HD對HPH大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖及凋亡影響的機(jī)制探究一、引言1.1研究背景低氧性肺動(dòng)脈高壓（hypoxicpulmonaryhypertension，HPH）是一種以肺動(dòng)脈壓力異常升高為顯著特征的疾病，其病理生理機(jī)制極為復(fù)雜，涉及多種細(xì)胞過程和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。在全球范圍內(nèi)，HPH的發(fā)病率呈上升趨勢，給人類健康帶來了嚴(yán)重威脅。相關(guān)研究表明，HPH在慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者中的患病率可高達(dá)30%-80%，在阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（OSAHS）患者中的患病率約為15%-30%。由于其發(fā)病隱匿，早期診斷困難，多數(shù)患者確診時(shí)病情已較為嚴(yán)重，預(yù)后較差，5年生存率僅為30%-40%，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和壽命。目前研究認(rèn)為，HPH的發(fā)病機(jī)制主要與肺血管收縮、肺血管重塑以及炎癥反應(yīng)等因素密切相關(guān)。當(dāng)機(jī)體處于低氧環(huán)境時(shí)，肺血管內(nèi)皮細(xì)胞首先受到刺激，導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙，進(jìn)而引起血管舒縮因子失衡，如一氧化氮（NO）、內(nèi)皮素-1（ET-1）等。同時(shí)，低氧還會激活一系列細(xì)胞內(nèi)信號通路，促使肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（PASMCs）增殖、遷移，細(xì)胞外基質(zhì)合成增加，最終導(dǎo)致肺血管壁增厚、管腔狹窄，肺動(dòng)脈壓力升高。此外，炎癥細(xì)胞浸潤、炎癥因子釋放也在HPH的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用。然而，盡管在HPH的發(fā)病機(jī)制研究方面取得了一定進(jìn)展，但目前仍未完全闡明其具體發(fā)病機(jī)制，這也限制了臨床治療手段的發(fā)展。在HPH的發(fā)病過程中，PASMCs的異常增殖和凋亡失衡起著關(guān)鍵作用。正常情況下，PASMCs的增殖和凋亡處于動(dòng)態(tài)平衡，以維持肺血管的正常結(jié)構(gòu)和功能。當(dāng)受到低氧等刺激時(shí)，PASMCs的增殖能力顯著增強(qiáng)，而凋亡則受到抑制，導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量不斷增加，肺血管壁增厚，血管阻力增大，進(jìn)而推動(dòng)HPH的發(fā)生和發(fā)展。有研究表明，在HPH患者和動(dòng)物模型中，PASMCs的增殖指數(shù)明顯高于正常對照組，而凋亡指數(shù)則顯著降低。此外，PASMCs的異常增殖和凋亡失衡還會導(dǎo)致肺血管重塑，進(jìn)一步加重肺動(dòng)脈高壓。因此，深入研究PASMCs增殖和凋亡的調(diào)控機(jī)制，對于揭示HPH的發(fā)病機(jī)制、尋找有效的治療靶點(diǎn)具有重要意義。硫化氫（hydrogensulfide，H2S）作為一種新型氣體信號分子，近年來在心血管疾病領(lǐng)域受到了廣泛關(guān)注。越來越多的研究表明，H2S在體內(nèi)具有多種重要的生理功能，如舒張血管、抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡等。在HPH的研究中發(fā)現(xiàn)，H2S與PASMCs的增殖和凋亡密切相關(guān)。在低氧性肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型中，給予外源性H2S供體可以顯著抑制PASMCs的增殖，促進(jìn)其凋亡，從而減輕肺血管重塑，降低肺動(dòng)脈壓力。然而，目前關(guān)于H2S對PASMCs增殖和凋亡的具體作用機(jī)制尚未完全明確，仍存在許多爭議和未知領(lǐng)域。本研究旨在探討H2S對HPH大鼠PASMCs增殖及凋亡的影響，并深入研究其潛在的作用機(jī)制，為HPH的防治提供新的理論依據(jù)和治療靶點(diǎn)。通過建立HPH大鼠模型，分離培養(yǎng)PASMCs，給予不同濃度的H2S供體干預(yù)，觀察PASMCs增殖和凋亡的變化，檢測相關(guān)信號通路蛋白的表達(dá)，有望揭示H2S在HPH發(fā)病過程中的作用機(jī)制，為臨床治療HPH提供新的思路和方法。1.2研究目的和意義本研究旨在深入探究硫化氫（H2S）對低氧性肺動(dòng)脈高壓（HPH）大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（PASMCs）增殖及凋亡的影響，并進(jìn)一步闡明其潛在的分子機(jī)制。通過建立HPH大鼠模型，分離培養(yǎng)PASMCs，給予不同濃度的H2S供體干預(yù)，運(yùn)用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等技術(shù)手段，檢測PASMCs的增殖活性、凋亡率以及相關(guān)信號通路蛋白的表達(dá)變化，從而明確H2S在HPH發(fā)病過程中對PASMCs的作用及其機(jī)制。本研究具有重要的理論和實(shí)踐意義。從理論層面來看，H2S作為一種新型氣體信號分子，在心血管系統(tǒng)中的作用機(jī)制尚未完全明確，尤其是在HPH發(fā)病過程中對PASMCs增殖和凋亡的調(diào)控機(jī)制存在諸多未知。本研究將為深入理解H2S在HPH發(fā)病機(jī)制中的作用提供新的理論依據(jù)，豐富和完善HPH的發(fā)病機(jī)制理論體系，有助于揭示氣體信號分子在心血管疾病中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為后續(xù)相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。從實(shí)踐意義角度出發(fā)，HPH是一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，目前臨床上缺乏有效的治療手段。本研究若能明確H2S對HPH大鼠PASMCs增殖及凋亡的影響及其機(jī)制，將為HPH的治療提供新的潛在靶點(diǎn)和治療策略。未來有望通過調(diào)節(jié)體內(nèi)H2S水平或干預(yù)其相關(guān)信號通路，開發(fā)出新型的治療藥物或治療方法，為HPH患者帶來新的希望，改善患者的預(yù)后和生活質(zhì)量，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值和社會效益。二、HPH與肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的理論基礎(chǔ)2.1HPH概述2.1.1HPH的定義與分類低氧性肺動(dòng)脈高壓（HPH）是指由于各種原因?qū)е碌臋C(jī)體長期處于低氧環(huán)境，進(jìn)而引起的以肺動(dòng)脈壓力異常升高為主要特征的病理生理綜合征。正常情況下，肺動(dòng)脈收縮壓為18-25mmHg，舒張壓為6-10mmHg，平均肺動(dòng)脈壓在12-16mmHg之間。當(dāng)靜息狀態(tài)下，平均肺動(dòng)脈壓≥25mmHg，且排除其他引起肺動(dòng)脈高壓的原因，即可診斷為HPH。根據(jù)病因，HPH可分為以下幾類：一是慢性阻塞性肺疾?。–OPD）相關(guān)的HPH，這是最為常見的類型。COPD患者由于氣道阻塞、通氣功能障礙，導(dǎo)致機(jī)體長期缺氧，肺血管收縮，肺血管阻力增加，最終引發(fā)肺動(dòng)脈高壓。有研究表明，約80%的COPD患者在疾病進(jìn)展過程中會出現(xiàn)不同程度的HPH。二是睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（SAHS）相關(guān)的HPH。SAHS患者在睡眠過程中反復(fù)出現(xiàn)呼吸暫停和低通氣，導(dǎo)致夜間低氧血癥，長期慢性缺氧可刺激肺血管收縮，引起肺動(dòng)脈壓力升高。流行病學(xué)調(diào)查顯示，SAHS患者中HPH的患病率約為30%-50%。三是高原性HPH，多發(fā)生于長期生活在高原地區(qū)的人群。高原地區(qū)空氣稀薄，氧分壓降低，人體吸入的氧氣不足，為了滿足機(jī)體對氧的需求，肺血管會發(fā)生代償性收縮，長期作用下導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓。此外，間質(zhì)性肺疾病、先天性心臟病等也可并發(fā)HPH，不同類型的HPH在發(fā)病機(jī)制、臨床表現(xiàn)和治療方法上存在一定差異。不同類型的HPH在臨床上的表現(xiàn)也有所不同。COPD相關(guān)的HPH患者，除了有咳嗽、咳痰、呼吸困難等COPD的典型癥狀外，還會逐漸出現(xiàn)活動(dòng)耐力下降、乏力、心悸等右心功能不全的表現(xiàn)。SAHS相關(guān)的HPH患者，往往有夜間打鼾、呼吸暫停、憋醒等癥狀，白天則表現(xiàn)為嗜睡、乏力、頭痛等。高原性HPH患者在進(jìn)入高原后，會出現(xiàn)頭痛、頭暈、呼吸困難、心慌等急性高原反應(yīng)癥狀，隨著時(shí)間推移，肺動(dòng)脈高壓逐漸加重，可出現(xiàn)右心室肥厚、右心衰竭等表現(xiàn)。2.1.2HPH的流行病學(xué)現(xiàn)狀HPH在全球范圍內(nèi)均有發(fā)病，且發(fā)病率呈上升趨勢。在歐美國家，COPD患者中HPH的患病率約為20%-40%，隨著COPD病情的加重，HPH的患病率也相應(yīng)增加。在發(fā)展中國家，由于醫(yī)療條件相對落后，對COPD等基礎(chǔ)疾病的診治不及時(shí)，HPH的患病率可能更高。據(jù)統(tǒng)計(jì)，印度COPD患者中HPH的患病率高達(dá)50%-60%。在我國，HPH同樣是一個(gè)不容忽視的公共衛(wèi)生問題。一項(xiàng)針對我國北方地區(qū)的流行病學(xué)調(diào)查顯示，COPD患者中HPH的患病率約為35%，且隨著年齡的增長，患病率逐漸升高。在老年COPD患者中，HPH的患病率可超過50%。近年來，隨著環(huán)境污染的加劇、老齡化社會的到來以及人們生活方式的改變，HPH的發(fā)病率呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢。空氣污染中的有害物質(zhì)，如顆粒物、二氧化硫、氮氧化物等，可刺激呼吸道，加重肺部炎癥，促進(jìn)COPD等疾病的發(fā)生發(fā)展，進(jìn)而增加HPH的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。老齡化社會的到來使得老年人群體不斷擴(kuò)大，而老年人往往存在多種慢性疾病，如COPD、高血壓、心臟病等，這些疾病相互影響，進(jìn)一步增加了HPH的發(fā)病幾率。此外，吸煙、缺乏運(yùn)動(dòng)、不健康飲食等不良生活方式也與HPH的發(fā)病密切相關(guān)。HPH的高發(fā)病率和患病率給社會和患者帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。一方面，HPH患者需要長期接受治療，包括藥物治療、氧療等，這不僅增加了患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，也給家庭和社會帶來了巨大的醫(yī)療費(fèi)用支出。另一方面，HPH患者的生活質(zhì)量明顯下降，由于呼吸困難、乏力等癥狀，患者的日?；顒?dòng)受到限制，嚴(yán)重影響了患者的心理健康和社交生活。同時(shí)，HPH若得不到及時(shí)有效的治療，病情會逐漸進(jìn)展，最終導(dǎo)致右心衰竭，危及患者生命。2.1.3HPH的發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展目前，HPH的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，但研究認(rèn)為主要涉及以下幾個(gè)方面：一是缺氧誘導(dǎo)的肺血管收縮。當(dāng)機(jī)體處于低氧環(huán)境時(shí)，肺血管內(nèi)皮細(xì)胞首先受到刺激，導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙，血管舒縮因子失衡。內(nèi)皮細(xì)胞分泌的一氧化氮（NO）具有舒張血管的作用，而內(nèi)皮素-1（ET-1）則可使血管收縮。在低氧狀態(tài)下，NO的合成和釋放減少，ET-1的表達(dá)和分泌增加，導(dǎo)致肺血管收縮，肺動(dòng)脈壓力升高。研究表明，給予外源性NO供體或ET-1受體拮抗劑，可以部分緩解低氧誘導(dǎo)的肺血管收縮。二是肺血管重塑。長期低氧刺激可導(dǎo)致肺血管壁結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，即肺血管重塑。這一過程涉及肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（PASMCs）的增殖、遷移，細(xì)胞外基質(zhì)合成增加以及血管壁炎癥細(xì)胞浸潤等。PASMCs在低氧刺激下，通過激活一系列細(xì)胞內(nèi)信號通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）通路等，促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移，導(dǎo)致肺血管壁增厚，管腔狹窄，肺血管阻力增加。三是炎癥反應(yīng)。炎癥在HPH的發(fā)病過程中也起著重要作用。低氧可誘導(dǎo)肺組織中炎癥細(xì)胞浸潤，如巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等，這些炎癥細(xì)胞釋放多種炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，進(jìn)一步加重肺血管內(nèi)皮損傷和炎癥反應(yīng)，促進(jìn)肺血管重塑和肺動(dòng)脈高壓的發(fā)展。臨床研究發(fā)現(xiàn)，HPH患者血清中TNF-α、IL-6等炎癥因子水平明顯升高，且與肺動(dòng)脈壓力呈正相關(guān)。四是氧化應(yīng)激。低氧環(huán)境下，機(jī)體產(chǎn)生過多的活性氧（ROS），導(dǎo)致氧化應(yīng)激失衡。ROS可損傷肺血管內(nèi)皮細(xì)胞和PASMCs，促進(jìn)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，同時(shí)還可激活相關(guān)信號通路，參與肺血管重塑。研究表明，給予抗氧化劑可以減輕低氧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷，改善肺血管功能。盡管目前對HPH的發(fā)病機(jī)制有了一定的認(rèn)識，但仍存在許多研究空白與不足。例如，對于不同信號通路之間的相互作用及其在HPH發(fā)病中的協(xié)同機(jī)制尚不完全清楚；炎癥反應(yīng)與肺血管重塑之間的具體聯(lián)系和調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究；此外，遺傳因素在HPH發(fā)病中的作用也有待進(jìn)一步探討，雖然已有研究發(fā)現(xiàn)一些基因多態(tài)性與HPH的發(fā)病相關(guān)，但具體的遺傳機(jī)制仍需進(jìn)一步明確。2.2肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞在HPH中的作用2.2.1肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的生理功能肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（PASMCs）是構(gòu)成肺動(dòng)脈血管壁中膜的主要細(xì)胞成分，在維持肺動(dòng)脈正常生理功能方面發(fā)揮著不可或缺的作用。在維持肺動(dòng)脈張力方面，PASMCs能夠根據(jù)機(jī)體的生理需求，通過自身的收縮和舒張來調(diào)節(jié)血管壁的張力。當(dāng)機(jī)體需要增加肺部血流量時(shí)，PASMCs舒張，使肺動(dòng)脈管徑增大，血流阻力減小，從而保證充足的血液供應(yīng)；反之，當(dāng)機(jī)體需要減少肺部血流量時(shí)，PASMCs收縮，肺動(dòng)脈管徑縮小，血流阻力增大。這種精確的調(diào)節(jié)機(jī)制對于維持肺動(dòng)脈壓力的穩(wěn)定至關(guān)重要，有助于確保肺部血液循環(huán)的正常進(jìn)行。在調(diào)節(jié)血管口徑方面，PASMCs的收縮和舒張活動(dòng)直接決定了肺動(dòng)脈血管口徑的大小。血管口徑的變化又會影響血流速度和血流量，進(jìn)而對肺循環(huán)血流動(dòng)力學(xué)產(chǎn)生影響。在正常生理狀態(tài)下，PASMCs通過對血管口徑的精細(xì)調(diào)節(jié)，使得肺循環(huán)能夠適應(yīng)不同的生理需求，如在運(yùn)動(dòng)時(shí)，能夠增加肺部血流量，滿足機(jī)體對氧氣的需求；在休息時(shí)，則適當(dāng)減少血流量，避免不必要的能量消耗。此外，PASMCs還參與了肺血管的結(jié)構(gòu)維持和修復(fù)過程，通過合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)成分，如膠原蛋白、彈性蛋白等，保持血管壁的彈性和穩(wěn)定性。PASMCs在參與肺循環(huán)血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定方面也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它與血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等相互作用，共同維持肺血管的正常結(jié)構(gòu)和功能。血管內(nèi)皮細(xì)胞能夠分泌多種血管活性物質(zhì)，如一氧化氮（NO）、內(nèi)皮素-1（ET-1）等，這些物質(zhì)可以調(diào)節(jié)PASMCs的收縮和舒張功能。NO具有舒張血管的作用，它可以通過激活鳥苷酸環(huán)化酶，使細(xì)胞內(nèi)cGMP水平升高，從而導(dǎo)致PASMCs舒張；而ET-1則是一種強(qiáng)效的血管收縮因子，它可以與PASMCs表面的受體結(jié)合，激活一系列細(xì)胞內(nèi)信號通路，導(dǎo)致PASMCs收縮。通過這種相互作用，PASMCs能夠根據(jù)血管內(nèi)皮細(xì)胞傳遞的信號，及時(shí)調(diào)整自身的收縮和舒張狀態(tài)，維持肺循環(huán)血流動(dòng)力學(xué)的穩(wěn)定。2.2.2異常增殖和凋亡與HPH的關(guān)聯(lián)在低氧性肺動(dòng)脈高壓（HPH）的發(fā)生發(fā)展過程中，PASMCs的異常增殖和凋亡失衡起著關(guān)鍵作用。當(dāng)機(jī)體處于低氧環(huán)境時(shí)，PASMCs會受到一系列刺激，導(dǎo)致其增殖活性顯著增強(qiáng)。低氧可以激活細(xì)胞內(nèi)的多種信號通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）通路等。這些信號通路的激活會促進(jìn)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，如細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）等，從而推動(dòng)PASMCs從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞增殖。有研究表明，在低氧條件下培養(yǎng)的PASMCs中，CyclinD1和CDK4的表達(dá)水平明顯升高，細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)。PASMCs的異常增殖會導(dǎo)致血管壁增厚、管腔狹窄。隨著PASMCs數(shù)量的不斷增加，血管壁中膜的厚度逐漸增大，而血管管腔則相應(yīng)變小。這使得肺血管的阻力明顯增加，肺動(dòng)脈壓力逐漸升高。在HPH患者和動(dòng)物模型中，均可以觀察到肺動(dòng)脈血管壁增厚、管腔狹窄的病理改變，且這種改變與PASMCs的增殖程度密切相關(guān)。此外，PASMCs的異常增殖還會導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)合成增加，進(jìn)一步加重血管壁的增厚和硬化，影響血管的彈性和舒縮功能。除了增殖異常外，PASMCs的凋亡失衡也是HPH發(fā)生發(fā)展的重要因素。正常情況下，PASMCs的凋亡與增殖處于動(dòng)態(tài)平衡，以維持細(xì)胞數(shù)量的穩(wěn)定和血管結(jié)構(gòu)的正常。在低氧等刺激下，PASMCs的凋亡受到抑制。低氧可以通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，如B細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）家族蛋白、半胱天冬酶（Caspase）等，抑制PASMCs的凋亡。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，在低氧條件下，其表達(dá)水平會升高，從而抑制細(xì)胞凋亡；而Caspase是一類凋亡執(zhí)行蛋白，低氧會抑制Caspase的活性，使細(xì)胞凋亡難以發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，在HPH大鼠模型中，PASMCs中Bcl-2的表達(dá)明顯增加，而Caspase-3的活性則顯著降低，表明PASMCs的凋亡受到了抑制。PASMCs凋亡失衡會破壞肺血管的正常組織結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致血管壁的穩(wěn)定性下降。凋亡受阻使得異常增殖的PASMCs不能及時(shí)被清除，進(jìn)一步加劇了血管壁的增厚和管腔狹窄。此外，凋亡失衡還會影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷和炎癥反應(yīng)的發(fā)生，進(jìn)一步促進(jìn)HPH的發(fā)展。PASMCs凋亡失衡會導(dǎo)致血管壁中細(xì)胞外基質(zhì)的代謝紊亂，使得膠原蛋白、彈性蛋白等合成增加，降解減少，血管壁變得僵硬，彈性降低，這也會加重肺動(dòng)脈高壓的程度。三、HD的相關(guān)研究3.1HD的特性及作用機(jī)制3.1.1HD的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)硫化氫（hydrogensulfide，H2S）是一種具有臭雞蛋氣味的無色氣體，在常溫常壓下易溶于水，其水溶液呈弱酸性，稱為氫硫酸。H2S的化學(xué)結(jié)構(gòu)簡單，由兩個(gè)氫原子和一個(gè)硫原子通過共價(jià)鍵連接而成，其分子式為H2S，分子量為34.08。在體內(nèi)，H2S主要由含硫氨基酸，如半胱氨酸，在一系列酶的催化作用下產(chǎn)生。其中，胱硫醚β-合酶（CBS）、胱硫醚γ-裂解酶（CSE）和3-巰基丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶（3-MST）是參與H2S生成的關(guān)鍵酶。H2S的物理和化學(xué)性質(zhì)對其在生物體內(nèi)的作用機(jī)制和生物活性具有重要影響。由于其具有脂溶性，H2S能夠自由通過細(xì)胞膜，迅速擴(kuò)散到細(xì)胞內(nèi)，與細(xì)胞內(nèi)的靶點(diǎn)相互作用。這種特性使得H2S能夠快速調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的生理過程，如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)等。此外，H2S的弱酸性使其在生物體內(nèi)能夠以分子態(tài)（H2S）和離子態(tài)（HS-、S2-）兩種形式存在，且這兩種形式的比例會受到環(huán)境pH值的影響。在生理pH值條件下，H2S主要以HS-的形式存在，但分子態(tài)的H2S更具生物活性，能夠更容易地穿透細(xì)胞膜，發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。H2S的化學(xué)性質(zhì)較為活潑，具有較強(qiáng)的還原性。在生物體內(nèi)，H2S可以與多種生物分子發(fā)生反應(yīng)，如蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等，從而調(diào)節(jié)這些生物分子的功能。H2S可以通過巰基化修飾作用，將硫原子添加到蛋白質(zhì)的半胱氨酸殘基上，改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。這種修飾作用可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的活性、穩(wěn)定性和定位，進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)的信號通路和生理過程。此外，H2S還可以與金屬離子結(jié)合，形成金屬硫化物，從而影響金屬離子的代謝和功能。3.1.2HD作用于細(xì)胞的一般機(jī)制H2S進(jìn)入細(xì)胞的方式主要是通過自由擴(kuò)散。由于其脂溶性，H2S能夠直接穿透細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。一旦進(jìn)入細(xì)胞，H2S可以與多種細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)相互作用，影響細(xì)胞內(nèi)信號通路和生理過程。H2S的一個(gè)重要作用靶點(diǎn)是離子通道。研究表明，H2S可以調(diào)節(jié)多種離子通道的活性，如鉀離子通道、鈣離子通道、氯離子通道等。H2S可以通過巰基化修飾作用，調(diào)節(jié)鉀離子通道的活性，導(dǎo)致細(xì)胞膜超極化，從而抑制細(xì)胞的興奮性。在肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中，H2S可以激活大電導(dǎo)鈣激活鉀通道（BKCa），使鉀離子外流增加，細(xì)胞膜超極化，抑制鈣離子內(nèi)流，從而導(dǎo)致血管舒張。此外，H2S還可以調(diào)節(jié)鈣離子通道的活性，影響細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的收縮、增殖和凋亡等生理過程。H2S還可以與細(xì)胞內(nèi)的酶相互作用，調(diào)節(jié)酶的活性。H2S可以通過巰基化修飾作用，調(diào)節(jié)一些關(guān)鍵酶的活性，如蛋白激酶、磷酸酶、氧化還原酶等。在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，H2S可以調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）通路等的活性。在低氧刺激下，H2S可以抑制MAPK通路的激活，從而抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖。此外，H2S還可以調(diào)節(jié)PI3K/Akt通路的活性，促進(jìn)細(xì)胞的存活和抗凋亡作用。H2S還可以通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)來影響細(xì)胞的生理過程。研究發(fā)現(xiàn)，H2S可以調(diào)節(jié)一些與細(xì)胞增殖、凋亡、炎癥反應(yīng)等相關(guān)基因的表達(dá)。在低氧性肺動(dòng)脈高壓中，H2S可以下調(diào)增殖相關(guān)基因的表達(dá)，如細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）等，從而抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖。同時(shí)，H2S可以上調(diào)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，如Bax、Caspase-3等，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外，H2S還可以調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，抑制炎癥因子的釋放，減輕炎癥反應(yīng)。3.2HD在細(xì)胞增殖和凋亡調(diào)節(jié)中的研究現(xiàn)狀3.2.1HD對不同細(xì)胞類型增殖和凋亡的影響硫化氫（H2S）作為一種內(nèi)源性氣體信號分子，對多種細(xì)胞類型的增殖和凋亡產(chǎn)生影響，且作用效果存在差異。在心血管系統(tǒng)相關(guān)細(xì)胞中，研究發(fā)現(xiàn)H2S對血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）的增殖和凋亡具有重要調(diào)節(jié)作用。在體外實(shí)驗(yàn)中，給予外源性H2S供體（如NaHS）可以抑制血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導(dǎo)的VSMCs增殖。研究表明，在AngⅡ刺激下，VSMCs的增殖活性明顯增強(qiáng)，細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）和增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）的表達(dá)顯著上調(diào)；而加入NaHS后，VSMCs的增殖受到抑制，CyclinD1和PCNA的表達(dá)水平明顯降低。這表明H2S可能通過抑制細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而阻礙VSMCs從G1期進(jìn)入S期，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。對于心肌細(xì)胞，H2S在缺血-再灌注損傷中對細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。在心肌缺血-再灌注模型中，心肌細(xì)胞凋亡明顯增加，而給予H2S供體后，凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著減少。研究發(fā)現(xiàn)，H2S可以上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，同時(shí)抑制半胱天冬酶-3（Caspase-3）的活性，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡，減輕缺血-再灌注損傷。在神經(jīng)系統(tǒng)中，H2S對神經(jīng)元細(xì)胞的增殖和凋亡也有影響。在體外培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞中，低濃度的H2S可以促進(jìn)神經(jīng)元的增殖，增加神經(jīng)元的存活數(shù)量；而高濃度的H2S則可能誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。有研究表明，低濃度的NaHS（10-100μmol/L）可以促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞的DNA合成，增加細(xì)胞數(shù)量；當(dāng)NaHS濃度達(dá)到500μmol/L時(shí)，神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡率明顯升高，且伴有Caspase-3活性增強(qiáng)和Bax表達(dá)上調(diào)。在腫瘤細(xì)胞中，H2S的作用較為復(fù)雜。對于某些腫瘤細(xì)胞，H2S可以抑制其增殖并誘導(dǎo)凋亡。在肝癌細(xì)胞中，給予H2S供體可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，H2S可以下調(diào)肝癌細(xì)胞中增殖相關(guān)基因的表達(dá)，如c-Myc、CyclinD1等，同時(shí)上調(diào)凋亡相關(guān)基因Bax、Caspase-3的表達(dá)。然而，也有研究報(bào)道在某些情況下，H2S可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。在乳腺癌細(xì)胞中，一定濃度的H2S可以激活PI3K/Akt信號通路，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移。這種差異可能與腫瘤細(xì)胞的類型、H2S的濃度以及作用時(shí)間等因素有關(guān)。H2S對不同細(xì)胞類型增殖和凋亡影響的差異，主要原因可能在于不同細(xì)胞類型中H2S的作用靶點(diǎn)和信號通路存在差異。不同細(xì)胞表面的受體種類和數(shù)量不同，對H2S的敏感性也不同，導(dǎo)致H2S在不同細(xì)胞中引發(fā)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程和生物學(xué)效應(yīng)存在差異。此外，細(xì)胞所處的微環(huán)境，如生長因子、細(xì)胞因子的濃度等，也可能影響H2S對細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)節(jié)作用。3.2.2相關(guān)作用機(jī)制的研究進(jìn)展目前研究表明，硫化氫（H2S）調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡的信號通路和分子機(jī)制較為復(fù)雜，涉及多個(gè)環(huán)節(jié)。在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖方面，H2S可以通過多種信號通路發(fā)揮作用。H2S可以抑制絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路。在血管平滑肌細(xì)胞中，當(dāng)細(xì)胞受到生長因子等刺激時(shí)，MAPK信號通路被激活，其中細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）1/2磷酸化水平升高，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，如CyclinD1、c-Myc等。而H2S可以通過抑制ERK1/2的磷酸化，阻斷MAPK信號通路的激活，從而抑制細(xì)胞增殖。研究發(fā)現(xiàn)，在給予H2S供體后，血管平滑肌細(xì)胞中ERK1/2的磷酸化水平明顯降低，CyclinD1和c-Myc的表達(dá)也隨之減少。H2S還可以調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路。在正常情況下，PI3K被激活后，催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3進(jìn)一步激活A(yù)kt，激活的Akt可以促進(jìn)細(xì)胞存活和增殖。在某些細(xì)胞中，H2S可以抑制PI3K的活性，減少PIP3的生成，從而抑制Akt的激活，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。在腫瘤細(xì)胞中，H2S對PI3K/Akt信號通路的調(diào)節(jié)作用則較為復(fù)雜，有時(shí)可能促進(jìn)該信號通路的激活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖；而在另一些情況下，則可能抑制該信號通路，抑制腫瘤細(xì)胞增殖。在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡方面，H2S主要通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性來發(fā)揮作用。H2S可以調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)。Bcl-2家族蛋白包括抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xl）和促凋亡蛋白（如Bax、Bad），它們之間的平衡決定了細(xì)胞的凋亡命運(yùn)。在心肌細(xì)胞缺血-再灌注損傷模型中，H2S可以上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，使Bcl-2/Bax比值升高，從而抑制細(xì)胞凋亡。研究表明，給予H2S供體后，心肌細(xì)胞中Bcl-2的蛋白水平明顯升高，Bax的蛋白水平降低，細(xì)胞凋亡率顯著下降。H2S還可以調(diào)節(jié)半胱天冬酶（Caspase）家族的活性。Caspase是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者，其中Caspase-3是凋亡執(zhí)行階段的關(guān)鍵酶。在多種細(xì)胞凋亡模型中，H2S可以抑制Caspase-3的活性，從而抑制細(xì)胞凋亡。在神經(jīng)元細(xì)胞受到氧化應(yīng)激損傷時(shí)，細(xì)胞內(nèi)Caspase-3活性升高，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；而給予H2S供體后，Caspase-3的活性被抑制，細(xì)胞凋亡減少。盡管目前對H2S調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡的機(jī)制有了一定的認(rèn)識，但仍存在許多爭議和未解決的問題。不同研究中H2S對同一信號通路的調(diào)節(jié)作用有時(shí)存在矛盾。在腫瘤細(xì)胞中，關(guān)于H2S對PI3K/Akt信號通路的調(diào)節(jié)作用，不同研究結(jié)果不盡相同，有的研究表明H2S促進(jìn)該信號通路激活，有的則表明H2S抑制該信號通路。這可能與實(shí)驗(yàn)條件、腫瘤細(xì)胞類型以及H2S的濃度和作用時(shí)間等因素有關(guān)，但具體原因尚未完全明確。對于H2S調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡的上游信號分子和受體，目前也尚未完全確定。雖然已知H2S可以通過自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞，但細(xì)胞內(nèi)感知H2S的受體以及H2S如何啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，仍有待進(jìn)一步研究。此外，H2S與其他氣體信號分子（如一氧化氮、一氧化碳）之間的相互作用及其在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡中的協(xié)同或拮抗機(jī)制，也需要深入探討。四、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法4.1實(shí)驗(yàn)材料4.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用SPF級雄性SD大鼠30只，體重200-250g，購自[具體動(dòng)物供應(yīng)商名稱]。大鼠飼養(yǎng)于溫度為(23±2)℃、相對濕度為(50±10)%的環(huán)境中，保持12h光照/12h黑暗的晝夜節(jié)律，自由攝食和飲水。動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。適應(yīng)性飼養(yǎng)期間，密切觀察大鼠的飲食、活動(dòng)、精神狀態(tài)等一般情況，確保大鼠健康狀況良好，以減少實(shí)驗(yàn)誤差。4.1.2細(xì)胞來源與培養(yǎng)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（PASMCs）取自上述SD大鼠。具體分離方法如下：將大鼠用10%水合氯醛（3ml/kg）腹腔注射麻醉后，迅速開胸取出肺組織，置于預(yù)冷的含雙抗（青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml）的PBS緩沖液中沖洗，去除血液和雜質(zhì)。分離出肺動(dòng)脈，剪去周圍結(jié)締組織，將肺動(dòng)脈剪成1mm3左右的小塊，放入含有0.1%Ⅱ型膠原酶和0.25%胰蛋白酶的混合消化液中，37℃消化30-40min，期間輕輕振蕩。待組織塊消化成單細(xì)胞懸液后，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，1000rpm離心5min，棄上清。用含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)24h后換液，去除未貼壁的細(xì)胞和雜質(zhì)。之后每2-3天換液一次，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)進(jìn)行傳代。傳代時(shí)，先用PBS沖洗細(xì)胞2次，加入0.25%胰蛋白酶消化液，37℃消化1-2min，待細(xì)胞變圓、脫壁后，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，吹打細(xì)胞使其分散成單細(xì)胞懸液，按1:3的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)選用第3-5代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究，以保證細(xì)胞的生物學(xué)特性穩(wěn)定。4.1.3主要試劑與儀器實(shí)驗(yàn)所需的硫化氫供體為硫氫化鈉（NaHS），購自[試劑供應(yīng)商名稱]，用無菌PBS配制成不同濃度的溶液備用。細(xì)胞增殖檢測試劑選用CellCountingKit-8（CCK-8）試劑盒，購自[具體品牌]，用于檢測細(xì)胞增殖活性。細(xì)胞凋亡檢測采用AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，購自[試劑供應(yīng)商名稱]，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)用到的主要儀器設(shè)備包括：CO?培養(yǎng)箱（[品牌及型號]），用于細(xì)胞培養(yǎng)；倒置顯微鏡（[品牌及型號]），觀察細(xì)胞形態(tài)和生長狀態(tài)；酶標(biāo)儀（[品牌及型號]），用于CCK-8實(shí)驗(yàn)中檢測吸光度值；流式細(xì)胞儀（[品牌及型號]），進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測；低溫離心機(jī)（[品牌及型號]），用于細(xì)胞離心收集；超凈工作臺（[品牌及型號]），提供無菌操作環(huán)境。4.2實(shí)驗(yàn)方法4.2.1HPH大鼠模型的建立與鑒定采用常壓低氧法建立HPH大鼠模型。將30只SD大鼠隨機(jī)分為對照組（10只）和低氧組（20只）。低氧組大鼠置于自制的低氧艙內(nèi)，艙內(nèi)氧濃度維持在（10±0.5）%，每天持續(xù)低氧暴露8h，每周暴露6d，共持續(xù)3周；對照組大鼠置于正常環(huán)境中飼養(yǎng)。在低氧暴露3周后，對低氧組大鼠進(jìn)行模型鑒定。首先，采用右心導(dǎo)管法檢測肺動(dòng)脈壓力。將大鼠用10%水合氯醛（3ml/kg）腹腔注射麻醉后，仰臥位固定于手術(shù)臺上，頸部正中切開皮膚，鈍性分離右側(cè)頸外靜脈，插入充滿肝素生理鹽水的聚乙烯導(dǎo)管，經(jīng)頸外靜脈緩慢插入右心室，連接壓力換能器，通過BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)記錄肺動(dòng)脈收縮壓（PASP）、舒張壓（PADP）和平均肺動(dòng)脈壓（mPAP）。計(jì)算右心室肥厚指數(shù)（RVHI），以評估右心室肥厚程度。將大鼠處死后，迅速取出心臟，用生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干水分，分離右心室（RV）、左心室加室間隔（LV+S），分別稱重，計(jì)算RVHI=RV/（LV+S）。同時(shí)，取部分肺組織，用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，在光鏡下觀察肺血管形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，如血管壁增厚、管腔狹窄等情況。當(dāng)mPAP較對照組升高25%以上，且RVHI明顯增加，同時(shí)肺血管出現(xiàn)典型的病理改變時(shí)，判定HPH大鼠模型建立成功。4.2.2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組與處理將培養(yǎng)至第3-5代的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（PASMCs），調(diào)整細(xì)胞密度為5×10?個(gè)/ml，接種于96孔板、6孔板或細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每孔或每個(gè)培養(yǎng)皿接種適量細(xì)胞懸液，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行分組處理。實(shí)驗(yàn)分為以下幾組：對照組，正常培養(yǎng)的PASMCs，不進(jìn)行任何處理；HPH模型組，將細(xì)胞置于含1%O?的低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，建立細(xì)胞低氧模型；HD低劑量處理組，在建立細(xì)胞低氧模型的基礎(chǔ)上，加入終濃度為50μmol/L的NaHS（硫化氫供體，作為HD）處理24h；HD中劑量處理組，加入終濃度為100μmol/L的NaHS處理24h；HD高劑量處理組，加入終濃度為200μmol/L的NaHS處理24h。4.2.3檢測指標(biāo)與方法采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性。在處理結(jié)束前2h，向96孔板中每孔加入10μlCCK-8試劑，繼續(xù)孵育2h后，用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD）值，根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞增殖率。增殖率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-對照組OD值）/對照組OD值×100%。采用EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶核苷）法檢測細(xì)胞增殖。按照EdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作。將細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，分組處理后，加入EdU工作液，37℃孵育2h，然后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，0.5%TritonX-100破膜，再加入Click反應(yīng)液進(jìn)行染色，最后用DAPI染核，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，計(jì)數(shù)EdU陽性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算EdU陽性細(xì)胞比例，以反映細(xì)胞增殖情況。EdU陽性細(xì)胞比例（%）=EdU陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。采用AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡。將處理后的細(xì)胞用胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞懸液，1000rpm離心5min，棄上清，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次。按照AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI染色液，輕輕混勻，避光孵育15min，再加入400μl結(jié)合緩沖液，立即用流式細(xì)胞儀檢測，分析細(xì)胞凋亡率。采用TUNEL（脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法）法檢測細(xì)胞凋亡。將細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，分組處理后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，0.1%TritonX-100破膜，按照TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，加入TdT酶和生物素標(biāo)記的dUTP，37℃孵育60min，再加入鏈霉親和素-HRP，室溫孵育30min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，計(jì)數(shù)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算TUNEL陽性細(xì)胞比例，以評估細(xì)胞凋亡情況。TUNEL陽性細(xì)胞比例（%）=TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測相關(guān)蛋白表達(dá)。收集處理后的細(xì)胞，加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，然后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉2h，加入相應(yīng)的一抗（如增殖相關(guān)蛋白PCNA、CyclinD1抗體，凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2抗體等），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10min，加入相應(yīng)的二抗（HRP標(biāo)記），室溫孵育1h，再次用TBST洗滌膜3次，每次10min。最后，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光、拍照，分析蛋白條帶的灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對表達(dá)量。目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測相關(guān)基因表達(dá)。收集處理后的細(xì)胞，用Trizol試劑提取總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后以cDNA為模板，根據(jù)目的基因（如增殖相關(guān)基因c-Myc、CyclinD1基因，凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2基因等）的引物序列，進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系和條件按照qRT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行設(shè)置。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)Ct值，采用2^-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量，以β-actin作為內(nèi)參基因。目的基因相對表達(dá)量=2^-ΔΔCt，其中ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）實(shí)驗(yàn)組-（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）對照組。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果5.1HD對HPH大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響采用CCK-8法檢測不同處理組肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（PASMCs）的增殖活性，結(jié)果顯示，與對照組相比，HPH模型組細(xì)胞在450nm波長處的吸光度（OD）值顯著升高（P<0.05），表明低氧刺激可明顯促進(jìn)PASMCs的增殖。與HPH模型組相比，HD低、中、高劑量處理組細(xì)胞的OD值均顯著降低（P<0.05），且呈劑量依賴性，HD高劑量處理組的OD值最低，說明HD能夠抑制HPH大鼠PASMCs的增殖，且隨著HD濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)。為進(jìn)一步驗(yàn)證CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用EdU法檢測細(xì)胞增殖情況。熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對照組中EdU陽性細(xì)胞（紅色熒光）較少，HPH模型組EdU陽性細(xì)胞明顯增多，表明低氧誘導(dǎo)PASMCs增殖。而HD處理組中，EdU陽性細(xì)胞數(shù)量隨著HD劑量的增加逐漸減少，HD高劑量處理組的EdU陽性細(xì)胞數(shù)量最少。通過對EdU陽性細(xì)胞比例的統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果與CCK-8實(shí)驗(yàn)一致，即HPH模型組EdU陽性細(xì)胞比例顯著高于對照組（P<0.05），HD低、中、高劑量處理組EdU陽性細(xì)胞比例均顯著低于HPH模型組（P<0.05），且呈劑量依賴性。通過蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測增殖相關(guān)蛋白PCNA、CyclinD1的表達(dá)。結(jié)果顯示，HPH模型組中PCNA、CyclinD1蛋白的表達(dá)水平顯著高于對照組（P<0.05），說明低氧刺激可上調(diào)增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖。HD處理組中，PCNA、CyclinD1蛋白的表達(dá)水平隨著HD劑量的增加逐漸降低，HD高劑量處理組的表達(dá)水平最低，與HPH模型組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明HD能夠抑制增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而抑制HPH大鼠PASMCs的增殖。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測增殖相關(guān)基因c-Myc、CyclinD1的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果表明，HPH模型組中c-Myc、CyclinD1基因的mRNA表達(dá)水平顯著高于對照組（P<0.05），HD低、中、高劑量處理組c-Myc、CyclinD1基因的mRNA表達(dá)水平均顯著低于HPH模型組（P<0.05），且呈劑量依賴性。這進(jìn)一步證實(shí)了HD可通過下調(diào)增殖相關(guān)基因的表達(dá)，抑制HPH大鼠PASMCs的增殖。綜上所述，HD能夠顯著抑制HPH大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖，且具有劑量依賴性，其作用機(jī)制可能與抑制增殖相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)有關(guān)。5.2HD對HPH大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡的影響采用AnnexinV-FITC/PI雙染法，通過流式細(xì)胞儀檢測不同處理組肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（PASMCs）的凋亡情況。結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞凋亡率較低，處于正常水平；HPH模型組細(xì)胞凋亡率顯著低于對照組（P<0.05），表明低氧抑制了PASMCs的凋亡。給予HD處理后，與HPH模型組相比，HD低、中、高劑量處理組細(xì)胞凋亡率均顯著升高（P<0.05），且呈劑量依賴性，HD高劑量處理組的凋亡率最高。這表明HD能夠促進(jìn)HPH大鼠PASMCs的凋亡，且隨著HD濃度的增加，促進(jìn)作用增強(qiáng)。利用TUNEL法進(jìn)一步檢測細(xì)胞凋亡情況。光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對照組中TUNEL陽性細(xì)胞（棕色染色）較少，HPH模型組TUNEL陽性細(xì)胞明顯減少，說明低氧抑制細(xì)胞凋亡。而HD處理組中，TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量隨著HD劑量的增加逐漸增多。通過對TUNEL陽性細(xì)胞比例的統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果與AnnexinV-FITC/PI雙染法一致，即HPH模型組TUNEL陽性細(xì)胞比例顯著低于對照組（P<0.05），HD低、中、高劑量處理組TUNEL陽性細(xì)胞比例均顯著高于HPH模型組（P<0.05），且呈劑量依賴性。通過蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2的表達(dá)。結(jié)果顯示，HPH模型組中Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著高于對照組（P<0.05），Bax蛋白的表達(dá)水平顯著低于對照組（P<0.05），Bcl-2/Bax比值升高，說明低氧抑制細(xì)胞凋亡。HD處理組中，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平隨著HD劑量的增加逐漸降低，Bax蛋白的表達(dá)水平逐漸升高，Bcl-2/Bax比值降低，與HPH模型組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明HD能夠調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)HPH大鼠PASMCs的凋亡。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果表明，HPH模型組中Bcl-2基因的mRNA表達(dá)水平顯著高于對照組（P<0.05），Bax基因的mRNA表達(dá)水平顯著低于對照組（P<0.05）。HD低、中、高劑量處理組Bcl-2基因的mRNA表達(dá)水平均顯著低于HPH模型組（P<0.05），Bax基因的mRNA表達(dá)水平均顯著高于HPH模型組（P<0.05），且呈劑量依賴性。這進(jìn)一步證實(shí)了HD可通過上調(diào)促凋亡基因Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)HPH大鼠PASMCs的凋亡。綜上所述，HD能夠顯著促進(jìn)HPH大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的凋亡，且具有劑量依賴性，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)有關(guān)。5.3相關(guān)蛋白和基因表達(dá)的變化蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測結(jié)果表明，與對照組相比，HPH模型組中增殖相關(guān)蛋白PCNA、CyclinD1的表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.05），而凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá)顯著下調(diào)，Bcl-2的表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.05），Bcl-2/Bax比值升高，提示細(xì)胞增殖活躍且凋亡受到抑制。在給予HD處理后，隨著HD劑量的增加，PCNA、CyclinD1蛋白的表達(dá)逐漸降低（P<0.05），表明HD能夠抑制增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。Bax蛋白的表達(dá)逐漸升高，Bcl-2蛋白的表達(dá)逐漸降低（P<0.05），Bcl-2/Bax比值降低，說明HD可通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果與蛋白質(zhì)免疫印跡法一致。HPH模型組中增殖相關(guān)基因c-Myc、CyclinD1的mRNA表達(dá)顯著高于對照組（P<0.05），HD處理組中c-Myc、CyclinD1基因的mRNA表達(dá)隨著HD劑量的增加逐漸降低（P<0.05）。凋亡相關(guān)基因Bax的mRNA表達(dá)在HPH模型組中顯著低于對照組，而在HD處理組中隨著HD劑量的增加逐漸升高（P<0.05）；Bcl-2基因的mRNA表達(dá)在HPH模型組中顯著高于對照組，在HD處理組中隨著HD劑量的增加逐漸降低（P<0.05）。這進(jìn)一步證實(shí)了HD可以通過調(diào)控增殖和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，影響HPH大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖和凋亡。這些蛋白和基因表達(dá)的變化與細(xì)胞增殖和凋亡的結(jié)果密切相關(guān)。增殖相關(guān)蛋白和基因表達(dá)的上調(diào)促進(jìn)了細(xì)胞增殖，而HD抑制了這些蛋白和基因的表達(dá)，從而抑制了細(xì)胞增殖。凋亡相關(guān)蛋白和基因表達(dá)的改變，尤其是Bcl-2/Bax比值的變化，直接影響了細(xì)胞的凋亡命運(yùn)，HD通過調(diào)節(jié)這一比值，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。這表明HD對HPH大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，是通過調(diào)控相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。六、結(jié)果討論6.1HD影響細(xì)胞增殖和凋亡的結(jié)果分析6.1.1與已有研究結(jié)果的對比本研究發(fā)現(xiàn)硫化氫（HD）能夠顯著抑制低氧性肺動(dòng)脈高壓（HPH）大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（PASMCs）的增殖，并促進(jìn)其凋亡，且呈劑量依賴性。這一結(jié)果與部分已有研究結(jié)果相符。有研究表明，在缺氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖模型中，給予外源性HD供體（如NaHS）后，細(xì)胞增殖受到抑制，同時(shí)細(xì)胞凋亡增加。在另一項(xiàng)關(guān)于低氧性肺動(dòng)脈高壓小鼠模型的研究中，也觀察到HD可以降低肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而減輕肺血管重塑。然而，也有一些研究結(jié)果與本研究存在差異。有研究報(bào)道在某些情況下，低濃度的HD對肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖和凋亡影響不明顯，只有在較高濃度時(shí)才會出現(xiàn)抑制增殖和促進(jìn)凋亡的作用。還有研究發(fā)現(xiàn)，HD對肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的作用可能受到細(xì)胞所處微環(huán)境的影響，在炎癥因子存在的情況下，HD的作用效果可能會發(fā)生改變。這些差異可能與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型、細(xì)胞培養(yǎng)條件、HD的給藥方式和劑量以及檢測指標(biāo)和方法的不同有關(guān)。不同研究中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的種類、品系以及年齡等因素可能會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。不同品系的大鼠或小鼠對低氧的敏感性和反應(yīng)性可能存在差異，從而導(dǎo)致HD對PASMCs的作用效果不同。細(xì)胞培養(yǎng)條件，如培養(yǎng)基的成分、血清濃度、培養(yǎng)時(shí)間等，也可能對細(xì)胞的增殖和凋亡產(chǎn)生影響。HD的給藥方式（如腹腔注射、靜脈注射、細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)直接加入等）和劑量不同，其在體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)的濃度和作用時(shí)間也會不同，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。此外，不同研究采用的檢測指標(biāo)和方法也不完全相同，這也可能導(dǎo)致結(jié)果的差異。6.1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和局限性本實(shí)驗(yàn)在設(shè)計(jì)上具有一定的合理性。采用常壓低氧法建立HPH大鼠模型，該方法能夠較好地模擬人類HPH的發(fā)病過程，具有較高的可靠性。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞分為對照組、HPH模型組以及不同劑量的HD處理組，通過對比不同組之間的差異，能夠明確HD對HPH大鼠PASMCs增殖和凋亡的影響。實(shí)驗(yàn)方法選擇較為恰當(dāng)，采用了多種檢測指標(biāo)和方法，如CCK-8法、EdU法檢測細(xì)胞增殖，AnnexinV-FITC/PI雙染法、TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡，以及Westernblot和qRT-PCR檢測相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)，多種方法相互驗(yàn)證，提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。在數(shù)據(jù)處理方面，采用了合適的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆治?，能夠?zhǔn)確地揭示不同組之間的差異，進(jìn)一步保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。然而，本研究也存在一定的局限性。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，雖然建立了HPH大鼠模型，但動(dòng)物模型與人類疾病仍存在一定的差異，不能完全反映人類HPH的發(fā)病機(jī)制和病理過程。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境是一種相對簡單的體外環(huán)境，缺乏體內(nèi)復(fù)雜的神經(jīng)、體液調(diào)節(jié)以及細(xì)胞間相互作用等因素，可能會影響HD對PASMCs的作用效果。本研究僅觀察了HD對PASMCs增殖和凋亡的影響，未探討HD對其他細(xì)胞類型（如血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等）的作用，而這些細(xì)胞在HPH的發(fā)病過程中也起著重要作用。此外，本研究雖然發(fā)現(xiàn)HD能夠影響PASMCs增殖和凋亡相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)，但對于HD作用的具體信號通路和分子機(jī)制尚未完全闡明，還需要進(jìn)一步深入研究。6.2HD作用機(jī)制的探討6.2.1參與的信號通路推測根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及已有研究，硫化氫（HD）調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡可能涉及多個(gè)信號通路。磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路是其中重要的一條。在正常生理狀態(tài)下，PI3K被激活后，催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3進(jìn)一步激活A(yù)kt。激活的Akt可以磷酸化下游的mTOR，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、增殖和代謝等過程。在低氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（PASMCs）增殖過程中，該信號通路可能被過度激活。本研究中，HD能夠抑制HPH大鼠PASMCs的增殖，推測HD可能通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路的活性來實(shí)現(xiàn)這一作用。HD可能抑制PI3K的活性，減少PIP3的生成，從而阻礙Akt的激活。Akt無法正常激活，就不能有效地磷酸化mTOR，使得mTOR的活性受到抑制。mTOR活性降低后，會抑制其下游與細(xì)胞增殖相關(guān)的蛋白質(zhì)合成，如細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）等，進(jìn)而抑制細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，最終抑制PASMCs的增殖。已有研究表明，在其他細(xì)胞類型中，如腫瘤細(xì)胞，HD可以通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，抑制細(xì)胞的增殖和遷移。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路也可能參與HD對細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)節(jié)。MAPK信號通路包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等多個(gè)亞家族。在低氧刺激下，PASMCs中的MAPK信號通路被激活，其中ERK1/2磷酸化水平升高，激活的ERK1/2可以促進(jìn)增殖相關(guān)基因的表達(dá)，如c-Myc、CyclinD1等，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。HD可能通過抑制MAPK信號通路中關(guān)鍵蛋白的磷酸化，來抑制細(xì)胞增殖。HD可以抑制ERK1/2的磷酸化，阻斷其向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位，使其無法激活下游的轉(zhuǎn)錄因子，從而抑制增殖相關(guān)基因的表達(dá)，達(dá)到抑制細(xì)胞增殖的目的。在細(xì)胞凋亡方面，HD可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白和半胱天冬酶（Caspase）家族的活性來實(shí)現(xiàn)。Bcl-2家族蛋白包括抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xl）和促凋亡蛋白（如Bax、Bad），它們之間的平衡決定了細(xì)胞的凋亡命運(yùn)。Caspase是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者，其中Caspase-3是凋亡執(zhí)行階段的關(guān)鍵酶。HD可能通過上調(diào)Bax的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，使Bcl-2/Bax比值降低，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。HD還可能激活Caspase-3的活性，促使細(xì)胞凋亡的發(fā)生。已有研究表明，在心肌細(xì)胞缺血-再灌注損傷中，HD可以通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白和Caspase-3的活性，抑制心肌細(xì)胞凋亡。6.2.2與HPH發(fā)病機(jī)制的關(guān)聯(lián)低氧性肺動(dòng)脈高壓（HPH）的發(fā)病機(jī)制主要涉及肺血管收縮、肺血管重塑以及炎癥反應(yīng)等。在肺血管重塑過程中，肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（PASMCs）的異常增殖和凋亡失衡起著關(guān)鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn)HD能夠抑制HPH大鼠PASMCs的增殖，促進(jìn)其凋亡，這對于改善HPH的病理進(jìn)程具有重要意義。HD抑制PASMCs增殖可以減輕肺血管壁的增厚。在HPH發(fā)病過程中，PASMCs異常增殖導(dǎo)致血管壁中膜增厚，管腔狹窄，肺血管阻力增加，肺動(dòng)脈壓力升高。HD通過抑制增殖相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)，如PCNA、CyclinD1、c-Myc等，阻礙PASMCs的增殖，從而減少血管壁中膜的細(xì)胞數(shù)量，緩解血管壁的增厚，降低肺血管阻力，有助于降低肺動(dòng)脈壓力。HD促進(jìn)PASMCs凋亡可以改善肺血管的結(jié)構(gòu)和功能。在HPH中，PASMCs凋亡受阻，使得異常增殖的細(xì)胞不能及時(shí)被清除，進(jìn)一步加重了血管壁的增厚和管腔狹窄。HD通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)，如上調(diào)Bax、下調(diào)Bcl-2，激活Caspase-3等，促進(jìn)PASMCs凋亡，清除異常增殖的細(xì)胞，恢復(fù)肺血管的正常結(jié)構(gòu)和功能，減輕肺血管重塑，從而對HPH的治療產(chǎn)生積極影響。從更宏觀的角度來看，HD對PASMCs增殖和凋亡的調(diào)節(jié)作用，有助于維持肺血管的穩(wěn)態(tài)，阻斷HPH的發(fā)展進(jìn)程。通過抑制PASMCs的異常增殖和促進(jìn)凋亡，HD可以改善肺血管的順應(yīng)性，增加肺血管的彈性，提高肺循環(huán)的效率，從而緩解HPH患者的癥狀，提高患者的生活質(zhì)量。這也表明HD在HPH治療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，未來有望開發(fā)以HD為基礎(chǔ)的治療藥物或治療方法，為HPH患者提供新的治療選擇。然而，目前關(guān)于HD在HPH治療中的應(yīng)用還處于基礎(chǔ)研究階段，還需要進(jìn)一步的臨床前研究和臨床試驗(yàn)來驗(yàn)證其安全性和有效性。七、結(jié)論與展望7.1研究主要結(jié)論本研究通過建立低氧性肺動(dòng)脈高壓（HPH）大鼠模型，并對其肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（PASMCs）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，深入探究了硫化氫（HD）對HPH大鼠PASMCs增殖及凋亡的影響。研究結(jié)果表明，HD能夠顯著抑制HPH大鼠PASMCs的增殖，促進(jìn)其凋亡，且這一作用呈劑量依賴性。在細(xì)胞增殖方面，CCK-8實(shí)驗(yàn)和EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致顯示，與對照組相比，HPH模型組PASMCs的增殖活性顯著增強(qiáng)；而給予HD處理后，HD低、中、高劑量處理組PASMCs的增殖活性均顯著降低，且隨著HD劑量的增加，抑制作用逐漸增強(qiáng)。蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測結(jié)果表明，HPH模型組中增殖相關(guān)蛋白PCNA、CyclinD1以及增殖相關(guān)基因