ICS13.06054IDB54/T0487—2025 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 4方法原理 5干擾與消除 6試劑和材料 7儀器和設(shè)備 38樣品制備 39分析步驟 410結(jié)果計(jì)算與表示 511精密度和正確度 712質(zhì)量保證和質(zhì)量控制 713廢物處理 7附錄A（規(guī)范性）A.1方法的檢出限和測定下限 8附錄B（資料性）B.1目標(biāo)化合物、內(nèi)標(biāo)物的多離子反應(yīng)監(jiān)測條件 9附錄C（資料性）C.1方法的精密度和正確度 DB54/T0487—2025本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由西藏自治區(qū)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心提出。本文件由西藏自治區(qū)生態(tài)環(huán)境保護(hù)廳歸口。本文件起草單位：西藏自治區(qū)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心，中國科學(xué)院青藏高原研究所，西藏大學(xué)。本文件主要起草人：索娜卓嘎，袁躍甫，央金拉姆，邊巴卓瑪，周云橋，賈小華，王彩紅，晉美占堆，次仁央金，張惠芳，趙礦，王小萍，董慧科，張繼峰，童銀棟。DB54/T0487—20251水質(zhì)11種抗生素類化合物的測定高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法本文件規(guī)定了使用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定11種抗生素類化合物的規(guī)范性引用文件、術(shù)語和定義、方法原理、干擾與消除、試劑和材料、儀器和設(shè)備、樣品制備、分析步驟、結(jié)果計(jì)算與表示、精密度與正確度、質(zhì)量保證和質(zhì)量控制和廢物處理等基本要求。本文件適用于地表水和污水中11種抗生素類化合物的測定。當(dāng)取樣量為1000ml，定容體積為1.0ml，進(jìn)樣體積為5μl時(shí)，本文件的方法檢出限為0.003μg/L~0.006μg/L，測定下限為0.010μg/L～0.023μg/L。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法HJ91.1污水監(jiān)測技術(shù)規(guī)范HJ91.2地表水環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測技術(shù)規(guī)范HJ493水質(zhì)樣品的保存和管理技術(shù)規(guī)定HJ494水質(zhì)采樣技術(shù)指導(dǎo)3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4方法原理水中的11種抗生素類化合物經(jīng)固相萃取法富集、凈化后，用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法分離檢測。根據(jù)化合物的保留時(shí)間和特征離子峰定性，內(nèi)標(biāo)法定量。5干擾與消除金屬離子與目標(biāo)化合物能形成絡(luò)合物，使固相萃取效率降低，可向水樣中加入乙二胺四乙酸二鈉抑制絡(luò)合物的形成。6試劑和材料試劑。1)警告——本方法所使用的有機(jī)溶劑對人體健康有害，試劑配制和樣品前處理過程應(yīng)在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行，操作時(shí)應(yīng)按規(guī)定要求佩戴防護(hù)器具，避免接觸皮膚和衣服。DB54/T0487—20252除非另有說明，分析時(shí)均使用符合國家標(biāo)準(zhǔn)的分析純試劑，實(shí)驗(yàn)所用純水為GB/T6682中規(guī)定的一級水。6.1.1乙腈(CH3CN)：色譜純。6.1.2甲醇(CH3OH)：色譜純。6.1.3甲酸(HCOOH)：色譜純。6.1.4乙酸銨(CH3COONH4)：色譜純。6.1.5鹽酸：c(HCl)=12mol/L：優(yōu)級純。6.1.6硫酸：c(H2SO4)=18.4mol/L：優(yōu)級純。6.1.7抗壞血酸(C6H8O6)：分析純。6.1.8乙二胺四乙酸二鈉(C10H14N2Na2O8)：分析純。6.1.9氫氧化鈉(NaOH)：分析純。6.1.10鹽酸溶液：c(HCl)=0.5mol/L：量取4ml鹽酸（6.1.5），緩慢加入到水中并定容至100ml。6.1.11硫酸溶液：c(H2SO4)=4.0mol/L：量取22ml硫酸（6.1.6），緩慢加入到水中，待溫度降低至室溫后，用水定容至100ml。6.1.12氫氧化鈉溶液：c(NaOH)=1.0mol/L：稱取4gNaOH（6.2.9），用水溶解后，轉(zhuǎn)移到100ml容量瓶中，定容至標(biāo)線。6.1.132mmol/L乙酸銨/0.2%甲酸水溶液：稱取154mg乙酸銨（6.1.4），用水溶解后加入2ml甲酸（6.1.3），轉(zhuǎn)移到1L容量瓶中，定容至標(biāo)線。6.1.14甲醇/水溶液(ψ=5%)：量取50ml甲醇（6.1.2），用水定容至1L。6.1.15甲酸/甲醇溶液(ψ=0.1%)：量取1ml甲酸（6.1.3），用甲醇（6.1.2）定容至1L。6.1.16氮?dú)猓杭兌取?9.99%。標(biāo)準(zhǔn)溶液6.2.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（c=100mg/L）準(zhǔn)確稱取10.0mg抗生素類化合物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度大于95%），用甲醇（6.1.2）溶解后，轉(zhuǎn)移到100ml棕色容量瓶中定容至標(biāo)線，此溶液可在-10℃下避光可保存1年。對于氟喹諾酮類抗生素，溶于含0.5%1.0mol/LNaOH（6.1.12）的甲醇溶液中。也可以直接購買有證標(biāo)準(zhǔn)溶液，參照制造商的產(chǎn)品說明書保存。6.2.2脫水紅霉素（c=2mg/L）取400μl100mg/L紅霉素儲(chǔ)備液于20ml棕色瓶中，加入19.6ml甲醇，然后加入約10μl硫酸溶液（6.1.11）調(diào)pH至3.0，室溫下震蕩4h，于-10℃避光可保存2個(gè)月。6.2.3標(biāo)準(zhǔn)使用液（c=1mg/L）3將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(6.2.1)用適量的甲醇(5.1.2)稀釋，現(xiàn)用現(xiàn)配。準(zhǔn)確稱取10.0mg內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(純度大于95%),用甲醇(6.1.2)溶解后，轉(zhuǎn)移到100ml棕色容量將內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液(6.2.4)用適量的甲醇(6.1.2)稀釋，現(xiàn)用現(xiàn)配。高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子化源(ESI),具備梯度洗脫和多反應(yīng)監(jiān)測7.2.5固相萃取柱：6ml,500mg,60μm親水親油平衡反相吸附固相萃取柱，親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮聚合物填料(或其他等效填料),聚丙烯外殼。7.2.7針式過濾器：0.22μm孔徑聚醚砜濾膜(有機(jī)系濾膜),聚丙烯外殼。8樣品制備按照HJ91.1和HJ494中相關(guān)規(guī)定采集、運(yùn)輸和保存樣品。樣品采集前，向1L棕色玻璃采樣瓶中加入150mg抗壞血酸(6.1.7)和0.2g乙二胺四乙酸二鈉(6.1.8),采樣時(shí)使樣品充滿樣品瓶，不留液上空間，并詳細(xì)記錄樣品編號(hào)、來源和周邊情況等信息。樣品采集后于現(xiàn)場立即加入硫酸溶液(6.11)調(diào)節(jié)樣品采集后應(yīng)盡快進(jìn)行分析。如暫不能分析，需在0~4℃冷藏避光保存，3天DB54/T0487—20254準(zhǔn)確量取1L樣品，加入100μl內(nèi)標(biāo)使用液（6.2.5），用玻璃纖維膜（7.2.4）過濾樣品。將固相萃取柱（7.2.5）安裝在固相萃取裝置（7.2.2）上。依次用5ml甲醇（6.1.2）、5ml鹽酸溶液（6.1.10）和5ml純水活化萃取柱。待萃取柱上超純水剩余約2ml時(shí)，通過管路在負(fù)壓下使水樣以10~15ml/min的流速全部通過萃取柱后，依次用5ml5%甲醇水溶液（6.1.14）和5ml超純水淋洗小柱，再真空抽干小柱使其完收集洗脫液。洗脫液經(jīng)氮吹儀（7.2.3）濃縮至近干，加入1ml甲醇（7.1.2）和2mmol/L乙酸銨/0.2%甲酸水溶液（6.1.13V:V=4:6）復(fù)溶，過0.22μm有機(jī)濾膜（7.2.7）后裝于1.5ml棕色進(jìn)樣瓶，待測。空白試樣的制備以實(shí)驗(yàn)用水代替樣品，按照與試樣制備相同步驟（8.2）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室空白試樣的制備。9分析步驟儀器參考條件9.1.1液相色譜參考條件a)流動(dòng)相A：2mmol/L乙酸銨/0.2%甲酸混合溶液（6.1.13）。b)流動(dòng)相B：乙腈（6.1.1）。c)梯度洗脫程序參考見表1。d)運(yùn)行時(shí)間：12分鐘。e)流速：0.3ml/min。f)柱溫：35℃。g)進(jìn)樣體積：5μl。表1液相色譜流動(dòng)相梯度洗脫程序注：設(shè)置2分鐘后運(yùn)行時(shí)間（Posttime）平衡至初始流動(dòng)相比例。9.1.2質(zhì)譜參考條件a)離子源：電噴霧離子源（ESI），正離子模式。b)監(jiān)測方式：多離子反應(yīng)監(jiān)測（MRM），具體條件參數(shù)見附錄B。c)毛細(xì)管電壓：4000V。d)干燥氣溫度：350℃e)干燥器流速：10L/min。f)霧化器壓力：35psi。9.1.3儀器調(diào)諧5按照儀器使用說明書的要求在規(guī)定時(shí)間和頻次內(nèi)對高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行儀器質(zhì)量軸和分辨率調(diào)諧，以確保儀器處于最佳測試狀態(tài)。在儀器使用過程中，如發(fā)現(xiàn)儀器質(zhì)量數(shù)出現(xiàn)明顯偏差或靈敏度明顯下降時(shí)，應(yīng)立即重新對儀器進(jìn)行質(zhì)量軸和分辨率調(diào)諧。9.2校準(zhǔn)曲線的建立取一定量抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)使用液(6.2.3)和內(nèi)標(biāo)使用液(6.2.5),用甲醇(6.1.2)和2mmol/L乙酸銨/0.2%甲酸水溶液(6.1.13)(V:V=4:6)稀釋，配置至少5個(gè)非零濃度點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，參考濃度按照儀器參考條件(9.1),由低濃度到高濃度的順序依次對標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測定。以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中目標(biāo)組分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，其對應(yīng)的峰面積(或峰高)與內(nèi)標(biāo)物峰面積(或峰高)的比值乘以內(nèi)標(biāo)物濃度的乘積為縱坐標(biāo)，建立校準(zhǔn)曲線。9.3試樣測定按照與校準(zhǔn)曲線的建立(9.2)相同的儀器條件進(jìn)行試樣(8.2)的測定。試樣中目標(biāo)化合物響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)，超出線性范圍最高點(diǎn)則重新制備樣品并測定。重新制備樣品時(shí)可減少樣品量或用純水稀釋樣品。9.4空白試驗(yàn)按照與試樣測定(9.3)相同的儀器條件進(jìn)行空白試樣(8.3)的測定。10結(jié)果計(jì)算與表示10.1定性分析每種被測抗生素選擇1個(gè)母離子和2個(gè)子離子進(jìn)行監(jiān)測。在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，某待測組分在樣品中的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液中的保留時(shí)間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2.5%,且在試樣譜圖中的定性離子的相對豐度(Ksam)與濃度相近的標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖中對應(yīng)的定性離子相對豐度(Ksta)偏差不超過表2規(guī)定的范圍，則可判定樣品中存在該待測物。11種抗生素類化合物和3種內(nèi)標(biāo)物的總離子流色譜圖見圖1。Ksam——樣品中目標(biāo)化合物定性離子的相對豐度(%);A?——樣品中目標(biāo)化合物定性離子對的峰面積(或峰高);A?——樣品中目標(biāo)化合物定量離子對的峰面積(或峰高)。Kstd——標(biāo)準(zhǔn)溶液中目標(biāo)化合物定性離子的相對豐度比(%);Astd2——標(biāo)準(zhǔn)溶液中目標(biāo)化合物定性離子對的峰面積(或峰高);Astd1——標(biāo)準(zhǔn)溶液中目標(biāo)化合物定量離子對的峰面積(或峰高)。6表2定性確認(rèn)時(shí)相對離子豐度比的最大允許偏差Ksam允許的偏差(%)Counts(%)vs.AcquisitionT圖1目標(biāo)物及內(nèi)標(biāo)的總離子流圖(目標(biāo)物200μg/L,內(nèi)標(biāo)100μg/L)2——磺胺甲基嘧啶算樣品中各目標(biāo)抗生素的質(zhì)量濃度。7Pi——樣品中目標(biāo)化合物i的質(zhì)量濃度(μg/L);Ai——樣品中目標(biāo)化合物i的峰面積(或峰高);Ais——樣品中內(nèi)標(biāo)物的峰面積(或峰高);Pis——樣品中內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度(μg/L);V;——提取液定容后的體積(ml);V——水樣體積(ml)。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)和實(shí)驗(yàn)室間進(jìn)行方法驗(yàn)證，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.0%~14.9%回收率為77.9%~128.1%,具體結(jié)校準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)應(yīng)≥0.995;每20個(gè)樣品或每批次(少于20個(gè)樣品)應(yīng)分析測定一個(gè)校準(zhǔn)曲線每10個(gè)樣品或每批次(少于10個(gè)樣品)需分析一個(gè)平行樣。平行樣的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)控制在25%以每10個(gè)樣品或每批次(少于10個(gè)樣品)需做一個(gè)基質(zhì)加標(biāo)樣，加標(biāo)回收率應(yīng)在60%~130%之間。8DB54/T0487—2025（規(guī)范性）A.1方法的檢出限和測定下限本方法中目標(biāo)化合物的檢出限和測定下限見表A.1。表A.1本方法中目標(biāo)化合物的檢出限和測定下限1234567899DB54/T0487—2025（資料性）B.1目標(biāo)化合物、內(nèi)標(biāo)物的多離子反應(yīng)監(jiān)測條件目標(biāo)化合物、內(nèi)標(biāo)物的多離子反應(yīng)監(jiān)測條件見表B.1。表B.1目標(biāo)化合物、內(nèi)標(biāo)物的多離子反應(yīng)監(jiān)測條件（帶*為定量離子）1234