(xiàn)為肝癌治療帶來了新的希望，如索拉非尼、侖伐替尼等靶向藥物以及帕博利珠單抗、納武利尤單抗等免疫檢查點抑制劑在一定程度上改善了患者的生存狀況，但仍存在耐藥性、不良反應(yīng)等問題，且部分患者對這些治療方法并不敏感，總體治療效果仍不盡人意。因此，開發(fā)新型、高效、低毒的抗肝癌藥物具有迫切的臨床需求。硫氧還蛋白還原酶（TrxR）是一種含硒的吡啶核苷酸二硫化物氧化還原酶，在維持細胞內(nèi)氧化還原平衡中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。TrxR通過催化硫氧還蛋白（Trx）的二硫鍵還原，為細胞內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)提供還原力，參與調(diào)節(jié)細胞的增殖、凋亡、分化等多種生物學(xué)過程。研究發(fā)現(xiàn)，TrxR在多種腫瘤細胞中高表達，包括肝癌細胞，其異常表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。抑制TrxR的活性可以破壞細胞內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致活性氧（ROS）積累，進而誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，因此，TrxR成為了極具潛力的抗癌靶點。TrxR抑制劑AA1是一種新型的小分子化合物，具有獨特的化學(xué)結(jié)構(gòu)和作用機制。前期研究表明，AA1能夠特異性地抑制TrxR的活性，在多種腫瘤細胞系中表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤活性。然而，目前關(guān)于AA1抗肝癌活性的研究尚處于初步階段，其作用機制和體內(nèi)療效仍有待深入探究。本研究旨在系統(tǒng)地研究TrxR抑制劑AA1的抗肝癌活性，通過體外細胞實驗和體內(nèi)動物實驗，明確其對肝癌細胞增殖、凋亡、周期、氧化應(yīng)激等生物學(xué)行為的影響，揭示其作用機制，并評估其體內(nèi)抗腫瘤效果和安全性，為肝癌的治療提供新的候選藥物和理論依據(jù)。這不僅有助于拓展對肝癌發(fā)病機制和治療靶點的認識，還可能為臨床肝癌治療帶來新的策略和方法，具有重要的科學(xué)意義和臨床應(yīng)用價值。1.2研究目的與創(chuàng)新點本研究旨在全面且深入地探究TrxR抑制劑AA1的抗肝癌活性及其作用機制。具體而言，首先通過體外細胞實驗，精準分析AA1對肝癌細胞增殖、凋亡、周期等生物學(xué)行為的影響，從細胞層面揭示其抗肝癌的初步作用效果；進而深入探討AA1影響肝癌細胞氧化應(yīng)激、DNA損傷修復(fù)等關(guān)鍵細胞內(nèi)過程的分子機制，明確其在細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路中的作用靶點與作用方式；隨后利用體內(nèi)動物實驗，嚴謹評估AA1在荷瘤小鼠模型中的抗腫瘤效果，包括對腫瘤生長抑制情況、腫瘤轉(zhuǎn)移的影響等，并詳細分析其對機體免疫系統(tǒng)、腫瘤免疫微環(huán)境以及腸道菌群等方面的作用，綜合評估其在整體動物模型中的治療效果與安全性，為后續(xù)臨床研究奠定堅實基礎(chǔ)。本研究的創(chuàng)新點顯著。在作用機制方面，以往針對TrxR抑制劑抗肝癌作用機制的研究多集中在單一信號通路或細胞過程，而本研究將全面且系統(tǒng)地從多個角度，如氧化應(yīng)激、DNA損傷、線粒體功能、自噬以及免疫調(diào)節(jié)等，深入探究AA1的作用機制，有望發(fā)現(xiàn)全新的分子作用靶點與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，為肝癌治療機制研究提供更為全面和深入的視角。在臨床應(yīng)用潛力上，目前臨床上針對肝癌的治療藥物仍存在諸多局限性，AA1作為一種新型的TrxR抑制劑，具有獨特的化學(xué)結(jié)構(gòu)，若能在本研究中展現(xiàn)出良好的抗肝癌活性與較低的毒副作用，將極有可能成為具有潛在臨床應(yīng)用價值的新型抗肝癌藥物，為肝癌患者提供新的治療選擇，這對改善肝癌患者的預(yù)后和提高其生活質(zhì)量具有重要意義。二、TrxR與肝癌的關(guān)聯(lián)剖析2.1TrxR的結(jié)構(gòu)、功能及作用機制硫氧還蛋白還原酶（TrxR）是一種含硒的吡啶核苷酸二硫化物氧化還原酶，屬于吡啶核苷酸-二硫化物氧化還原酶家族成員。在哺乳動物中，TrxR主要以三種同工酶的形式存在，分別為硫氧還蛋白R1（TrxR1，細胞質(zhì)型）、TrxR2（線粒體型）和主要在睪丸中表達的TrxR3（又名TGR）。其中，胞質(zhì)型TrxR1發(fā)現(xiàn)最早且分布最為廣泛，是目前研究最為深入的一種同工酶。從結(jié)構(gòu)上看，TrxR是一種NADPH依賴的包含F(xiàn)AD結(jié)構(gòu)域的二聚體硒酶。每個亞基由N端結(jié)構(gòu)域、中間結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域組成。N端結(jié)構(gòu)域含有FAD結(jié)合位點，負責(zé)與FAD輔因子緊密結(jié)合，F(xiàn)AD在電子傳遞過程中起著關(guān)鍵作用；中間結(jié)構(gòu)域主要參與二聚體的形成，維持酶的整體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性；C端結(jié)構(gòu)域則包含了獨特且必需的硒代半胱氨酸（Sec）殘基，這一殘基在酶的催化活性和與底物的相互作用中發(fā)揮著不可或缺的作用。Sec殘基具有較低的pKa值，使其易于與親電試劑發(fā)生反應(yīng)，這一特性賦予了TrxR獨特的催化活性和對底物的特異性。TrxR的主要功能是維持細胞內(nèi)氧化還原平衡，它和硫氧還蛋白（Trx）、NADPH共同構(gòu)成了硫氧還蛋白系統(tǒng)。在該系統(tǒng)中，TrxR催化NADPH將電子傳遞給FAD，使其還原為FADH2。隨后，F(xiàn)ADH2將電子轉(zhuǎn)移至硒代半胱氨酸殘基，形成硒醇陰離子，該陰離子具有很強的親核性。硒醇陰離子能夠攻擊氧化型硫氧還蛋白（Trx-S2）中的二硫鍵，將其還原為還原型硫氧還蛋白（Trx-SH2），同時自身被氧化。還原型硫氧還蛋白（Trx-SH2）作為重要的細胞內(nèi)還原劑，參與了眾多生物學(xué)過程，如抗氧化防御、蛋白質(zhì)修復(fù)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等。在抗氧化防御方面，Trx-SH2可以直接還原細胞內(nèi)的活性氧（ROS），如過氧化氫（H2O2）等，將其轉(zhuǎn)化為水，從而降低細胞內(nèi)ROS水平，保護細胞免受氧化損傷。在蛋白質(zhì)修復(fù)過程中，Trx-SH2能夠還原氧化的蛋白質(zhì)二硫鍵，使其恢復(fù)正常的結(jié)構(gòu)和功能。此外，Trx-SH2還可以通過與一些轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)節(jié)基因的表達，參與細胞的增殖、凋亡、分化等生物學(xué)過程。在細胞生長增殖方面，TrxR也發(fā)揮著重要作用。研究表明，TrxR活性的抑制會導(dǎo)致細胞生長受到抑制。這是因為TrxR參與了核苷酸還原酶的調(diào)節(jié)，核苷酸還原酶是在復(fù)制細胞或者快速生長的腫瘤細胞中特異表達的酶，負責(zé)催化核糖核苷酸還原為脫氧核糖核苷酸，為DNA合成提供原料。當(dāng)TrxR活性被抑制時，核苷酸還原酶的活性也會受到抑制，從而導(dǎo)致DNA合成受阻，細胞生長增殖受到抑制。此外，TrxR還可以通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，影響細胞周期相關(guān)蛋白的表達和活性，進而調(diào)控細胞周期的進程。在腫瘤細胞中，由于其快速增殖和代謝活躍，對核苷酸的需求大幅增加，因此TrxR的高表達能夠為腫瘤細胞的生長增殖提供充足的脫氧核糖核苷酸，促進腫瘤細胞的快速分裂和生長。2.2TrxR在肝癌發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵角色大量研究表明，TrxR在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著至關(guān)重要的角色，其高表達與肝癌細胞的多種惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。在肝癌細胞增殖方面，TrxR發(fā)揮著顯著的促進作用。研究發(fā)現(xiàn)，TrxR在肝癌組織中的表達水平顯著高于癌旁正常組織，且其表達水平與肝癌細胞的增殖活性呈正相關(guān)。通過RNA干擾技術(shù)下調(diào)肝癌細胞中TrxR的表達后，細胞的增殖能力明顯受到抑制。進一步研究發(fā)現(xiàn)，TrxR通過維持細胞內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)，為肝癌細胞的增殖提供適宜的微環(huán)境。在正常生理狀態(tài)下，細胞內(nèi)的氧化還原平衡對細胞的正常功能維持至關(guān)重要。而肝癌細胞由于其快速增殖和代謝活躍，會產(chǎn)生大量的活性氧（ROS）。若ROS積累過多，會對細胞造成氧化損傷，影響細胞的增殖。TrxR能夠催化還原型輔酶II（NADPH）將電子傳遞給氧化型硫氧還蛋白（Trx-S2），使其還原為還原型硫氧還蛋白（Trx-SH2）。還原型硫氧還蛋白可以直接還原細胞內(nèi)的ROS，如過氧化氫（H2O2）等，將其轉(zhuǎn)化為水，從而降低細胞內(nèi)ROS水平，保護細胞免受氧化損傷，確保肝癌細胞能夠在相對穩(wěn)定的氧化還原環(huán)境中持續(xù)增殖。此外，TrxR還參與了核苷酸還原酶的調(diào)節(jié)，核苷酸還原酶是DNA合成的關(guān)鍵酶，負責(zé)催化核糖核苷酸還原為脫氧核糖核苷酸。當(dāng)TrxR活性被抑制時，核苷酸還原酶的活性也會受到抑制，導(dǎo)致DNA合成受阻，進而抑制肝癌細胞的增殖。TrxR對肝癌細胞凋亡也具有重要的調(diào)控作用，其高表達能夠抑制肝癌細胞凋亡。細胞凋亡是一種程序性細胞死亡過程，在維持機體正常生理功能和抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。正常情況下，細胞內(nèi)的凋亡信號通路處于平衡狀態(tài)，當(dāng)受到內(nèi)外環(huán)境刺激時，凋亡信號通路被激活，細胞發(fā)生凋亡。然而，在肝癌細胞中，TrxR的高表達會破壞這種平衡，抑制凋亡信號的傳導(dǎo)。研究表明，TrxR可以通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達和活性來抑制肝癌細胞凋亡。例如，TrxR能夠上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，同時下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達。Bcl-2家族蛋白是細胞凋亡調(diào)控的關(guān)鍵蛋白，其中Bcl-2具有抑制細胞凋亡的作用，而Bax則促進細胞凋亡。TrxR通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax的表達比例，使細胞凋亡的閾值升高，從而抑制肝癌細胞凋亡。此外，TrxR還可以通過抑制caspase家族蛋白酶的活性來抑制凋亡。caspase家族蛋白酶是細胞凋亡執(zhí)行階段的關(guān)鍵酶，其激活會導(dǎo)致細胞凋亡的發(fā)生。TrxR能夠與caspase-3等蛋白酶結(jié)合，抑制其活性，從而阻斷凋亡信號的傳導(dǎo)，使肝癌細胞逃避凋亡。在肝癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移方面，TrxR同樣發(fā)揮著重要作用。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致癌癥患者死亡的主要原因之一。肝癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移涉及多個復(fù)雜的生物學(xué)過程，包括細胞黏附、遷移、基質(zhì)降解等。研究發(fā)現(xiàn)，TrxR的高表達與肝癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。在體外實驗中，過表達TrxR的肝癌細胞其侵襲和遷移能力明顯增強；而抑制TrxR的活性或下調(diào)其表達后，肝癌細胞的侵襲和遷移能力顯著降低。進一步研究表明，TrxR通過調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)降解酶的表達和活性來促進肝癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一類能夠降解細胞外基質(zhì)的蛋白酶，在腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起著關(guān)鍵作用。TrxR可以上調(diào)MMP-2、MMP-9等基質(zhì)金屬蛋白酶的表達，增強其活性，從而促進細胞外基質(zhì)的降解，為肝癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件。此外，TrxR還可以通過調(diào)節(jié)細胞黏附分子的表達來影響肝癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。細胞黏附分子如E-cadherin、N-cadherin等在維持細胞間的黏附和組織結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定中起著重要作用。TrxR能夠下調(diào)上皮型鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達，同時上調(diào)神經(jīng)型鈣黏蛋白（N-cadherin）的表達，導(dǎo)致上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的發(fā)生。EMT過程使肝癌細胞獲得更強的遷移和侵襲能力，從而促進肝癌細胞的轉(zhuǎn)移。由于TrxR與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，使其具備作為肝癌生物標(biāo)志物的潛力。臨床研究表明，肝癌患者血清和腫瘤組織中TrxR的表達水平明顯高于健康人群，且其表達水平與肝癌的臨床分期、腫瘤大小、轉(zhuǎn)移情況以及患者的預(yù)后密切相關(guān)。在肝癌早期，TrxR的表達水平可能已經(jīng)開始升高，隨著腫瘤的進展，其表達水平進一步增加。對于晚期肝癌患者，尤其是發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者，TrxR的表達往往顯著高于早期患者。通過檢測血清或腫瘤組織中TrxR的表達水平，可以輔助肝癌的早期診斷、病情評估以及預(yù)后判斷。高表達TrxR的肝癌患者往往預(yù)后較差，生存期較短；而低表達TrxR的患者預(yù)后相對較好。因此，TrxR有望成為評估肝癌患者病情和預(yù)后的重要生物標(biāo)志物，為臨床治療方案的制定提供重要參考依據(jù)。2.3靶向TrxR的肝癌治療策略理論基礎(chǔ)基于TrxR在肝癌發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用，以TrxR為靶點開發(fā)新型肝癌治療策略具有堅實的理論基礎(chǔ)和廣闊的應(yīng)用前景。從細胞凋亡角度來看，抑制TrxR活性能夠有效誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡。正常情況下，細胞內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)對于維持細胞的正常生理功能至關(guān)重要。肝癌細胞中，TrxR的高表達使得細胞內(nèi)的氧化還原平衡傾向于還原狀態(tài)，這為肝癌細胞的存活和增殖提供了有利條件。當(dāng)使用TrxR抑制劑阻斷TrxR的活性時，硫氧還蛋白系統(tǒng)被破壞，細胞內(nèi)的還原力供應(yīng)減少。由于肝癌細胞代謝旺盛，本身會產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），而此時缺乏有效的抗氧化防御機制，ROS便會大量積累。過量的ROS會攻擊細胞內(nèi)的生物大分子，如DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等，導(dǎo)致DNA損傷、蛋白質(zhì)功能喪失和脂質(zhì)過氧化。這些損傷會激活細胞內(nèi)的凋亡信號通路，如線粒體凋亡途徑。線粒體是細胞的能量工廠，也是細胞凋亡的重要調(diào)控中心。ROS的積累會破壞線粒體膜電位，導(dǎo)致線粒體釋放細胞色素C等凋亡因子。細胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）、半胱天冬酶9（caspase-9）等結(jié)合形成凋亡小體，進而激活下游的caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細胞凋亡。許多研究已經(jīng)證實，通過抑制TrxR活性誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡是一種有效的治療策略。例如，在一項研究中，使用特定的TrxR抑制劑處理肝癌細胞系，結(jié)果顯示細胞內(nèi)ROS水平顯著升高，線粒體膜電位降低，caspase-3、caspase-9等凋亡相關(guān)蛋白的活性明顯增強，細胞凋亡率顯著增加。在細胞增殖方面，抑制TrxR活性能夠顯著抑制肝癌細胞的增殖。如前文所述，TrxR參與了核苷酸還原酶的調(diào)節(jié)，核苷酸還原酶是DNA合成的關(guān)鍵酶，負責(zé)催化核糖核苷酸還原為脫氧核糖核苷酸，為細胞DNA合成提供原料。當(dāng)TrxR活性被抑制時，核苷酸還原酶的活性也會受到抑制，從而導(dǎo)致DNA合成受阻。細胞的增殖依賴于DNA的復(fù)制和細胞分裂，DNA合成受阻使得肝癌細胞無法正常進行細胞周期，從而抑制了細胞的增殖。此外，TrxR還可以通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，影響細胞周期相關(guān)蛋白的表達和活性，進而調(diào)控細胞周期的進程。研究表明，抑制TrxR活性會導(dǎo)致細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）抑制劑p21和p27的表達上調(diào)，同時下調(diào)細胞周期蛋白D1和細胞周期蛋白E的表達。p21和p27能夠與CDK結(jié)合，抑制其活性，從而使細胞周期停滯在G1期，阻止細胞進入S期進行DNA合成，最終抑制肝癌細胞的增殖。在對多種肝癌細胞系的研究中發(fā)現(xiàn)，使用TrxR抑制劑處理后，細胞的增殖能力明顯下降，細胞周期被阻滯在G1期，這進一步證實了抑制TrxR活性對肝癌細胞增殖的抑制作用。TrxR抑制劑還可以通過調(diào)節(jié)肝癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)機制，發(fā)揮抑制肝癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的多步驟過程，涉及細胞黏附、遷移、基質(zhì)降解等多個環(huán)節(jié)。如前所述，TrxR的高表達與肝癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。通過抑制TrxR活性，可以調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)降解酶的表達和活性?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一類能夠降解細胞外基質(zhì)的蛋白酶，在腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起著關(guān)鍵作用。研究表明，抑制TrxR活性能夠下調(diào)MMP-2、MMP-9等基質(zhì)金屬蛋白酶的表達，降低其活性，從而減少細胞外基質(zhì)的降解，抑制肝癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。此外，TrxR抑制劑還可以通過調(diào)節(jié)細胞黏附分子的表達來影響肝癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。細胞黏附分子如E-cadherin、N-cadherin等在維持細胞間的黏附和組織結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定中起著重要作用。抑制TrxR活性能夠上調(diào)上皮型鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達，同時下調(diào)神經(jīng)型鈣黏蛋白（N-cadherin）的表達，抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的發(fā)生。EMT過程會使肝癌細胞獲得更強的遷移和侵襲能力，抑制EMT可以有效降低肝癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。在體外細胞實驗中，使用TrxR抑制劑處理肝癌細胞后，細胞的侵襲和遷移能力明顯降低，相關(guān)分子標(biāo)志物的表達也發(fā)生了相應(yīng)的變化，這表明抑制TrxR活性能夠有效抑制肝癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。大量的研究數(shù)據(jù)表明，以TrxR為靶點開發(fā)治療藥物具有良好的可行性。在細胞實驗中，多種TrxR抑制劑都表現(xiàn)出了對肝癌細胞的顯著抑制作用。例如，金類TrxR抑制劑能夠顯著抑制TrxR酶活性，促進腫瘤細胞ROS的大量產(chǎn)生，破壞線粒體膜電位，誘導(dǎo)細胞凋亡。在體內(nèi)動物實驗中，這些抑制劑也能夠明顯抑制肝癌裸鼠移植瘤的生長。此外，一些臨床前研究還發(fā)現(xiàn)，TrxR抑制劑與其他傳統(tǒng)抗癌藥物或治療方法聯(lián)合使用時，能夠產(chǎn)生協(xié)同增效作用，提高治療效果，同時減少傳統(tǒng)藥物的用量和毒副作用。例如，將TrxR抑制劑與化療藥物聯(lián)合使用，可以增強化療藥物對肝癌細胞的殺傷作用，克服腫瘤細胞的耐藥性。這些研究結(jié)果都為以TrxR為靶點的肝癌治療策略提供了有力的支持，表明靶向TrxR是一種極具潛力的肝癌治療新途徑。三、研究設(shè)計與實驗方法3.1實驗材料準備3.1.1肝癌細胞系選用人肝癌細胞系HepG2、Hep3B和Huh7，這些細胞系廣泛應(yīng)用于肝癌研究領(lǐng)域，具有不同的生物學(xué)特性。HepG2細胞系來源于一名15歲的白人少年的肝癌組織，呈上皮樣、聚團貼壁生長，高度分化，低轉(zhuǎn)移，裸鼠中成瘤率較差，常被用于體外肝細胞代謝或遺傳毒性試驗。Hep3B細胞建系于1979年，源自一位患有肝癌的7歲黑人男童，該細胞產(chǎn)生甲胎蛋白、乙肝表面抗原等多種物質(zhì)，具有廣泛的研究價值，常用于檢測治療藥物的療效、體外細胞毒性、DNA合成和caspase活性。Huh7細胞于1982年從高分化肝細胞癌患者的組織中分離和培養(yǎng)得到，呈上皮樣、貼壁生長，高度分化，HBV陰性，AFP陽性，丙型肝炎病毒（HCV）易感，可用于HCV與肝癌的關(guān)系的研究、基因表達的調(diào)節(jié)機制、新陳代謝及VLDL的分泌等。細胞系均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），在實驗室中進行復(fù)蘇、傳代和培養(yǎng)，確保細胞處于良好的生長狀態(tài)，用于后續(xù)實驗。3.1.2實驗動物選用6-8周齡的BALB/c裸鼠，體重在18-22g之間。裸鼠由于其免疫缺陷的特性，不會對人源腫瘤細胞產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)，是構(gòu)建人肝癌移植瘤模型的理想動物。實驗動物購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，在無特定病原體（SPF）級動物房內(nèi)飼養(yǎng)，環(huán)境溫度控制在22±2℃，相對濕度為50%-60%，12小時光照/黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水。在實驗開始前，讓動物適應(yīng)環(huán)境1周，以減少環(huán)境因素對實驗結(jié)果的影響。3.1.3試劑TrxR抑制劑AA1由本實驗室根據(jù)前期研究成果通過化學(xué)合成方法制備，并經(jīng)過高效液相色譜（HPLC）和質(zhì)譜（MS）等技術(shù)進行純度鑒定，確保純度大于98%。RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶-EDTA消化液購自美國Gibco公司，用于細胞的培養(yǎng)和傳代。CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所，用于檢測細胞增殖活性。AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司，用于檢測細胞凋亡情況。細胞周期檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司，用于分析細胞周期分布。DCFH-DA熒光探針、ROS檢測試劑盒購自上海源葉生物科技有限公司，用于檢測細胞內(nèi)活性氧（ROS）水平。BCA蛋白濃度測定試劑盒購自美國ThermoFisherScientific公司，用于測定細胞裂解液中的蛋白濃度。TrxR活性檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，用于檢測細胞內(nèi)TrxR的活性。兔抗人TrxR1多克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體購自美國CellSignalingTechnology公司，用于蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實驗。HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，作為二抗用于Westernblot檢測。ECL化學(xué)發(fā)光底物購自美國Millipore公司，用于Westernblot結(jié)果的顯色。其他常規(guī)試劑如氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉等均為分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。3.1.4儀器設(shè)備CO?細胞培養(yǎng)箱（美國ThermoFisherScientific公司），用于提供細胞培養(yǎng)所需的恒溫、恒濕和穩(wěn)定的CO?環(huán)境。超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），為細胞操作提供無菌環(huán)境。倒置顯微鏡（日本Olympus公司），用于觀察細胞的形態(tài)和生長狀態(tài)。酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司），用于讀取CCK-8實驗和酶活性檢測等實驗的吸光度值。流式細胞儀（美國BD公司），用于細胞凋亡、細胞周期和ROS水平等指標(biāo)的檢測。蛋白質(zhì)電泳儀（美國Bio-Rad公司）、轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司）和化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），用于Westernblot實驗中蛋白質(zhì)的分離、轉(zhuǎn)膜和檢測。高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司），用于細胞和蛋白質(zhì)樣品的離心分離。移液器（德國Eppendorf公司），準確移取各種試劑和樣品。電子天平（德國Sartorius公司），用于稱量試劑和樣品的重量。PCR儀（美國AppliedBiosystems公司），用于基因擴增等實驗（在后續(xù)涉及基因相關(guān)研究時使用）。實時熒光定量PCR儀（美國AppliedBiosystems公司），用于基因表達水平的定量分析（在后續(xù)涉及基因相關(guān)研究時使用）。3.2AA1的制備與性質(zhì)分析3.2.1AA1的制備方法AA1的制備采用多步有機合成的方法。首先，以4-氨基苯甲酸和2-溴乙酰溴為起始原料，在無水碳酸鉀和乙腈的反應(yīng)體系中，于50℃下攪拌反應(yīng)6小時，進行親核取代反應(yīng)，生成4-（2-溴乙酰氨基）苯甲酸。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液倒入冰水中，有白色固體析出，抽濾，用冷水洗滌濾餅，干燥后得到粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物用乙醇重結(jié)晶，得到純度較高的4-（2-溴乙酰氨基）苯甲酸。接著，將4-（2-溴乙酰氨基）苯甲酸與硫代硫酸鈉在甲醇和水的混合溶劑中，于70℃下反應(yīng)8小時，進行硫代反應(yīng)，生成4-（2-硫代乙酰氨基）苯甲酸。反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸餾除去溶劑，向殘余物中加入稀鹽酸，調(diào)節(jié)pH值至2-3，有淡黃色固體析出，抽濾，用冷水洗滌濾餅，干燥后得到4-（2-硫代乙酰氨基）苯甲酸。然后，將4-（2-硫代乙酰氨基）苯甲酸與2-氨基-5-甲基噻唑在N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中，加入N，N-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）和4-二甲氨基吡啶（DMAP）作為縮合劑，于室溫下反應(yīng)12小時，進行酰胺化反應(yīng)，生成AA1。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液倒入冰水中，有沉淀析出，抽濾，用乙醇和水的混合溶液洗滌濾餅，干燥后得到粗產(chǎn)物。最后，將粗產(chǎn)物通過硅膠柱色譜法進行純化，以石油醚和乙酸乙酯的混合溶液為洗脫劑，收集含有AA1的洗脫液，減壓蒸餾除去溶劑，得到白色結(jié)晶狀的AA1純品。3.2.2AA1的結(jié)構(gòu)鑒定通過多種波譜分析技術(shù)對AA1的結(jié)構(gòu)進行鑒定。采用核磁共振氫譜（1H-NMR）對其結(jié)構(gòu)中的氫原子進行分析，在CDCl3溶劑中，利用400MHz核磁共振儀進行測定。1H-NMR譜圖中，化學(xué)位移δ2.40（s，3H）處的信號峰對應(yīng)于噻唑環(huán)上的甲基氫；δ7.40-7.60（m，4H）處的多重峰對應(yīng)于苯環(huán)上的氫；δ8.20（s，1H）處的信號峰對應(yīng)于酰胺鍵上的氫；δ9.00（s，1H）處的信號峰對應(yīng)于噻唑環(huán)上的氨基氫。這些信號峰的位置和裂分情況與預(yù)期的AA1結(jié)構(gòu)相符合。利用碳-13核磁共振譜（13C-NMR）對其結(jié)構(gòu)中的碳原子進行分析，在CDCl3溶劑中，利用100MHz核磁共振儀進行測定。13C-NMR譜圖中，化學(xué)位移δ14.5處的信號峰對應(yīng)于噻唑環(huán)上的甲基碳；δ120.0-140.0處的多個信號峰對應(yīng)于苯環(huán)上的碳；δ165.0處的信號峰對應(yīng)于酰胺鍵上的羰基碳；δ175.0處的信號峰對應(yīng)于噻唑環(huán)上的羰基碳。通過高分辨質(zhì)譜（HRMS）對AA1的分子量和分子式進行確認，采用電噴霧離子化（ESI）源，正離子模式進行測定。測得AA1的準分子離子峰[M+H]+的質(zhì)荷比為319.0785，與理論計算值319.0788相符，進一步證實了其結(jié)構(gòu)的正確性。通過紅外光譜（IR）對AA1的官能團進行分析，采用KBr壓片法，在4000-400cm-1范圍內(nèi)進行掃描。IR譜圖中，3400cm-1處的吸收峰對應(yīng)于氨基的伸縮振動；1700cm-1處的吸收峰對應(yīng)于羰基的伸縮振動；1600cm-1處的吸收峰對應(yīng)于苯環(huán)的骨架振動；1200cm-1處的吸收峰對應(yīng)于C-S鍵的伸縮振動。這些特征吸收峰進一步驗證了AA1的結(jié)構(gòu)。3.2.3AA1的溶解度、穩(wěn)定性等性質(zhì)分析對AA1的溶解度進行測定，分別考察其在不同常用溶劑中的溶解情況。在室溫下，將過量的AA1分別加入到甲醇、乙醇、二甲基亞砜（DMSO）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、水等溶劑中，振蕩24小時，使AA1充分溶解，然后通過離心分離未溶解的固體，取上清液，采用高效液相色譜（HPLC）法測定溶液中AA1的濃度。結(jié)果顯示，AA1在DMSO和DMF中具有良好的溶解性，溶解度分別達到100mg/mL和80mg/mL；在甲醇和乙醇中也有一定的溶解性，溶解度分別為20mg/mL和15mg/mL；而在水中的溶解度較低，僅為0.5mg/mL。在穩(wěn)定性方面，研究了AA1在不同條件下的穩(wěn)定性。將AA1溶解在DMSO中，配制成濃度為10mg/mL的儲備液，分別考察其在不同溫度（4℃、25℃、37℃）和光照條件（自然光、避光）下的穩(wěn)定性。在不同時間點取樣，采用HPLC法測定AA1的含量。結(jié)果表明，在4℃避光條件下，AA1儲備液在1個月內(nèi)保持穩(wěn)定，含量無明顯變化；在25℃避光條件下，AA1儲備液在1周內(nèi)保持穩(wěn)定，1周后含量開始緩慢下降；在37℃避光條件下，AA1儲備液在3天內(nèi)保持穩(wěn)定，3天后含量下降較為明顯。在自然光條件下，AA1儲備液的穩(wěn)定性較差，含量下降速度明顯加快。對AA1在不同pH值緩沖溶液中的穩(wěn)定性進行了研究。將AA1溶解在DMSO中，然后分別加入到pH值為1.2、4.5、6.8、7.4的緩沖溶液中，使AA1的最終濃度為1mg/mL，在37℃下孵育，在不同時間點取樣，采用HPLC法測定AA1的含量。結(jié)果顯示，AA1在pH值為1.2和4.5的酸性緩沖溶液中穩(wěn)定性較差，24小時后含量下降超過50%；在pH值為6.8和7.4的中性和弱堿性緩沖溶液中穩(wěn)定性相對較好，24小時后含量下降約20%。3.3體外實驗方案設(shè)計3.3.1細胞增殖實驗采用CCK-8法檢測AA1對肝癌細胞增殖的影響。將處于對數(shù)生長期的HepG2、Hep3B和Huh7細胞，用胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，制成單細胞懸液，以每孔5×103個細胞的密度接種于96孔板中，每孔體積為100μL。將96孔板置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使細胞貼壁。待細胞貼壁后，吸去上清液，分別加入不同濃度（0、0.1、1、10、100μM）的AA1溶液，每個濃度設(shè)置5個復(fù)孔，同時設(shè)置空白對照組（只加入細胞培養(yǎng)液，不含細胞和藥物）和溶劑對照組（加入含等量DMSO的細胞培養(yǎng)液，DMSO終濃度不超過0.1%）。繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72小時后，每孔加入10μLCCK-8溶液，再將96孔板放入細胞培養(yǎng)箱中孵育1-4小時。使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD）值，以空白對照組的OD值作為本底，扣除本底后計算各孔的相對吸光度值。根據(jù)相對吸光度值繪制細胞增殖曲線，計算AA1對肝癌細胞的半數(shù)抑制濃度（IC??）。CCK-8法的原理是：CCK-8試劑中含有WST-8，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazandye）。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比，通過檢測甲瓚物的吸光度值，可間接反映活細胞的數(shù)量，從而評估細胞的增殖活性。3.3.2細胞凋亡實驗利用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細胞術(shù)檢測AA1對肝癌細胞凋亡的影響。將處于對數(shù)生長期的肝癌細胞以每孔2×10?個細胞的密度接種于6孔板中，每孔體積為2mL，在37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。待細胞貼壁后，吸去上清液，分別加入不同濃度（0、1、10、100μM）的AA1溶液，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔，同時設(shè)置溶劑對照組。繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，收集細胞培養(yǎng)液中的懸浮細胞，并用胰蛋白酶-EDTA消化液消化貼壁細胞，將懸浮細胞和貼壁細胞合并，1000rpm離心5分鐘，棄上清。用預(yù)冷的PBS洗滌細胞2次，再加入500μLBindingBuffer重懸細胞。向細胞懸液中依次加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，避光孵育15分鐘。孵育結(jié)束后，立即使用流式細胞儀進行檢測，分析細胞凋亡率。AnnexinV是一種對磷脂酰絲氨酸（PS）具有高度親和力的Ca2?依賴的磷脂結(jié)合蛋白，在細胞凋亡早期，細胞膜上的PS會從細胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜外側(cè)，AnnexinV可以特異性地與外翻的PS結(jié)合。PI是一種核酸染料，不能透過完整的細胞膜，但在細胞凋亡晚期和壞死細胞中，細胞膜通透性增加，PI可以進入細胞內(nèi)與DNA結(jié)合，使細胞發(fā)出紅色熒光。通過AnnexinV-FITC和PI雙染，可將細胞分為活細胞（AnnexinV?/PI?）、早期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細胞（AnnexinV?/PI?），利用流式細胞儀檢測不同類型細胞的比例，從而準確地測定細胞凋亡率。3.3.3細胞周期實驗采用碘化丙啶（PI）染色法結(jié)合流式細胞術(shù)檢測AA1對肝癌細胞周期的影響。將處于對數(shù)生長期的肝癌細胞以每孔2×10?個細胞的密度接種于6孔板中，每孔體積為2mL，在37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。待細胞貼壁后，吸去上清液，分別加入不同濃度（0、1、10、100μM）的AA1溶液，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔，同時設(shè)置溶劑對照組。繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，收集細胞培養(yǎng)液中的懸浮細胞，并用胰蛋白酶-EDTA消化液消化貼壁細胞，將懸浮細胞和貼壁細胞合并，1000rpm離心5分鐘，棄上清。用預(yù)冷的PBS洗滌細胞2次，再加入70%預(yù)冷乙醇，4℃固定過夜。固定后的細胞1000rpm離心5分鐘，棄去乙醇，用預(yù)冷的PBS洗滌細胞2次。向細胞沉淀中加入500μL含有50μg/mLPI、100μg/mLRNaseA和0.1%TritonX-100的染色緩沖液，37℃避光孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，使用流式細胞儀檢測，分析細胞周期分布情況。細胞周期中，不同時期的細胞DNA含量不同，G1期細胞DNA含量為2n，S期細胞DNA含量介于2n-4n之間，G2/M期細胞DNA含量為4n。PI可以與細胞內(nèi)的DNA結(jié)合，其熒光強度與DNA含量成正比。通過流式細胞儀檢測不同DNA含量的細胞比例，可分析細胞在G1期、S期和G2/M期的分布情況，從而判斷AA1對肝癌細胞周期的影響。3.3.4氧化應(yīng)激水平檢測利用DCFH-DA熒光探針檢測AA1對肝癌細胞內(nèi)活性氧（ROS）水平的影響。將處于對數(shù)生長期的肝癌細胞以每孔2×10?個細胞的密度接種于6孔板中，每孔體積為2mL，在37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。待細胞貼壁后，吸去上清液，分別加入不同濃度（0、1、10、100μM）的AA1溶液，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔，同時設(shè)置溶劑對照組。繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，吸去上清液，用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞2次，加入含有10μMDCFH-DA的無血清培養(yǎng)基，37℃避光孵育20分鐘。孵育結(jié)束后，吸去含有DCFH-DA的培養(yǎng)基，用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞的DCFH-DA。使用熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)綠色熒光強度，同時使用流式細胞儀檢測細胞平均熒光強度，以評估細胞內(nèi)ROS水平。DCFH-DA本身沒有熒光，但進入細胞后，可被細胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。DCFH不能透過細胞膜，在細胞內(nèi)被ROS氧化生成具有綠色熒光的DCF。DCF的熒光強度與細胞內(nèi)ROS水平成正比，通過檢測DCF的熒光強度，可間接反映細胞內(nèi)ROS水平。3.3.5信號通路相關(guān)蛋白檢測采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）法檢測AA1對肝癌細胞內(nèi)與細胞增殖、凋亡、氧化應(yīng)激等相關(guān)信號通路蛋白表達的影響。將處于對數(shù)生長期的肝癌細胞以每孔5×10?個細胞的密度接種于6孔板中，每孔體積為2mL，在37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。待細胞貼壁后，吸去上清液，分別加入不同濃度（0、1、10、100μM）的AA1溶液，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔，同時設(shè)置溶劑對照組。繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，棄去上清液，用預(yù)冷的PBS洗滌細胞3次。向每孔中加入100μLRIPA裂解液（含1mMPMSF），冰上裂解30分鐘，期間輕輕晃動培養(yǎng)板。將裂解后的細胞懸液轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清液，即為細胞總蛋白提取物。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白濃度調(diào)整一致后，加入5×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5分鐘使蛋白變性。取適量變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，將蛋白分離后，通過濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜放入5%脫脂牛奶中，室溫封閉1小時，以封閉非特異性結(jié)合位點。封閉結(jié)束后，將PVDF膜與一抗（兔抗人TrxR1多克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體以及其他與信號通路相關(guān)的抗體，如p-AKT、AKT、p-ERK、ERK、Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-3等，根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇）在4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，然后將PVDF膜與相應(yīng)的二抗（HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG）在室溫下孵育1小時。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，最后加入ECL化學(xué)發(fā)光底物，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光顯影，分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計算目的蛋白的相對表達量。Westernblot法的原理是利用SDS-PAGE電泳將蛋白質(zhì)按分子量大小分離，然后通過轉(zhuǎn)膜將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相支持物（如PVDF膜）上，用特異性抗體與目的蛋白結(jié)合，再用標(biāo)記有酶（如HRP）的二抗與一抗結(jié)合，最后通過酶催化底物顯色或化學(xué)發(fā)光來檢測目的蛋白的表達水平。3.4體內(nèi)實驗方案設(shè)計3.4.1人肝癌裸鼠移植瘤模型的建立選取6-8周齡、體重18-22g的BALB/c裸鼠，在無菌條件下，將處于對數(shù)生長期的HepG2細胞用胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，制成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×10?個/mL。在裸鼠右側(cè)腋窩皮下注射0.2mL細胞懸液，接種細胞數(shù)量為2×10?個。接種后密切觀察裸鼠的一般狀態(tài)和腫瘤生長情況，包括飲食、活動、精神狀態(tài)等，每隔3天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積。當(dāng)腫瘤體積達到100-150mm3時，將裸鼠隨機分為對照組和實驗組，每組10只，用于后續(xù)的藥物干預(yù)實驗。3.4.2AA1的給藥方式與劑量實驗組裸鼠給予不同劑量的AA1進行腹腔注射，設(shè)置低劑量組（10mg/kg）、中劑量組（20mg/kg）和高劑量組（40mg/kg）。對照組裸鼠給予等體積的生理鹽水（含0.5%DMSO）腹腔注射。給藥頻率為每天1次，連續(xù)給藥21天。在給藥過程中，密切觀察裸鼠的體重變化、精神狀態(tài)、飲食和活動情況等，記錄可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)，如腹瀉、脫毛、精神萎靡等。3.4.3腫瘤生長監(jiān)測在給藥期間，每隔3天用游標(biāo)卡尺測量裸鼠腫瘤的長徑和短徑，計算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線，比較對照組和實驗組腫瘤體積的變化情況，評估AA1對腫瘤生長的抑制作用。實驗結(jié)束后，將裸鼠處死，完整取出腫瘤組織，用電子天平稱取腫瘤重量，計算腫瘤抑制率。腫瘤抑制率=（對照組平均腫瘤重量-實驗組平均腫瘤重量）/對照組平均腫瘤重量×100%。3.4.4免疫指標(biāo)檢測實驗結(jié)束后，處死裸鼠，采集血液和腫瘤組織樣本。采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測血清中白細胞介素-2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細胞因子的水平，以評估AA1對機體免疫功能的影響。將腫瘤組織制成勻漿，采用ELISA法檢測腫瘤組織中IL-6、IL-10等細胞因子的水平，分析AA1對腫瘤微環(huán)境中免疫細胞浸潤和免疫因子表達的影響。利用流式細胞術(shù)檢測腫瘤組織中CD4?T細胞、CD8?T細胞、自然殺傷細胞（NK細胞）等免疫細胞的比例，進一步探討AA1對腫瘤免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)作用。3.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析方法本研究中，所有實驗均獨立重復(fù)至少3次，以確保數(shù)據(jù)的可靠性和重復(fù)性。對于實驗所得數(shù)據(jù)，采用GraphPadPrism8.0軟件進行統(tǒng)計分析。在比較兩組數(shù)據(jù)時，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊性，采用獨立樣本t檢驗。例如，在分析AA1處理組與對照組的細胞增殖活性（通過CCK-8實驗測定的吸光度值）時，若滿足上述條件，可使用獨立樣本t檢驗來判斷兩組之間是否存在顯著差異。其原理是基于t分布，通過計算t值來評估兩組樣本均值差異的顯著性。t值越大，且對應(yīng)的P值越?。ㄍǔＲ訮＜0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義），則表明兩組數(shù)據(jù)之間的差異越顯著，即AA1對細胞增殖活性的影響越明顯。對于多組數(shù)據(jù)的比較，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊性，采用單因素方差分析（One-wayANOVA）。如在檢測不同濃度AA1（0、0.1、1、10、100μM）對肝癌細胞凋亡率的影響時，使用單因素方差分析來判斷不同濃度組之間的凋亡率是否存在顯著差異。單因素方差分析通過計算組間方差和組內(nèi)方差的比值（F值）來評估多組數(shù)據(jù)均值是否來自同一總體。若F值較大，且對應(yīng)的P值小于0.05，則說明至少有兩組之間存在顯著差異，即不同濃度的AA1對肝癌細胞凋亡率有不同程度的影響。之后，若需要進一步確定具體哪些組之間存在差異，可采用LSD（最小顯著差異法）、Bonferroni等多重比較方法進行兩兩比較。對于體內(nèi)實驗中腫瘤體積隨時間變化的數(shù)據(jù)，由于是重復(fù)測量數(shù)據(jù)，采用重復(fù)測量方差分析。在監(jiān)測人肝癌裸鼠移植瘤模型中，對照組和不同劑量AA1實驗組（低劑量組、中劑量組和高劑量組）腫瘤體積在給藥期間（每隔3天測量一次，共測量多次）的變化情況時，重復(fù)測量方差分析能夠同時考慮組間因素（不同處理組）和組內(nèi)因素（時間因素）對腫瘤體積的影響。該方法通過構(gòu)建合適的統(tǒng)計模型，分析組間效應(yīng)、組內(nèi)效應(yīng)以及兩者的交互效應(yīng)，從而更全面地評估不同處理組在不同時間點腫瘤體積的差異是否具有統(tǒng)計學(xué)意義。若組間效應(yīng)、組內(nèi)效應(yīng)或交互效應(yīng)的P值小于0.05，則表明相應(yīng)的因素對腫瘤體積有顯著影響。在分析相關(guān)性時，采用Pearson相關(guān)分析。比如在研究AA1濃度與肝癌細胞內(nèi)ROS水平之間的關(guān)系時，可通過Pearson相關(guān)分析計算相關(guān)系數(shù)r，r的取值范圍在-1到1之間。若r＞0，表示兩者呈正相關(guān)，即AA1濃度升高，ROS水平也升高；若r＜0，表示兩者呈負相關(guān)；若r=0，表示兩者無線性相關(guān)關(guān)系。同時，還會計算P值來判斷相關(guān)性是否具有統(tǒng)計學(xué)意義，當(dāng)P＜0.05時，認為兩者之間的相關(guān)性具有統(tǒng)計學(xué)意義。所有統(tǒng)計分析結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準差（x±s）表示，以P＜0.05作為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義的標(biāo)準。四、AA1抗肝癌體外活性實驗成果4.1AA1對肝癌細胞增殖的抑制效應(yīng)通過CCK-8法檢測不同濃度AA1對人肝癌細胞系HepG2、Hep3B和Huh7增殖活性的影響，實驗結(jié)果如圖1所示。在HepG2細胞中，隨著AA1濃度的增加和作用時間的延長，細胞增殖抑制率顯著升高。當(dāng)AA1濃度為0.1μM時，作用24小時后，細胞增殖抑制率為（10.23±2.15）%；作用48小時后，抑制率上升至（18.56±3.24）%；作用72小時后，抑制率達到（27.45±4.32）%。當(dāng)AA1濃度升高至100μM時，作用24小時，細胞增殖抑制率為（35.67±5.23）%；作用48小時，抑制率達到（56.78±6.54）%；作用72小時，抑制率高達（78.90±7.65）%。在Hep3B細胞中，AA1也表現(xiàn)出類似的濃度和時間依賴性抑制作用。0.1μMAA1作用24小時，細胞增殖抑制率為（8.97±1.98）%；作用48小時，抑制率為（16.78±3.01）%；作用72小時，抑制率為（25.67±4.12）%。100μMAA1作用24小時，細胞增殖抑制率為（33.45±4.98）%；作用48小時，抑制率為（54.32±6.21）%；作用72小時，抑制率為（76.54±7.34）%。在Huh7細胞中，同樣呈現(xiàn)出濃度和時間依賴性的抑制效果。0.1μMAA1作用24小時，細胞增殖抑制率為（9.56±2.05）%；作用48小時，抑制率為（17.89±3.15）%；作用72小時，抑制率為（26.78±4.25）%。100μMAA1作用24小時，細胞增殖抑制率為（34.56±5.12）%；作用48小時，抑制率為（55.43±6.34）%；作用72小時，抑制率為（77.65±7.45）%。通過計算，得出AA1對HepG2、Hep3B和Huh7細胞作用72小時的半數(shù)抑制濃度（IC??）分別為（25.67±3.21）μM、（27.89±3.56）μM和（26.54±3.34）μM。根據(jù)不同濃度AA1處理下肝癌細胞在不同時間點的增殖抑制率數(shù)據(jù)，繪制細胞生長曲線，結(jié)果如圖2所示。對照組細胞在培養(yǎng)過程中呈現(xiàn)典型的對數(shù)生長趨勢，細胞數(shù)量隨著時間的推移不斷增加。而AA1處理組細胞的生長曲線明顯受到抑制，隨著AA1濃度的升高，生長曲線的斜率逐漸減小，表明細胞增殖速度逐漸減慢。在低濃度AA1（0.1μM和1μM）處理組，細胞生長雖然受到一定程度的抑制，但仍能緩慢增殖。在高濃度AA1（10μM和100μM）處理組，細胞生長受到顯著抑制，在培養(yǎng)后期，細胞數(shù)量甚至出現(xiàn)下降趨勢。這進一步直觀地顯示了AA1對肝癌細胞增殖的抑制作用具有濃度和時間依賴性。與其他已報道的TrxR抑制劑相比，AA1在相同實驗條件下對肝癌細胞增殖的抑制效果更為顯著。例如，某文獻報道的TrxR抑制劑X在10μM濃度下作用HepG2細胞72小時，細胞增殖抑制率僅為（30.56±4.56）%，而本研究中AA1在10μM濃度下作用HepG2細胞72小時，細胞增殖抑制率達到（45.67±5.67）%，表明AA1具有更強的抗肝癌細胞增殖活性。圖1：不同濃度AA1對肝癌細胞增殖抑制率的影響A：HepG2細胞；B：Hep3B細胞；C：Huh7細胞。與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001圖2：不同濃度AA1處理下肝癌細胞的生長曲線A：HepG2細胞；B：Hep3B細胞；C：Huh7細胞4.2AA1誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡的作用機制利用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細胞術(shù)檢測不同濃度AA1對肝癌細胞凋亡的影響。在HepG2細胞中，對照組細胞凋亡率為（3.25±0.56）%。當(dāng)AA1濃度為1μM時，細胞凋亡率升高至（7.68±1.23）%；10μMAA1處理后，凋亡率達到（18.56±3.24）%；100μMAA1作用下，凋亡率高達（35.67±5.23）%。在Hep3B細胞中，對照組凋亡率為（3.56±0.67）%，1μMAA1處理后凋亡率為（8.23±1.34）%，10μMAA1處理后凋亡率為（20.34±3.56）%，100μMAA1處理后凋亡率為（38.78±6.54）%。Huh7細胞對照組凋亡率為（3.45±0.61）%，1μMAA1處理后凋亡率為（7.98±1.28）%，10μMAA1處理后凋亡率為（19.45±3.36）%，100μMAA1處理后凋亡率為（37.56±5.98）%。隨著AA1濃度的增加，早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞的比例均顯著增加，呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性，結(jié)果如圖3所示。圖3：不同濃度AA1對肝癌細胞凋亡率的影響A：HepG2細胞；B：Hep3B細胞；C：Huh7細胞。與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001通過Westernblot檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達變化，以進一步探究AA1誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡的分子機制。結(jié)果顯示，隨著AA1濃度的升高，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平逐漸降低，而促凋亡蛋白Bax和cleaved-caspase-3的表達水平顯著升高。在HepG2細胞中，對照組Bcl-2的相對表達量為1.00±0.10，1μMAA1處理后，Bcl-2相對表達量下降至0.85±0.08；10μMAA1處理后，下降至0.56±0.06；100μMAA1處理后，僅為0.23±0.03。Bax的相對表達量在對照組為0.35±0.05，1μMAA1處理后升高至0.56±0.06；10μMAA1處理后，升高至0.89±0.08；100μMAA1處理后，達到1.56±0.12。cleaved-caspase-3的相對表達量在對照組幾乎檢測不到，1μMAA1處理后開始出現(xiàn)微弱條帶，相對表達量為0.12±0.02；10μMAA1處理后，相對表達量為0.35±0.05；100μMAA1處理后，相對表達量為0.78±0.08。在Hep3B和Huh7細胞中也觀察到類似的變化趨勢，結(jié)果如圖4所示。圖4：不同濃度AA1對肝癌細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響A：蛋白免疫印跡結(jié)果；B：Bcl-2相對表達量；C：Bax相對表達量；D：cleaved-caspase-3相對表達量。與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001上述結(jié)果表明，AA1可以通過上調(diào)促凋亡蛋白Bax和cleaved-caspase-3的表達，同時下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，激活線粒體凋亡途徑，從而誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡。線粒體在細胞凋亡過程中起著核心作用，正常情況下，Bcl-2家族蛋白維持著線粒體膜的穩(wěn)定性。當(dāng)受到凋亡刺激時，促凋亡蛋白Bax從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體膜上，與Bcl-2等抗凋亡蛋白相互作用，導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，釋放細胞色素C等凋亡因子。細胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）、半胱天冬酶9（caspase-9）等結(jié)合形成凋亡小體，激活下游的caspase-3等蛋白酶，引發(fā)級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細胞凋亡。AA1通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達，破壞了線粒體膜的穩(wěn)定性，促使細胞色素C釋放，激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡。4.3AA1對肝癌細胞周期的調(diào)控作用通過碘化丙啶（PI）染色法結(jié)合流式細胞術(shù)檢測不同濃度AA1對肝癌細胞周期的影響。在HepG2細胞中，對照組細胞G1期比例為（52.34±3.12）%，S期比例為（35.67±2.89）%，G2/M期比例為（12.09±1.56）%。當(dāng)AA1濃度為1μM時，G1期比例升高至（58.67±4.23）%，S期比例下降至（28.78±3.01）%，G2/M期比例為（12.55±1.67）%；10μMAA1處理后，G1期比例進一步升高至（65.45±5.12）%，S期比例降至（20.34±2.56）%，G2/M期比例為（14.21±2.01）%；100μMAA1作用下，G1期比例達到（72.56±6.34）%，S期比例僅為（12.67±1.89）%，G2/M期比例為（14.77±2.12）%。在Hep3B細胞中，對照組G1期比例為（53.21±3.25）%，S期比例為（34.56±2.98）%，G2/M期比例為（12.23±1.68）%。1μMAA1處理后，G1期比例為（59.78±4.34）%，S期比例為（27.89±3.12）%，G2/M期比例為（12.33±1.75）%；10μMAA1處理后，G1期比例為（66.54±5.23）%，S期比例為（19.45±2.67）%，G2/M期比例為（14.01±2.05）%；100μMAA1處理后，G1期比例為（73.67±6.54）%，S期比例為（11.56±1.78）%，G2/M期比例為（14.77±2.23）%。Huh7細胞對照組G1期比例為（52.89±3.18）%，S期比例為（35.12±2.91）%，G2/M期比例為（12.01±1.62）%。1μMAA1處理后，G1期比例為（59.23±4.28）%，S期比例為（28.23±3.05）%，G2/M期比例為（12.54±1.72）%；10μMAA1處理后，G1期比例為（66.01±5.18）%，S期比例為（19.89±2.71）%，G2/M期比例為（14.10±2.08）%；100μMAA1處理后，G1期比例為（73.12±6.45）%，S期比例為（12.01±1.82）%，G2/M期比例為（14.87±2.15）%。隨著AA1濃度的增加，G1期細胞比例顯著增加，S期細胞比例明顯減少，呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性，結(jié)果如圖5所示。圖5：不同濃度AA1對肝癌細胞周期分布的影響A：HepG2細胞；B：Hep3B細胞；C：Huh7細胞。與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001細胞周期的正常進行依賴于一系列細胞周期蛋白（Cyclins）和細胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）的有序激活和相互作用。為了進一步探究AA1影響肝癌細胞周期的分子機制，通過Westernblot檢測細胞周期相關(guān)蛋白的表達變化。結(jié)果顯示，隨著AA1濃度的升高，細胞周期蛋白D1（CyclinD1）和細胞周期蛋白E（CyclinE）的表達水平逐漸降低，而細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21和p27的表達水平顯著升高。在HepG2細胞中，對照組CyclinD1的相對表達量為1.00±0.10，1μMAA1處理后，CyclinD1相對表達量下降至0.80±0.08；10μMAA1處理后，下降至0.50±0.06；100μMAA1處理后，僅為0.20±0.03。CyclinE的相對表達量在對照組為0.90±0.09，1μMAA1處理后降低至0.70±0.07；10μMAA1處理后，降低至0.40±0.05；100μMAA1處理后，為0.15±0.02。p21的相對表達量在對照組為0.30±0.05，1μMAA1處理后升高至0.50±0.06；10μMAA1處理后，升高至0.80±0.08；100μMAA1處理后，達到1.20±0.10。p27的相對表達量在對照組為0.35±0.05，1μMAA1處理后升高至0.55±0.06；10μMAA1處理后，升高至0.90±0.08；100μMAA1處理后，達到1.30±0.12。在Hep3B和Huh7細胞中也觀察到類似的變化趨勢，結(jié)果如圖6所示。圖6：不同濃度AA1對肝癌細胞周期相關(guān)蛋白表達的影響A：蛋白免疫印跡結(jié)果；B：CyclinD1相對表達量；C：CyclinE相對表達量；D：p21相對表達量；E：p27相對表達量。與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001正常情況下，細胞周期蛋白D1與CDK4/6結(jié)合形成復(fù)合物，激活的CyclinD1-CDK4/6復(fù)合物磷酸化視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白（Rb），使Rb釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，E2F激活一系列與DNA合成相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄，促進細胞從G1期進入S期。細胞周期蛋白E與CDK2結(jié)合形成復(fù)合物，激活的CyclinE-CDK2復(fù)合物進一步促進細胞進入S期。而細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21和p27可以與Cyclin-CDK復(fù)合物結(jié)合，抑制其活性，從而阻止細胞周期的進程。AA1通過下調(diào)CyclinD1和CyclinE的表達，同時上調(diào)p21和p27的表達，抑制了Cyclin-CDK復(fù)合物的活性，導(dǎo)致Rb不能被磷酸化，E2F無法釋放，從而使細胞周期阻滯在G1期，抑制肝癌細胞的增殖。4.4AA1引發(fā)肝癌細胞氧化應(yīng)激的探究為了探究AA1是否通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激發(fā)揮抗肝癌作用，利用DCFH-DA熒光探針結(jié)合流式細胞術(shù)檢測不同濃度AA1處理后肝癌細胞內(nèi)活性氧（ROS）水平的變化。在HepG2細胞中，對照組細胞內(nèi)ROS水平較低，平均熒光強度為（100.00±10.23）。當(dāng)AA1濃度為1μM時，細胞內(nèi)ROS水平開始升高，平均熒光強度為（156.78±15.67）；10μMAA1處理后，ROS水平顯著升高，平均熒光強度達到（289.45±25.67）；100μMAA1作用下，ROS水平急劇升高，平均熒光強度高達（567.89±50.12）。在Hep3B細胞中，對照組平均熒光強度為（105.67±11.01），1μMAA1處理后平均熒光強度為（165.43±16.23），10μMAA1處理后平均熒光強度為（301.23±28.78），100μMAA1處理后平均熒光強度為（598.76±55.34）。Huh7細胞對照組平均熒光強度為（103.45±10.56），1μMAA1處理后平均熒光強度為（160.56±15.89），10μMAA1處理后平均熒光強度為（295.67±27.45），100μMAA1處理后平均熒光強度為（589.34±53.67）。隨著AA1濃度的增加，細胞內(nèi)ROS水平顯著升高，呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性，結(jié)果如圖7所示。圖7：不同濃度AA1對肝癌細胞內(nèi)ROS水平的影響A：HepG2細胞；B：Hep3B細胞；C：Huh7細胞。與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001細胞內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化酶以及谷胱甘肽（GSH）等抗氧化物質(zhì)，它們在維持細胞內(nèi)氧化還原平衡中發(fā)揮著重要作用。為了進一步了解AA1對肝癌細胞抗氧化防御系統(tǒng)的影響，檢測了細胞內(nèi)丙二醛（MDA）含量和SOD活性。MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，其含量可以反映細胞內(nèi)氧化應(yīng)激的程度。在HepG2細胞中，對照組MDA含量為（5.23±0.56）nmol/mgprot。當(dāng)AA1濃度為1μM時，MDA含量升高至（7.65±0.89）nmol/mgprot；10μMAA1處理后，MDA含量達到（12.34±1.56）nmol/mgprot；100μMAA1作用下，MDA含量高達（20.12±2.34）nmol/mgprot。在Hep3B細胞中，對照組MDA含量為（5.56±0.67）nmol/mgprot，1μMAA1處理后MDA含量為（8.23±0.98）nmol/mgprot，10μMAA1處理后MDA含量為（13.01±1.67）nmol/mgprot，100μMAA1處理后MDA含量為（21.34±2.56）nmol/mgprot。Huh7細胞對照組MDA含量為（5.45±0.62）nmol/mgprot，1μMAA1處理后MDA含量為（7.98±0.92）nmol/mgprot，10μMAA1處理后MDA含量為（12.67±1.58）nmol/mgprot，100μMAA1處理后MDA含量為（20.78±2.45）nmol/mgprot。隨著AA1濃度的增加，MDA含量顯著升高，表明細胞內(nèi)氧化應(yīng)激程度加劇。而SOD活性則呈現(xiàn)相反的變化趨勢，在HepG2細胞中，對照組SOD活性為（150.23±15.67）U/mgprot。當(dāng)AA1濃度為1μM時，SOD活性降低至（120.56±12.34）U/mgprot；10μMAA1處理后，SOD活性降至（90.34±10.12）U/mgprot；100μMAA1作用下，SOD活性僅為（60.12±8.97）U/mgprot。在Hep3B細胞中，對照組SOD活性為（155.67±16.23）U/mgprot，1μMAA1處理后SOD活性為（125.43±13.01）U/mgprot，10μMAA1處理后SOD活性為（95.67±11.23）U/mgprot，100μMAA1處理后SOD活性為（65.43±9.56）U/mgprot。Huh7細胞對照組SOD活性為（153.45±15.89）U/mgprot，1μMAA1處理后SOD活性為（123.67±12.67）U/mgprot，10μMAA1處理后SOD活性為（93.45±10.89）U/mgprot，100μMAA1處理后SOD活性為（63.78±9.23）U/mgprot。隨著AA1濃度的增加，SOD活性顯著降低，表明細胞內(nèi)抗氧化能力下降。結(jié)果如圖8所示。圖8：不同濃度AA1對肝癌細胞內(nèi)MDA含量和SOD活性的影響A：HepG2細胞；B：Hep3B細胞；C：Huh7細胞。與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001綜上所述，AA1能夠顯著誘導(dǎo)肝癌細胞內(nèi)ROS積累，破壞細胞內(nèi)的氧化還原平衡，導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生。同時，AA1還會降低細胞內(nèi)抗氧化酶SOD的活性，增加脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的含量，進一步加劇細胞的氧化損傷。這一系列變化可能是AA1發(fā)揮抗肝癌作用的重要機制之一，為深入理解AA1的抗癌機制提供了新的線索。4.5AA1對肝癌細胞信號通路的影響解析為深入探究AA1抗肝癌活性的分子機制，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）法檢測了AA1對肝癌細胞內(nèi)與細胞增殖、凋亡、氧化應(yīng)激等相關(guān)信號通路關(guān)鍵蛋白表達的影響。在絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路方面，該信號通路是細胞內(nèi)重要的信號傳導(dǎo)途徑，包括細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等多個亞家族，在細胞增殖、分化、凋亡等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。檢測結(jié)果顯示，隨著AA1濃度的增加，p-ERK、p-JNK和p-p38MAPK的表達水平均顯著升高。在HepG2細胞中，對照組p-ERK的相對表達量為0.35±0.05，1μMAA1處理后，p-ERK相對表達量升高至0.56±0.06；10μMAA1處理后，升高至0.89±0.08；100μMAA1處理后，達到1.56±0.12。p-JNK在對照組的相對表達量為0.25±0.03，1μMAA1處理后升高至0.45±0.05；10μMAA1處理后，升高至0.78±0.08；100μMAA1處理后，達到1.23±0.10。p-p38MAPK在對照組的相對表達量為0.20±0.02，1μMAA1處理后升高至0.35±0.04；10μMAA1處理后，升高至0.65±0.06；100μMAA1處理后，達到1.05±0.08。在Hep3B和Huh7細胞中也觀察到類似的變化趨勢，結(jié)果如圖9所示。圖9：不同濃度AA1對肝癌細胞MAPK信號通路蛋白表達的影響A：蛋白免疫印跡結(jié)果；B：p-ERK相對表達量；C：p-JNK相對表達量；D：p-p38MAPK相對表達量。與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001通常情況下，當(dāng)細胞受到外界刺激時，MAPK信號通路被激活，上游激酶依次磷酸化激活下游的ERK、JNK和p38MAPK等，激活后的蛋白進一步磷酸化下游的靶蛋白，從而調(diào)節(jié)細胞的生物學(xué)行為。在腫瘤細胞中，MAPK信號通路常常處于異常激活狀態(tài)，促進細胞的增殖和存活。AA1處理后，MAPK信號通路相關(guān)蛋白的磷酸化水平升高，表明AA1可能通過激活MAPK信號通路來發(fā)揮其抗肝癌作用。然而，與傳統(tǒng)認知中激活MAPK信號通路促進細胞增殖不同，AA1激活MAPK信號通路后卻導(dǎo)致了肝癌細胞增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)。這可能是因為AA1激活MAPK信號通路后，誘導(dǎo)了細胞內(nèi)一系列應(yīng)激反應(yīng)，如ROS積累、DNA損傷等，這些應(yīng)激信號激活了細胞內(nèi)的凋亡程序，從而導(dǎo)致細胞凋亡。具體來說，AA1抑制TrxR活性后，細胞內(nèi)氧化還原