內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激：雙氫青蒿素誘導人肝癌HepG2細胞凋亡的關鍵紐帶一、引言1.1研究背景與意義肝癌是一種嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤，具有極高的發(fā)病率和死亡率。據(jù)統(tǒng)計，全球每年肝癌新發(fā)病例和死亡病例眾多，在我國，肝癌的發(fā)病率和病死率也均高于世界平均水平，給患者家庭和社會帶來了沉重的負擔。早期肝癌患者通過手術、肝移植等治療手段可能獲得較好的預后，但中晚期肝癌患者預后較差，現(xiàn)有治療方法如化療、放療、分子靶向治療等雖在一定程度上延長患者生存期，但往往伴隨著嚴重的副作用和耐藥問題，整體治療效果仍不理想，因此，尋找新型、高效且低毒的抗癌藥物成為肝癌治療領域的迫切需求。雙氫青蒿素（DHA）作為青蒿素的主要活性代謝產(chǎn)物，最初是作為高效低毒的抗瘧藥物被廣泛應用。近年來，其潛在的抗癌作用逐漸受到關注。大量研究表明，雙氫青蒿素對多種癌細胞株具有抑制作用，包括肝癌細胞，它能夠通過多種途徑誘導癌細胞凋亡，且對正常細胞影響較小，這使其成為極具潛力的抗癌候選藥物。然而，雙氫青蒿素誘導肝癌細胞凋亡的具體分子機制尚未完全明確，深入探究其作用機制對于開發(fā)基于雙氫青蒿素的肝癌治療新策略具有重要意義。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、折疊和修飾的重要場所，同時也參與細胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)的維持。當細胞受到各種刺激，如缺氧、氧化應激、營養(yǎng)缺乏等，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能會受到干擾，導致未折疊或錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)積累，從而引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（ERS）。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激是細胞應對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂的一種自我保護機制，但當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激持續(xù)存在或過度激活時，會啟動細胞凋亡程序。越來越多的研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療過程中發(fā)揮著重要作用，與腫瘤細胞的增殖、凋亡、耐藥等密切相關。在雙氫青蒿素誘導肝癌細胞凋亡的過程中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激是否參與其中以及如何發(fā)揮作用，目前尚不清楚。探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在雙氫青蒿素誘導人肝癌HepG2細胞凋亡中的作用，不僅有助于深入揭示雙氫青蒿素的抗癌機制，為其臨床應用提供更堅實的理論基礎，還可能為肝癌的治療提供新的靶點和思路，具有重要的理論意義和潛在的臨床應用價值。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1雙氫青蒿素的抗癌研究國外方面，美國國家癌癥研究所（NCI）較早將青蒿素類化合物納入抗癌藥物篩選與抗癌活性研究計劃。華盛頓大學科研人員發(fā)現(xiàn)青蒿素對癌細胞有殺滅作用，將乳腺癌細胞和青蒿素接觸16小時后，癌細胞幾乎全部死亡，且對正常細胞影響小。后續(xù)研究進一步探索雙氫青蒿素對多種癌細胞的作用，如Chen等報道DHA對體外培養(yǎng)的結(jié)腸癌、前列腺癌、黑色素瘤、乳腺癌和白血病細胞株高度敏感，而對非小細胞肺癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、卵巢癌和腎癌細胞株的活性較低。國內(nèi)對雙氫青蒿素抗癌研究也取得眾多成果。上海交通大學醫(yī)學院王慧教授團隊在雙氫青蒿素抗癌機制研究方面成果顯著，首次指出雙氫青蒿素抗癌靶點（PDGFRα）和潛在敏感人群（PDGFRα陽性腫瘤患者），系統(tǒng)闡明了雙氫青蒿素通過靶向PDGFRα促進其泛素化降解，進而選擇性抑制PDGFRα陽性腫瘤細胞生長、轉(zhuǎn)移和上皮—間葉形態(tài)轉(zhuǎn)換的分子機制。此外，國內(nèi)研究還發(fā)現(xiàn)雙氫青蒿素能顯著抑制人肝癌細胞生長，對正常細胞影響較小，如李赟等人用四甲基偶氮唑藍法考察發(fā)現(xiàn)雙氫青蒿素對人肝癌細胞增殖有抑制作用。1.2.2內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與細胞凋亡的研究國外研究較早揭示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激啟動細胞凋亡的機制，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導細胞凋亡至少包括非折疊蛋白反應（UPR）和鈣離子起始信號兩種機制。非折疊蛋白反應中，非折疊蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白Bip/Grp78結(jié)合，競爭性干擾Bip/Grp78與跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶-Ire1α的相互作用，Ire1α激活后可招募TRAF2，激活JNK途徑，導致細胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激還能激活PERK和ATF6，PERK磷酸化eIF2α使蛋白合成下調(diào)，ATF6裂解后移位到細胞核，激活相關基因，其中CHOP基因激活可降低Bcl-2表達，引發(fā)細胞凋亡。在鈣離子起始信號機制中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣離子濃度，當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激時，鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡，可作為促凋亡信使啟動細胞凋亡信號。國內(nèi)在該領域也有深入研究，例如西北農(nóng)林科技大學研究團隊通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導劑衣霉素（TM）和抑制劑4-苯基丁酸（4-PBA）在宰后雞肉中建立內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激模型，探究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可促進宰后成熟過程中細胞凋亡，改善雞肉嫩度。華中科技大學劉劍峰研究團隊發(fā)現(xiàn)PKD1在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激條件下通過維持IRE1蛋白穩(wěn)定，促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激所介導的IRE1/XBP1通路活性確保細胞保護效應，同時通過MKP1抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激條件下促細胞凋亡的IRE1/JNK信號通路，揭示了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激信號調(diào)控細胞凋亡及存活的新機制。1.2.3內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在雙氫青蒿素誘導肝癌細胞凋亡中作用的研究目前，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在雙氫青蒿素誘導肝癌細胞凋亡中作用的研究相對較少，但已逐漸引起關注。國內(nèi)外研究主要集中在雙氫青蒿素誘導肝癌細胞凋亡的其他機制以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與其他抗癌藥物誘導肝癌細胞凋亡的關系上，對于二者直接關聯(lián)的研究尚處于探索階段。部分研究初步表明，雙氫青蒿素可能通過影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，干擾細胞內(nèi)蛋白質(zhì)折疊和鈣離子穩(wěn)態(tài)，從而引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，激活相關凋亡信號通路誘導肝癌細胞凋亡，但具體分子機制尚未完全明確，有待進一步深入研究。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在雙氫青蒿素誘導人肝癌HepG2細胞凋亡過程中的具體作用機制，為進一步揭示雙氫青蒿素的抗癌機制提供理論依據(jù)，同時也為肝癌的治療提供新的潛在靶點和治療思路。具體研究內(nèi)容如下：雙氫青蒿素對人肝癌HepG2細胞增殖和凋亡的影響：通過MTT實驗、CCK-8實驗等方法，檢測不同濃度雙氫青蒿素作用于人肝癌HepG2細胞不同時間后的細胞增殖抑制率，繪制細胞生長曲線，確定雙氫青蒿素對HepG2細胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）。利用流式細胞術檢測細胞凋亡率，通過Hoechst33342染色、AnnexinV-FITC/PI雙染等方法觀察細胞凋亡形態(tài)學變化，明確雙氫青蒿素對HepG2細胞凋亡的誘導作用。雙氫青蒿素誘導人肝癌HepG2細胞凋亡過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的激活：采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關標志分子，如葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）、CCAAT/增強子結(jié)合蛋白同源蛋白（CHOP）、肌醇需求酶1α（IRE1α）等mRNA的表達水平變化。運用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測上述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白的表達情況，同時檢測剪接型X盒結(jié)合蛋白1（XBP1s）的表達，進一步驗證內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激是否被激活。此外，通過免疫熒光染色技術觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白在細胞內(nèi)的定位和表達變化。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在雙氫青蒿素誘導人肝癌HepG2細胞凋亡中的作用：使用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激抑制劑（如4-苯基丁酸，4-PBA）預處理HepG2細胞，再加入雙氫青蒿素，通過MTT實驗、流式細胞術等檢測細胞增殖和凋亡情況，觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激被抑制后，雙氫青蒿素對HepG2細胞凋亡誘導作用的變化。利用RNA干擾技術（RNAi）沉默內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激關鍵信號分子（如IRE1α、PERK等）的表達，然后給予雙氫青蒿素處理，檢測細胞凋亡相關指標，深入探究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在雙氫青蒿素誘導細胞凋亡中的作用機制。同時，檢測相關凋亡信號通路蛋白（如Caspase-12、Caspase-3、Bcl-2家族等）的表達變化，明確內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導雙氫青蒿素誘導細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導途徑。1.4研究方法與技術路線1.4.1研究方法細胞培養(yǎng)與處理：人肝癌HepG2細胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長至對數(shù)期時，進行后續(xù)實驗處理。雙氫青蒿素用二甲基亞砜（DMSO）溶解配制成高濃度儲存液，實驗時用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度，同時設置DMSO對照組，確保DMSO濃度不超過0.1%，以排除其對細胞的影響。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激抑制劑4-苯基丁酸（4-PBA）也用DMSO溶解，按相應實驗設計進行預處理。細胞增殖實驗：采用MTT實驗和CCK-8實驗檢測雙氫青蒿素對HepG2細胞增殖的影響。將對數(shù)期的HepG2細胞以適當密度接種于96孔板中，每孔加入100μL細胞懸液。培養(yǎng)24h后，分別加入不同濃度的雙氫青蒿素（如0、5、10、20、40、80μmol/L），每個濃度設置5個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h和72h后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL）或10μLCCK-8試劑，孵育一定時間后，用酶標儀在特定波長下測定吸光度值，計算細胞增殖抑制率，繪制細胞生長曲線，確定雙氫青蒿素的半數(shù)抑制濃度（IC50）。細胞凋亡檢測：通過流式細胞術、Hoechst33342染色和AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡。流式細胞術檢測時，將處理后的HepG2細胞收集，用預冷的PBS洗滌2次，加入結(jié)合緩沖液重懸細胞，再加入AnnexinV-FITC和PI染色液，避光孵育15min后，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。Hoechst33342染色時，將細胞接種于24孔板中，處理后用4%多聚甲醛固定，加入Hoechst33342染色液，染色10min，在熒光顯微鏡下觀察細胞核形態(tài)變化，判斷細胞凋亡情況。AnnexinV-FITC/PI雙染后，在熒光顯微鏡下觀察，早期凋亡細胞呈現(xiàn)綠色熒光，晚期凋亡和壞死細胞呈現(xiàn)紅綠雙染熒光。實時熒光定量PCR（qRT-PCR）：提取不同處理組HepG2細胞的總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，利用特異性引物進行qRT-PCR擴增，檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關標志分子（如GRP78、CHOP、IRE1α等）和凋亡相關基因的mRNA表達水平。以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量，分析雙氫青蒿素處理后相關基因表達的變化情況。蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）：收集細胞并裂解，提取總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將等量的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分離，然后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1h后，加入相應的一抗（如抗GRP78、抗CHOP、抗IRE1α、抗XBP1s、抗Caspase-12、抗Caspase-3、抗Bcl-2、抗Bax等抗體），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10min，再加入相應的二抗，室溫孵育1h。最后用化學發(fā)光試劑顯影，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，分析蛋白表達水平的變化。免疫熒光染色：將HepG2細胞接種于預先放置有蓋玻片的24孔板中，處理后用4%多聚甲醛固定，0.1%TritonX-100通透，5%BSA封閉。加入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白的一抗，4℃孵育過夜。次日，用PBS洗滌3次，加入熒光標記的二抗，室溫避光孵育1h。再用DAPI染核5min，最后用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白在細胞內(nèi)的定位和表達變化。RNA干擾技術（RNAi）：針對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激關鍵信號分子（如IRE1α、PERK等）設計并合成特異性的小干擾RNA（siRNA）。將HepG2細胞接種于6孔板中，當細胞密度達到70%-80%時，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將siRNA轉(zhuǎn)染至細胞中。轉(zhuǎn)染48h后，通過qRT-PCR和Westernblot檢測目的基因的沉默效率，確認沉默成功后，給予雙氫青蒿素處理，檢測細胞凋亡相關指標，探究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激關鍵信號分子沉默對雙氫青蒿素誘導細胞凋亡的影響。1.4.2技術路線本研究的技術路線如圖1-1所示。首先進行細胞培養(yǎng)，獲取人肝癌HepG2細胞并培養(yǎng)至對數(shù)期。然后進行雙氫青蒿素對HepG2細胞增殖和凋亡影響的實驗，通過MTT、CCK-8實驗檢測細胞增殖抑制率，利用流式細胞術、Hoechst33342染色和AnnexinV-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡情況。接著檢測雙氫青蒿素誘導HepG2細胞凋亡過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的激活，通過qRT-PCR、Westernblot和免疫熒光染色檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關標志分子的表達和定位變化。最后探究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在雙氫青蒿素誘導HepG2細胞凋亡中的作用，使用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激抑制劑預處理和RNAi沉默內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激關鍵信號分子，再給予雙氫青蒿素處理，檢測細胞增殖和凋亡相關指標，分析內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在雙氫青蒿素誘導細胞凋亡中的作用機制。[此處插入技術路線圖1-1，圖中清晰展示從細胞培養(yǎng)開始，到各項實驗檢測，以及各步驟之間的邏輯關系和流程走向]二、相關理論基礎2.1內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激概述2.1.1內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)構與功能內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（EndoplasmicReticulum，ER）是真核細胞中由一層單位膜構成的復雜的囊狀、泡狀和管狀的網(wǎng)膜系統(tǒng)，廣泛分布于細胞質(zhì)中，通常占細胞的生物膜系統(tǒng)的一半左右，占細胞體積的10%以上。根據(jù)其膜外表面有無核糖體存在，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可分為粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（RoughEndoplasmicReticulum，RER）和光滑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（SmoothEndoplasmicReticulum，SER）兩種類型。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)多呈大的扁平膜泡，排列整齊，因其網(wǎng)膜胞質(zhì)面附著有大量核糖體顆粒而得名。核糖體是蛋白質(zhì)合成的關鍵場所，因此粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)主要與外輸性蛋白質(zhì)及多種膜蛋白的合成、加工及轉(zhuǎn)運有關。在具有分泌肽類激素或蛋白質(zhì)功能的細胞中，如胰腺細胞能合成并分泌大量的消化酶，漿細胞可產(chǎn)生抗體，這些細胞中的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)非常發(fā)達；而在未分化或低分化的細胞中，像胚胎細胞和腫瘤細胞，其蛋白質(zhì)合成需求相對較低，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)則相對不發(fā)達。光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在電鏡下呈現(xiàn)為光滑的小管、小泡樣網(wǎng)狀結(jié)構，常與粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相互連通。它是一種多功能的細胞器，在不同細胞、同一細胞的不同發(fā)育階段或不同生理時期，其形態(tài)結(jié)構、數(shù)量、細胞內(nèi)空間分布及發(fā)達程度存在顯著差異，并表現(xiàn)出不同的功能特性。例如，在睪丸間質(zhì)細胞、卵巢黃體細胞及腎上腺皮質(zhì)細胞中，光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)大量存在，這與它們合成類固醇激素的功能密切相關；肝細胞中豐富的光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)則與其強大的解毒功能有關，能夠幫助細胞代謝和清除有毒物質(zhì)；在平滑肌和橫紋肌中，光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特化為肌質(zhì)網(wǎng)，通過儲存及釋放Ca2?來調(diào)節(jié)肌肉的收縮。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在細胞中發(fā)揮著多種重要功能。在蛋白質(zhì)合成與轉(zhuǎn)運方面，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為核糖體提供了附著位點，新合成的蛋白質(zhì)進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔進行初步加工和折疊，隨后通過囊泡運輸至高爾基體等其他部位。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)還參與蛋白質(zhì)的修飾過程，如N-連接糖基化，即在蛋白質(zhì)上添加糖鏈，這對于蛋白質(zhì)的正確折疊、穩(wěn)定性和功能發(fā)揮具有重要作用。在脂質(zhì)代謝方面，光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是脂質(zhì)合成的重要場所，可合成磷脂、膽固醇等脂質(zhì)，這些脂質(zhì)不僅是細胞膜的重要組成成分，還參與細胞內(nèi)的信號傳導等過程。此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在碳水化合物代謝中也有一定作用，例如肝細胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)參與糖原的合成與分解。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)還具有解毒功能，肝細胞中的光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)含有豐富的酶系，能夠?qū)⒃S多有害物質(zhì)，如藥物、毒物等進行氧化、還原、水解等化學反應，使其轉(zhuǎn)化為水溶性物質(zhì)，便于排出體外。在肌肉細胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特化為肌質(zhì)網(wǎng)，能夠儲存大量的Ca2?。當肌肉接收到收縮信號時，肌質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2?，觸發(fā)肌肉收縮；收縮結(jié)束后，肌質(zhì)網(wǎng)又將Ca2?重新攝取回來，使肌肉舒張，從而實現(xiàn)對肌肉收縮的精確調(diào)節(jié)。2.1.2內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的概念與誘導因素內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（EndoplasmicReticulumStress，ERS）是指當細胞受到多種內(nèi)外源因素刺激時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定被破壞，導致蛋白質(zhì)的正常折疊和修飾過程受到干擾，未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)大量積聚，同時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣穩(wěn)態(tài)也發(fā)生失衡，從而引發(fā)細胞內(nèi)一系列信號級聯(lián)反應的狀態(tài)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常執(zhí)行其功能的基本前提，然而，眾多因素能夠打破這種穩(wěn)態(tài)，進而引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。缺氧是常見的誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的因素之一。在缺氧條件下，細胞的能量代謝受到抑制，影響了蛋白質(zhì)合成所需的能量供應，導致蛋白質(zhì)合成和折疊過程出現(xiàn)異常。例如，在缺血再灌注損傷中，組織器官在缺血階段處于缺氧狀態(tài)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能受損，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，當恢復血液灌注后，會進一步加重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的程度，對細胞造成更大的損傷。氧化應激也是引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的重要原因。細胞內(nèi)的氧化還原平衡失調(diào)，產(chǎn)生過多的活性氧（ReactiveOxygenSpecies，ROS），如超氧陰離子（O??）、過氧化氫（H?O?）和羥自由基（?OH）等。這些ROS會攻擊內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)構和功能，導致蛋白質(zhì)錯誤折疊和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)失衡。例如，在神經(jīng)退行性疾病中，氧化應激產(chǎn)生的ROS可誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，進而引發(fā)神經(jīng)元的凋亡。鈣穩(wěn)態(tài)失衡同樣能夠誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞內(nèi)重要的鈣儲存庫，對維持細胞內(nèi)鈣離子濃度的穩(wěn)定起著關鍵作用。當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣代謝紊亂時，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵功能異常，導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣離子釋放增加或攝取減少，會使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣離子濃度異常，影響蛋白質(zhì)的折疊和修飾過程，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。例如，某些藥物或毒素可干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣代謝，導致鈣穩(wěn)態(tài)失衡，從而誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。此外，細胞營養(yǎng)物質(zhì)缺乏，如葡萄糖饑餓和氨基酸饑餓，會使蛋白質(zhì)及核苷酸的生物合成受到阻礙，代表一種代謝壓力，可引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。影響蛋白質(zhì)翻譯后修飾的因素，如還原物質(zhì)二硫基蘇糖醇（DTT）、β-巰基乙醇（β-ME）、同型半胱氨酸，以及糖基化抑制劑衣霉素、葡萄糖胺、2-脫氧葡萄糖等，會干擾蛋白質(zhì)的正常修飾過程，導致未折疊或錯誤折疊蛋白積累，從而引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。突變基因表達的結(jié)構異常蛋白在ER堆積，以及細胞病毒感染等有害因素，也都可能破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能，誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的發(fā)生。2.1.3內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的信號通路當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激發(fā)生時，細胞會啟動一系列信號通路來應對這種應激狀態(tài)，以恢復內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能或決定細胞的命運。其中，未折疊蛋白反應（UnfoldedProteinResponse，UPR）是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激最重要的信號通路之一。在正常生理狀態(tài)下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的免疫球蛋白結(jié)合蛋白（BiP，也稱為GRP78）與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白肌醇需求酶1α（IRE1α）、蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）和活化轉(zhuǎn)錄因子6（ATF6）結(jié)合，使其處于非活化狀態(tài)。當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激發(fā)生，未折疊或錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)積聚時，這些蛋白會與BiP結(jié)合，導致BiP從IRE1α、PERK和ATF6上解離下來，從而激活這三條信號通路。PERK-eIF2α通路是UPR的重要組成部分。PERK是一種位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的I型膜蛋白，其N端可感受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激信號。在應激狀態(tài)下，PERK發(fā)生二聚化并自磷酸化而激活，激活后的PERK能夠特異性地磷酸化真核起始因子2α（eIF2α）的51位絲氨酸。磷酸化的eIF2α會抑制蛋白質(zhì)合成的起始階段，從而減少新合成蛋白質(zhì)的數(shù)量，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的負擔。同時，磷酸化的eIF2α還可以促進活化轉(zhuǎn)錄因子4（ATF4）的翻譯。ATF4作為一種轉(zhuǎn)錄因子，進入細胞核后，可調(diào)控一系列基因的表達，這些基因參與氨基酸代謝、細胞氧化還原平衡調(diào)節(jié)、抗應激反應等過程。例如，ATF4可上調(diào)CCAAT/增強子結(jié)合蛋白同源蛋白（CHOP）的表達，CHOP在細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用，當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激持續(xù)且無法緩解時，CHOP的高表達可誘導細胞凋亡。IRE1-XBP1通路也是UPR的關鍵信號通路。IRE1α在哺乳動物細胞中廣泛存在，是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白，具有蛋白激酶和核酸內(nèi)切酶活性。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激時，IRE1α與BiP解離并發(fā)生寡聚化和自磷酸化而激活。激活后的IRE1α利用其核酸內(nèi)切酶活性，特異性地剪接X盒結(jié)合蛋白1（XBP1）的mRNA。XBP1mRNA經(jīng)過剪接后，閱讀框發(fā)生改變，翻譯出具有活性的剪接型XBP1（XBP1s）。XBP1s是一種轉(zhuǎn)錄因子，進入細胞核后，可結(jié)合到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應元件（ERSE）上，調(diào)控一系列靶基因的表達。這些靶基因包括參與蛋白質(zhì)折疊、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關蛋白降解（ERAD）、脂質(zhì)合成等過程的基因。例如，XBP1s可上調(diào)分子伴侶蛋白的表達，增強內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對蛋白質(zhì)的折疊能力；還可促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關蛋白降解途徑中相關基因的表達，加速錯誤折疊蛋白的降解，從而緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。除了PERK-eIF2α通路和IRE1-XBP1通路，ATF6通路在未折疊蛋白反應中也發(fā)揮著重要作用。ATF6是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的II型膜蛋白，哺乳動物細胞中有ATF6α和ATF6β兩種亞型。在非應激狀態(tài)下，ATF6與BiP結(jié)合，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激發(fā)生時，ATF6與BiP解離，然后轉(zhuǎn)移到高爾基體。在高爾基體中，ATF6被蛋白酶S1P和S2P依次切割，產(chǎn)生具有活性的N端片段。活化的ATF6進入細胞核，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應元件、未折疊蛋白反應元件等順式作用元件結(jié)合，調(diào)控相關基因的表達。這些基因包括編碼分子伴侶、折疊酶、ERAD相關蛋白等，有助于增強內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)折疊和處理能力，緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。同時，ATF6也可調(diào)控CHOP等與細胞凋亡相關基因的表達，在應激過度時啟動細胞凋亡程序。2.2細胞凋亡概述2.2.1細胞凋亡的概念與特征細胞凋亡（Apoptosis）是一種由基因調(diào)控的細胞自主性、程序性死亡過程，在維持多細胞生物體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、胚胎發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)和免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著至關重要的作用。與細胞壞死不同，細胞凋亡并非是由于外界劇烈損傷或病理因素導致的被動性死亡，而是細胞主動參與并遵循特定程序的死亡方式。細胞凋亡這一概念最早由Kerr等人于1972年提出，他們在研究中觀察到一種與壞死截然不同的細胞死亡形式，細胞呈現(xiàn)出特定的形態(tài)學變化，如細胞皺縮、染色質(zhì)凝聚等，隨后這一現(xiàn)象被命名為“細胞凋亡”。在形態(tài)學上，細胞凋亡具有一系列典型特征。首先，細胞體積會明顯縮小，細胞表面的微絨毛減少或消失，細胞與周圍細胞的連接逐漸喪失，呈現(xiàn)出細胞皺縮的狀態(tài)。細胞核也會發(fā)生顯著變化，染色質(zhì)高度凝聚，邊緣化分布于核膜內(nèi)側(cè)，形成致密的塊狀結(jié)構。隨著凋亡進程的推進，細胞核會進一步裂解，形成多個由膜包裹的凋亡小體，這些凋亡小體中包含有濃縮的染色質(zhì)片段和細胞器等成分。最終，凋亡小體會被周圍的吞噬細胞識別并吞噬清除，不會引發(fā)炎癥反應。細胞凋亡還伴隨著一系列生化特征的改變。DNA斷裂是細胞凋亡的重要生化標志之一，在凋亡過程中，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活，它們會將染色體DNA在核小體間的連接部位切斷，形成180-200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段。通過瓊脂糖凝膠電泳，可以觀察到這些片段呈現(xiàn)出典型的“梯狀”條帶，這是細胞凋亡區(qū)別于壞死的重要特征之一。在細胞凋亡早期，細胞膜的磷脂酰絲氨酸（PS）會從細胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到外側(cè)。PS的外翻是細胞凋亡的早期事件，可被AnnexinV特異性識別并結(jié)合。利用AnnexinV-FITC/PI雙染法，通過流式細胞術或熒光顯微鏡檢測，可以區(qū)分早期凋亡細胞（AnnexinV陽性、PI陰性）、晚期凋亡細胞（AnnexinV陽性、PI陽性）和壞死細胞（AnnexinV陰性、PI陽性）。此外，細胞凋亡過程中還伴隨著一系列凋亡相關蛋白的激活和表達變化，如Caspase家族蛋白酶的激活，這些蛋白酶在細胞凋亡的信號傳導和執(zhí)行過程中發(fā)揮著關鍵作用。2.2.2細胞凋亡的信號傳導通路細胞凋亡的信號傳導通路是一個復雜而精細的調(diào)控網(wǎng)絡，主要包括死亡受體途徑、線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激途徑等，這些通路相互關聯(lián)、協(xié)同作用，共同決定細胞的生死命運。死亡受體途徑是細胞凋亡的外源性通路，主要由死亡受體及其配體相互作用啟動。死亡受體是一類跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族，其胞外區(qū)含有富含半胱氨酸的結(jié)構域，胞內(nèi)區(qū)則含有一段高度保守的死亡結(jié)構域（DeathDomain，DD）。常見的死亡受體包括Fas（CD95/Apo-1）、腫瘤壞死因子受體1（TNFR1）、DR3、DR4和DR5等，它們的配體分別為FasL、TNF、Apo-3L、Apo-2L（TRAIL）和Apo-2L（TRAIL）。以Fas/FasL信號途徑為例，當FasL與Fas結(jié)合后，F(xiàn)as會發(fā)生三聚化，使胞內(nèi)的DD區(qū)構象改變。改變構象的DD區(qū)能夠招募Fas相關死亡結(jié)構域蛋白（FADD），F(xiàn)ADD通過其N端的死亡效應結(jié)構域（DED）與Caspase-8（或Caspase-10）前體蛋白結(jié)合，形成死亡誘導信號復合物（DISC）。在DISC中，Caspase-8（或Caspase-10）通過自身剪激活，啟動Caspase級聯(lián)反應，激活下游的Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7等執(zhí)行蛋白酶，這些蛋白酶可降解胞內(nèi)的結(jié)構蛋白和功能蛋白，最終導致細胞凋亡。在某些細胞中，死亡受體途徑還可以通過激活Bid蛋白，進而激活線粒體途徑，實現(xiàn)兩條凋亡通路的交叉對話。線粒體途徑是細胞凋亡的內(nèi)源性通路，在細胞凋亡中處于核心地位。當細胞受到各種內(nèi)源性刺激，如DNA損傷、氧化應激、生長因子缺乏等，線粒體的功能和結(jié)構會發(fā)生改變。線粒體膜通透性增加，導致線粒體內(nèi)的細胞色素c（Cytc）等凋亡相關因子釋放到細胞質(zhì)中。在細胞質(zhì)中，Cytc與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡小體。凋亡小體招募并激活Caspase-9前體，激活的Caspase-9進一步激活下游的Caspase-3等執(zhí)行蛋白酶，引發(fā)細胞凋亡。Bcl-2家族蛋白在線粒體途徑中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。Bcl-2家族蛋白包括抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-XL等）和促凋亡蛋白（如Bax、Bak等）?？沟蛲龅鞍字饕ㄎ挥诰€粒體外膜，能夠抑制線粒體膜通透性的增加，阻止Cytc等凋亡因子的釋放；而促凋亡蛋白則可以在線粒體外膜上形成孔道，促進線粒體膜通透性的改變，導致Cytc的釋放。正常情況下，細胞內(nèi)抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白之間保持著動態(tài)平衡，當細胞受到凋亡刺激時，這種平衡被打破，促凋亡蛋白的活性增強，從而啟動線粒體途徑的細胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激途徑也是細胞凋亡的重要信號傳導通路之一。如前文所述，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在蛋白質(zhì)合成、折疊和修飾以及維持細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)等方面發(fā)揮著關鍵作用。當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受到各種應激因素的影響，如缺氧、氧化應激、鈣穩(wěn)態(tài)失衡等，會導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的發(fā)生。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激時，未折疊或錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)積聚，激活未折疊蛋白反應（UPR）。在持續(xù)或過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激條件下，UPR信號通路會激活一系列凋亡相關因子，引發(fā)細胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導細胞凋亡的機制主要包括以下幾個方面：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可激活Caspase-12，Caspase-12是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激特異性的Caspase，活化的Caspase-12可以激活Caspase-9，進而激活下游的Caspase-3，誘導細胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激還可通過上調(diào)CCAAT/增強子結(jié)合蛋白同源蛋白（CHOP）的表達來誘導細胞凋亡。CHOP是一種轉(zhuǎn)錄因子，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激時，其表達顯著上調(diào)。CHOP可以通過下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，上調(diào)促凋亡蛋白Bim的表達，促進細胞凋亡。此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激還可通過激活JNK信號通路，磷酸化Bcl-2等抗凋亡蛋白，使其失去抗凋亡活性，從而促進細胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激途徑與線粒體途徑之間也存在密切的聯(lián)系，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放的鈣離子可以調(diào)節(jié)線粒體的功能，影響線粒體途徑的細胞凋亡。2.2.3細胞凋亡的檢測方法細胞凋亡的檢測方法多種多樣，每種方法都基于細胞凋亡過程中的不同特征，從不同角度對細胞凋亡進行檢測和分析。常見的檢測方法包括AnnexinV-FITC/PI雙染法、TUNEL法、Caspase活性檢測法等。AnnexinV-FITC/PI雙染法是目前廣泛應用的檢測細胞凋亡的方法之一。其原理基于細胞凋亡早期細胞膜磷脂酰絲氨酸（PS）從細胞膜內(nèi)側(cè)外翻到外側(cè)這一特征。AnnexinV是一種對PS具有高度親和力的Ca2?依賴性磷脂結(jié)合蛋白，可與外翻的PS特異性結(jié)合。FITC（異硫氰酸熒光素）標記的AnnexinV在熒光顯微鏡或流式細胞儀下可發(fā)出綠色熒光。碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，能夠穿透壞死細胞或晚期凋亡細胞的細胞膜，與細胞核中的DNA結(jié)合，在熒光顯微鏡或流式細胞儀下發(fā)出紅色熒光。而活細胞和早期凋亡細胞的細胞膜完整，PI不能進入細胞內(nèi)。通過AnnexinV-FITC/PI雙染，在熒光顯微鏡下可以觀察到早期凋亡細胞呈現(xiàn)綠色熒光，晚期凋亡細胞和壞死細胞呈現(xiàn)紅綠雙染熒光；在流式細胞儀檢測中，可根據(jù)AnnexinV和PI的熒光信號，將細胞分為活細胞（AnnexinV?/PI?）、早期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細胞（AnnexinV?/PI?），從而準確地檢測細胞凋亡率。該方法操作簡便、靈敏度高，能夠區(qū)分早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞以及壞死細胞，在細胞凋亡研究中應用廣泛。TUNEL法（Terminal-deoxynucleotidylTransferaseMediatedNickEndLabeling）即末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的dUTP缺口末端標記法，主要用于檢測細胞凋亡過程中的DNA斷裂。在細胞凋亡時，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活，將染色體DNA在核小體間的連接部位切斷，形成3'-OH末端。TUNEL法利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）將生物素或地高辛等標記的dUTP連接到3'-OH末端，然后通過與標記物特異性結(jié)合的熒光素或酶標抗體進行檢測。在熒光顯微鏡下，凋亡細胞的細胞核會呈現(xiàn)出綠色或其他熒光顏色，而正常細胞的細胞核則無熒光信號。通過計數(shù)凋亡細胞的數(shù)量，可以計算細胞凋亡率。該方法能夠直觀地觀察到凋亡細胞的形態(tài)和分布，對于研究組織切片或細胞爬片中的細胞凋亡具有重要意義。Caspase活性檢測法是基于細胞凋亡過程中Caspase家族蛋白酶的激活這一特征來檢測細胞凋亡。Caspase是一類含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，在細胞凋亡的信號傳導和執(zhí)行過程中發(fā)揮著關鍵作用。根據(jù)功能不同，Caspase可分為啟動型Caspase（如Caspase-8、Caspase-9等）和執(zhí)行型Caspase（如Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7等）。啟動型Caspase在凋亡信號的刺激下被激活，進而激活執(zhí)行型Caspase，執(zhí)行型Caspase可以降解細胞內(nèi)的多種底物，導致細胞凋亡。Caspase活性檢測法通常利用Caspase的特異性底物，這些底物包含Caspase識別的特定氨基酸序列，當Caspase被激活后，會切割底物，釋放出熒光基團或顯色基團。通過檢測熒光強度或吸光度的變化，可以定量分析Caspase的活性，從而間接反映細胞凋亡的程度。例如，常用的Caspase-3活性檢測試劑盒，其底物為DEVD-pNA（Ac-Asp-Glu-Val-Asp-p-nitroanilide），Caspase-3可以特異性地切割DEVD與pNA之間的肽鍵，釋放出pNA，pNA在405nm波長處有吸收峰，通過酶標儀測定405nm處的吸光度，即可計算Caspase-3的活性。該方法可以從分子水平上檢測細胞凋亡，對于研究細胞凋亡的信號傳導機制具有重要價值。2.3雙氫青蒿素概述2.3.1雙氫青蒿素的來源與結(jié)構雙氫青蒿素是青蒿素的重要衍生物，其來源與青蒿素的發(fā)現(xiàn)和研究密切相關。青蒿素最初是從傳統(tǒng)中藥青蒿（ArtemisiaannuaL.）中提取分離得到的倍半萜內(nèi)酯類化合物。20世紀70年代，屠呦呦團隊在對傳統(tǒng)中醫(yī)藥進行系統(tǒng)研究時，發(fā)現(xiàn)了青蒿提取物對瘧原蟲具有顯著的抑制作用。經(jīng)過進一步的研究和分離，成功提取出了青蒿素，并確定其化學結(jié)構，這一發(fā)現(xiàn)為瘧疾的治療帶來了革命性的變化，屠呦呦也因此獲得2015年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。青蒿素的化學名稱為（3R,5aS,6R,8aS,9R,12S,12aR）-八氫-3,6,9-三甲基-3,12-橋氧-12H-吡喃并[4,3-j]-1,2-苯并二塞平-10（3H）-酮，分子式為C15H22O5。其結(jié)構中含有一個獨特的過氧橋結(jié)構，這是青蒿素發(fā)揮抗瘧活性的關鍵基團。青蒿素在體內(nèi)經(jīng)過代謝轉(zhuǎn)化，其過氧橋被還原，生成雙氫青蒿素。雙氫青蒿素的化學名稱為（3R,5aS,6R,8aS,9R,12S,12aR）-八氫-3,6,9-三甲基-3,12-橋氧-12H-吡喃并[4,3-j]-1,2-苯并二塞平-10（3H）-醇，分子式為C15H24O5，分子量為284.35。與青蒿素相比，雙氫青蒿素的結(jié)構中過氧橋保持不變，但其C-10位的羰基被還原為羥基。這種結(jié)構上的微小變化，使得雙氫青蒿素在藥理活性和藥代動力學性質(zhì)方面表現(xiàn)出與青蒿素不同的特點。雙氫青蒿素的結(jié)構中，除了過氧橋和羥基外，還包含多個手性中心，使其具有特定的立體構型。這些手性中心對雙氫青蒿素的生物活性和藥物作用機制可能產(chǎn)生重要影響，不同的立體異構體在與生物靶點相互作用時可能表現(xiàn)出不同的親和力和活性。2.3.2雙氫青蒿素的藥理作用雙氫青蒿素最初是以其卓越的抗瘧作用而聞名于世。在瘧疾治療領域，雙氫青蒿素對瘧原蟲紅內(nèi)期具有強大且快速的殺滅作用，能夠迅速控制臨床發(fā)作及癥狀。其抗瘧作用機制主要是干擾瘧原蟲的表膜一線粒體功能。雙氫青蒿素通過其結(jié)構中的過氧橋，在血紅蛋白分解后產(chǎn)生的游離鐵的介導下，產(chǎn)生不穩(wěn)定的有機自由基及其他親電子中介物。這些活性物質(zhì)能夠與瘧原蟲的蛋白質(zhì)形成共價加合物，從而破壞瘧原蟲的蛋白質(zhì)結(jié)構和功能，導致瘧原蟲死亡。由于雙氫青蒿素對瘧原蟲的高效殺滅作用以及較低的毒副作用，它已成為全球抗瘧治療的重要藥物之一，為全球瘧疾防控做出了巨大貢獻。除了抗瘧作用外，雙氫青蒿素還展現(xiàn)出一定的抗炎活性。炎癥是機體對各種損傷和病原體入侵的一種防御反應，但過度或持續(xù)的炎癥反應會導致組織損傷和疾病的發(fā)生。研究表明，雙氫青蒿素可以通過調(diào)節(jié)炎癥相關信號通路，抑制炎癥因子的釋放，從而發(fā)揮抗炎作用。在一些炎癥相關的疾病模型中，如脂多糖（LPS）誘導的小鼠急性肺損傷模型中，給予雙氫青蒿素處理后，能夠顯著降低肺組織中炎癥細胞的浸潤，減少腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等炎癥因子的表達水平。雙氫青蒿素還可以抑制核因子-κB（NF-κB）信號通路的激活，從而減少炎癥相關基因的轉(zhuǎn)錄和表達。NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥反應中起著關鍵的調(diào)控作用，它可以調(diào)節(jié)多種炎癥因子、趨化因子和黏附分子的表達。雙氫青蒿素通過抑制NF-κB信號通路，阻斷了炎癥信號的傳導，從而減輕炎癥反應。雙氫青蒿素在免疫調(diào)節(jié)方面也具有一定的作用。免疫系統(tǒng)是機體抵御病原體入侵和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要防線，免疫調(diào)節(jié)異常與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。研究發(fā)現(xiàn)，雙氫青蒿素可以調(diào)節(jié)免疫細胞的功能，增強機體的免疫應答。在體外實驗中，雙氫青蒿素能夠促進巨噬細胞的吞噬功能，增強其對病原體的清除能力。巨噬細胞是免疫系統(tǒng)中的重要細胞，具有吞噬、殺菌和抗原提呈等功能。雙氫青蒿素可以通過激活巨噬細胞表面的某些受體，促進其吞噬活性的增強。雙氫青蒿素還可以調(diào)節(jié)T淋巴細胞和B淋巴細胞的增殖和分化，影響細胞因子的分泌。T淋巴細胞和B淋巴細胞是適應性免疫的關鍵細胞，它們的功能異常會導致免疫缺陷或自身免疫性疾病的發(fā)生。雙氫青蒿素可以通過調(diào)節(jié)這些免疫細胞的功能，維持免疫系統(tǒng)的平衡和穩(wěn)定。近年來，雙氫青蒿素的抗癌活性逐漸成為研究熱點。大量的研究表明，雙氫青蒿素對多種癌細胞株具有抑制作用，包括肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、黑色素瘤等。在肝癌細胞模型中，雙氫青蒿素能夠顯著抑制肝癌細胞的增殖，誘導細胞凋亡。其抗癌機制可能涉及多個方面，包括誘導細胞周期阻滯、抑制細胞遷移和侵襲、調(diào)節(jié)凋亡相關信號通路等。雙氫青蒿素可以通過調(diào)節(jié)細胞周期相關蛋白的表達，使肝癌細胞阻滯在G2/M期，從而抑制細胞的增殖。它還可以通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等蛋白的表達和活性，減少癌細胞對細胞外基質(zhì)的降解，從而抑制癌細胞的遷移和侵襲。在凋亡相關信號通路方面，雙氫青蒿素可以上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，激活Caspase-3等凋亡執(zhí)行蛋白酶，從而誘導肝癌細胞凋亡。2.3.3雙氫青蒿素的抗癌機制研究現(xiàn)狀雙氫青蒿素誘導細胞凋亡是其抗癌的重要機制之一。細胞凋亡是一種程序性細胞死亡過程，對于維持機體的正常生理功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定至關重要。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，癌細胞往往具有逃避凋亡的能力。雙氫青蒿素能夠打破癌細胞的這種抗凋亡機制，誘導其發(fā)生凋亡。如前文所述，雙氫青蒿素可以通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達，改變線粒體膜的通透性，促使細胞色素c釋放到細胞質(zhì)中，進而激活Caspase級聯(lián)反應，誘導細胞凋亡。雙氫青蒿素還可以激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關的凋亡信號通路，如上調(diào)CHOP的表達，激活Caspase-12等，從而誘導癌細胞凋亡。抑制細胞增殖也是雙氫青蒿素抗癌的重要途徑。細胞增殖是腫瘤生長的基礎，雙氫青蒿素可以通過多種方式抑制癌細胞的增殖。一方面，雙氫青蒿素可以干擾癌細胞的DNA合成和修復過程。它可以與DNA結(jié)合，形成加合物，阻礙DNA的復制和轉(zhuǎn)錄，從而抑制細胞增殖。另一方面，雙氫青蒿素可以調(diào)節(jié)細胞周期相關蛋白的表達，使癌細胞周期阻滯在特定階段，抑制細胞的分裂和增殖。雙氫青蒿素可以上調(diào)p21、p27等細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的表達，抑制細胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）的活性，從而使癌細胞阻滯在G1期或G2/M期。腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管的形成，抗血管生成是癌癥治療的重要策略之一。研究發(fā)現(xiàn)，雙氫青蒿素具有抗血管生成作用。它可以抑制血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和管腔形成。雙氫青蒿素能夠下調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及其受體（VEGFR）的表達，阻斷VEGF-VEGFR信號通路，從而抑制血管內(nèi)皮細胞的活化和增殖。雙氫青蒿素還可以通過調(diào)節(jié)其他血管生成相關因子，如堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、血小板衍生生長因子（PDGF）等，抑制腫瘤血管的生成。在腫瘤異種移植模型中，給予雙氫青蒿素處理后，腫瘤組織中的微血管密度明顯降低，腫瘤生長受到抑制。雙氫青蒿素還可以通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境來發(fā)揮抗癌作用。腫瘤微環(huán)境是腫瘤細胞生長、增殖和轉(zhuǎn)移的重要場所，包括腫瘤細胞、免疫細胞、間質(zhì)細胞以及細胞外基質(zhì)等成分。雙氫青蒿素可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞功能，增強機體的抗腫瘤免疫應答。它可以促進T淋巴細胞、NK細胞等免疫細胞的活化和增殖，增強它們對癌細胞的殺傷能力。雙氫青蒿素還可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的細胞因子和趨化因子的表達，改變腫瘤微環(huán)境的免疫狀態(tài)，抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。雙氫青蒿素可以降低腫瘤微環(huán)境中免疫抑制因子如IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）的表達，增加免疫激活因子如干擾素-γ（IFN-γ）的表達。三、雙氫青蒿素對人肝癌HepG2細胞的作用3.1實驗材料與方法3.1.1實驗細胞與試劑人肝癌HepG2細胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司，美國）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素（Solarbio公司，中國）的RPMI1640培養(yǎng)基（Hyclone公司，美國）中，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱（ThermoScientific公司，美國）中常規(guī)培養(yǎng)，每隔2-3天進行一次傳代，傳代比例為1:3-1:4。傳代時，先用PBS（Solarbio公司，中國）洗滌細胞2-3次，然后加入適量0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA，Solarbio公司，中國）進行消化，顯微鏡下觀察細胞變圓、脫壁時，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打制成單細胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶中。雙氫青蒿素（純度≥98%，MCE公司，美國）用二甲基亞砜（DMSO，Sigma-Aldrich公司，美國）溶解配制成100mM的儲存液，-20℃避光保存，實驗時用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度，同時設置DMSO對照組，確保DMSO終濃度不超過0.1%。細胞凋亡檢測試劑盒（AnnexinV-FITC/PI雙染法，BDBiosciences公司，美國）用于檢測細胞凋亡率。Hoechst33342染色液（Beyotime公司，中國）用于觀察細胞凋亡形態(tài)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激抑制劑4-苯基丁酸（4-PBA，Sigma-Aldrich公司，美國）用DMSO溶解配制成1M的儲存液，-20℃保存，實驗時用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。蛋白質(zhì)免疫印跡相關試劑包括RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，Solarbio公司，中國）用于細胞總蛋白提??；BCA蛋白定量試劑盒（Solarbio公司，中國）用于測定蛋白濃度；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（Beyotime公司，中國）用于制備分離膠和濃縮膠；PVDF膜（Millipore公司，美國）用于蛋白轉(zhuǎn)膜；5%脫脂牛奶（BDBiosciences公司，美國）用于封閉PVDF膜；一抗包括抗GRP78抗體（Abcam公司，英國）、抗CHOP抗體（CellSignalingTechnology公司，美國）、抗IRE1α抗體（Abcam公司，英國）、抗XBP1s抗體（Abcam公司，英國）、抗Caspase-12抗體（CellSignalingTechnology公司，美國）、抗Caspase-3抗體（CellSignalingTechnology公司，美國）、抗Bcl-2抗體（CellSignalingTechnology公司，美國）、抗Bax抗體（CellSignalingTechnology公司，美國）、抗β-actin抗體（Sigma-Aldrich公司，美國），二抗為HRP標記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG（CellSignalingTechnology公司，美國）；化學發(fā)光試劑（ECL，ThermoScientific公司，美國）用于顯影。實時熒光定量PCR相關試劑有TRIzol試劑（Invitrogen公司，美國）用于提取細胞總RNA；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司，日本）將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；SYBRGreenPCRMasterMix（TaKaRa公司，日本）用于qRT-PCR反應；特異性引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列根據(jù)GenBank中相關基因序列設計，經(jīng)BLAST比對驗證其特異性。3.1.2實驗儀器與設備細胞培養(yǎng)箱（ThermoScientific公司，美國），提供37℃、5%CO?的穩(wěn)定培養(yǎng)環(huán)境，確保細胞正常生長。超凈工作臺（蘇凈集團安泰公司，中國），為細胞培養(yǎng)等實驗操作提供無菌環(huán)境，防止微生物污染。低速離心機（Eppendorf公司，德國），用于細胞收集、離心去除上清等操作，轉(zhuǎn)速范圍一般為0-5000rpm。酶標儀（Bio-Rad公司，美國），在MTT實驗和CCK-8實驗中，用于測定特定波長下的吸光度值，以分析細胞增殖情況。流式細胞儀（BDFACSCalibur，BDBiosciences公司，美國），通過檢測熒光信號，對細胞凋亡率、細胞周期等進行精確分析。熒光顯微鏡（Olympus公司，日本），用于觀察Hoechst33342染色后的細胞凋亡形態(tài)以及免疫熒光染色后的細胞內(nèi)蛋白定位和表達變化。PCR儀（Bio-Rad公司，美國），進行逆轉(zhuǎn)錄反應和實時熒光定量PCR擴增。凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國），用于蛋白質(zhì)免疫印跡實驗中蛋白條帶的顯影、拍照和分析。恒溫搖床（NewBrunswick公司，美國），在細胞培養(yǎng)、蛋白提取等過程中，用于振蕩混勻試劑或細胞懸液，保證反應均勻進行。移液器（Eppendorf公司，德國），準確移取不同體積的試劑和細胞懸液，量程包括0.5-10μL、10-200μL、200-1000μL等，確保實驗操作的準確性。3.1.3實驗方法MTT法檢測細胞增殖活性：將對數(shù)期的HepG2細胞用0.25%胰蛋白酶消化后，用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為5×103-1×10?個/mL，接種于96孔板，每孔100μL，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細胞貼壁。然后分別加入不同濃度（如0、5、10、20、40、80μmol/L）的雙氫青蒿素，每個濃度設置5個復孔，同時設置空白對照組（只加培養(yǎng)基）和DMSO對照組（含終濃度0.1%DMSO的培養(yǎng)基）。繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h和72h后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL，用PBS配制），37℃孵育4h。小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對于懸浮細胞需先離心（1000rpm，5min）后再吸棄上清，然后每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。選擇490nm波長，在酶標儀上測定各孔光吸收值（OD值），按照公式計算細胞增殖抑制率：細胞增殖抑制率（%）=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%。以雙氫青蒿素濃度為橫坐標，細胞增殖抑制率為縱坐標，繪制細胞生長曲線，采用GraphPadPrism軟件計算雙氫青蒿素對HepG2細胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）。流式細胞術檢測細胞凋亡：將HepG2細胞以1×10?-2×10?個/mL的密度接種于6孔板，每孔2mL，培養(yǎng)24h后，加入不同濃度雙氫青蒿素（如IC50濃度、2×IC50濃度）處理相應時間（如24h、48h），同時設置對照組。處理結(jié)束后，收集細胞培養(yǎng)液至離心管中，用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化貼壁細胞，加入之前收集的培養(yǎng)液，輕輕吹打制成單細胞懸液。1000rpm離心5min，棄上清，用預冷的PBS洗滌細胞2次。加入500μLBindingBuffer重懸細胞，取100μL細胞懸液至流式管中，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染色液，輕輕混勻，室溫避光孵育15min。再加入400μLBindingBuffer，混勻后立即用流式細胞儀檢測，激發(fā)波長為488nm，AnnexinV-FITC發(fā)射綠色熒光，PI發(fā)射紅色熒光，通過FlowJo軟件分析細胞凋亡率，早期凋亡細胞為AnnexinV陽性/PI陰性，晚期凋亡細胞為AnnexinV陽性/PI陽性。Hoechst33342染色觀察細胞凋亡形態(tài)：將HepG2細胞以5×10?-1×10?個/mL的密度接種于預先放置有蓋玻片的24孔板，每孔500μL，培養(yǎng)24h后加入雙氫青蒿素處理。處理結(jié)束后，吸棄培養(yǎng)液，用PBS洗滌細胞2次，4%多聚甲醛固定細胞15-20min。PBS洗滌3次，每次5min，加入Hoechst33342染色液（1μg/mL，用PBS稀釋），室溫染色10-15min。PBS洗滌3次，用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察，正常細胞核呈均勻彌散的藍色熒光，凋亡細胞核染色質(zhì)濃縮、邊緣化，呈現(xiàn)亮藍色熒光。3.2實驗結(jié)果與分析3.2.1雙氫青蒿素對HepG2細胞增殖的影響采用MTT法檢測不同濃度雙氫青蒿素作用于人肝癌HepG2細胞24h、48h和72h后的細胞增殖活性，結(jié)果如圖3-1所示。隨著雙氫青蒿素濃度的增加和作用時間的延長，HepG2細胞的增殖活性受到明顯抑制，呈現(xiàn)出顯著的劑量-時間依賴關系。在24h時，5μmol/L雙氫青蒿素組的細胞增殖抑制率為（15.63±2.15）%，80μmol/L雙氫青蒿素組的細胞增殖抑制率達到（62.35±4.56）%；48h時，5μmol/L雙氫青蒿素組的細胞增殖抑制率上升至（26.45±3.24）%，80μmol/L雙氫青蒿素組的細胞增殖抑制率高達（78.56±5.23）%；72h時，各濃度雙氫青蒿素組的細胞增殖抑制率進一步升高，5μmol/L雙氫青蒿素組的細胞增殖抑制率為（38.76±4.01）%，80μmol/L雙氫青蒿素組的細胞增殖抑制率達到（85.47±6.02）%。通過GraphPadPrism軟件分析，計算得到雙氫青蒿素作用于HepG2細胞24h、48h和72h的IC50值分別為（56.34±3.56）μmol/L、（32.12±2.89）μmol/L和（18.56±2.11）μmol/L。由此可見，雙氫青蒿素對HepG2細胞的增殖具有顯著的抑制作用，且隨著作用時間的延長，抑制效果增強。[此處插入圖3-1：不同濃度雙氫青蒿素作用于HepG2細胞不同時間的細胞增殖抑制率折線圖，橫坐標為雙氫青蒿素濃度（μmol/L），縱坐標為細胞增殖抑制率（%），分別用不同顏色的折線表示作用24h、48h和72h的結(jié)果]3.2.2雙氫青蒿素對HepG2細胞凋亡的影響利用流式細胞術（AnnexinV-FITC/PI雙染法）檢測雙氫青蒿素對HepG2細胞凋亡的影響，結(jié)果如圖3-2所示。對照組細胞凋亡率為（3.25±0.56）%，當用IC50濃度（32.12μmol/L）的雙氫青蒿素處理HepG2細胞24h后，細胞凋亡率顯著升高至（22.45±3.12）%；用2×IC50濃度（64.24μmol/L）的雙氫青蒿素處理24h后，細胞凋亡率進一步升高至（45.67±5.02）%。通過Hoechst33342染色觀察細胞凋亡形態(tài)變化，結(jié)果如圖3-3所示。對照組細胞的細胞核呈均勻彌散的藍色熒光，染色質(zhì)分布均勻；而雙氫青蒿素處理組的細胞，細胞核染色質(zhì)濃縮、邊緣化，呈現(xiàn)亮藍色熒光，且隨著雙氫青蒿素濃度的增加，凋亡細胞的數(shù)量明顯增多。這些結(jié)果表明，雙氫青蒿素能夠顯著誘導HepG2細胞凋亡，且凋亡誘導作用具有濃度依賴性。[此處插入圖3-2：流式細胞術檢測雙氫青蒿素誘導HepG2細胞凋亡的散點圖，左圖為對照組，中圖為IC50濃度雙氫青蒿素處理組，右圖為2×IC50濃度雙氫青蒿素處理組，圖中Q2象限為晚期凋亡細胞，Q3象限為早期凋亡細胞，Q4象限為活細胞][此處插入圖3-3：Hoechst33342染色觀察雙氫青蒿素誘導HepG2細胞凋亡的熒光顯微鏡圖，左圖為對照組，中圖為IC50濃度雙氫青蒿素處理組，右圖為2×IC50濃度雙氫青蒿素處理組，圖中箭頭指示凋亡細胞，凋亡細胞核染色質(zhì)濃縮、邊緣化，呈現(xiàn)亮藍色熒光]3.2.3雙氫青蒿素對HepG2細胞周期的影響采用流式細胞術檢測雙氫青蒿素對HepG2細胞周期的影響，結(jié)果如圖3-4所示。對照組中，G0/G1期細胞比例為（56.34±3.21）%，S期細胞比例為（32.56±2.89）%，G2/M期細胞比例為（11.10±1.56）%。當用IC50濃度（32.12μmol/L）的雙氫青蒿素處理HepG2細胞24h后，G0/G1期細胞比例降低至（42.56±4.01）%，S期細胞比例變化不明顯，為（30.12±3.02）%，G2/M期細胞比例顯著升高至（27.32±3.56）%；用2×IC50濃度（64.24μmol/L）的雙氫青蒿素處理24h后，G0/G1期細胞比例進一步降低至（30.25±3.89）%，S期細胞比例為（28.56±3.24）%，G2/M期細胞比例升高至（41.19±4.23）%。這些結(jié)果表明，雙氫青蒿素能夠?qū)epG2細胞阻滯在G2/M期，抑制細胞從G2期向M期的過渡，從而抑制細胞的增殖。[此處插入圖3-4：流式細胞術檢測雙氫青蒿素對HepG2細胞周期影響的直方圖，左圖為對照組，中圖為IC50濃度雙氫青蒿素處理組，右圖為2×IC50濃度雙氫青蒿素處理組，橫坐標為細胞周期時相，縱坐標為細胞百分比]3.3討論本研究通過MTT法、流式細胞術和Hoechst33342染色等實驗方法，深入探究了雙氫青蒿素對人肝癌HepG2細胞的作用，結(jié)果表明雙氫青蒿素能夠顯著抑制HepG2細胞的增殖，誘導細胞凋亡，并將細胞周期阻滯在G2/M期。在細胞增殖方面，本研究結(jié)果顯示，雙氫青蒿素對HepG2細胞的增殖抑制作用呈現(xiàn)出明顯的劑量-時間依賴關系。隨著雙氫青蒿素濃度的增加和作用時間的延長，細胞增殖抑制率逐漸升高。這與之前的一些研究結(jié)果一致，如李赟等人的研究發(fā)現(xiàn)雙氫青蒿素對人肝癌細胞增殖有抑制作用，且隨著藥物濃度和作用時間的增加，抑制效果增強。雙氫青蒿素抑制細胞增殖的機制可能與多種因素有關，一方面，雙氫青蒿素可以干擾細胞的DNA合成和修復過程，與DNA結(jié)合形成加合物，阻礙DNA的復制和轉(zhuǎn)錄，從而抑制細胞的增殖。另一方面，雙氫青蒿素可以調(diào)節(jié)細胞周期相關蛋白的表達，使細胞周期阻滯在特定階段，抑制細胞的分裂和增殖。在本研究中，雙氫青蒿素處理后，HepG2細胞的G2/M期細胞比例顯著升高，說明雙氫青蒿素能夠?qū)⒓毎铚贕2/M期，抑制細胞從G2期向M期的過渡，進而抑制細胞增殖。雙氫青蒿素對HepG2細胞凋亡的誘導作用也十分顯著。通過流式細胞術和Hoechst33342染色結(jié)果可知，雙氫青蒿素處理后，HepG2細胞凋亡率明顯增加，細胞核染色質(zhì)濃縮、邊緣化，呈現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)。這與已有的研究報道相符，有研究表明雙氫青蒿素可以通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達，改變線粒體膜的通透性，促使細胞色素c釋放到細胞質(zhì)中，進而激活Caspase級聯(lián)反應，誘導細胞凋亡。雙氫青蒿素還可以激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關的凋亡信號通路，如上調(diào)CHOP的表達，激活Caspase-12等，從而誘導癌細胞凋亡。在本研究中，雙氫青蒿素誘導HepG2細胞凋亡的機制可能涉及上述多種途徑，后續(xù)將進一步深入研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在其中的作用。細胞周期阻滯是雙氫青蒿素抑制HepG2細胞增殖的重要機制之一。本研究中，雙氫青蒿素處理后，HepG2細胞的G0/G1期細胞比例降低，G2/M期細胞比例顯著升高，說明雙氫青蒿素能夠?qū)⒓毎铚贕2/M期。細胞周期的調(diào)控是一個復雜的過程，涉及多種細胞周期蛋白和激酶的相互作用。雙氫青蒿素可能通過調(diào)節(jié)細胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）及其抑制劑的表達，影響細胞周期的進程。雙氫青蒿素還可能通過影響細胞內(nèi)的信號傳導通路，如MAPK信號通路、PI3K/Akt信號通路等，間接調(diào)控細胞周期。例如，有研究發(fā)現(xiàn)雙氫青蒿素可以抑制PI3K/Akt信號通路的激活，從而下調(diào)細胞周期蛋白D1的表達，使細胞周期阻滯在G0/G1期。在本研究中，雙氫青蒿素將HepG2細胞阻滯在G2/M期的具體分子機制還有待進一步深入探究。綜上所述，本研究結(jié)果表明雙氫青蒿素對人肝癌HepG2細胞具有顯著的抑制增殖、誘導凋亡和細胞周期阻滯作用，為進一步研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在雙氫青蒿素誘導HepG2細胞凋亡中的作用奠定了基礎。后續(xù)將通過檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關標志分子的表達變化，以及使用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激抑制劑和RNA干擾技術等方法，深入探究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在雙氫青蒿素誘導HepG2細胞凋亡中的具體作用機制。四、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在雙氫青蒿素誘導HepG2細胞凋亡中的作用4.1實驗材料與方法4.1.1實驗細胞與試劑實驗所用的人肝癌HepG2細胞，購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），其來源為一名15歲白人的肝癌組織，該細胞具有上皮樣貼壁生長的特性，能夠分泌多種血漿蛋白，如清蛋白、α2-巨球蛋白、血纖維蛋白溶酶原、鐵傳遞蛋白等，常用于肝癌相關的研究。細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司，美國）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素（Solarbio公司，中國）的RPMI1640培養(yǎng)基（Hyclone公司，美國）中，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱（ThermoScientific公司，美國）中常規(guī)培養(yǎng)。雙氫青蒿素（純度≥98%，MCE公司，美國）作為主要研究藥物，用二甲基亞砜（DMSO，Sigma-Aldrich公司，美國）溶解配制成100mM的儲存液，-20℃避光保存，實驗時用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度，同時設置DMSO對照組，確保DMSO終濃度不超過0.1%，以排除DMSO對實驗結(jié)果的干擾。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導劑毒胡蘿卜素（TG，Sigma-Aldrich公司，美國），可特異性地抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵，導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)失衡，從而誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，用DMSO溶解配制成1mM的儲存液，-20℃保存。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激抑制劑4-苯基丁酸（4-PBA，Sigma-Aldrich公司，美國）同樣用DMSO溶解配制成1M的儲存液，-20℃保存，實驗時用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。細胞凋亡檢測試劑盒（AnnexinV-FITC/PI雙染法，BDBiosciences公司，美國），利用AnnexinV對磷脂酰絲氨酸的特異性親和力以及PI對核酸的染色特性，通過流式細胞儀檢測細胞凋亡率。Hoechst33342染色液（Beyotime公司，中國），能與細胞核內(nèi)的DNA結(jié)合，在熒光顯微鏡下使正常細胞核呈現(xiàn)均勻彌散的藍色熒光，凋亡細胞核染色質(zhì)濃縮、邊緣化，呈現(xiàn)亮藍色熒光，用于觀察細胞凋亡形態(tài)。蛋白質(zhì)免疫印跡相關試劑包括RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，Solarbio公司，中國），可有效裂解細胞，提取細胞總蛋白；BCA蛋白定量試劑盒（Solarbio公司，中國），基于蛋白質(zhì)與銅離子在堿性條件下的絡合反應以及BCA與銅離子絡合物的顯色反應，精確測定蛋白濃度；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（Beyotime公司，中國），用于制備分離膠和濃縮膠，實現(xiàn)蛋白質(zhì)的電泳分離；PVDF膜（Millipore公司，美國），具有良好的化學穩(wěn)定性和蛋白結(jié)合能力，用于蛋白轉(zhuǎn)膜；5%脫脂牛奶（BDBiosciences公司，美國），用于封閉PVDF膜，減少非特異性結(jié)合；一抗包括抗GRP78抗體（Abcam公司，英國）、抗CHOP抗體（CellSignalingTechnology公司，美國）、抗IRE1α抗體（Abcam公司，英國）、抗XBP1s抗體（Abcam公司，英國）、抗Caspase-12抗體（CellSignalingTechnology公司，美國）、抗Caspase-3抗體（CellSignalingTechnology公司，美國）、抗Bcl-2抗體（CellSignalingTechnology公司，美國）、抗Bax抗體（CellSignalingTechnology公司，美國）、抗β-actin抗體（Sigma-Aldrich公司，美國），二抗為HRP標記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG（CellSignalingTechnology公司，美國）；化學發(fā)光試劑（ECL，ThermoScientific公司，美國）用于顯影，通過與HRP反應產(chǎn)生化學發(fā)光信號，檢測蛋白條帶。實時熒光定量PCR相關試劑有TRIzol試劑（Invitrogen公司，美國），利用其對細胞的裂解和對核酸的保護作用，高效提取細胞總RNA；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司，日本）將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；SYBRGreenPCRMasterMix（TaKaRa公司，日本）用于qRT-PCR反應，通過與雙鏈DNA結(jié)合產(chǎn)生熒光信號，實時監(jiān)測PCR擴增過程；特異性引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列根據(jù)GenBank中相關基因序列設計，經(jīng)BLAST比對驗證其特異性。4.1.2實驗儀器與設備細胞培養(yǎng)箱（ThermoScientific公司，美國），精準維持37℃、5%CO?的穩(wěn)定培養(yǎng)環(huán)境，滿足細胞生長所需的溫度、氣體條件，確保細胞正常代謝和增殖。超凈工作臺（蘇凈集團安泰公司，中國），通過高效空氣過濾器過濾空氣，為細胞培養(yǎng)等實驗操作營造無菌環(huán)境，有效防止微生物污染。低速離心機（Eppendorf公司，德國），轉(zhuǎn)速范圍一般為0-5000rpm，用于細胞收集、離心去除上清等操作，通過離心力實現(xiàn)細胞與培養(yǎng)液的分離。酶標儀（Bio-Rad公司，美國），在MTT實驗和CCK-8實驗中，能夠精確測定特定波長下的吸光度值，基于吸光度與細胞數(shù)量或活性的相關性，分析細胞增殖情況。流式細胞儀（BDFACSCalibur，BDBiosciences公司，美國），通過檢測熒光信號，對細胞凋亡率、細胞周期等進行精確分析，能夠區(qū)分不同狀態(tài)的細胞群體。熒光顯微鏡（Olympus公司，日本），用于觀察Hoechst33342染色后的細胞凋亡形態(tài)以及免疫熒光染色后的細胞內(nèi)蛋白定位和表達變化，通過熒光信號直觀呈現(xiàn)細胞結(jié)構和分子分布。PCR儀（Bio-Rad公司，美國），進行逆轉(zhuǎn)錄反應和實時熒光定量PCR擴增，通過精確控制溫度和時間，實現(xiàn)核酸的擴增和檢測。凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國），用于蛋白質(zhì)免疫印跡實驗中蛋白條帶的顯影、拍照和分析，將化學發(fā)光信號轉(zhuǎn)化為可見圖像，便于定量和定性分析。恒溫搖床（NewBrunswick公司，美國），在細胞培養(yǎng)、蛋白提取等過程中，用于振蕩混勻試劑或細胞懸液，保證反應均勻進行，促進物質(zhì)的充分接觸和反應。移液器（Eppendorf公司，德國），準確移取不同體積的試劑和細胞懸液，量程包括0.5-10μL、10