直接分離目的DNA

經(jīng)限制酶切割，電泳、分離DNA片段。適用于獲得細(xì)菌、質(zhì)粒、病毒等低等生物的基因片段。真核生物的染色體DNA中含有內(nèi)含子序列，不適合于基因工程的需要。第一頁，共64頁。2.cDNA文庫以mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成的互補(bǔ)DNA。以此得到的某種細(xì)胞內(nèi)所有mRNA的cDNA，稱為cDNA文庫。第二頁，共64頁。3.RT-PCR基本原理：將細(xì)胞中mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。mRNAcDNAPCR產(chǎn)物第三頁，共64頁。不論用哪種方法，目的是得到不含內(nèi)含子的DNA序列。第四頁，共64頁。第二節(jié)重組DNA分子的構(gòu)建第五頁，共64頁。Linkofcohesiveend粘末端連接一.目的基因與載體的連接第六頁，共64頁。Linkofbluntend平末端連接第七頁，共64頁。平末端連接RecombinantDNAT4DNAligasevector1第八頁，共64頁。連接反應(yīng)的實(shí)際反應(yīng)溫度為4～160C。160C時，需4小時，若40C時，需過夜。平末端連接反應(yīng)效率低。為提高反應(yīng)效率，可采用平末端加尾巴的辦法，將平末端改造成粘末端。第九頁，共64頁。平末端連接的缺點(diǎn)*moredifficultligation連接困難*2-directioninsertion雙向插入*self-reconnection自身環(huán)化*noeasywayofretrieving theinsert

重新篩選插入的片斷困難第十頁，共64頁。vector12vector12AABAB

平齊末端連接時，插入的方向是隨機(jī)的，稱為雙向插入。會給后續(xù)的工作造成很多麻煩。第十一頁，共64頁。EcoRIEcoRI單酶切粘末端連接第十二頁，共64頁。第十三頁，共64頁。單酶切粘末端連接的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)*Usingthesameoneenzymetocut

用同一種酶切*Ligatedeasilyandcoveniently

連接容易方便缺點(diǎn)*Self-reconnectionofvector

載體自身環(huán)化*Insertedintwodirections

雙向插入第十四頁，共64頁。單酶切粘末端的雙向插入GCTTAAAATTCGAATTCGGCTTAAGCTTAAAATTCGGCTTAAAATTCG第十五頁，共64頁。AATTCxxxxxxA

GxxxxxxTTCGAGAGCTTCTTAAAGAATTCxxxxxxAAGCTTCTTAAGxxxxxxTTCGAAligase雙酶切粘末端連接EcoRIHindIIIEcoRIHindIII第十六頁，共64頁。雙酶切粘末端連接的特點(diǎn)*Usingthesametwoenzymestocut*Ligatedeasilyandconveniently*noself-reconnectionofvector*Insertedinonedirection定向插入缺點(diǎn)操作比較麻煩。如果兩種酶要求的條件不同，需要進(jìn)行兩個階段的反應(yīng)。第十七頁，共64頁。幾種實(shí)驗方法利用相應(yīng)的技術(shù)方法，使實(shí)驗順利進(jìn)行。第十八頁，共64頁。Linkofhomopolymerictails

添加同聚尾避免質(zhì)粒的自身環(huán)化末端轉(zhuǎn)移酶第十九頁，共64頁。添加接頭，引入限制酶的切割位點(diǎn)，然后用相應(yīng)的酶切割。第二十頁，共64頁。

野生型細(xì)菌具有針對外源DNA的限制和修飾系統(tǒng)，會切割外源DNA分子。因此用于基因工程的受體菌，需經(jīng)篩選和人工改造。第三節(jié)重組子導(dǎo)入細(xì)胞第二十一頁，共64頁。外源DNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞的過程叫做轉(zhuǎn)化。但不包括由病毒介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)入。常用的方法有如下：第二十二頁，共64頁。ThefirstisachemicalmethodutilizingCaCl2andheatshocktopromoteDNAentryintocells.

氯化鈣法：利用氯化鈣和熱休克使受體菌成為感受態(tài)細(xì)胞，促進(jìn)外源DNA的進(jìn)入。

第二十三頁，共64頁。

宿主細(xì)胞與重組DNA在00C的低滲氯化鈣溶液中孵育，快速轉(zhuǎn)入420C造成熱休克。經(jīng)此處理后的細(xì)胞“容易”接受外源的DNA，一般叫做感受態(tài)細(xì)胞。第二十四頁，共64頁。處理宿主細(xì)胞低滲溶液＋熱休克

E.coli+0.1MCaCl2

competentcells(E.coli)

被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞Low-osmosismakescellexpanding0-4℃RecombinantDNA+42℃Heatmakescellmoreexpandingandmembranemorepermeable第二十五頁，共64頁。

處于感受態(tài)的細(xì)菌表面正電荷增加，細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)有改變，通透性增強(qiáng)，轉(zhuǎn)化子易于進(jìn)入細(xì)胞。第二十六頁，共64頁。其他處理受體細(xì)胞的方法利用二甲基亞砜（DMSO）處理細(xì)胞二巰基蘇糖醇（DTT）處理細(xì)胞。利用聚乙二醇（PEG）處理細(xì)胞。第二十七頁，共64頁。WhencompetentcellsaremixedwithDNA，somecells(actually,veryfew)becometransformed:theyacquirerecombinantvectorDNA.

Pseudo-positivepositive第二十八頁，共64頁。

第四節(jié)重組子的篩選與鑒定第二十九頁，共64頁。Aftertransformation，onlyafewcellstakeuptheplasmidDNA，andthereonlyhasonerecombinantmoleculeinonerecipientcell(受體細(xì)胞)，soamethodisneededforselectingthose

轉(zhuǎn)化步驟后，轉(zhuǎn)進(jìn)重組質(zhì)粒的細(xì)胞是較少的。因此需要挑選出含有重組子的細(xì)胞。第三十頁，共64頁。Directselection直接篩選Antiboticresistance抗菌素抗性Markerrescueselection借助顏色篩選Insituhybridization原位雜交Immunologyselection免疫篩選Immunochemistrymethod免疫化學(xué)Enzymeimmunodetectionassay酶免疫分析第三十一頁，共64頁。

質(zhì)粒載體帶有氨芐青霉素抗性基因，在宿主細(xì)胞內(nèi)該抗性基因表達(dá)出可水解氨芐青霉素的酶，因而宿主細(xì)胞可在含氨芐青霉素的瓊脂糖平板上生長。利用抗生素抗性篩選第三十二頁，共64頁。復(fù)制起點(diǎn)氨芐青霉素抗性基因第三十三頁，共64頁。第三十四頁，共64頁。第三十五頁，共64頁。2.利用顏色篩選

插入失活現(xiàn)象X-gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-B-D-半乳糖苷第三十六頁，共64頁。多克隆位點(diǎn)半乳糖苷酶的基因內(nèi)有多克隆位點(diǎn)，酶切插入外源DNA后，該基因無法表達(dá).第三十七頁，共64頁。第三十八頁，共64頁。

完整的LacZ基因內(nèi)，經(jīng)過改造加入了多克隆位點(diǎn)，但并不影響LacZ基因的表達(dá)。當(dāng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)胞后，完整的LacZ基因表達(dá)產(chǎn)物與細(xì)菌的有關(guān)基因表達(dá)產(chǎn)物共同組成有功能的半乳糖苷酶，該酶把無色的X-gal切割成半乳糖和藍(lán)色的5－溴－4－氯－靛藍(lán)，使得菌落呈現(xiàn)藍(lán)色。第三十九頁，共64頁。表示外源基因插入編碼半乳糖苷酶的基因區(qū)段第四十頁，共64頁。Targetgene第四十一頁，共64頁。第四十二頁，共64頁。藍(lán)色菌落無插入序列白色菌落含插入序列轉(zhuǎn)化菌具有氨芐青霉素抗性，可在加有氨芐青霉素的平板上生長。第四十三頁，共64頁。使用含Amp+X-Gal的瓊脂糖平板篩選克隆，可能出現(xiàn)三種情況。1.載體自身環(huán)化，產(chǎn)生藍(lán)色菌落；2帶有正確插入目的基因序列的菌落，白色菌落。3未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，不能生長。第四十四頁，共64頁。3.Insituhybridization原位雜交生長在瓊脂糖平板上的菌落，可定點(diǎn)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，加入放射性的探針（即帶有放射性的與目的片斷互補(bǔ)的核酸片斷），與菌落雜交。經(jīng)洗滌后的膜與X－光膠片作用，挑選出陽性克隆。第四十五頁，共64頁。第四十六頁，共64頁。DNAhybridization

第四十七頁，共64頁。第四十八頁，共64頁。第四十九頁，共64頁。第五十頁，共64頁。第五十一頁，共64頁。第五十二頁，共64頁。免疫法篩選外源基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)出的蛋白質(zhì)，可與特異性的抗體結(jié)合。第五十三頁，共64頁。利用抗體篩選原理

目的基因編碼的蛋白質(zhì)作為抗原，用特異性抗體與之反應(yīng)，再根據(jù)顏色等變化，篩選出菌落。方法在瓊脂平板上的菌落，轉(zhuǎn)移到尼龍濾膜上，若某菌落帶有目的基因，并可表達(dá)該目的基因所編碼的蛋白質(zhì)，則加入該蛋白質(zhì)的特異抗體，可與該菌落結(jié)合，附著在濾膜上，不會被洗掉。該抗體可攜帶酶或熒光，易于檢測。第五十四頁，共64頁。Screeningwithantibodiesisusedwhenclonedgeneisexpressedandantibodiesrecognizingtheencodedproteinareavailable.

第五十五頁，共64頁。第五節(jié)基因表達(dá)產(chǎn)物的鑒定第五十六頁，共64頁?；虮磉_(dá)

基因表達(dá)指某基因在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄為mRNA繼而翻譯成蛋白質(zhì)的過程。DNARNAProtein轉(zhuǎn)錄翻譯第五十七頁，共64頁。研究基因表達(dá)的手段1、RT-PCR(RNA)2、Northernblot(RNA)3、Westernblot(蛋白質(zhì)）

4、免疫組化（蛋白質(zhì)）第五十八頁，共64頁。1、RT-PCR基本原理：將細(xì)胞中mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。根據(jù)PCR產(chǎn)物的量，判斷基因表達(dá)的強(qiáng)度。mRNAcDNAPCR產(chǎn)物第五十九頁，共64頁。2、Northernblot標(biāo)記探針與膜固相RNA雜交。根據(jù)雜交信號強(qiáng)弱判斷表達(dá)量，根據(jù)雜交信號位置判斷分子長度。雜交信號第六十頁，共64頁。實(shí)驗操作：1）RNA提取2）RNA電泳（分離不同長度RNA)3）轉(zhuǎn)膜(形成固相RNA)4）探針標(biāo)記（同位素/非同位素）5）雜交6）洗膜7）顯影（放