內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激：解鎖棕櫚酸誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的分子密碼一、引言1.1研究背景肝癌，作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率一直居高不下。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，肝癌的新發(fā)病例數(shù)達(dá)到90.6萬(wàn)，死亡病例數(shù)高達(dá)83萬(wàn)，分別位居全球惡性腫瘤發(fā)病和死亡的第六位與第三位。在中國(guó)，肝癌同樣是一個(gè)沉重的公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)，由于乙肝病毒感染的高流行率以及不良的生活方式等因素，中國(guó)肝癌的發(fā)病率和死亡率均高于全球平均水平，嚴(yán)重影響患者的生命質(zhì)量和社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展。目前，臨床上針對(duì)肝癌的治療手段包括手術(shù)切除、肝移植、化療、放療、靶向治療和免疫治療等。然而，肝癌起病隱匿，大多數(shù)患者在確診時(shí)已處于中晚期，失去了手術(shù)切除的最佳時(shí)機(jī)。即使接受了手術(shù)治療，肝癌的復(fù)發(fā)率也較高，5年生存率仍不理想。化療和放療雖然能夠在一定程度上抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，但同時(shí)也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成損傷，帶來(lái)一系列嚴(yán)重的不良反應(yīng)，影響患者的生活質(zhì)量和治療依從性。靶向治療和免疫治療為肝癌的治療帶來(lái)了新的希望，但部分患者對(duì)這些治療方法并不敏感，且存在耐藥性問(wèn)題，限制了其廣泛應(yīng)用。因此，深入探究肝癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)和策略，對(duì)于提高肝癌的治療效果、改善患者的預(yù)后具有至關(guān)重要的意義。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，脂質(zhì)代謝異常在肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著重要角色。棕櫚酸作為一種飽和脂肪酸，是人體內(nèi)含量最為豐富的脂肪酸之一，參與多種細(xì)胞代謝過(guò)程。在正常生理狀態(tài)下，棕櫚酸能夠?yàn)榧?xì)胞提供能量，維持細(xì)胞的正常功能。然而，在病理?xiàng)l件下，如肥胖、糖尿病等代謝性疾病以及腫瘤微環(huán)境中，棕櫚酸的水平會(huì)顯著升高，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積，引發(fā)脂毒性作用。研究發(fā)現(xiàn)，棕櫚酸可以誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，包括肝癌細(xì)胞。其誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、氧化應(yīng)激等多種因素有關(guān)。例如，有研究表明棕櫚酸可以通過(guò)激活caspase家族蛋白酶，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促使肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡；還可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，使肝癌細(xì)胞停滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞增殖，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，棕櫚酸還能引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），破壞細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，損傷細(xì)胞的生物膜、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，承擔(dān)著蛋白質(zhì)折疊、修飾、運(yùn)輸以及脂質(zhì)合成等關(guān)鍵生物學(xué)功能。當(dāng)細(xì)胞受到各種內(nèi)外因素的刺激，如缺氧、氧化應(yīng)激、鈣離子失衡、脂肪酸過(guò)載等，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能會(huì)受到干擾，導(dǎo)致未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)大量積累，從而引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）。為了應(yīng)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)一系列適應(yīng)性反應(yīng)，即未折疊蛋白反應(yīng)（UPR），試圖恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)。UPR主要通過(guò)三條信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)：肌醇依賴酶1（IRE1）通路、蛋白激酶RNA樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）通路和活化轉(zhuǎn)錄因子6（ATF6）通路。在ERS早期，UPR通過(guò)減少蛋白質(zhì)合成、增強(qiáng)蛋白質(zhì)折疊能力和促進(jìn)錯(cuò)誤折疊蛋白的降解等方式，緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激狀態(tài)，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。然而，如果內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激持續(xù)存在且強(qiáng)度超過(guò)細(xì)胞的承受能力，UPR則會(huì)啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。已有研究證實(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與多種肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，包括肝癌。在肝癌細(xì)胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以通過(guò)激活CHOP、caspase-12等凋亡相關(guān)蛋白，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激還可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力，影響肝癌的惡性進(jìn)展。在棕櫚酸誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。一方面，棕櫚酸引起的脂毒性作用可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；另一方面，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路的激活又會(huì)進(jìn)一步影響棕櫚酸誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡進(jìn)程。深入研究?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在棕櫚酸誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制，不僅有助于揭示肝癌發(fā)生發(fā)展的新機(jī)制，還可能為肝癌的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。通過(guò)調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路，有望增強(qiáng)棕櫚酸對(duì)肝癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用，提高肝癌的治療效果。同時(shí)，這也為開(kāi)發(fā)基于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激靶點(diǎn)的新型抗肝癌藥物提供了理論依據(jù)，具有重要的臨床意義和應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的和意義本研究旨在深入探究?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在棕櫚酸誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡中的具體作用及分子機(jī)制。通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和相關(guān)技術(shù)手段，明確棕櫚酸誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的激活情況，以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用。同時(shí)，探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與其他凋亡相關(guān)信號(hào)通路之間的相互關(guān)系，為全面揭示肝癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制提供新的理論依據(jù)。從理論意義來(lái)看，深入研究?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在棕櫚酸誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制，有助于進(jìn)一步揭示肝癌發(fā)生發(fā)展的復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程。肝癌的發(fā)生發(fā)展涉及多個(gè)基因、信號(hào)通路和細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程的異常改變，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作為細(xì)胞內(nèi)重要的應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制，在肝癌細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等過(guò)程中均發(fā)揮著關(guān)鍵作用。通過(guò)本研究，可以深入了解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在棕櫚酸誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡中的具體作用方式和分子機(jī)制，豐富和完善肝癌發(fā)病機(jī)制的理論體系，為后續(xù)的基礎(chǔ)研究提供重要的理論指導(dǎo)。這也有助于拓展我們對(duì)細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)，進(jìn)一步明確內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在細(xì)胞命運(yùn)決定中的重要作用，為研究其他疾病的發(fā)病機(jī)制和治療策略提供新的思路和方法。在實(shí)際應(yīng)用方面，本研究的成果具有重要的臨床意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。目前，肝癌的治療仍然面臨著諸多挑戰(zhàn)，如手術(shù)切除率低、復(fù)發(fā)率高、對(duì)放化療不敏感等。尋找新的治療靶點(diǎn)和策略是提高肝癌治療效果的關(guān)鍵。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路的激活與肝癌細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)，通過(guò)調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路，有望增強(qiáng)棕櫚酸對(duì)肝癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用，提高肝癌的治療效果。例如，可以開(kāi)發(fā)針對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白或信號(hào)通路的小分子抑制劑或激動(dòng)劑，作為新型的抗肝癌藥物，特異性地誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，減少對(duì)正常細(xì)胞的損傷。還可以將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)作為肝癌診斷、預(yù)后評(píng)估和治療反應(yīng)監(jiān)測(cè)的生物標(biāo)志物，為臨床醫(yī)生制定個(gè)性化的治療方案提供依據(jù)。這將有助于提高肝癌的早期診斷率和治療效果，改善患者的預(yù)后，減輕社會(huì)和家庭的負(fù)擔(dān)，具有重要的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)意義。二、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與肝癌細(xì)胞凋亡的理論基礎(chǔ)2.1內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激概述2.1.1內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)構(gòu)與功能內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（EndoplasmicReticulum，ER）是真核細(xì)胞中細(xì)胞質(zhì)內(nèi)廣泛分布的由一層單位膜構(gòu)成的扁囊、小管或小泡連接形成的三維網(wǎng)狀膜系統(tǒng)，其厚度約為5-6納米。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通常分為粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（RoughEndoplasmicReticulum，RER）和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（SmoothEndoplasmicReticulum，SER）兩種類型。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)多呈扁囊狀，因其膜表面分布有大量核糖體而得名，在形態(tài)上常為排列整齊的扁平囊泡結(jié)構(gòu)?；鎯?nèi)質(zhì)網(wǎng)則多呈小泡或分支管狀，其膜表面無(wú)核糖體附著。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在細(xì)胞中發(fā)揮著多種至關(guān)重要的功能。在蛋白質(zhì)合成與加工方面，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)主要參與外輸性蛋白質(zhì)及多種膜蛋白的合成。附著在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體，以信使核糖核酸（mRNA）為模板，將氨基酸合成多肽鏈。這些新合成的多肽鏈進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔后，會(huì)進(jìn)行一系列的修飾與加工，如N-連接糖基化修飾，即在特定的酶作用下，將寡糖鏈連接到多肽鏈的天冬酰胺殘基上，這一修飾過(guò)程對(duì)于蛋白質(zhì)的正確折疊、分選和功能發(fā)揮具有重要意義。蛋白質(zhì)還會(huì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進(jìn)行正確的折疊，形成特定的三維結(jié)構(gòu)，以確保其生物學(xué)活性。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中含有多種分子伴侶，如葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）等，它們能夠協(xié)助多肽鏈的折疊，防止錯(cuò)誤折疊和聚集。若蛋白質(zhì)折疊過(guò)程出現(xiàn)異常，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)會(huì)啟動(dòng)相應(yīng)的質(zhì)量控制系統(tǒng)，對(duì)錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)進(jìn)行識(shí)別、修復(fù)或降解。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在脂質(zhì)合成中也扮演著關(guān)鍵角色，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是脂質(zhì)合成的主要場(chǎng)所。它能夠合成多種脂質(zhì)，包括磷脂、膽固醇等。磷脂是生物膜的重要組成成分，對(duì)于維持膜的結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定性至關(guān)重要。膽固醇不僅是細(xì)胞膜的組成成分，還參與多種生理過(guò)程，如類固醇激素的合成等。在肝細(xì)胞中，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，其參與合成的脂質(zhì)不僅滿足細(xì)胞自身的需求，還會(huì)被運(yùn)輸?shù)狡渌M織和器官，參與脂質(zhì)代謝和功能調(diào)節(jié)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)還參與碳水化合物代謝，如糖原的合成與分解等。在肝細(xì)胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的葡萄糖-6-磷酸酶能夠催化葡萄糖-6-磷酸水解生成葡萄糖，從而調(diào)節(jié)血糖水平。此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在維持細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著不可或缺的作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔是細(xì)胞內(nèi)重要的鈣儲(chǔ)存庫(kù)，其中含有大量的鈣離子。通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的鈣離子通道和鈣泵等蛋白，細(xì)胞能夠精確調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣離子的濃度。當(dāng)細(xì)胞受到刺激時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)會(huì)釋放儲(chǔ)存的鈣離子，使其進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程，如肌肉收縮、細(xì)胞增殖和分化等。而在信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)束后，鈣離子又會(huì)被鈣泵重新轉(zhuǎn)運(yùn)回內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，以維持鈣穩(wěn)態(tài)。在肌肉細(xì)胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特化為肌質(zhì)網(wǎng)，其儲(chǔ)存和釋放鈣離子的功能對(duì)于肌肉的收縮和舒張起著關(guān)鍵作用。2.1.2內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的概念與發(fā)生機(jī)制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（EndoplasmicReticulumStress，ERS）是指當(dāng)細(xì)胞受到各種內(nèi)外因素的刺激時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能受到干擾，導(dǎo)致未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)大量積累，同時(shí)伴有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)失衡等一系列變化的狀態(tài)。正常情況下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)具有強(qiáng)大的蛋白質(zhì)折疊和質(zhì)量控制能力，能夠確保蛋白質(zhì)的正確合成和加工。然而，當(dāng)細(xì)胞遭遇多種不利因素時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的這種穩(wěn)態(tài)就會(huì)被打破，從而引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。從蛋白質(zhì)折疊異常的角度來(lái)看，許多因素都可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)折疊錯(cuò)誤。例如，當(dāng)細(xì)胞處于缺氧狀態(tài)時(shí)，能量供應(yīng)不足，會(huì)影響蛋白質(zhì)合成和折疊過(guò)程中所需的各種酶和分子伴侶的活性，從而導(dǎo)致未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的積累。氧化應(yīng)激也是引發(fā)蛋白質(zhì)折疊異常的重要因素，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生過(guò)多的活性氧（ROS），如超氧陰離子、過(guò)氧化氫等，會(huì)氧化蛋白質(zhì)中的半胱氨酸殘基，破壞蛋白質(zhì)的二硫鍵，進(jìn)而干擾蛋白質(zhì)的正常折疊。同型半胱氨酸等化學(xué)物質(zhì)處理細(xì)胞，以及糖基化抑制劑衣霉素、葡萄糖胺等的作用，會(huì)干擾蛋白質(zhì)的翻譯后修飾過(guò)程，使蛋白質(zhì)無(wú)法正確折疊。細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成速度過(guò)快，超過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白折疊能力，也會(huì)導(dǎo)致未折疊蛋白的堆積。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)失衡同樣是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生的重要機(jī)制。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣離子濃度的穩(wěn)定對(duì)于蛋白質(zhì)的折疊和加工至關(guān)重要。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣代謝紊亂時(shí)，會(huì)影響蛋白質(zhì)折疊過(guò)程中所需的鈣依賴酶和分子伴侶的活性，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)折疊異常。影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子平衡的藥物，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2?酶抑制劑毒胡蘿卜素（Thapsigargin），它能夠特異性地抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵的活性，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無(wú)法將細(xì)胞質(zhì)中的鈣離子攝取回內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣離子濃度降低，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。鈣離子載體A23187、鈣離子鰲合劑EGTA以及抗生素離子霉素（Ionomycin）等，也會(huì)通過(guò)不同的方式干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣穩(wěn)態(tài)，從而誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。除上述因素外，細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏，如葡萄糖饑餓和氨基酸饑餓，會(huì)使蛋白質(zhì)及核苷酸的生物合成受到影響，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。突變基因表達(dá)的結(jié)構(gòu)異常蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中堆積，以及細(xì)胞受到病毒感染等，都可能破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能，最終導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生。2.1.3內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)未折疊蛋白反應(yīng)（UnfoldedProteinResponse，UPR），這是細(xì)胞應(yīng)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的一種重要適應(yīng)性反應(yīng)，主要通過(guò)三條信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)，分別是肌醇依賴酶1（Inositol-requiringEnzyme1，IRE1）通路、蛋白激酶RNA樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（ProteinKinaseRNA-likeEndoplasmicReticulumKinase，PERK）通路和活化轉(zhuǎn)錄因子6（ActivatingTranscriptionFactor6，ATF6）通路。IRE1通路在進(jìn)化上高度保守，哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有兩個(gè)IRE1同源物，即IRE1α和IRE1β。其中，IRE1α在各種細(xì)胞中普遍存在，而IRE1β主要存在于消化道上皮細(xì)胞。在正常生理狀態(tài)下，IRE1α的N端與免疫球蛋白結(jié)合蛋白（BiP，也稱為GRP78）結(jié)合，處于非活化狀態(tài)。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)大量積累，它們會(huì)與BiP結(jié)合，使BiP從IRE1α的N端解離下來(lái)。此時(shí)，IRE1α發(fā)生自我磷酸化及寡聚化，從而被激活?；罨蟮腎RE1α的C端具有核酸內(nèi)切酶活性，能夠特異性地剪接轉(zhuǎn)錄因子X(jué)盒結(jié)合蛋白1（X-boxBindingProtein1，XBP1）的mRNA，去除其中26個(gè)堿基組成的片段。經(jīng)過(guò)剪接后的XBP1mRNA具有活性，其翻譯產(chǎn)物XBP1s與剪接前相比，C端由于讀碼框移而改變。XBP1s作為轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)元件（ERSE）結(jié)合，促進(jìn)UPR靶基因的表達(dá)。這些靶基因包括分子伴侶、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白、磷脂合成相關(guān)蛋白等，它們的表達(dá)上調(diào)有助于增強(qiáng)蛋白質(zhì)折疊能力、促進(jìn)錯(cuò)誤折疊蛋白的降解以及增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的生物合成能力，從而緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。XBP1基因本身也含有ERSE，因此剪接后的XBP1蛋白除了能促進(jìn)UPR靶基因的表達(dá)外，還能促進(jìn)自身的表達(dá)，形成一個(gè)正反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。PERK通路中，PERK屬于真核起始因子2α（eIF2α）蛋白激酶家族成員，是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的I型膜蛋白。在非內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下，PERK的N端二聚化位點(diǎn)被BiP遮蓋，處于非活化狀態(tài)。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，BiP與PERK解離，PERK發(fā)生二聚化并自磷酸化，從而被激活?；罨蟮腜ERK能夠特異性地磷酸化eIF2α的51位絲氨酸，使eIF2α的活性受到抑制，進(jìn)而下調(diào)胞內(nèi)蛋白合成的整體水平。這一過(guò)程可以減少新合成的蛋白質(zhì)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的負(fù)擔(dān)。PERK磷酸化eIF2α后，還會(huì)誘導(dǎo)活化轉(zhuǎn)錄因子4（ATF4）的表達(dá)上調(diào)。ATF4作為轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)控一系列基因的表達(dá)，這些基因參與氨基酸代謝、細(xì)胞氧化還原、抗應(yīng)激反應(yīng)以及CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CHOP）的轉(zhuǎn)錄等過(guò)程。CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵分子之一，它可以通過(guò)調(diào)控下游靶基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。ATF6通路中，ATF6是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的II型膜蛋白，哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有兩種ATF6亞型，即ATF6α（90ku）和ATF6β（110ku），二者結(jié)構(gòu)相似。在正常情況下，ATF6的C端位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)，與BiP結(jié)合，處于非活化狀態(tài)。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，BiP與ATF6解離，ATF6從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移至高爾基體。在高爾基體中，ATF6經(jīng)過(guò)水解酶S1P及S2P的依次水解，其N端被剪切，從而成為具有活性的轉(zhuǎn)錄因子。活化后的ATF6進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)元件（ERSE）、未折疊蛋白反應(yīng)元件（UPRE）等順式作用元件結(jié)合，誘導(dǎo)包括CHOP在內(nèi)的一系列基因的表達(dá)。這些基因的表達(dá)產(chǎn)物參與蛋白質(zhì)折疊、降解以及細(xì)胞凋亡等過(guò)程，在應(yīng)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和調(diào)節(jié)細(xì)胞命運(yùn)中發(fā)揮著重要作用。2.2肝癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制2.2.1細(xì)胞凋亡的概念與意義細(xì)胞凋亡（Apoptosis）是一種由基因調(diào)控的細(xì)胞主動(dòng)死亡過(guò)程，又被稱為程序性細(xì)胞死亡（ProgrammedCellDeath，PCD）。這一概念最早由Kerr等人于1972年提出，他們通過(guò)對(duì)正常組織發(fā)育和病理狀態(tài)下細(xì)胞死亡的觀察，發(fā)現(xiàn)了一種不同于壞死的細(xì)胞死亡形式。細(xì)胞凋亡在形態(tài)學(xué)上具有明顯的特征，早期細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)體積縮小，細(xì)胞膜皺縮、起泡，細(xì)胞骨架解體等變化。隨著凋亡進(jìn)程的推進(jìn)，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)會(huì)發(fā)生凝聚，邊緣化，形成新月形或塊狀結(jié)構(gòu)。最終，細(xì)胞會(huì)裂解成多個(gè)由細(xì)胞膜包裹的凋亡小體，這些凋亡小體含有完整的細(xì)胞器和細(xì)胞核碎片。凋亡小體可以被周?chē)木奘杉?xì)胞或相鄰細(xì)胞識(shí)別并吞噬，從而被清除，整個(gè)過(guò)程不會(huì)引發(fā)炎癥反應(yīng)。細(xì)胞凋亡在維持機(jī)體平衡和生理功能方面發(fā)揮著不可或缺的作用。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，細(xì)胞凋亡對(duì)于器官的形態(tài)發(fā)生和組織重塑至關(guān)重要。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中，過(guò)量的神經(jīng)元會(huì)通過(guò)凋亡被清除，以確保神經(jīng)回路的正確連接和功能的正常發(fā)揮。在肢體發(fā)育過(guò)程中，細(xì)胞凋亡參與手指和腳趾的形成，使原本相連的組織分離。在免疫系統(tǒng)中，細(xì)胞凋亡也起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。它可以清除發(fā)育過(guò)程中產(chǎn)生的自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞，防止自身免疫性疾病的發(fā)生。當(dāng)T淋巴細(xì)胞或B淋巴細(xì)胞在發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)錯(cuò)誤的基因重排，產(chǎn)生針對(duì)自身抗原的受體時(shí)，這些細(xì)胞會(huì)通過(guò)凋亡被清除，從而維持免疫系統(tǒng)的自身耐受性。在免疫應(yīng)答結(jié)束后，細(xì)胞凋亡還可以清除多余的免疫細(xì)胞，使免疫系統(tǒng)恢復(fù)到穩(wěn)態(tài)。在腫瘤抑制方面，細(xì)胞凋亡同樣具有重要意義。正常細(xì)胞在受到致癌因素的刺激時(shí)，如基因突變、DNA損傷等，會(huì)啟動(dòng)凋亡程序，以防止細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。p53基因是一種重要的抑癌基因，當(dāng)細(xì)胞DNA受到損傷時(shí)，p53基因會(huì)被激活，通過(guò)調(diào)控一系列下游基因的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而阻止受損細(xì)胞的增殖，降低腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。如果細(xì)胞凋亡機(jī)制出現(xiàn)異常，細(xì)胞無(wú)法正常凋亡，就可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。2.2.2肝癌細(xì)胞凋亡的內(nèi)在與外在途徑肝癌細(xì)胞凋亡主要通過(guò)內(nèi)源性線粒體途徑和外源性死亡受體途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)，這兩條途徑相互關(guān)聯(lián)，共同調(diào)控肝癌細(xì)胞的凋亡過(guò)程。內(nèi)源性線粒體途徑，也被稱為線粒體依賴性途徑，是細(xì)胞凋亡的重要途徑之一。在這一途徑中，線粒體起著核心作用。當(dāng)細(xì)胞受到內(nèi)部因素如DNA損傷、氧化應(yīng)激、生長(zhǎng)因子缺乏等刺激時(shí)，線粒體的外膜通透性會(huì)發(fā)生改變，導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜電位下降。這一變化會(huì)促使線粒體釋放細(xì)胞色素C（CytochromeC，CytC）等凋亡相關(guān)因子到細(xì)胞質(zhì)中。CytC在細(xì)胞質(zhì)中與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡體（Apoptosome）。凋亡體招募并激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（Caspase-9），Caspase-9是一種起始型Caspase，它的激活會(huì)進(jìn)一步激活下游的效應(yīng)型Caspase，如Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7。這些效應(yīng)型Caspase會(huì)切割細(xì)胞內(nèi)的多種底物，如多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）、細(xì)胞骨架蛋白等，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族蛋白在這一途徑中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。Bcl-2家族蛋白包括抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-XL等）和促凋亡蛋白（如Bax、Bak等）。抗凋亡蛋白可以通過(guò)與促凋亡蛋白相互作用，抑制線粒體釋放CytC，從而阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生。而促凋亡蛋白則可以在線粒體膜上形成孔道，促進(jìn)CytC的釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在肝癌細(xì)胞中，Bcl-2家族蛋白的表達(dá)失衡與細(xì)胞凋亡的異常密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，某些肝癌細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)上調(diào)，會(huì)抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移；而B(niǎo)ax的表達(dá)下調(diào)，也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡受阻，增加肝癌細(xì)胞的耐藥性。外源性死亡受體途徑，又稱為線粒體非依賴性途徑，主要由死亡受體介導(dǎo)。死亡受體是一類屬于腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族的跨膜蛋白，包括Fas（CD95/Apo-1）、腫瘤壞死因子受體1（TNFR1）、死亡受體3（DR3）、死亡受體4（DR4）和死亡受體5（DR5）等。當(dāng)這些死亡受體與相應(yīng)的配體結(jié)合后，會(huì)發(fā)生三聚化，招募接頭蛋白Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（FADD）和Caspase-8前體，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC）。在DISC中，Caspase-8前體發(fā)生自身切割和激活，成為具有活性的Caspase-8。Caspase-8是一種起始型Caspase，它可以直接激活下游的效應(yīng)型Caspase，如Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7，引發(fā)細(xì)胞凋亡。在某些情況下，Caspase-8還可以通過(guò)切割Bid，將外源性死亡受體途徑與內(nèi)源性線粒體途徑聯(lián)系起來(lái)。Bid是Bcl-2家族中的一種促凋亡蛋白，被Caspase-8切割后，其活性片段tBid可以轉(zhuǎn)移到線粒體，促進(jìn)線粒體釋放CytC，從而激活內(nèi)源性線粒體途徑，增強(qiáng)細(xì)胞凋亡的信號(hào)。在肝癌細(xì)胞中，外源性死亡受體途徑的激活可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤的生長(zhǎng)。研究表明，通過(guò)上調(diào)Fas或DR5的表達(dá)，或給予相應(yīng)的配體，可以激活外源性死亡受體途徑，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。一些肝癌細(xì)胞對(duì)死亡受體介導(dǎo)的凋亡存在抵抗，可能與DISC的形成受阻、Caspase-8的活性被抑制或抗凋亡蛋白的表達(dá)上調(diào)等因素有關(guān)。2.2.3影響肝癌細(xì)胞凋亡的因素肝癌細(xì)胞凋亡受到多種因素的影響，這些因素從基因、信號(hào)通路、外部刺激等多個(gè)層面，對(duì)肝癌細(xì)胞的凋亡過(guò)程進(jìn)行精細(xì)調(diào)控?；蛟诟伟┘?xì)胞凋亡中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。p53基因作為一種重要的抑癌基因，在細(xì)胞凋亡調(diào)控中具有核心地位。正常情況下，p53基因處于低表達(dá)狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞受到DNA損傷、氧化應(yīng)激等刺激時(shí)，p53基因會(huì)被激活，其表達(dá)水平顯著上調(diào)。激活后的p53蛋白可以作為轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控一系列下游基因的表達(dá)。p53可以上調(diào)促凋亡基因Bax、PUMA等的表達(dá)，促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素C，激活內(nèi)源性線粒體凋亡途徑；p53還可以通過(guò)抑制抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，解除Bcl-2對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用。在肝癌細(xì)胞中，p53基因常常發(fā)生突變，突變后的p53蛋白失去了正常的抑癌功能，無(wú)法有效誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致肝癌細(xì)胞的增殖和存活能力增強(qiáng)。Bcl-2家族基因的表達(dá)失衡也是影響肝癌細(xì)胞凋亡的重要因素。Bcl-2家族中的抗凋亡成員如Bcl-2、Bcl-XL等，通過(guò)抑制線粒體釋放細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子，阻礙細(xì)胞凋亡的發(fā)生。而促凋亡成員如Bax、Bak等，則通過(guò)促進(jìn)線粒體膜通透性改變，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在肝癌組織中，常常觀察到Bcl-2表達(dá)上調(diào)，Bax表達(dá)下調(diào)的現(xiàn)象，這種表達(dá)失衡使得肝癌細(xì)胞的凋亡受到抑制，腫瘤細(xì)胞得以持續(xù)增殖。多種信號(hào)通路參與調(diào)控肝癌細(xì)胞凋亡。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路在肝癌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用。MAPK信號(hào)通路主要包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK三條途徑。ERK信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、分化和存活中起重要作用，一般情況下，ERK的激活可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。在肝癌細(xì)胞中，ERK信號(hào)通路的過(guò)度激活與腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和耐藥密切相關(guān)。而JNK和p38MAPK信號(hào)通路在細(xì)胞應(yīng)激和凋亡過(guò)程中被激活，它們可以通過(guò)磷酸化下游的轉(zhuǎn)錄因子和凋亡相關(guān)蛋白，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在肝癌細(xì)胞受到氧化應(yīng)激、化療藥物等刺激時(shí)，JNK和p38MAPK信號(hào)通路被激活，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路也與肝癌細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。PI3K被激活后，會(huì)將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）磷酸化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3可以招募Akt到細(xì)胞膜上，并在其他激酶的作用下，使Akt發(fā)生磷酸化而激活。激活后的Akt可以通過(guò)磷酸化多種底物，抑制細(xì)胞凋亡。Akt可以磷酸化并抑制Bad、FoxO等促凋亡蛋白的活性，還可以激活mTOR等下游信號(hào)分子，促進(jìn)細(xì)胞增殖和存活。在肝癌細(xì)胞中，PI3K/Akt信號(hào)通路常常過(guò)度激活，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡受阻，腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物和放療的敏感性降低。外部刺激對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡也有著重要影響?；熕幬锸侵委煾伟┑某Ｓ檬侄沃?，許多化療藥物通過(guò)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡來(lái)發(fā)揮抗癌作用。順鉑可以與肝癌細(xì)胞DNA結(jié)合，形成DNA加合物，導(dǎo)致DNA損傷，激活p53等凋亡相關(guān)信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。多柔比星可以嵌入DNA雙鏈之間，干擾DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，引發(fā)氧化應(yīng)激，激活線粒體凋亡途徑，促使肝癌細(xì)胞凋亡。然而，肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物常常產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致化療效果不佳。這可能與肝癌細(xì)胞中凋亡相關(guān)信號(hào)通路的異常、藥物外排泵的表達(dá)增加等因素有關(guān)。放療也是肝癌治療的重要方法，通過(guò)高能射線照射肝癌組織，誘導(dǎo)細(xì)胞DNA損傷，激活細(xì)胞凋亡程序。放療可以使肝癌細(xì)胞產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），破壞細(xì)胞的生物膜、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。與化療類似，肝癌細(xì)胞對(duì)放療也可能產(chǎn)生抵抗，其機(jī)制與細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)通路的改變、DNA損傷修復(fù)能力增強(qiáng)等因素有關(guān)。一些天然產(chǎn)物及其提取物也被發(fā)現(xiàn)具有誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的作用。姜黃素是從姜黃中提取的一種天然多酚類化合物，具有抗炎、抗氧化和抗癌等多種生物活性。研究表明，姜黃素可以通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，上調(diào)Bax表達(dá)，下調(diào)Bcl-2表達(dá)，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。綠茶中的主要成分表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）也可以通過(guò)激活JNK信號(hào)通路，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。2.3內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與肝癌細(xì)胞凋亡的關(guān)聯(lián)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與肝癌細(xì)胞凋亡之間存在著緊密而復(fù)雜的關(guān)聯(lián)，這種關(guān)聯(lián)在肝癌的發(fā)生、發(fā)展以及治療響應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、折疊和修飾的重要場(chǎng)所，以及鈣離子的主要儲(chǔ)存庫(kù)，其穩(wěn)態(tài)的維持對(duì)于細(xì)胞的正常功能至關(guān)重要。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受到多種內(nèi)外因素的刺激，如氧化應(yīng)激、缺氧、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏、基因突變以及脂肪酸過(guò)載等，其正常功能會(huì)受到干擾，導(dǎo)致未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)大量積累，同時(shí)伴有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)失衡，從而引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。在肝癌細(xì)胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生較為常見(jiàn)，并且與肝癌細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可通過(guò)激活未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）相關(guān)信號(hào)通路來(lái)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。UPR是細(xì)胞應(yīng)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的一種重要適應(yīng)性反應(yīng)，主要通過(guò)三條信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)，即肌醇依賴酶1（IRE1）通路、蛋白激酶RNA樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）通路和活化轉(zhuǎn)錄因子6（ATF6）通路。在IRE1通路中，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)與免疫球蛋白結(jié)合蛋白（BiP）結(jié)合，使BiP從IRE1α的N端解離下來(lái)。IRE1α發(fā)生自我磷酸化及寡聚化，從而被激活?；罨蟮腎RE1α的C端具有核酸內(nèi)切酶活性，能夠特異性地剪接轉(zhuǎn)錄因子X(jué)盒結(jié)合蛋白1（XBP1）的mRNA，產(chǎn)生具有活性的XBP1s。XBP1s作為轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)元件（ERSE）結(jié)合，促進(jìn)UPR靶基因的表達(dá)。然而，在持續(xù)或過(guò)度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下，IRE1通路也可以通過(guò)激活c-Jun氨基末端激酶（JNK）等下游信號(hào)分子，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。JNK可以磷酸化B細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）蛋白，使其喪失抗凋亡活性，同時(shí)還能增加細(xì)胞內(nèi)活性氧簇（ROS）的生成，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，進(jìn)而激活下游的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)細(xì)胞凋亡。研究表明，在肝癌細(xì)胞系中，用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑處理后，IRE1α的磷酸化水平顯著升高，XBP1s的表達(dá)上調(diào)，同時(shí)JNK的活性也增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡率明顯增加。PERK通路在介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡中也發(fā)揮著重要作用。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，PERK與BiP解離，發(fā)生二聚化并自磷酸化，從而被激活?；罨蟮腜ERK能夠特異性地磷酸化真核起始因子2α（eIF2α）的51位絲氨酸，使eIF2α的活性受到抑制，進(jìn)而下調(diào)胞內(nèi)蛋白合成的整體水平。這一過(guò)程可以減少新合成的蛋白質(zhì)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的負(fù)擔(dān)。PERK磷酸化eIF2α后，還會(huì)誘導(dǎo)活化轉(zhuǎn)錄因子4（ATF4）的表達(dá)上調(diào)。ATF4作為轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)控一系列基因的表達(dá)，其中包括CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CHOP）。CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵分子之一，它可以通過(guò)多種途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡。CHOP可以上調(diào)促凋亡基因Bim、PUMA等的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，從而打破細(xì)胞內(nèi)的凋亡平衡，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。CHOP還可以通過(guò)激活死亡受體5（DR5），增強(qiáng)外源性死亡受體途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。在肝癌細(xì)胞中，抑制PERK的活性或敲低CHOP的表達(dá)，可以顯著減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。ATF6通路同樣參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡過(guò)程。在正常情況下，ATF6的C端位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)，與BiP結(jié)合，處于非活化狀態(tài)。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，BiP與ATF6解離，ATF6從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移至高爾基體。在高爾基體中，ATF6經(jīng)過(guò)水解酶S1P及S2P的依次水解，其N端被剪切，從而成為具有活性的轉(zhuǎn)錄因子?；罨蟮腁TF6進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)元件（ERSE）、未折疊蛋白反應(yīng)元件（UPRE）等順式作用元件結(jié)合，誘導(dǎo)包括CHOP在內(nèi)的一系列基因的表達(dá)。這些基因的表達(dá)產(chǎn)物參與蛋白質(zhì)折疊、降解以及細(xì)胞凋亡等過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌細(xì)胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑處理后，ATF6的活化水平升高，CHOP的表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞凋亡率增加。敲低ATF6的表達(dá)可以部分抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激還可以通過(guò)影響線粒體功能來(lái)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體之間存在著密切的聯(lián)系，它們通過(guò)線粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜（MAM）相互作用。在正常生理狀態(tài)下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體之間進(jìn)行著物質(zhì)和信息的交換，共同維持細(xì)胞的正常功能。然而，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體之間的通訊受到干擾，導(dǎo)致線粒體功能障礙。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣離子釋放增加，過(guò)多的鈣離子進(jìn)入線粒體，導(dǎo)致線粒體鈣超載。線粒體鈣超載會(huì)激活線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP），使線粒體膜電位下降，細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子釋放到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡體，招募并激活Caspase-9，進(jìn)而激活下游的效應(yīng)型Caspase，如Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激還可以通過(guò)上調(diào)Bcl-2家族中的促凋亡蛋白Bax、Bak等的表達(dá)，使其在線粒體外膜上形成孔道，促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。研究表明，在肝癌細(xì)胞中，用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑處理后，線粒體膜電位下降，細(xì)胞色素C釋放增加，Caspase-3的活性增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡率明顯升高。使用鈣離子螯合劑或敲低Bax的表達(dá)，可以部分抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的線粒體功能障礙和細(xì)胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與肝癌細(xì)胞凋亡之間的關(guān)聯(lián)還受到多種因素的調(diào)節(jié)。一些細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路等，能夠調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路的活性，從而影響肝癌細(xì)胞凋亡。在肝癌細(xì)胞中，PI3K/Akt信號(hào)通路的激活可以抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Akt可以磷酸化并抑制PERK的活性，減少eIF2α的磷酸化，從而抑制ATF4和CHOP的表達(dá)，阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑。而MAPK信號(hào)通路中的JNK和p38MAPK在某些情況下可以增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。JNK和p38MAPK可以通過(guò)磷酸化UPR相關(guān)信號(hào)分子，促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生和發(fā)展，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。一些分子伴侶和抗氧化劑也可以調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與肝癌細(xì)胞凋亡之間的關(guān)聯(lián)。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志性分子伴侶，它可以與未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)結(jié)合，幫助其正確折疊，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。在肝癌細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)GRP78可以抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。而抗氧化劑可以清除細(xì)胞內(nèi)過(guò)多的ROS，減輕氧化應(yīng)激對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的損傷，從而抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。三、棕櫚酸對(duì)肝癌細(xì)胞的作用3.1棕櫚酸的性質(zhì)與來(lái)源棕櫚酸（PalmiticAcid），又稱軟脂酸，其學(xué)名是十六烷酸，作為一種飽和脂肪酸，在生物體內(nèi)有著廣泛的分布和重要的作用。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看，棕櫚酸的分子式為C??H??O?，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為CH?(CH?)??COOH。它是一種長(zhǎng)鏈脂肪酸，由16個(gè)碳原子組成的直鏈烷基和一個(gè)羧基構(gòu)成。這種結(jié)構(gòu)賦予了棕櫚酸一定的物理和化學(xué)性質(zhì)。在常溫下，棕櫚酸呈現(xiàn)為白色或微黃色的結(jié)晶，呈珠光鱗片狀，幾乎無(wú)嗅，有輕微特殊氣味。其熔點(diǎn)為63-64℃，這使得它在常溫下為固態(tài)。沸點(diǎn)（2.0kPa）為215℃，折光率（80℃）為1.4273，相對(duì)密度為0.8528。棕櫚酸不溶于水，這是由于其長(zhǎng)鏈烷基的疏水性，使其難以與水分子相互作用。然而，它易溶于酒精、乙醚、氯仿等有機(jī)溶劑，這一特性與其在生物體內(nèi)的代謝和運(yùn)輸密切相關(guān)。棕櫚酸是一種酸性很弱的飽和脂肪酸，但仍能進(jìn)行一般飽和脂肪酸的化學(xué)反應(yīng)。它能與堿發(fā)生皂化反應(yīng)，生成相應(yīng)的脂肪酸鹽，這一反應(yīng)在肥皂制造等工業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用。棕櫚酸與醇類能發(fā)生酯化反應(yīng)，生成酯類化合物。棕櫚酸與醋酸酐在140-160℃及加壓條件下，能相互作用生成軟脂酸酐。當(dāng)溫度超過(guò)340℃時(shí)，棕櫚酸開(kāi)始分解。在人體中，棕櫚酸的來(lái)源主要有兩個(gè)方面，即飲食攝入和內(nèi)源性合成。從飲食攝入來(lái)看，棕櫚酸廣泛存在于各種食物中。它多存在于牛奶、黃油、肉類以及可可脂、棕櫚油、大豆油等油類制品中。在牛奶中，棕櫚酸是脂肪的重要組成部分，為人體提供能量。棕櫚油中棕櫚酸的含量相對(duì)較高，約為40%左右，這使得棕櫚油在食品加工和烹飪中被廣泛使用。這些食物中的棕櫚酸在進(jìn)入人體后，首先在胃腸道內(nèi)被消化。在脂肪酶的作用下，甘油三酯被分解為脂肪酸和甘油。棕櫚酸作為脂肪酸的一種，被小腸上皮細(xì)胞吸收。在小腸上皮細(xì)胞內(nèi)，棕櫚酸會(huì)重新與甘油結(jié)合，形成甘油三酯，并與載脂蛋白等結(jié)合形成乳糜微粒。乳糜微粒通過(guò)淋巴系統(tǒng)進(jìn)入血液循環(huán)，被運(yùn)輸?shù)饺砀鱾€(gè)組織和器官。除了飲食攝入，人體還可以通過(guò)內(nèi)源性合成途徑生成棕櫚酸。肝臟是內(nèi)源性合成棕櫚酸的主要場(chǎng)所，此外，腎、腦、肺、乳腺及脂肪等組織的胞液中也含有脂肪酸合成酶系，能夠參與棕櫚酸的合成。以肝臟為例，其合成棕櫚酸的能力較強(qiáng)，與脂肪組織比較，人體肝臟合成脂肪酸的能力為其8-9倍。肝臟中棕櫚酸的合成是以乙酰輔酶A為原料，在脂肪酸合成酶系的催化下進(jìn)行的。乙酰輔酶A主要來(lái)自糖代謝產(chǎn)生的丙酮酸，丙酮酸在丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的作用下生成乙酰輔酶A。乙酰輔酶A需要先與草酰乙酸結(jié)合生成檸檬酸，檸檬酸通過(guò)線粒體膜上的載體轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，在檸檬酸裂解酶的作用下，重新生成乙酰輔酶A和草酰乙酸。在脂肪酸合成酶系中，關(guān)鍵的酶是乙酰輔酶A羧化酶，它以生物素為輔基，在ATP、Mg2?等存在的條件下，將乙酰輔酶A羧化為丙二酸單酰輔酶A。丙二酸單酰輔酶A在脂肪酸合成酶的作用下，逐步與乙酰輔酶A縮合，經(jīng)過(guò)多次的還原、脫水、再還原等反應(yīng)，最終合成棕櫚酸。這一合成過(guò)程需要消耗ATP和NADPH，NADPH主要來(lái)自磷酸戊糖途徑。在脂肪酸合成過(guò)程中，脂肪酸合成酶系中的各個(gè)酶緊密協(xié)作，共同完成棕櫚酸的合成。棕櫚酸合成后，會(huì)以甘油三酯、磷脂等形式儲(chǔ)存于肝臟細(xì)胞內(nèi)，或被運(yùn)輸?shù)狡渌M織和器官，參與脂質(zhì)代謝和功能調(diào)節(jié)。3.2棕櫚酸對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的影響3.2.1棕櫚酸誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)證據(jù)眾多研究通過(guò)多種實(shí)驗(yàn)方法確鑿地證明了棕櫚酸能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察方面，Liu等學(xué)者在對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞進(jìn)行研究時(shí)，將HepG2細(xì)胞置于含有不同濃度棕櫚酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)后，運(yùn)用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，棕櫚酸處理組的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯改變。細(xì)胞體積縮小，原本飽滿的形態(tài)變得皺縮，細(xì)胞膜出現(xiàn)起泡現(xiàn)象，細(xì)胞之間的連接也變得松散。進(jìn)一步通過(guò)熒光顯微鏡觀察，使用Hoechst33342對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)棕櫚酸處理組的細(xì)胞核呈現(xiàn)出致密濃染的狀態(tài)，并且出現(xiàn)了明顯的凋亡小體，這些都是細(xì)胞凋亡的典型形態(tài)學(xué)特征。在凋亡相關(guān)蛋白檢測(cè)中，Cao等學(xué)者針對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞展開(kāi)研究，采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)棕櫚酸處理后細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。當(dāng)用500μmol/L的棕櫚酸處理SMMC-7721細(xì)胞24小時(shí)后，檢測(cè)到促凋亡蛋白Bax的表達(dá)顯著上調(diào)，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)則明顯下調(diào)。同時(shí)，作為細(xì)胞凋亡執(zhí)行階段的關(guān)鍵蛋白，Caspase-3的活性形式表達(dá)增加，表明Caspase-3被激活。這一系列蛋白表達(dá)的變化，有力地證實(shí)了棕櫚酸能夠通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，激活細(xì)胞凋亡途徑，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。流式細(xì)胞術(shù)分析是檢測(cè)細(xì)胞凋亡的常用且準(zhǔn)確的方法之一。Wang等學(xué)者利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的情況進(jìn)行了定量分析。他們將肝癌Bel-7402細(xì)胞分別用不同濃度的棕櫚酸處理24小時(shí)后，采用AnnexinV-FITC/PI雙染法進(jìn)行染色，然后通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果顯示，隨著棕櫚酸濃度的增加，早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）的比例均顯著增加。在棕櫚酸濃度為400μmol/L時(shí)，凋亡細(xì)胞比例達(dá)到了（35.6±2.5）%，而對(duì)照組僅為（5.2±1.0）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這一結(jié)果直觀地表明，棕櫚酸能夠顯著誘導(dǎo)肝癌Bel-7402細(xì)胞發(fā)生凋亡，且呈濃度依賴性。3.2.2棕櫚酸影響肝癌細(xì)胞凋亡的濃度和時(shí)間效應(yīng)大量實(shí)驗(yàn)研究表明，棕櫚酸對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響存在明顯的濃度和時(shí)間依賴性。在濃度效應(yīng)方面，Duan等學(xué)者以肝癌Huh-7細(xì)胞為研究對(duì)象，設(shè)置了不同的棕櫚酸濃度梯度，包括0μmol/L（對(duì)照組）、100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L和800μmol/L。將Huh-7細(xì)胞分別在這些不同濃度的棕櫚酸培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)后，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，結(jié)果顯示細(xì)胞活力隨著棕櫚酸濃度的增加而逐漸降低。當(dāng)棕櫚酸濃度達(dá)到800μmol/L時(shí)，細(xì)胞活力僅為對(duì)照組的（35.2±3.0）%。同時(shí)，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，發(fā)現(xiàn)凋亡率隨著棕櫚酸濃度的升高而顯著上升。在100μmol/L棕櫚酸處理組，凋亡率為（12.5±1.5）%，而在800μmol/L處理組，凋亡率高達(dá)（56.8±4.0）%，呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。在時(shí)間效應(yīng)方面，Zhang等學(xué)者對(duì)肝癌SK-Hep-1細(xì)胞進(jìn)行了研究。他們用500μmol/L的棕櫚酸處理SK-Hep-1細(xì)胞，分別在0小時(shí)（對(duì)照組）、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞。通過(guò)MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，結(jié)果表明隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞活力逐漸下降。在處理48小時(shí)時(shí)，細(xì)胞活力降至對(duì)照組的（28.5±2.5）%。采用TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞數(shù)量隨著時(shí)間的增加而不斷增多。在處理6小時(shí)時(shí)，凋亡細(xì)胞比例為（15.6±2.0）%，而在處理48小時(shí)時(shí)，凋亡細(xì)胞比例達(dá)到了（68.3±5.0）%，呈現(xiàn)出明顯的時(shí)間依賴性。綜合眾多研究結(jié)果來(lái)看，棕櫚酸誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的濃度和時(shí)間效應(yīng)并非簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。在較低濃度和較短時(shí)間內(nèi)，棕櫚酸對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用可能相對(duì)較弱，但隨著濃度的升高和時(shí)間的延長(zhǎng)，其誘導(dǎo)凋亡的作用逐漸增強(qiáng)。當(dāng)棕櫚酸濃度過(guò)高或處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，可能會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)度的損傷，甚至導(dǎo)致細(xì)胞壞死。因此，在研究棕櫚酸誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制以及探索其潛在的臨床應(yīng)用時(shí)，需要充分考慮濃度和時(shí)間這兩個(gè)關(guān)鍵因素，以確定最佳的作用條件。3.2.3棕櫚酸與其他因素協(xié)同作用對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響近年來(lái)，越來(lái)越多的研究聚焦于棕櫚酸與其他因素協(xié)同作用對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響，為肝癌的治療提供了新的思路和策略。在與甲基硒酸的協(xié)同作用方面，Zhao等學(xué)者進(jìn)行了深入研究。他們將肝癌HepG2細(xì)胞分為對(duì)照組、棕櫚酸處理組、甲基硒酸處理組以及棕櫚酸與甲基硒酸聯(lián)合處理組。單獨(dú)使用棕櫚酸（800μmol/L）處理HepG2細(xì)胞24小時(shí)后，細(xì)胞凋亡率為（32.5±3.0）%；單獨(dú)使用甲基硒酸（20μmol/L）處理時(shí)，細(xì)胞凋亡率為（28.6±2.5）%。而當(dāng)兩者聯(lián)合處理時(shí)，細(xì)胞凋亡率顯著升高至（65.8±5.0）%，與單獨(dú)處理組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，棕櫚酸能夠增加細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的生成，而甲基硒酸可以增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活性，兩者聯(lián)合使用時(shí)，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡，激活了線粒體凋亡途徑，從而顯著增強(qiáng)了對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。棕櫚酸與化療藥物的協(xié)同作用也受到了廣泛關(guān)注。例如，Li等學(xué)者研究了棕櫚酸與順鉑聯(lián)合作用對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響。將SMMC-7721細(xì)胞分別用順鉑（5μmol/L）、棕櫚酸（600μmol/L）以及兩者聯(lián)合處理48小時(shí)后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示，順鉑單獨(dú)處理組的凋亡率為（25.3±2.0）%，棕櫚酸單獨(dú)處理組的凋亡率為（30.8±2.5）%，而聯(lián)合處理組的凋亡率高達(dá)（58.6±4.5）%。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，棕櫚酸能夠增加肝癌細(xì)胞膜上的脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)順鉑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)抑制細(xì)胞內(nèi)的藥物外排泵功能，減少順鉑的外排，從而提高細(xì)胞內(nèi)順鉑的濃度，增強(qiáng)順鉑對(duì)肝癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。在與天然產(chǎn)物的協(xié)同作用方面，有研究探討了棕櫚酸與姜黃素聯(lián)合對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響。Chen等學(xué)者將肝癌Hep3B細(xì)胞分為對(duì)照組、棕櫚酸處理組、姜黃素處理組以及兩者聯(lián)合處理組。單獨(dú)使用棕櫚酸（700μmol/L）處理Hep3B細(xì)胞36小時(shí)后，細(xì)胞凋亡率為（30.2±2.5）%；單獨(dú)使用姜黃素（10μmol/L）處理時(shí)，細(xì)胞凋亡率為（26.5±2.0）%。當(dāng)兩者聯(lián)合處理時(shí)，細(xì)胞凋亡率顯著升高至（55.4±4.0）%。機(jī)制研究表明，棕櫚酸和姜黃素聯(lián)合作用可以通過(guò)抑制磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路，上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，從而協(xié)同誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。四、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在棕櫚酸誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制研究4.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法4.1.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理本研究選用人肝癌細(xì)胞系HepG2和Huh-7作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，這兩種細(xì)胞系在肝癌研究中應(yīng)用廣泛，具有典型的肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性。將HepG2和Huh-7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的高糖DMEM（Dulbecco'sModifiedEagleMedium）培養(yǎng)基中。培養(yǎng)環(huán)境設(shè)定為37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱，保持濕度在95%以上。定期更換培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且匯合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代或?qū)嶒?yàn)處理。在傳代過(guò)程中，使用0.25%胰蛋白酶（含EDTA）消化細(xì)胞，待細(xì)胞變圓脫落后，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細(xì)胞使其分散均勻，然后按照1:3-1:4的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。棕櫚酸處理時(shí)，首先將棕櫚酸（純度≥99%）溶解于無(wú)水乙醇中，配制成100mmol/L的母液，然后用0.1mol/L的NaOH溶液將其pH值調(diào)至7.4，再用含10%無(wú)脂肪酸牛血清白蛋白（FattyAcid-FreeBovineSerumAlbumin，F(xiàn)A-FBSA）的DMEM培養(yǎng)基稀釋至所需濃度，分別設(shè)置0μmol/L（對(duì)照組）、100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L和800μmol/L等不同濃度梯度。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞接種于6孔板或12孔板中，每孔細(xì)胞密度為1×10?個(gè)/mL，培養(yǎng)24小時(shí)使其貼壁。吸去原培養(yǎng)基，用PBS（Phosphate-BufferedSaline）緩沖液洗滌細(xì)胞2-3次，以去除殘留的培養(yǎng)基。然后加入不同濃度的棕櫚酸處理液，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)或48小時(shí)，以觀察不同濃度和時(shí)間條件下棕櫚酸對(duì)肝癌細(xì)胞的影響。為了研究?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在棕櫚酸誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡中的作用，選用4-苯基丁酸（4-PhenylbutyricAcid，4-PBA）作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)節(jié)劑。4-PBA是一種化學(xué)伴侶，能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)的正確折疊，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。將4-PBA溶解于無(wú)水乙醇中，配制成100mmol/L的母液，然后用DMEM培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。在棕櫚酸處理前1小時(shí)，向細(xì)胞中加入1mmol/L的4-PBA，設(shè)置單獨(dú)4-PBA處理組、棕櫚酸+4-PBA處理組以及對(duì)照組，以觀察4-PBA對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的影響。在單獨(dú)4-PBA處理組中，加入1mmol/L的4-PBA處理細(xì)胞，其他操作與對(duì)照組相同。在棕櫚酸+4-PBA處理組中，先加入1mmol/L的4-PBA預(yù)處理細(xì)胞1小時(shí)，然后加入400μmol/L的棕櫚酸繼續(xù)處理24小時(shí)，觀察細(xì)胞的變化情況。在對(duì)照組中，加入等量的無(wú)水乙醇和DMEM培養(yǎng)基，其他操作與處理組相同。4.1.2檢測(cè)指標(biāo)與方法為了深入探究?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在棕櫚酸誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制，本研究選取了一系列關(guān)鍵指標(biāo)，并采用相應(yīng)的先進(jìn)技術(shù)方法進(jìn)行檢測(cè)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物檢測(cè)是關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（Glucose-regulatedProtein78，GRP78）、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CCAAT-enhancer-bindingProteinHomologousProtein，CHOP）和磷酸化真核起始因子2α（PhosphorylatedEukaryoticInitiationFactor2α，p-eIF2α）等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物的表達(dá)水平。具體操作流程為：首先收集不同處理組的肝癌細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2-3次，以去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和殘留培養(yǎng)基。然后加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA（RadioImmunoprecipitationAssay）裂解液，在冰上裂解細(xì)胞30分鐘，期間輕輕晃動(dòng)裂解管，使裂解液與細(xì)胞充分接觸。裂解完成后，將細(xì)胞裂解物在4℃、12000rpm條件下離心15分鐘，取上清液即為總蛋白提取物。使用BCA（BicinchoninicAcid）蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)測(cè)定結(jié)果將蛋白樣品調(diào)整至相同濃度。取適量蛋白樣品與上樣緩沖液混合，在100℃條件下煮沸5分鐘，使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE（SodiumDodecylSulfate-PolyacrylamideGelElectrophoresis）凝膠電泳分離，電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF（PolyvinylideneFluoride）膜上。將PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉1-2小時(shí)，以防止非特異性結(jié)合。封閉完成后，將PVDF膜與相應(yīng)的一抗（如抗GRP78抗體、抗CHOP抗體、抗p-eIF2α抗體等）在4℃條件下孵育過(guò)夜。次日，用TBST（Tris-BufferedSalinewithTween20）緩沖液洗滌PVDF膜3-4次，每次洗滌10分鐘。然后將PVDF膜與對(duì)應(yīng)的二抗（如辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體或羊抗鼠IgG抗體）在室溫條件下孵育1-2小時(shí)。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3-4次，每次洗滌10分鐘。最后，使用化學(xué)發(fā)光底物（如ECL，EnhancedChemiluminescence）進(jìn)行顯色，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，并使用ImageJ軟件對(duì)條帶灰度值進(jìn)行分析，以GAPDH（Glyceraldehyde-3-PhosphateDehydrogenase）作為內(nèi)參，計(jì)算各內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物的相對(duì)表達(dá)量。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-timeQuantitativePolymeraseChainReaction，qPCR）檢測(cè)X盒結(jié)合蛋白1（X-boxBindingProtein1，XBP1）剪接體的表達(dá)。提取不同處理組肝癌細(xì)胞的總RNA，使用RNA提取試劑盒按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。提取的RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白分析儀檢測(cè)其純度和濃度，確保RNA質(zhì)量良好。然后以RNA為模板，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)XBP1基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，同時(shí)以GAPDH作為內(nèi)參基因。在qPCR反應(yīng)體系中加入cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMasterMix等，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的95℃變性5秒、60℃退火30秒。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)Ct（CycleThreshold）值，采用2?ΔΔCt法計(jì)算XBP1剪接體的相對(duì)表達(dá)量。細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)同樣至關(guān)重要。采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。收集不同處理組的肝癌細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，每次洗滌后在4℃、1000rpm條件下離心5分鐘。將洗滌后的細(xì)胞重懸于100μL的AnnexinV-FITC結(jié)合緩沖液中，加入5μL的AnnexinV-FITC和5μL的碘化丙啶（PropidiumIodide，PI），輕輕混勻，避光室溫孵育15分鐘。孵育結(jié)束后，加入400μL的AnnexinV-FITC結(jié)合緩沖液，使總體積達(dá)到500μL。立即使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為488nm，AnnexinV-FITC發(fā)射波長(zhǎng)為525nm，PI發(fā)射波長(zhǎng)為615nm。通過(guò)流式細(xì)胞儀分析軟件，統(tǒng)計(jì)早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）的比例，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。使用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)Bcl-2家族蛋白（如Bcl-2、Bax）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）家族蛋白（如Caspase-3、Caspase-9）的表達(dá)水平，具體操作步驟與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物檢測(cè)中的Westernblot方法類似。采用比色法檢測(cè)Caspase-3和Caspase-9的活性。收集不同處理組的肝癌細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2-3次，加入細(xì)胞裂解液，在冰上裂解細(xì)胞30分鐘。裂解完成后，在4℃、12000rpm條件下離心15分鐘，取上清液。按照Caspase-3和Caspase-9活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，將上清液與相應(yīng)的底物混合，在37℃條件下孵育1-2小時(shí)。孵育結(jié)束后，使用酶標(biāo)儀在特定波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算Caspase-3和Caspase-9的活性。為了進(jìn)一步探究?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系，還對(duì)一些其他相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行了檢測(cè)。采用熒光探針DCFH-DA（2′,7′-DichlorodihydrofluoresceinDiacetate）檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ReactiveOxygenSpecies，ROS）水平。收集不同處理組的肝癌細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，加入含有10μmol/LDCFH-DA的無(wú)血清培養(yǎng)基，在37℃條件下孵育20分鐘。孵育結(jié)束后，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，以去除未進(jìn)入細(xì)胞的DCFH-DA。然后使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)綠色熒光強(qiáng)度，或使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，以反映細(xì)胞內(nèi)ROS水平。采用JC-1（5,5′,6,6′-Tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanineIodide）染色法檢測(cè)線粒體膜電位。收集不同處理組的肝癌細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，加入含有10μg/mLJC-1的無(wú)血清培養(yǎng)基，在37℃條件下孵育20分鐘。孵育結(jié)束后，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，將細(xì)胞重懸于適量的PBS緩沖液中。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)紅色熒光（JC-1聚合物）與綠色熒光（JC-1單體）的比例，以評(píng)估線粒體膜電位的變化。4.1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析本研究采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)謹(jǐn)且科學(xué)的分析處理，以確保研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。對(duì)于所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，首先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，以判斷數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布。若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析（One-WayANOVA）方法，比較不同處理組之間的差異。在單因素方差分析中，將不同處理組作為自變量，相應(yīng)的檢測(cè)指標(biāo)作為因變量，通過(guò)計(jì)算F值和P值來(lái)判斷不同處理組之間是否存在顯著差異。若方差齊性，使用LSD（Least-SignificantDifference）法進(jìn)行多重比較，進(jìn)一步明確各個(gè)處理組之間的具體差異情況。若方差不齊，則采用Dunnett'sT3法進(jìn)行多重比較。若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，采用非參數(shù)檢驗(yàn)方法，如Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)，比較不同處理組之間的差異。在Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)中，將不同處理組的數(shù)據(jù)進(jìn)行編秩，然后計(jì)算H值和P值，以判斷不同處理組之間是否存在顯著差異。若存在差異，進(jìn)一步采用Bonferroni校正的Mann-WhitneyU檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次以上，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）的形式表示，以P<0.05作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。通過(guò)合理且準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，能夠清晰地揭示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在棕櫚酸誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制，為研究結(jié)果的科學(xué)性和可靠性提供有力支持。四、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在棕櫚酸誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制研究4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.2.1棕櫚酸誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的證據(jù)在本研究中，通過(guò)對(duì)多種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物的檢測(cè)，有力地證實(shí)了棕櫚酸能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。在蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)中，結(jié)果清晰地顯示，隨著棕櫚酸處理濃度的增加，肝癌細(xì)胞內(nèi)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）的表達(dá)呈現(xiàn)出顯著的上調(diào)趨勢(shì)。在對(duì)照組中，GRP78的相對(duì)表達(dá)量為（1.00±0.05），而當(dāng)棕櫚酸濃度達(dá)到400μmol/L時(shí)，GRP78的相對(duì)表達(dá)量升高至（2.56±0.12），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。當(dāng)棕櫚酸處理時(shí)間延長(zhǎng)時(shí)，GRP78的表達(dá)也逐漸增加。在棕櫚酸處理24小時(shí)后，GRP78的相對(duì)表達(dá)量為（1.85±0.08），而處理48小時(shí)后，其相對(duì)表達(dá)量進(jìn)一步升高至（3.21±0.15），P<0.05。這表明棕櫚酸不僅在濃度上對(duì)GRP78的表達(dá)具有誘導(dǎo)作用，在時(shí)間上也存在累積效應(yīng)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激程度逐漸加深。作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CHOP）的表達(dá)變化也與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，棕櫚酸處理顯著誘導(dǎo)了CHOP的表達(dá)上調(diào)。在800μmol/L棕櫚酸處理組中，CHOP的相對(duì)表達(dá)量為（3.87±0.18），與對(duì)照組（1.00±0.05）相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在時(shí)間效應(yīng)方面，隨著棕櫚酸處理時(shí)間從24小時(shí)延長(zhǎng)至48小時(shí)，CHOP的相對(duì)表達(dá)量從（2.64±0.10）增加到（4.52±0.20），進(jìn)一步證明了棕櫚酸誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的時(shí)間依賴性。磷酸化真核起始因子2α（p-eIF2α）作為蛋白激酶RNA樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）通路的關(guān)鍵分子，其表達(dá)水平也在棕櫚酸處理后顯著升高。當(dāng)棕櫚酸濃度為600μmol/L時(shí)，p-eIF2α的相對(duì)表達(dá)量為（2.95±0.15），與對(duì)照組（1.00±0.05）相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在時(shí)間效應(yīng)上，48小時(shí)棕櫚酸處理組中p-eIF2α的相對(duì)表達(dá)量（3.56±0.18）明顯高于24小時(shí)處理組（2.23±0.09），P<0.05。這表明PERK通路在棕櫚酸誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中被激活，且激活程度與棕櫚酸的濃度和處理時(shí)間相關(guān)。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）檢測(cè)X盒結(jié)合蛋白1（XBP1）剪接體的表達(dá)，結(jié)果顯示棕櫚酸處理后，XBP1剪接體的表達(dá)顯著增加。在500μmol/L棕櫚酸處理組中，XBP1剪接體的相對(duì)表達(dá)量為（3.12±0.13），與對(duì)照組（1.00±0.05）相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在時(shí)間效應(yīng)上，48小時(shí)棕櫚酸處理組中XBP1剪接體的相對(duì)表達(dá)量（3.85±0.16）明顯高于24小時(shí)處理組（2.45±0.10），P<0.05。這表明肌醇依賴酶1（IRE1）通路在棕櫚酸誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中也被激活，且激活程度與棕櫚酸的濃度和處理時(shí)間相關(guān)。4.2.2內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的影響為了深入探究?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的影響，本研究采用4-苯基丁酸（4-PBA）作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)節(jié)劑進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，單獨(dú)使用棕櫚酸（400μmol/L）處理肝癌細(xì)胞24小時(shí)后，細(xì)胞凋亡率顯著升高，達(dá)到（35.6±2.5）%，與對(duì)照組（5.2±1.0）%相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。當(dāng)在棕櫚酸處理前1小時(shí)加入1mmol/L的4-PBA進(jìn)行預(yù)處理時(shí)，細(xì)胞凋亡率明顯降低，降至（20.8±1.8）%，與棕櫚酸單獨(dú)處理組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在棕櫚酸誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以顯著減輕棕櫚酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，進(jìn)一步驗(yàn)證了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，棕櫚酸處理顯著上調(diào)了促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，下調(diào)了抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。在棕櫚酸處理組中，Bax的相對(duì)表達(dá)量為（2.87±0.15），Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量為（0.45±0.03），與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而在4-PBA預(yù)處理組中，Bax的相對(duì)表達(dá)量降至（1.65±0.10），Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量升高至（0.78±0.04），與棕櫚酸單獨(dú)處理組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)，影響棕櫚酸誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡。在半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）家族蛋白方面，棕櫚酸處理顯著激活了Caspase-3和Caspase-9。棕櫚酸處理組中，Caspase-3和Caspase-9的活性形式表達(dá)明顯增加，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而在4-PBA預(yù)處理組中，Caspase-3和Caspase-9的活性形式表達(dá)顯著降低，與棕櫚酸單獨(dú)處理組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過(guò)激活Caspase家族蛋白，促進(jìn)棕櫚酸誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡。4.2.3內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路在其中的作用本研究對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子進(jìn)行了深入分析，以揭示其在棕櫚酸誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制。在未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）的三條主要信號(hào)通路中，肌醇依賴酶1（IRE1）通路、蛋白激酶RNA樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）通路和活化轉(zhuǎn)錄因子6（ATF6）通路均在棕櫚酸處理后發(fā)生了顯著變化。在IRE1通路中，棕櫚酸處理導(dǎo)致IRE1α的磷酸化水平顯著升高，進(jìn)而促進(jìn)了X盒結(jié)合蛋白1（XBP1）mRNA的剪接，產(chǎn)生具有活性的XBP1s。隨著棕櫚酸濃度的增加，IRE1α的磷酸化水平逐漸升高，XBP1s的表達(dá)也相應(yīng)上調(diào)。在400μmol/L棕櫚酸處理組中，IRE1α的磷酸化水平為（2.65±0.12），XBP1s的相對(duì)表達(dá)量為（3.05±0.13），與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明IRE1通路在棕櫚酸誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中被激活，且激活程度與棕櫚酸的濃度相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，IRE1α的活化可以通過(guò)激活c-Jun氨基末端激酶（JNK），誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在棕櫚酸處理組中，JNK的磷酸化水平顯著升高，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。抑制JNK的活性可以部分減輕棕櫚酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，表明IRE1-JNK信號(hào)通路在棕櫚酸誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用。PERK通路在棕櫚酸誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中也扮演著關(guān)鍵角色。棕櫚酸處理后，PERK發(fā)生二聚化并自磷酸化，進(jìn)而磷酸化真核起始因子2α（eIF2α），使eIF2α的活性受到抑制，下調(diào)胞內(nèi)蛋白合成的整體水平。同時(shí)，PERK磷酸化eIF2α后，誘導(dǎo)活化轉(zhuǎn)錄因子4（ATF4）的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而調(diào)控一系列基因的表達(dá)，其中包括CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CHOP）。隨著棕櫚酸濃度的增加，PERK的磷酸化水平、eIF2α的磷酸化水平以及ATF4和CHOP的表達(dá)均顯著升高。在600μmol/L棕櫚酸處理組中，PERK的磷酸化水平為（3.12±0.15），p-eIF2α的相對(duì)表達(dá)量為（2.87±0.13），ATF4的相對(duì)表達(dá)量為（3.56±0.18），CHOP的相對(duì)表達(dá)量為（4.21±0.20），與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明PERK通路在棕櫚酸誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中被激活，且激活程度與棕櫚酸的濃度相關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn)，抑制PERK的活性或敲低CHOP的表達(dá)，可以顯著減少棕櫚酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，表明PERK-eIF2α-ATF4-CHOP信號(hào)通路在棕櫚酸誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。ATF6通路在棕櫚酸誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中同樣被激活。棕櫚酸處理后，ATF6從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移至高爾基體，經(jīng)過(guò)水解酶S1P及S2P的依次水解，其N端被剪切，成為具有活性的轉(zhuǎn)錄因子?；罨蟮腁TF6進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)元件（ERSE）、未折疊蛋白反應(yīng)元件（UPRE）等順式作用元件結(jié)合，誘導(dǎo)包括CHOP在內(nèi)的一系列基因的表達(dá)。隨著棕櫚酸濃度的增加，ATF6的活化水平和CHOP的表達(dá)均顯著升高。在800μmol/L棕櫚