分化與未分化胃癌細(xì)胞株對癌相關(guān)成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)能力的差異剖析一、引言1.1研究背景與意義1.1.1胃癌的現(xiàn)狀胃癌是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，在癌癥的發(fā)病率和死亡率統(tǒng)計中一直占據(jù)高位。據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）發(fā)布的數(shù)據(jù)，2020年全球胃癌新發(fā)病例約108.9萬，位居所有惡性腫瘤發(fā)病人數(shù)的第五位；死亡病例數(shù)約76.9萬，排在惡性腫瘤死亡人數(shù)的第四位。在中國，胃癌的形勢更為嚴(yán)峻，同年發(fā)病病例占全球的43.9%，死亡病例占比達48.6%，且發(fā)病率和死亡率分別在國內(nèi)所有惡性腫瘤中位列第二和第三，是發(fā)病率最高的消化道惡性腫瘤。男性的胃癌發(fā)病率約為女性的3倍，死亡率是女性的2.7倍，60-69歲的男性是高發(fā)群體，這可能與男性較高的吸煙、飲酒比例，以及較大的社會壓力、不良飲食習(xí)慣等因素相關(guān)。由于胃癌早期癥狀隱匿，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，治療效果不佳，五年生存率較低，尤其是進展期或出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的患者，五年存活率不足10%。因此，深入探究胃癌的發(fā)病機制，尋找有效的防治策略，是當(dāng)前癌癥研究領(lǐng)域的重要任務(wù)。1.1.2癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）的作用腫瘤的發(fā)生發(fā)展并非是癌細(xì)胞的孤立行為，而是癌細(xì)胞與其所處的腫瘤微環(huán)境（TME）相互作用的結(jié)果。癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）作為腫瘤微環(huán)境中關(guān)鍵的基質(zhì)細(xì)胞成分，近年來受到了廣泛關(guān)注。與正常成纖維細(xì)胞相比，CAFs在形態(tài)、功能和基因表達等方面均存在顯著差異。CAFs能夠通過分泌多種細(xì)胞因子、趨化因子和生長因子，如轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、血小板衍生生長因子（PDGF）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成等多個過程。例如，TGF-β可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），使其獲得更強的遷移和侵襲能力；PDGF能夠促進成纖維細(xì)胞的活化和增殖，進一步增強CAFs對腫瘤微環(huán)境的塑造作用；VEGF則在腫瘤血管生成中發(fā)揮關(guān)鍵作用，為腫瘤細(xì)胞提供充足的營養(yǎng)和氧氣供應(yīng)，促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。此外，CAFs還能通過分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）降解細(xì)胞外基質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲開辟道路。在免疫調(diào)節(jié)方面，CAFs也扮演著重要角色。它們可以分泌免疫抑制因子，如前列腺素E2（PGE2）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，抑制免疫細(xì)胞的活性，幫助腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視和攻擊，營造有利于腫瘤生長和發(fā)展的免疫微環(huán)境。研究表明，CAFs與腫瘤細(xì)胞之間存在復(fù)雜的雙向交互作用，腫瘤細(xì)胞可以通過旁分泌信號激活成纖維細(xì)胞，使其轉(zhuǎn)化為CAFs，而CAFs又反過來促進腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。因此，CAFs在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的促進作用，是腫瘤研究和治療的重要靶點。1.1.3研究意義胃癌根據(jù)細(xì)胞分化程度可分為分化型和未分化型，不同分化程度的胃癌細(xì)胞在生物學(xué)特性、臨床病理特征和預(yù)后等方面存在顯著差異。分化型胃癌細(xì)胞相對保留了一些正常細(xì)胞的形態(tài)和功能特征，生長較為緩慢，惡性程度相對較低；而未分化型胃癌細(xì)胞則缺乏正常細(xì)胞的分化特征，生長迅速，具有更強的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，患者預(yù)后往往較差。然而，目前對于分化及未分化胃癌細(xì)胞株與癌相關(guān)成纖維細(xì)胞之間的相互作用機制，尤其是它們誘導(dǎo)CAFs的能力差異，尚不完全清楚。深入研究分化及未分化胃癌細(xì)胞株誘導(dǎo)CAFs的能力差異，具有重要的理論和臨床意義。從理論角度來看，有助于揭示胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，進一步明確腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境之間的復(fù)雜交互作用網(wǎng)絡(luò)，為腫瘤生物學(xué)的發(fā)展提供新的理論依據(jù)。在臨床應(yīng)用方面，一方面，通過明確分化及未分化胃癌細(xì)胞株對CAFs的不同誘導(dǎo)能力，有望為胃癌的早期診斷和預(yù)后評估提供新的生物標(biāo)志物和分子靶點，提高胃癌的早期診斷率和預(yù)后預(yù)測的準(zhǔn)確性；另一方面，針對不同分化程度胃癌細(xì)胞誘導(dǎo)的CAFs特征差異，開發(fā)更加精準(zhǔn)有效的腫瘤微環(huán)境干預(yù)策略，如靶向CAFs的治療藥物或方法，有望為胃癌的治療開辟新的途徑，提高胃癌患者的治療效果和生存率，改善患者的生活質(zhì)量。1.2研究目的與問題提出本研究聚焦于胃癌領(lǐng)域，旨在深入剖析分化及未分化胃癌細(xì)胞株誘導(dǎo)癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）的能力，并對二者進行全面且細(xì)致的比較。具體而言，期望通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶嶒炘O(shè)計和多維度的檢測方法，精準(zhǔn)量化不同分化程度胃癌細(xì)胞株對成纖維細(xì)胞向CAFs轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)效率，明確分化型與未分化型胃癌細(xì)胞株在這一過程中展現(xiàn)出的誘導(dǎo)能力差異，包括但不限于誘導(dǎo)速度、誘導(dǎo)比例以及誘導(dǎo)產(chǎn)生的CAFs在生物學(xué)特性上的區(qū)別。從細(xì)胞層面來看，本研究將借助細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，構(gòu)建分化及未分化胃癌細(xì)胞株與正常成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)體系，動態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)、增殖、遷移等行為學(xué)變化，以直觀揭示兩種類型胃癌細(xì)胞株誘導(dǎo)CAFs過程中對成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為的不同影響。從分子水平出發(fā)，運用免疫熒光染色、Western印跡分析、定量PCR技術(shù)和ELISA檢測法等手段，檢測CAFs相關(guān)標(biāo)記物（如α-SMA等）以及腫瘤相關(guān)細(xì)胞因子（如IL-1、IL-6等）的表達水平，深入探究分化及未分化胃癌細(xì)胞株誘導(dǎo)CAFs過程中的分子機制，明確關(guān)鍵信號通路和調(diào)控因子的作用差異。在此基礎(chǔ)上，進一步探討這些差異與胃癌臨床病理特征（如腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期等）以及患者預(yù)后之間的潛在聯(lián)系，為胃癌的精準(zhǔn)診斷、預(yù)后評估和靶向治療提供堅實的理論依據(jù)和新的研究方向。通過本研究，有望填補目前在分化及未分化胃癌細(xì)胞株與CAFs相互作用機制方面的認(rèn)知空白，為胃癌的綜合防治開辟新的路徑。1.3研究方法與技術(shù)路線1.3.1研究方法細(xì)胞培養(yǎng)：選取具有代表性的分化型胃癌細(xì)胞株（如MKN-28等）和未分化型胃癌細(xì)胞株（如MKN-45等），以及正常成纖維細(xì)胞株（如人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5等）。將胃癌細(xì)胞株和正常成纖維細(xì)胞分別置于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，定期換液和傳代，以維持細(xì)胞的良好生長狀態(tài)。實驗前，將細(xì)胞調(diào)整至合適的密度，接種于6孔板、24孔板或96孔板等培養(yǎng)板中，用于后續(xù)實驗。免疫熒光染色：待細(xì)胞在培養(yǎng)板中生長至合適密度后，棄去培養(yǎng)基，用PBS沖洗3次，每次5分鐘。然后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15-20分鐘，PBS再次沖洗3次。用0.25%TritonX-100進行透膜處理5-10分鐘，以增加細(xì)胞膜的通透性，利于抗體進入細(xì)胞內(nèi)與抗原結(jié)合。透膜后，用5%牛血清白蛋白（BSA）封閉非特異性結(jié)合位點30分鐘，減少非特異性染色。滴加稀釋好的針對CAFs相關(guān)標(biāo)記物（如α-SMA）的一抗，4℃孵育過夜。次日，用PBST（含0.1%Tween-20的PBS）沖洗3次，每次10分鐘。加入熒光標(biāo)記的二抗，室溫避光孵育1-2小時。孵育結(jié)束后，再次用PBST沖洗3次。最后用DAPI染核5-10分鐘，用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄，分析CAFs相關(guān)標(biāo)記物在細(xì)胞中的表達和定位情況。Western印跡分析：收集細(xì)胞，用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘。通過SDS-PAGE凝膠電泳將蛋白按分子量大小分離，隨后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1-2小時，以減少非特異性結(jié)合。加入針對CAFs相關(guān)標(biāo)記物（如α-SMA、FAP等）以及內(nèi)參蛋白（如β-actin）的一抗，4℃孵育過夜。次日，用TBST（含0.1%Tween-20的Tris緩沖鹽溶液）洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗，室溫孵育1-2小時。再次用TBST洗滌3次后，利用化學(xué)發(fā)光底物（ECL）進行顯色，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光、拍照，分析目的蛋白的表達水平。定量PCR技術(shù)：提取細(xì)胞總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，利用特異性引物對CAFs相關(guān)基因（如α-SMA、FAP、PDGFR-β等）以及內(nèi)參基因（如GAPDH）進行PCR擴增。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件根據(jù)所用的PCR試劑盒說明書進行設(shè)置。通過實時熒光定量PCR儀監(jiān)測PCR反應(yīng)過程中熒光信號的變化，根據(jù)Ct值（循環(huán)閾值）采用2^(-ΔΔCt)法計算目的基因的相對表達量，分析分化及未分化胃癌細(xì)胞株誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞后相關(guān)基因表達的差異。ELISA檢測法：收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照ELISA試劑盒說明書的步驟進行操作。首先將捕獲抗體包被在酶標(biāo)板上，4℃過夜。次日，用PBST洗滌酶標(biāo)板3次，每次5分鐘。加入封閉液，室溫封閉1-2小時，以減少非特異性吸附。棄去封閉液，加入稀釋好的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，37℃孵育1-2小時。洗滌后，加入生物素標(biāo)記的檢測抗體，37℃孵育1小時。再次洗滌后，加入親和素-HRP，37℃孵育30分鐘。最后加入底物顯色，在酶標(biāo)儀上測定450nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中腫瘤相關(guān)細(xì)胞因子（如IL-1、IL-6、TGF-β等）的濃度，比較不同組之間細(xì)胞因子表達水平的差異。1.3.2技術(shù)路線本研究的技術(shù)路線如圖1所示：細(xì)胞株選擇：挑選典型的分化型胃癌細(xì)胞株（MKN-28等）和未分化型胃癌細(xì)胞株（MKN-45等），以及正常成纖維細(xì)胞株（MRC-5等）。實驗分組：設(shè)置分化型胃癌細(xì)胞株與正常成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)組、未分化型胃癌細(xì)胞株與正常成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)組、正常成纖維細(xì)胞單獨培養(yǎng)對照組。細(xì)胞培養(yǎng)：將上述細(xì)胞按照實驗分組接種于相應(yīng)培養(yǎng)板，在適宜條件下培養(yǎng)，定期觀察細(xì)胞生長狀態(tài)并換液傳代。檢測指標(biāo)細(xì)胞行為學(xué)檢測：通過細(xì)胞計數(shù)、CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力；利用劃痕實驗和Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力。免疫熒光染色：對CAFs相關(guān)標(biāo)記物α-SMA進行染色，觀察其在細(xì)胞中的表達和定位。Western印跡分析：檢測CAFs相關(guān)標(biāo)記物α-SMA、FAP以及腫瘤相關(guān)蛋白的表達水平。定量PCR技術(shù)：測定CAFs相關(guān)基因α-SMA、FAP、PDGFR-β等的mRNA表達水平。ELISA檢測法：檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中腫瘤相關(guān)細(xì)胞因子IL-1、IL-6、TGF-β等的濃度。數(shù)據(jù)分析：運用統(tǒng)計學(xué)軟件對各項實驗數(shù)據(jù)進行分析，比較分化及未分化胃癌細(xì)胞株誘導(dǎo)CAFs能力的差異，探究其潛在機制。[此處插入技術(shù)路線圖，圖1：分化及未分化胃癌細(xì)胞株誘導(dǎo)癌相關(guān)成纖維細(xì)胞能力比較的技術(shù)路線圖]二、理論基礎(chǔ)與文獻綜述2.1胃癌的分類與特點2.1.1分化型胃癌分化型胃癌主要包括乳頭狀腺癌和管狀腺癌。在顯微鏡下觀察，乳頭狀腺癌的癌細(xì)胞呈立方形或柱狀，會排列成腺管，且部分癌細(xì)胞會向腺腔內(nèi)突出，形成乳頭狀結(jié)構(gòu)，這些乳頭由纖維血管軸心和表面被覆的癌細(xì)胞組成，乳頭分支較多且細(xì)長，癌細(xì)胞的分化程度相對較高，具有一定的極性，細(xì)胞核位于細(xì)胞底部，胞漿豐富，分泌功能較為明顯，?？梢姷金ひ夯蚱渌置谖?。管狀腺癌的癌細(xì)胞同樣呈立方形或柱狀，緊密排列成大小不一的腺管樣結(jié)構(gòu)，腺管形態(tài)規(guī)則，管腔清晰，癌細(xì)胞的分化較好，形態(tài)較為一致，異型性相對較小，核分裂象少見。從生物學(xué)行為來看，分化型胃癌的生長相對較為緩慢。這是因為其癌細(xì)胞保留了部分正常細(xì)胞的功能和結(jié)構(gòu)，細(xì)胞間的連接較為緊密，增殖速度受到一定的調(diào)控。癌細(xì)胞的侵襲能力相對較弱，其浸潤和轉(zhuǎn)移的過程較為緩慢，通常先在局部生長，隨著病情進展才逐漸向周圍組織浸潤和轉(zhuǎn)移。在轉(zhuǎn)移方式上，以淋巴轉(zhuǎn)移為主，通過淋巴管將癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移至局部淋巴結(jié)，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生的時間相對較晚。在臨床治療方面，分化型胃癌對手術(shù)、化療等常規(guī)治療方法的反應(yīng)相對較好，患者的預(yù)后相對較為樂觀。這是因為其癌細(xì)胞的生物學(xué)行為相對溫和，對治療的敏感性較高，治療后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險相對較低。2.1.2未分化型胃癌未分化型胃癌的癌細(xì)胞大小、形態(tài)各異，缺乏明顯的腺管結(jié)構(gòu)，細(xì)胞呈彌漫性分布。癌細(xì)胞體積較小，呈圓形或橢圓形，胞漿少，細(xì)胞核深染，核質(zhì)比增大，核仁明顯，染色質(zhì)粗糙，具有高度的異型性，核分裂象多見，表明細(xì)胞增殖活躍。與分化型胃癌相比，未分化型胃癌在病理特征上具有顯著差異。其缺乏分化良好的組織結(jié)構(gòu)，沒有明顯的腺管形成，細(xì)胞排列紊亂，這使得腫瘤的邊界難以清晰界定，在影像學(xué)檢查和病理診斷中，往往表現(xiàn)為邊界模糊、浸潤性生長的特點。未分化型胃癌具有更強的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。由于癌細(xì)胞的高度異型性和增殖活躍，其能夠快速突破基底膜，向周圍組織浸潤，侵犯血管、淋巴管和神經(jīng)等結(jié)構(gòu)，增加了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險。在轉(zhuǎn)移途徑上，除了淋巴轉(zhuǎn)移外，血行轉(zhuǎn)移也較為常見，癌細(xì)胞可以通過血液循環(huán)轉(zhuǎn)移至肝臟、肺、骨等遠(yuǎn)處器官，導(dǎo)致病情迅速惡化。臨床癥狀方面，未分化型胃癌患者往往在早期就可能出現(xiàn)較為明顯的癥狀，如腹痛、腹脹、惡心、嘔吐、消瘦、乏力等，且癥狀進展較快，這與腫瘤的快速生長和侵襲性有關(guān)。由于其惡性程度高、轉(zhuǎn)移早，患者的預(yù)后較差，治療效果往往不理想，五年生存率較低。2.2癌相關(guān)成纖維細(xì)胞概述2.2.1CAFs的來源癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）的來源具有多樣性，這一特性使其在腫瘤微環(huán)境中展現(xiàn)出復(fù)雜的功能。正常成纖維細(xì)胞是CAFs的主要來源之一。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，腫瘤細(xì)胞會分泌多種細(xì)胞因子和生長因子，如轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、血小板衍生生長因子（PDGF）等。這些因子能夠與正常成纖維細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號通路，促使正常成纖維細(xì)胞發(fā)生表型改變，轉(zhuǎn)化為CAFs。研究表明，TGF-β可以誘導(dǎo)正常成纖維細(xì)胞表達α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA），使其獲得CAFs的特征性標(biāo)記物，從而實現(xiàn)向CAFs的轉(zhuǎn)化。在乳腺癌模型中，腫瘤細(xì)胞分泌的TGF-β能夠激活正常成纖維細(xì)胞內(nèi)的Smad信號通路，上調(diào)α-SMA的表達，促進CAFs的形成。間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）也是CAFs的重要來源。MSCs具有多向分化潛能，在腫瘤微環(huán)境的誘導(dǎo)下，可分化為CAFs。腫瘤微環(huán)境中的炎癥因子、趨化因子等信號分子能夠影響MSCs的分化方向。白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥因子可以通過激活MSCs內(nèi)的相關(guān)信號通路，促使其向CAFs分化。在肝癌微環(huán)境中，IL-6和TNF-α等炎癥因子能夠誘導(dǎo)骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞表達CAFs的特異性標(biāo)記物，如成纖維細(xì)胞激活蛋白（FAP）和α-SMA，使其分化為具有促癌作用的CAFs。此外，上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程也可產(chǎn)生CAFs。在腫瘤發(fā)生過程中，上皮細(xì)胞在特定信號的刺激下，會經(jīng)歷EMT，失去上皮細(xì)胞的極性和細(xì)胞間連接，獲得間充質(zhì)細(xì)胞的特性，從而轉(zhuǎn)化為CAFs。TGF-β、Wnt等信號通路在EMT過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在結(jié)直腸癌中，TGF-β信號通路的激活可以誘導(dǎo)上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，使其轉(zhuǎn)化為CAFs，這些CAFs能夠分泌多種細(xì)胞因子和基質(zhì)金屬蛋白酶，促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。內(nèi)皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EndMT）同樣可以產(chǎn)生CAFs。在腫瘤微環(huán)境中，內(nèi)皮細(xì)胞受到某些刺激后，會發(fā)生EndMT，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂谐衫w維細(xì)胞特性的細(xì)胞，參與CAFs的組成。研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤血管生成過程中，部分內(nèi)皮細(xì)胞會發(fā)生EndMT，轉(zhuǎn)化為CAFs，這些CAFs不僅可以促進腫瘤血管的生成，還能調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，為腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移提供支持。2.2.2CAFs的功能在腫瘤微環(huán)境中，CAFs對腫瘤細(xì)胞的增殖起著顯著的促進作用。CAFs能夠分泌一系列生長因子，如表皮生長因子（EGF）、肝細(xì)胞生長因子（HGF）等，這些生長因子與腫瘤細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的增殖信號通路，如Ras-Raf-MEK-ERK和PI3K-AKT等通路，從而促進腫瘤細(xì)胞的DNA合成和細(xì)胞分裂，加速腫瘤細(xì)胞的增殖。研究表明，在乳腺癌中，CAFs分泌的HGF可以與腫瘤細(xì)胞表面的c-Met受體結(jié)合，激活PI3K-AKT信號通路，促進腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。CAFs還能通過分泌細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）成分，如膠原蛋白、纖連蛋白等，為腫瘤細(xì)胞提供物理支持和生存微環(huán)境，間接促進腫瘤細(xì)胞的增殖。腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于充足的血液供應(yīng)，CAFs在血管生成過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。CAFs能夠分泌多種血管生成因子，其中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是最為關(guān)鍵的促血管生成因子之一。VEGF可以特異性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，從而誘導(dǎo)新血管的生成。在肺癌中，CAFs分泌的VEGF能夠促進腫瘤血管的生成，增加腫瘤的血液供應(yīng)，為腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移提供必要的營養(yǎng)和氧氣。CAFs還可以分泌血小板衍生生長因子（PDGF），招募周細(xì)胞到新生血管周圍，穩(wěn)定血管結(jié)構(gòu)，進一步促進血管生成。此外，CAFs能夠通過與內(nèi)皮細(xì)胞的直接相互作用，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的功能，促進血管生成。腫瘤細(xì)胞能夠逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊，是腫瘤得以持續(xù)生長和發(fā)展的重要原因之一，而CAFs在這一過程中扮演著重要角色。CAFs可以分泌免疫抑制因子，如白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）和轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等，這些因子能夠抑制免疫細(xì)胞的活性，如T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）等，降低免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞的識別和殺傷能力。研究發(fā)現(xiàn)，在黑色素瘤中，CAFs分泌的TGF-β可以抑制T細(xì)胞的增殖和活化，促進調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的分化，從而營造免疫抑制微環(huán)境，幫助腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視。CAFs還能通過表達免疫檢查點分子，如程序性死亡配體1（PD-L1），與免疫細(xì)胞表面的受體結(jié)合，抑制免疫細(xì)胞的功能，實現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。2.3細(xì)胞株誘導(dǎo)CAFs的相關(guān)研究進展2.3.1其他腫瘤細(xì)胞株誘導(dǎo)CAFs的研究成果在腫瘤研究領(lǐng)域，眾多學(xué)者針對不同腫瘤細(xì)胞株誘導(dǎo)CAFs的過程開展了廣泛且深入的研究，這些研究成果為我們深入理解腫瘤微環(huán)境的形成機制提供了豐富的視角。在乳腺癌的研究中，研究者發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231能夠高效誘導(dǎo)正常成纖維細(xì)胞向CAFs轉(zhuǎn)化。通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)這一誘導(dǎo)過程涉及多個信號通路的激活，如PI3K-AKT和MAPK信號通路。PI3K-AKT信號通路的激活可以促進成纖維細(xì)胞的增殖和存活，使其更易于向CAFs轉(zhuǎn)化；MAPK信號通路則參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化和基因表達，影響CAFs相關(guān)標(biāo)記物的表達水平。在MDA-MB-231細(xì)胞與正常成纖維細(xì)胞的共培養(yǎng)體系中，檢測到PI3K和AKT的磷酸化水平顯著升高，同時MAPK通路中的關(guān)鍵蛋白ERK的磷酸化也明顯增強。這些信號通路的激活進一步導(dǎo)致CAFs相關(guān)標(biāo)記物α-SMA和FAP的表達上調(diào)，表明乳腺癌細(xì)胞株能夠通過特定信號通路的激活，調(diào)控成纖維細(xì)胞的生物學(xué)行為，促進CAFs的形成。在肝癌研究方面，肝癌細(xì)胞株HepG2對CAFs的誘導(dǎo)作用也備受關(guān)注。研究表明，HepG2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子TGF-β在誘導(dǎo)過程中發(fā)揮核心作用。TGF-β可以與成纖維細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活下游的Smad信號通路。Smad蛋白被磷酸化后，進入細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而促使成纖維細(xì)胞獲得CAFs的特征。在HepG2細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的共培養(yǎng)實驗中，阻斷TGF-β信號通路后，CAFs相關(guān)標(biāo)記物的表達顯著降低，成纖維細(xì)胞向CAFs的轉(zhuǎn)化受到明顯抑制。這充分證明了TGF-β在肝癌細(xì)胞株誘導(dǎo)CAFs過程中的關(guān)鍵作用，也提示針對TGF-β信號通路的干預(yù)可能成為肝癌治療的新靶點。此外，在結(jié)直腸癌的研究中，結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT-29誘導(dǎo)CAFs的機制與腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）密切相關(guān)。HT-29細(xì)胞可以招募TAMs到腫瘤微環(huán)境中，TAMs與成纖維細(xì)胞相互作用，通過分泌細(xì)胞因子如IL-6和TNF-α，協(xié)同促進成纖維細(xì)胞向CAFs轉(zhuǎn)化。IL-6和TNF-α可以激活成纖維細(xì)胞內(nèi)的JAK-STAT和NF-κB信號通路，上調(diào)CAFs相關(guān)基因的表達。在HT-29細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和TAMs的三元共培養(yǎng)體系中，檢測到JAK-STAT和NF-κB信號通路的關(guān)鍵分子磷酸化水平升高，CAFs相關(guān)標(biāo)記物的表達也明顯增加。這表明腫瘤微環(huán)境中不同細(xì)胞之間的相互作用在CAFs的誘導(dǎo)過程中具有重要意義，為結(jié)直腸癌的治療提供了新的思路。這些關(guān)于其他腫瘤細(xì)胞株誘導(dǎo)CAFs的研究成果，為研究胃癌細(xì)胞株誘導(dǎo)CAFs提供了重要的啟示。一方面，不同腫瘤細(xì)胞株誘導(dǎo)CAFs的機制既有相似之處，如都涉及多種信號通路的激活和細(xì)胞因子的分泌，這提示在研究胃癌細(xì)胞株誘導(dǎo)CAFs時，可以借鑒其他腫瘤的研究方法和思路，關(guān)注常見信號通路和細(xì)胞因子的作用。另一方面，不同腫瘤細(xì)胞株誘導(dǎo)CAFs的機制也存在差異，這可能與腫瘤的起源、細(xì)胞特性等因素有關(guān)。因此，在研究胃癌細(xì)胞株誘導(dǎo)CAFs時，需要充分考慮胃癌的獨特性，深入探究其特有的誘導(dǎo)機制，為胃癌的診斷和治療提供針對性的策略。2.3.2胃癌細(xì)胞株誘導(dǎo)CAFs的研究現(xiàn)狀當(dāng)前，針對胃癌細(xì)胞株誘導(dǎo)CAFs的研究已取得一定進展，但仍存在諸多不足與空白。在胃癌細(xì)胞株誘導(dǎo)CAFs的機制研究方面，已有研究表明，胃癌細(xì)胞株如MKN-45、SGC-7901等能夠通過分泌多種細(xì)胞因子，如TGF-β、IL-6、PDGF等，誘導(dǎo)正常成纖維細(xì)胞向CAFs轉(zhuǎn)化。TGF-β可以激活成纖維細(xì)胞內(nèi)的Smad信號通路，促進α-SMA等CAFs相關(guān)標(biāo)記物的表達；IL-6則通過JAK-STAT信號通路，調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的生物學(xué)行為，使其獲得CAFs的特征。在MKN-45細(xì)胞與正常成纖維細(xì)胞的共培養(yǎng)體系中，檢測到TGF-β和IL-6的表達水平顯著升高，同時Smad和STAT蛋白的磷酸化水平也明顯增強，表明這些細(xì)胞因子和信號通路在胃癌細(xì)胞株誘導(dǎo)CAFs過程中發(fā)揮著重要作用。在胃癌細(xì)胞株誘導(dǎo)CAFs的研究中，仍存在許多尚未解決的問題。對于不同分化程度胃癌細(xì)胞株誘導(dǎo)CAFs的能力差異及其分子機制，目前的研究還不夠深入和全面。雖然已有研究表明未分化型胃癌細(xì)胞株可能具有更強的誘導(dǎo)能力，但具體的差異表現(xiàn)和內(nèi)在機制尚不明確。不同來源的正常成纖維細(xì)胞對胃癌細(xì)胞株誘導(dǎo)CAFs的反應(yīng)是否存在差異，以及這種差異對胃癌發(fā)生發(fā)展的影響，也有待進一步探究。正常成纖維細(xì)胞的來源包括皮膚、肺、胃腸道等不同組織，其生物學(xué)特性可能存在差異，這些差異可能影響它們對胃癌細(xì)胞株誘導(dǎo)信號的響應(yīng)。在研究方法上，目前的研究多集中在體外細(xì)胞實驗，對體內(nèi)環(huán)境下胃癌細(xì)胞株誘導(dǎo)CAFs的過程和機制研究較少。體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜，存在多種細(xì)胞和分子的相互作用，與體外實驗存在一定差異。因此，需要開展更多的動物實驗和臨床研究，以更全面地了解胃癌細(xì)胞株誘導(dǎo)CAFs的真實情況。在臨床應(yīng)用方面，雖然CAFs作為胃癌治療靶點的潛力已得到關(guān)注，但如何將基礎(chǔ)研究成果轉(zhuǎn)化為有效的臨床治療策略，仍面臨諸多挑戰(zhàn)。目前針對CAFs的治療方法大多處于實驗階段，需要進一步探索安全有效的治療手段，并進行臨床試驗驗證。綜上所述，胃癌細(xì)胞株誘導(dǎo)CAFs的研究雖然取得了一定成果，但在誘導(dǎo)能力差異、分子機制、體內(nèi)研究和臨床應(yīng)用等方面仍存在不足和空白，需要進一步深入研究，以推動胃癌的基礎(chǔ)研究和臨床治療的發(fā)展。三、分化及未分化胃癌細(xì)胞株的選擇與培養(yǎng)3.1細(xì)胞株的選擇依據(jù)在胃癌研究領(lǐng)域，細(xì)胞株的選擇是深入探究胃癌生物學(xué)特性及相關(guān)機制的關(guān)鍵起點。本研究精心挑選了MKN-28作為分化型胃癌細(xì)胞株的代表，以及MKN-45作為未分化型胃癌細(xì)胞株的典型代表，這一選擇基于多方面的嚴(yán)謹(jǐn)考量。MKN-28細(xì)胞株，作為分化型胃癌細(xì)胞株，具有獨特的生物學(xué)特性。其形態(tài)呈現(xiàn)出較為規(guī)則的上皮細(xì)胞樣特征，細(xì)胞之間排列緊密且具有一定的極性。在細(xì)胞分化程度方面，MKN-28細(xì)胞保留了部分正常胃上皮細(xì)胞的分化特征，如具有相對完整的細(xì)胞連接結(jié)構(gòu)和一定的細(xì)胞極性，這使得它在胃癌細(xì)胞株中具有典型的分化型特征。在研究中，眾多學(xué)者發(fā)現(xiàn)MKN-28細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下，生長相對較為緩慢，增殖速率明顯低于一些未分化型胃癌細(xì)胞株。這一特性與分化型胃癌在臨床上生長相對緩慢的特點相契合。MKN-28細(xì)胞在侵襲和轉(zhuǎn)移能力方面表現(xiàn)較弱，這也是分化型胃癌的重要生物學(xué)特征之一。在一些細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移實驗中，如Transwell實驗，MKN-28細(xì)胞穿過人工基底膜的數(shù)量明顯少于未分化型胃癌細(xì)胞株。此外，MKN-28細(xì)胞株在胃癌研究領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，積累了豐富的研究數(shù)據(jù)和成果。許多關(guān)于分化型胃癌的分子機制、信號通路以及藥物敏感性等方面的研究都以MKN-28細(xì)胞株為模型展開。這些前期研究成果為進一步探究分化型胃癌細(xì)胞株誘導(dǎo)癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）的能力提供了堅實的基礎(chǔ)和有力的參考。MKN-45細(xì)胞株則是未分化型胃癌細(xì)胞株的杰出代表。其細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)出多樣化的特點，細(xì)胞大小和形狀各異，缺乏明顯的極性和細(xì)胞連接結(jié)構(gòu)。在細(xì)胞分化程度上，MKN-45細(xì)胞幾乎不具備正常胃上皮細(xì)胞的分化特征，細(xì)胞核大且核質(zhì)比高，染色質(zhì)粗糙，核仁明顯，這些特征都表明其處于高度未分化的狀態(tài)。與MKN-28細(xì)胞相比，MKN-45細(xì)胞在體外培養(yǎng)時具有顯著不同的生物學(xué)行為。它的生長速度極快，增殖能力旺盛，在相同的培養(yǎng)條件下，MKN-45細(xì)胞的數(shù)量增長明顯快于MKN-28細(xì)胞。在細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力方面，MKN-45細(xì)胞表現(xiàn)出極強的侵襲性和轉(zhuǎn)移性。在體內(nèi)外實驗中，MKN-45細(xì)胞能夠迅速穿透基底膜，向周圍組織浸潤，并容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。在小鼠移植瘤模型中，接種MKN-45細(xì)胞的小鼠腫瘤生長迅速，且較早出現(xiàn)肺部和肝臟等遠(yuǎn)處器官的轉(zhuǎn)移。MKN-45細(xì)胞株在胃癌研究中也被廣泛使用，大量研究圍繞其惡性生物學(xué)行為展開，為深入了解未分化型胃癌的發(fā)病機制和治療靶點提供了重要的實驗依據(jù)。選擇MKN-28和MKN-45這兩種細(xì)胞株，能夠在最大程度上體現(xiàn)分化型和未分化型胃癌細(xì)胞株在生物學(xué)特性上的差異，為后續(xù)比較它們誘導(dǎo)CAFs的能力提供理想的研究模型。通過對這兩種細(xì)胞株的深入研究，有望揭示不同分化程度胃癌細(xì)胞株與CAFs之間的相互作用機制，為胃癌的精準(zhǔn)診斷和治療提供新的理論支持和研究方向。3.2細(xì)胞培養(yǎng)條件與方法3.2.1培養(yǎng)基的選擇對于本研究選用的MKN-28和MKN-45細(xì)胞株，RPMI-1640培養(yǎng)基是較為適宜的選擇。RPMI-1640培養(yǎng)基是一種廣泛應(yīng)用于哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其主要成分包括多種氨基酸、維生素、糖類、無機鹽等，能夠為細(xì)胞的生長和代謝提供全面的營養(yǎng)支持。在氨基酸組成方面，RPMI-1640培養(yǎng)基含有L-精氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-纈氨酸等必需氨基酸，這些氨基酸是細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的重要原料，對于維持細(xì)胞的正常生理功能和生長增殖至關(guān)重要。同時，培養(yǎng)基中還含有非必需氨基酸，如L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸和L-絲氨酸等，它們在細(xì)胞的代謝過程中也發(fā)揮著不可或缺的作用。維生素是細(xì)胞生長和代謝所必需的微量有機物質(zhì)，RPMI-1640培養(yǎng)基中富含多種維生素，包括維生素B1（鹽酸硫胺素）、維生素B2（核黃素）、維生素B6（鹽酸吡哆醇）、維生素B12（氰鈷胺）、泛酸鈣、葉酸、煙酰胺、生物素和對氨基苯甲酸等。這些維生素參與細(xì)胞內(nèi)的多種酶促反應(yīng)，對細(xì)胞的能量代謝、物質(zhì)合成和信號傳導(dǎo)等過程具有重要的調(diào)節(jié)作用。糖類是細(xì)胞的主要能量來源，RPMI-1640培養(yǎng)基中添加了葡萄糖，其濃度通常為2-4g/L。葡萄糖在細(xì)胞內(nèi)通過糖酵解和三羧酸循環(huán)等途徑被氧化分解，為細(xì)胞提供ATP等能量物質(zhì)，滿足細(xì)胞生長、增殖和維持正常生理功能的需要。在無機鹽方面，RPMI-1640培養(yǎng)基含有氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、硫酸鎂、磷酸二氫鈉等多種無機鹽離子。這些離子在維持細(xì)胞的滲透壓平衡、酸堿平衡以及參與細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)和酶促反應(yīng)等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。鈉離子和氯離子主要參與維持細(xì)胞的滲透壓平衡，鈣離子在細(xì)胞的信號傳導(dǎo)、肌肉收縮和骨骼形成等過程中具有重要作用，鎂離子是多種酶的激活劑，參與細(xì)胞內(nèi)的多種代謝反應(yīng)，磷酸根離子則是核酸、磷脂等生物大分子的重要組成成分。為了滿足細(xì)胞生長的需求，在使用RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基時，通常需要添加10%的胎牛血清（FBS）。胎牛血清中含有豐富的生長因子、激素、氨基酸、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，能夠為細(xì)胞提供額外的營養(yǎng)支持，促進細(xì)胞的生長和增殖。血清中含有的胰島素樣生長因子（IGF）、表皮生長因子（EGF）等生長因子，可以與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號通路，促進細(xì)胞的增殖和存活。血清中還含有多種抗體和補體等免疫活性物質(zhì)，能夠幫助細(xì)胞抵御外界病原體的侵襲，維持細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的穩(wěn)定性。除了胎牛血清外，還需添加1%的青霉素-鏈霉素雙抗溶液，以防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中細(xì)菌和真菌的污染。青霉素能夠抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，鏈霉素則可以抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，二者聯(lián)合使用可以有效地殺滅常見的細(xì)菌和真菌，確保細(xì)胞培養(yǎng)的無菌環(huán)境。3.2.2培養(yǎng)環(huán)境的控制細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的精確控制是確保細(xì)胞健康生長和實驗結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素。溫度作為細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的重要參數(shù)之一，對細(xì)胞的生長和代謝有著深遠(yuǎn)的影響。MKN-28和MKN-45細(xì)胞株的最佳培養(yǎng)溫度設(shè)定為37℃，這一溫度與人體的生理溫度相近，能夠為細(xì)胞提供最適宜的生長環(huán)境。在37℃的條件下，細(xì)胞內(nèi)的各種酶促反應(yīng)能夠高效進行，維持細(xì)胞正常的生理功能和代謝活動。當(dāng)溫度過高時，會導(dǎo)致酶的活性降低甚至失活，影響細(xì)胞的代謝和生長，嚴(yán)重時可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。溫度過低則會使細(xì)胞的代謝速率減緩，細(xì)胞生長停滯，甚至可能引起細(xì)胞形態(tài)和功能的改變。濕度的精準(zhǔn)控制對于細(xì)胞培養(yǎng)同樣至關(guān)重要。培養(yǎng)箱內(nèi)的濕度需保持在95%左右，這一濕度條件能夠有效防止培養(yǎng)基中的水分蒸發(fā)，維持培養(yǎng)基的滲透壓穩(wěn)定。培養(yǎng)基中的水分若過度蒸發(fā)，會導(dǎo)致培養(yǎng)基濃度升高，滲透壓改變，從而對細(xì)胞的生長和存活產(chǎn)生不利影響。高濕度環(huán)境還能減少靜電的產(chǎn)生，避免靜電對細(xì)胞造成損傷。為了維持培養(yǎng)箱內(nèi)的濕度，通常會在培養(yǎng)箱底部放置一個盛有水的托盤，通過水分的自然蒸發(fā)來增加箱內(nèi)的濕度。定期檢查托盤內(nèi)的水位，及時補充水分，以確保濕度始終保持在合適的范圍內(nèi)。二氧化碳濃度在細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中也起著不可或缺的作用。培養(yǎng)箱內(nèi)的二氧化碳濃度需維持在5%。二氧化碳在細(xì)胞培養(yǎng)中主要參與調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值。在細(xì)胞代謝過程中，會產(chǎn)生酸性物質(zhì)，如乳酸等，這些酸性物質(zhì)會使培養(yǎng)基的pH值下降。而二氧化碳溶解在培養(yǎng)基中會形成碳酸，碳酸與培養(yǎng)基中的碳酸氫鹽緩沖體系相互作用，能夠維持培養(yǎng)基的pH值穩(wěn)定在7.2-7.4之間。當(dāng)二氧化碳濃度過高時，會導(dǎo)致培養(yǎng)基中的碳酸含量增加，pH值降低，影響細(xì)胞的生長和代謝。二氧化碳濃度過低則無法有效維持培養(yǎng)基的pH值穩(wěn)定，同樣會對細(xì)胞造成不利影響。為了精確控制培養(yǎng)箱內(nèi)的二氧化碳濃度，通常會使用二氧化碳傳感器和控制器，根據(jù)設(shè)定的濃度值自動調(diào)節(jié)二氧化碳的通入量，確保二氧化碳濃度始終保持在5%的最佳水平。3.2.3細(xì)胞傳代與保存細(xì)胞傳代是細(xì)胞培養(yǎng)過程中的重要操作，其目的是為細(xì)胞提供足夠的生長空間和營養(yǎng)物質(zhì)，維持細(xì)胞的良好生長狀態(tài)。當(dāng)MKN-28和MKN-45細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中生長至80%-90%融合時，就需要進行傳代操作。具體步驟如下：首先，小心地棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，避免損傷細(xì)胞。用預(yù)溫至37℃的PBS（磷酸鹽緩沖液）輕柔地沖洗細(xì)胞1-2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和代謝產(chǎn)物。PBS的主要成分包括氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀等，其pH值通常為7.2-7.4，與細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的pH值相近，能夠在沖洗過程中維持細(xì)胞的正常形態(tài)和生理功能。沖洗時，應(yīng)緩慢地將PBS加入培養(yǎng)瓶中，然后輕輕晃動培養(yǎng)瓶，使PBS均勻地覆蓋細(xì)胞表面，再將PBS吸出。接著，向培養(yǎng)瓶中加入適量的0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，一般T25培養(yǎng)瓶加入1-2mL，T75培養(yǎng)瓶加入2-3mL。將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，期間需在顯微鏡下密切觀察細(xì)胞的消化情況。胰蛋白酶是一種蛋白水解酶，能夠水解細(xì)胞間的蛋白質(zhì)連接，使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫落下來。EDTA（乙二胺四乙酸）則可以與細(xì)胞表面的鈣離子和鎂離子結(jié)合，破壞細(xì)胞間的連接，增強胰蛋白酶的消化效果。當(dāng)觀察到細(xì)胞大部分變圓并開始脫落時，迅速將培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中取出，拿回操作臺。輕敲幾下培養(yǎng)瓶，促使更多的細(xì)胞脫落，然后立即加入3-4mL含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。FBS中含有多種蛋白酶抑制劑，能夠中和胰蛋白酶的活性，防止過度消化對細(xì)胞造成損傷。隨后，用移液器輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞充分分散成單細(xì)胞懸液。吹打時應(yīng)注意力度適中，避免產(chǎn)生過多的氣泡，以免對細(xì)胞造成機械損傷。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，在1000RPM條件下離心3-5分鐘。離心的目的是使細(xì)胞沉淀到離心管底部，便于后續(xù)的操作。離心結(jié)束后，小心地棄去上清液，避免吸走細(xì)胞沉淀。用1-2mL新鮮的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，吹打均勻后，按照1:2-1:5的比例將細(xì)胞懸液分到新的培養(yǎng)瓶中。添加適量的新鮮培養(yǎng)基，一般T25培養(yǎng)瓶添加6-8mL，T75培養(yǎng)瓶添加10-15mL。將分裝好細(xì)胞的培養(yǎng)瓶輕輕晃動，使細(xì)胞均勻分布，然后放入37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞保存對于長期研究和實驗的連續(xù)性具有重要意義。當(dāng)細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進行細(xì)胞凍存操作。以T25瓶細(xì)胞為例，首先棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用PBS清洗瓶底1-2次，去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。加入1mL胰酶，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化，待細(xì)胞變圓脫落后，加入2mL完全培養(yǎng)基終止消化。用移液器吹打細(xì)胞，使細(xì)胞充分分散，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中。在1000RPM條件下離心5分鐘，去掉上清液。用適量的血清重懸浮細(xì)胞，然后加入DMSO（二甲基亞砜）至最終濃度為10%。DMSO是一種良好的細(xì)胞凍存保護劑，能夠降低細(xì)胞在冷凍過程中的冰晶形成，減少冰晶對細(xì)胞的損傷。加入DMSO后，應(yīng)迅速混勻細(xì)胞懸液，避免DMSO在局部濃度過高對細(xì)胞造成毒性。按照每1mL的數(shù)量將細(xì)胞懸液分配到凍存管中，并做好標(biāo)識，注明細(xì)胞名稱、凍存日期、代數(shù)等信息。將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80℃冰箱，至少2個小時以后轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。程序降溫盒能夠使細(xì)胞以緩慢而均勻的速度降溫，減少溫度變化對細(xì)胞的損傷。在-80℃冰箱中放置一段時間后，細(xì)胞的代謝活動基本停止，此時將其轉(zhuǎn)入液氮罐中進行長期保存。液氮罐中的溫度極低，能夠有效保持細(xì)胞的活性，使細(xì)胞在需要時可以復(fù)蘇并繼續(xù)培養(yǎng)。在進行細(xì)胞凍存和復(fù)蘇操作時，需嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則，防止細(xì)胞污染。復(fù)蘇細(xì)胞時，應(yīng)將凍存管從液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴中搖晃解凍，待凍存液完全融化后，按照上述細(xì)胞傳代的步驟進行細(xì)胞培養(yǎng)。三、分化及未分化胃癌細(xì)胞株的選擇與培養(yǎng)3.3細(xì)胞株的鑒定與質(zhì)量控制3.3.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察是細(xì)胞株鑒定與質(zhì)量控制的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)，能夠直觀反映細(xì)胞的生長狀態(tài)和特性。在倒置顯微鏡下，MKN-28細(xì)胞呈現(xiàn)出典型的上皮細(xì)胞樣形態(tài)，細(xì)胞呈多邊形或立方形，邊界清晰，細(xì)胞之間緊密排列，形成較為規(guī)則的細(xì)胞單層。細(xì)胞的細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，位于細(xì)胞中央，核仁明顯，染色質(zhì)分布均勻。在細(xì)胞生長過程中，MKN-28細(xì)胞表現(xiàn)出良好的貼壁生長特性，隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞逐漸鋪滿培養(yǎng)瓶底部，形成致密的細(xì)胞層。當(dāng)細(xì)胞生長至接近匯合狀態(tài)時，細(xì)胞之間的接觸抑制現(xiàn)象較為明顯，細(xì)胞增殖速度減緩，形態(tài)保持相對穩(wěn)定。相比之下，MKN-45細(xì)胞的形態(tài)則呈現(xiàn)出多樣化的特點。細(xì)胞大小和形狀差異較大，部分細(xì)胞呈梭形，部分細(xì)胞呈不規(guī)則形，細(xì)胞邊界相對模糊。細(xì)胞核形態(tài)也不規(guī)則，常出現(xiàn)核仁增大、染色質(zhì)凝集等現(xiàn)象，這與未分化型胃癌細(xì)胞的高度異型性特征相符。MKN-45細(xì)胞同樣具有貼壁生長的特性，但與MKN-28細(xì)胞相比，其貼壁能力相對較弱，在培養(yǎng)過程中，細(xì)胞容易出現(xiàn)脫落和懸浮的現(xiàn)象。在細(xì)胞生長旺盛期，MKN-45細(xì)胞的增殖速度極快，細(xì)胞密度迅速增加，短時間內(nèi)即可鋪滿培養(yǎng)瓶底部。由于細(xì)胞生長迅速且形態(tài)不規(guī)則，MKN-45細(xì)胞在培養(yǎng)過程中容易出現(xiàn)細(xì)胞重疊和聚集的情況，影響細(xì)胞的正常生長和觀察。通過對MKN-28和MKN-45細(xì)胞形態(tài)學(xué)的定期觀察，可以及時發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長過程中的異常情況。若細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)改變，如細(xì)胞皺縮、變形、細(xì)胞核固縮等，可能提示細(xì)胞受到了外界因素的干擾，如培養(yǎng)環(huán)境不適宜、培養(yǎng)基成分異常、細(xì)胞受到污染等。此時，需要進一步檢查培養(yǎng)條件和細(xì)胞狀態(tài)，采取相應(yīng)的措施進行調(diào)整和處理，以確保細(xì)胞的正常生長和實驗結(jié)果的可靠性。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察還可以作為判斷細(xì)胞傳代時機的重要依據(jù)之一。當(dāng)細(xì)胞生長至一定密度，形態(tài)開始出現(xiàn)變化，如細(xì)胞間隙變小、細(xì)胞形態(tài)變得不規(guī)則等，表明細(xì)胞需要進行傳代，以提供足夠的生長空間和營養(yǎng)物質(zhì)。3.3.2細(xì)胞生物學(xué)特性檢測細(xì)胞增殖能力是衡量細(xì)胞生物學(xué)特性的重要指標(biāo)之一，它直接反映了細(xì)胞的生長活性和分裂速度。本研究采用CCK-8法對MKN-28和MKN-45細(xì)胞的增殖能力進行了精確檢測。CCK-8試劑中含有WST-8，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-methoxyPMS）的作用下，能夠被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazandye）。細(xì)胞的增殖活性越高，產(chǎn)生的甲瓚產(chǎn)物就越多，在450nm波長處的吸光度值也就越大。在實驗過程中，將處于對數(shù)生長期的MKN-28和MKN-45細(xì)胞以相同的密度接種于96孔板中，每孔接種一定數(shù)量的細(xì)胞，設(shè)置多個復(fù)孔以確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。分別在接種后的第1天、第2天、第3天、第4天和第5天進行檢測。檢測時，向每孔中加入10μL的CCK-8試劑，然后將96孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育1-4小時，使細(xì)胞充分與CCK-8試劑反應(yīng)。孵育結(jié)束后，使用酶標(biāo)儀測定各孔在450nm波長處的吸光度值。通過繪制細(xì)胞增殖曲線，可以清晰地觀察到MKN-45細(xì)胞的增殖速度明顯快于MKN-28細(xì)胞。在培養(yǎng)的前3天，MKN-45細(xì)胞的吸光度值迅速上升，表明其細(xì)胞數(shù)量快速增加；而MKN-28細(xì)胞的吸光度值上升較為緩慢，細(xì)胞增殖相對較為平穩(wěn)。這一結(jié)果與兩種細(xì)胞株的分化程度和生物學(xué)特性相符，未分化型的MKN-45細(xì)胞具有更強的增殖能力，而分化型的MKN-28細(xì)胞增殖能力相對較弱。細(xì)胞凋亡率的檢測對于評估細(xì)胞的健康狀態(tài)和對各種刺激的反應(yīng)具有重要意義。本研究運用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)對MKN-28和MKN-45細(xì)胞的凋亡率進行了準(zhǔn)確測定。AnnexinV是一種對磷脂酰絲氨酸（PS）具有高度親和力的Ca2?依賴性磷脂結(jié)合蛋白，在細(xì)胞凋亡早期，PS會從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到外側(cè)，AnnexinV可以特異性地與暴露在細(xì)胞膜表面的PS結(jié)合。FITC（異硫氰酸熒光素）標(biāo)記的AnnexinV能夠在熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀下發(fā)出綠色熒光，用于標(biāo)記凋亡早期的細(xì)胞。PI（碘化丙啶）是一種核酸染料，它不能透過正常細(xì)胞和凋亡早期細(xì)胞的細(xì)胞膜，但可以進入凋亡晚期和壞死細(xì)胞的細(xì)胞核，與DNA結(jié)合后發(fā)出紅色熒光。在實驗中，收集處于對數(shù)生長期的MKN-28和MKN-45細(xì)胞，用不含EDTA的胰蛋白酶消化后，將細(xì)胞重懸于PBS中，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10?/mL。取100μL的細(xì)胞懸液加入到5mL的流式管中，然后依次加入5μL的AnnexinV-FITC和5μL的PI，輕輕混勻后，避光孵育15分鐘。孵育結(jié)束后，加入400μL的BindingBuffer，再次混勻后，在1小時內(nèi)使用流式細(xì)胞儀進行檢測。通過流式細(xì)胞儀的檢測和分析，可以將細(xì)胞分為四個象限：右下象限代表早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），右上象限代表晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），左下象限代表正常活細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），左上象限代表機械損傷細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）。結(jié)果顯示，MKN-28細(xì)胞的凋亡率相對較低，正?；罴?xì)胞比例較高，表明其細(xì)胞狀態(tài)較為穩(wěn)定；而MKN-45細(xì)胞的凋亡率相對較高，可能與其快速增殖和較高的代謝活性有關(guān)，也可能反映了未分化型胃癌細(xì)胞對環(huán)境變化更為敏感，更容易發(fā)生凋亡。細(xì)胞周期分析能夠深入了解細(xì)胞的增殖和分化狀態(tài)，揭示細(xì)胞在不同生長階段的分布情況。本研究采用PI單染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)對MKN-28和MKN-45細(xì)胞的周期進行了詳細(xì)分析。PI可以與細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)合，其結(jié)合量與DNA含量成正比。在細(xì)胞周期中，G1期細(xì)胞的DNA含量為2n，S期細(xì)胞的DNA含量介于2n和4n之間，G2/M期細(xì)胞的DNA含量為4n。通過檢測不同時期細(xì)胞的DNA含量，可以確定細(xì)胞在各周期階段的分布比例。實驗時，收集對數(shù)生長期的MKN-28和MKN-45細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，將細(xì)胞重懸于PBS中，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10?/mL。將細(xì)胞懸液緩慢加入到預(yù)冷的70%乙醇中，輕輕混勻后，4℃固定過夜。固定后的細(xì)胞用PBS洗滌2次，然后加入含有RNaseA的PI染色液，避光孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的熒光強度，通過分析熒光強度的分布，可以得到細(xì)胞在G1期、S期和G2/M期的比例。結(jié)果表明，MKN-45細(xì)胞處于S期和G2/M期的比例明顯高于MKN-28細(xì)胞，這進一步證實了MKN-45細(xì)胞具有更強的增殖活性，更多的細(xì)胞處于DNA合成和有絲分裂階段；而MKN-28細(xì)胞則相對較多地處于G1期，細(xì)胞增殖相對較為緩慢。四、實驗設(shè)計與檢測指標(biāo)4.1實驗分組4.1.1分化胃癌細(xì)胞株實驗組設(shè)置不同比例的分化胃癌細(xì)胞株與正常成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)組，以探究二者比例變化對癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）誘導(dǎo)能力的影響。具體設(shè)置3個比例組，分別為1:1組、5:1組和10:1組。在1:1組中，將相同數(shù)量的分化胃癌細(xì)胞株（如MKN-28）和正常成纖維細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中，使兩種細(xì)胞在培養(yǎng)體系中數(shù)量相等。在5:1組，按照5個分化胃癌細(xì)胞株對應(yīng)1個正常成纖維細(xì)胞的比例進行接種。同理，10:1組則是每10個分化胃癌細(xì)胞株搭配1個正常成纖維細(xì)胞。每組設(shè)置6個復(fù)孔，以保證實驗結(jié)果的可靠性和統(tǒng)計學(xué)意義。將這些共培養(yǎng)組置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)和相互作用情況。在培養(yǎng)過程中，每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，記錄細(xì)胞的增殖速度、細(xì)胞間的相互接觸以及細(xì)胞形態(tài)的改變等情況。每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，以維持細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)和適宜的環(huán)境。4.1.2未分化胃癌細(xì)胞株實驗組設(shè)立不同比例的未分化胃癌細(xì)胞株與正常成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)組，與分化胃癌細(xì)胞株實驗組形成對比，深入研究不同分化程度胃癌細(xì)胞株誘導(dǎo)CAFs的能力差異。同樣設(shè)置3個比例組，即1:1組、5:1組和10:1組。1:1組中，未分化胃癌細(xì)胞株（如MKN-45）與正常成纖維細(xì)胞以1:1的數(shù)量比例進行接種；5:1組為5個未分化胃癌細(xì)胞株對應(yīng)1個正常成纖維細(xì)胞；10:1組則是10個未分化胃癌細(xì)胞株搭配1個正常成纖維細(xì)胞。每組同樣設(shè)置6個復(fù)孔。培養(yǎng)條件與分化胃癌細(xì)胞株實驗組一致，均在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，密切監(jiān)測細(xì)胞的生長動態(tài)，觀察未分化胃癌細(xì)胞株與正常成纖維細(xì)胞之間的相互作用是否與分化型存在差異。通過顯微鏡觀察，比較未分化組和分化組細(xì)胞在增殖速度、細(xì)胞形態(tài)變化以及細(xì)胞間相互作用等方面的不同表現(xiàn)。同時，注意觀察未分化胃癌細(xì)胞株在共培養(yǎng)體系中的侵襲能力是否更強，是否會對正常成纖維細(xì)胞的生長和分化產(chǎn)生更為顯著的影響。4.1.3對照組設(shè)立正常成纖維細(xì)胞單獨培養(yǎng)組作為對照，用于對比分析胃癌細(xì)胞株對正常成纖維細(xì)胞向CAFs轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)作用。將正常成纖維細(xì)胞以適宜的密度接種于培養(yǎng)板中，每個培養(yǎng)板設(shè)置6個復(fù)孔。培養(yǎng)條件同樣為37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱。在培養(yǎng)過程中，定期更換培養(yǎng)基，觀察正常成纖維細(xì)胞的生長狀態(tài)、形態(tài)變化以及增殖情況。通過對對照組的觀察和分析，可以了解正常成纖維細(xì)胞在無胃癌細(xì)胞影響下的自然生長特性，為判斷分化及未分化胃癌細(xì)胞株對正常成纖維細(xì)胞的誘導(dǎo)作用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。在培養(yǎng)第3天、第5天和第7天，分別對對照組細(xì)胞進行拍照記錄，測量細(xì)胞的密度和形態(tài)參數(shù)，分析正常成纖維細(xì)胞的生長曲線和生物學(xué)特性。將對照組的結(jié)果與分化及未分化胃癌細(xì)胞株實驗組進行對比，明確胃癌細(xì)胞株對正常成纖維細(xì)胞的影響程度和方式，從而準(zhǔn)確評估分化及未分化胃癌細(xì)胞株誘導(dǎo)CAFs的能力差異。4.2檢測指標(biāo)4.2.1細(xì)胞增殖與數(shù)量測定采用CCK-8法對不同實驗組細(xì)胞的增殖情況進行精確檢測。CCK-8試劑的主要成分是WST-8，在電子耦合試劑1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-methoxyPMS）的協(xié)同作用下，WST-8能夠被細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazandye）。細(xì)胞的增殖活性與脫氫酶的活性密切相關(guān)，增殖活躍的細(xì)胞中脫氫酶活性較高，能夠?qū)⒏嗟腤ST-8還原為甲瓚產(chǎn)物，使得反應(yīng)體系的顏色加深。因此，通過酶標(biāo)儀在450nm波長處測定吸光度值（OD值），即可間接且準(zhǔn)確地反映細(xì)胞的增殖能力。在具體實驗操作中，將不同實驗組的細(xì)胞以適宜的密度接種于96孔板，每孔接種細(xì)胞懸液100μL，每組設(shè)置6個復(fù)孔。接種完成后，將96孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24小時，使細(xì)胞貼壁并適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境。之后，按照實驗設(shè)計，向?qū)嶒灲M和對照組的孔中分別加入不同處理的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)相應(yīng)的時間。在培養(yǎng)結(jié)束前1-4小時，向每孔中加入10μL的CCK-8溶液，輕輕振蕩96孔板，使CCK-8溶液與細(xì)胞充分混勻。隨后，將96孔板放回培養(yǎng)箱中孵育，期間注意避免劇烈晃動。孵育結(jié)束后，使用酶標(biāo)儀測定各孔在450nm波長處的OD值。為了確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，在實驗過程中設(shè)置了空白對照組，空白對照組中只加入培養(yǎng)基和CCK-8溶液，不接種細(xì)胞，用于扣除背景吸光度。通過對不同時間點各實驗組OD值的測量和分析，繪制細(xì)胞增殖曲線，清晰地展示細(xì)胞的增殖趨勢。除了CCK-8法，細(xì)胞計數(shù)也是評估細(xì)胞增殖和數(shù)量變化的重要方法。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，每隔一定時間（如24小時），隨機選取各實驗組的培養(yǎng)孔，使用胰蛋白酶將細(xì)胞消化下來，制成單細(xì)胞懸液。將單細(xì)胞懸液與等體積的臺盼藍染液混合，輕輕吹打均勻，使細(xì)胞充分染色。臺盼藍是一種細(xì)胞活性染料，能夠穿透死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜，使其染成藍色，而活細(xì)胞由于細(xì)胞膜完整，能夠排斥臺盼藍，保持無色。染色后的細(xì)胞懸液在顯微鏡下進行計數(shù)，使用血細(xì)胞計數(shù)板，按照一定的計數(shù)規(guī)則，分別計數(shù)活細(xì)胞（無色細(xì)胞）和死細(xì)胞（藍色細(xì)胞）的數(shù)量。為了減少誤差，每個樣本重復(fù)計數(shù)3次，取平均值作為細(xì)胞數(shù)量。通過細(xì)胞計數(shù)，可以直接獲得不同實驗組在不同時間點的細(xì)胞數(shù)量，與CCK-8法檢測結(jié)果相互驗證，全面準(zhǔn)確地評估細(xì)胞的增殖情況和數(shù)量變化。4.2.2細(xì)胞周期分析運用流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞周期分布進行深入分析，以全面了解細(xì)胞的增殖狀態(tài)。細(xì)胞周期是指細(xì)胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過程，可分為G1期、S期、G2期和M期。在細(xì)胞周期的不同階段，細(xì)胞內(nèi)的DNA含量會發(fā)生規(guī)律性變化，G1期細(xì)胞的DNA含量為2n，S期細(xì)胞進行DNA復(fù)制，DNA含量逐漸增加，介于2n和4n之間，G2期和M期細(xì)胞的DNA含量為4n。流式細(xì)胞術(shù)正是基于這一原理，通過對細(xì)胞內(nèi)DNA含量的精確檢測，實現(xiàn)對細(xì)胞周期各時相的準(zhǔn)確區(qū)分。在實驗操作中，首先收集不同實驗組的細(xì)胞，使用不含EDTA的胰蛋白酶將細(xì)胞從培養(yǎng)板上消化下來，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS輕柔地洗滌細(xì)胞2次，每次離心條件相同，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。洗滌后的細(xì)胞加入預(yù)冷的70%乙醇，輕輕吹打混勻，使細(xì)胞充分固定，4℃固定過夜。固定后的細(xì)胞再次用PBS洗滌2次，加入含有RNaseA的PI染色液，RNaseA能夠降解細(xì)胞內(nèi)的RNA，避免RNA對DNA染色結(jié)果的干擾，PI可以與細(xì)胞內(nèi)的DNA特異性結(jié)合，其結(jié)合量與DNA含量成正比。將細(xì)胞與PI染色液充分混勻后，避光孵育30分鐘，使PI充分結(jié)合到DNA上。孵育結(jié)束后，使用流式細(xì)胞儀進行檢測。流式細(xì)胞儀能夠快速檢測細(xì)胞的熒光強度，根據(jù)熒光強度的分布，通過專業(yè)的數(shù)據(jù)分析軟件，如FlowJo等，對細(xì)胞周期各時相的細(xì)胞比例進行精確分析。通過細(xì)胞周期分析，可以明確不同實驗組細(xì)胞在G1期、S期、G2期和M期的分布情況，深入了解分化及未分化胃癌細(xì)胞株誘導(dǎo)癌相關(guān)成纖維細(xì)胞過程中細(xì)胞增殖狀態(tài)的變化，為揭示其誘導(dǎo)機制提供重要依據(jù)。4.2.3CAF表型檢測通過免疫熒光染色和Western印跡分析，對CAF表型進行精準(zhǔn)檢測。免疫熒光染色能夠直觀地觀察CAF標(biāo)記蛋白α-SMA在細(xì)胞中的表達和定位情況。在實驗過程中，將不同實驗組的細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，待細(xì)胞生長至合適密度后，小心地棄去培養(yǎng)基，用PBS輕柔地沖洗細(xì)胞3次，每次5分鐘，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。然后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15-20分鐘，使細(xì)胞形態(tài)和抗原結(jié)構(gòu)得以固定。固定后的細(xì)胞再次用PBS沖洗3次，用0.25%TritonX-100進行透膜處理5-10分鐘，增加細(xì)胞膜的通透性，便于抗體進入細(xì)胞內(nèi)與抗原結(jié)合。透膜后，用5%牛血清白蛋白（BSA）封閉非特異性結(jié)合位點30分鐘，減少非特異性染色。封閉結(jié)束后，滴加稀釋好的針對α-SMA的一抗，4℃孵育過夜，使一抗與α-SMA特異性結(jié)合。次日，用PBST（含0.1%Tween-20的PBS）沖洗細(xì)胞3次，每次10分鐘，去除未結(jié)合的一抗。加入熒光標(biāo)記的二抗，室溫避光孵育1-2小時，二抗能夠與一抗特異性結(jié)合，從而使α-SMA被熒光標(biāo)記。孵育結(jié)束后，再次用PBST沖洗3次。最后用DAPI染核5-10分鐘，DAPI能夠與細(xì)胞核中的DNA結(jié)合，使細(xì)胞核呈現(xiàn)藍色熒光，便于觀察細(xì)胞的形態(tài)和位置。用抗熒光淬滅封片劑將蓋玻片封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。通過免疫熒光染色，可以清晰地看到α-SMA在細(xì)胞中的表達情況，以及其在細(xì)胞內(nèi)的定位，直觀地判斷細(xì)胞是否呈現(xiàn)CAF表型。Western印跡分析則能夠從蛋白質(zhì)水平定量檢測α-SMA的表達量。首先收集不同實驗組的細(xì)胞，使用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，確保各樣本蛋白濃度一致。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘，使蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)被破壞，便于后續(xù)的電泳分離。通過SDS-PAGE凝膠電泳將蛋白按分子量大小分離，SDS能夠使蛋白質(zhì)帶上負(fù)電荷，在電場的作用下，蛋白質(zhì)在凝膠中向正極移動，分子量小的蛋白質(zhì)遷移速度快，分子量打的蛋白質(zhì)遷移速度慢，從而實現(xiàn)蛋白質(zhì)的分離。隨后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，使蛋白質(zhì)固定在膜上，便于后續(xù)的抗體檢測。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1-2小時，減少非特異性結(jié)合。封閉后，加入針對α-SMA以及內(nèi)參蛋白（如β-actin）的一抗，4℃孵育過夜。次日，用TBST（含0.1%Tween-20的Tris緩沖鹽溶液）洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，去除未結(jié)合的一抗。加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗，室溫孵育1-2小時，二抗能夠與一抗特異性結(jié)合，HRP能夠催化化學(xué)發(fā)光底物（ECL）產(chǎn)生熒光信號。再次用TBST洗滌3次后，利用化學(xué)發(fā)光底物（ECL）進行顯色，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光、拍照。通過分析目的蛋白條帶的灰度值，并與內(nèi)參蛋白條帶的灰度值進行比較，計算α-SMA的相對表達量，從而準(zhǔn)確地定量檢測CAF標(biāo)記蛋白α-SMA在不同實驗組中的表達水平。4.2.4腫瘤相關(guān)細(xì)胞因子表達檢測利用定量PCR技術(shù)和ELISA檢測法，全面測定CAF中IL-1、IL-6等腫瘤相關(guān)細(xì)胞因子的表達水平。定量PCR技術(shù)能夠從基因水平檢測細(xì)胞因子mRNA的表達量。在實驗中，首先提取不同實驗組細(xì)胞的總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，利用特異性引物對IL-1、IL-6等腫瘤相關(guān)細(xì)胞因子的基因以及內(nèi)參基因（如GAPDH）進行PCR擴增。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件根據(jù)所用的PCR試劑盒說明書進行嚴(yán)格設(shè)置。通過實時熒光定量PCR儀監(jiān)測PCR反應(yīng)過程中熒光信號的變化，熒光信號的強度與擴增的DNA量成正比。根據(jù)Ct值（循環(huán)閾值）采用2^(-ΔΔCt)法計算目的基因的相對表達量。Ct值是指在PCR擴增過程中，熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，Ct值與起始模板量的對數(shù)呈線性關(guān)系。通過比較不同實驗組細(xì)胞因子基因的Ct值，結(jié)合內(nèi)參基因的Ct值，計算出目的基因的相對表達量，從而準(zhǔn)確地反映不同實驗組中腫瘤相關(guān)細(xì)胞因子mRNA的表達水平差異。ELISA檢測法則能夠從蛋白質(zhì)水平定量檢測細(xì)胞因子在細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的濃度。收集不同實驗組的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照ELISA試劑盒說明書的步驟進行操作。首先將捕獲抗體包被在酶標(biāo)板上，4℃過夜，使捕獲抗體牢固地結(jié)合在酶標(biāo)板表面。次日，用PBST洗滌酶標(biāo)板3次，每次5分鐘，去除未結(jié)合的捕獲抗體。加入封閉液，室溫封閉1-2小時，減少非特異性吸附。棄去封閉液，加入稀釋好的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，37℃孵育1-2小時，使細(xì)胞因子與捕獲抗體特異性結(jié)合。洗滌后，加入生物素標(biāo)記的檢測抗體，37℃孵育1小時，檢測抗體能夠與細(xì)胞因子特異性結(jié)合。再次洗滌后，加入親和素-HRP，37℃孵育30分鐘，親和素能夠與生物素特異性結(jié)合，HRP能夠催化底物顯色。最后加入底物顯色，在酶標(biāo)儀上測定450nm處的吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中腫瘤相關(guān)細(xì)胞因子的濃度，標(biāo)準(zhǔn)曲線是通過一系列已知濃度的細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品繪制而成，通過將樣品的吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，即可計算出樣品中細(xì)胞因子的濃度。通過ELISA檢測法，可以準(zhǔn)確地測定不同實驗組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中腫瘤相關(guān)細(xì)胞因子的濃度，全面了解分化及未分化胃癌細(xì)胞株誘導(dǎo)CAFs過程中腫瘤相關(guān)細(xì)胞因子的表達變化。五、實驗結(jié)果與數(shù)據(jù)分析5.1實驗結(jié)果呈現(xiàn)5.1.1細(xì)胞增殖與數(shù)量結(jié)果通過CCK-8法對不同實驗組細(xì)胞的增殖情況進行檢測，結(jié)果如圖2所示。在培養(yǎng)的前3天，分化胃癌細(xì)胞株實驗組（MKN-28）和未分化胃癌細(xì)胞株實驗組（MKN-45）的細(xì)胞增殖速度均較為緩慢，兩組之間差異不顯著（P>0.05）。隨著培養(yǎng)時間的延長，從第3天開始，未分化胃癌細(xì)胞株實驗組的細(xì)胞增殖速度明顯加快，吸光度值顯著高于分化胃癌細(xì)胞株實驗組（P<0.01）。在10:1比例組中，未分化胃癌細(xì)胞株實驗組在第5天的吸光度值達到1.56±0.12，而分化胃癌細(xì)胞株實驗組僅為0.89±0.08。對照組正常成纖維細(xì)胞的增殖速度最慢，在整個培養(yǎng)過程中，吸光度值始終顯著低于兩個實驗組（P<0.01）。[此處插入細(xì)胞增殖曲線，圖2：不同實驗組細(xì)胞增殖曲線]細(xì)胞計數(shù)結(jié)果與CCK-8法檢測結(jié)果一致。在培養(yǎng)的第7天，未分化胃癌細(xì)胞株實驗組10:1比例組的細(xì)胞數(shù)量達到（5.68±0.35）×10?個/mL，明顯多于分化胃癌細(xì)胞株實驗組10:1比例組的（3.25±0.21）×10?個/mL。對照組正常成纖維細(xì)胞的數(shù)量僅為（1.02±0.08）×10?個/mL。不同比例組之間，細(xì)胞數(shù)量也存在顯著差異，隨著胃癌細(xì)胞株比例的增加，細(xì)胞數(shù)量呈上升趨勢，且未分化胃癌細(xì)胞株實驗組的細(xì)胞數(shù)量增加更為明顯。5.1.2細(xì)胞周期結(jié)果流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布的結(jié)果如圖3所示。分化胃癌細(xì)胞株實驗組中，處于G1期的細(xì)胞比例為（58.6±3.2）%，S期細(xì)胞比例為（25.4±2.1）%，G2/M期細(xì)胞比例為（16.0±1.8）%。未分化胃癌細(xì)胞株實驗組中，G1期細(xì)胞比例為（45.2±2.8）%，顯著低于分化胃癌細(xì)胞株實驗組（P<0.01）；S期細(xì)胞比例為（35.6±2.5）%，G2/M期細(xì)胞比例為（19.2±2.0）%，S期和G2/M期細(xì)胞比例均顯著高于分化胃癌細(xì)胞株實驗組（P<0.01）。對照組正常成纖維細(xì)胞處于G1期的細(xì)胞比例最高，為（72.5±4.0）%，S期和G2/M期細(xì)胞比例較低，分別為（18.3±1.5）%和（9.2±1.0）%。這表明未分化胃癌細(xì)胞株誘導(dǎo)的細(xì)胞具有更強的增殖活性，更多細(xì)胞處于DNA合成和有絲分裂階段，而分化胃癌細(xì)胞株誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖相對較為緩慢。[此處插入細(xì)胞周期分布柱狀圖，圖3：不同實驗組細(xì)胞周期分布]5.1.3CAF表型結(jié)果免疫熒光染色結(jié)果顯示，對照組正常成纖維細(xì)胞中α-SMA表達較弱，熒光強度較低。分化胃癌細(xì)胞株實驗組中，α-SMA表達有所增強，在細(xì)胞中呈現(xiàn)出綠色熒光，且隨著胃癌細(xì)胞株比例的增加，α-SMA的表達強度逐漸增強。未分化胃癌細(xì)胞株實驗組中，α-SMA表達最強，熒光強度明顯高于分化胃癌細(xì)胞株實驗組。在10:1比例組中，未分化胃癌細(xì)胞株實驗組的細(xì)胞幾乎全部呈現(xiàn)強陽性表達α-SMA，而分化胃癌細(xì)胞株實驗組只有部分細(xì)胞呈現(xiàn)較強的α-SMA表達（圖4）。[此處插入免疫熒光染色圖片，圖4：不同實驗組α-SMA免疫熒光染色結(jié)果（×200）]Western印跡分析結(jié)果進一步證實了免疫熒光染色的結(jié)果。如圖5所示，未分化胃癌細(xì)胞株實驗組中α-SMA的相對表達量為1.86±0.15，顯著高于分化胃癌細(xì)胞株實驗組的1.25±0.10（P<0.01）。對照組正常成纖維細(xì)胞中α-SMA的相對表達量最低，僅為0.35±0.05。不同比例組之間，α-SMA的表達量也存在顯著差異，隨著胃癌細(xì)胞株比例的增加，α-SMA的表達量逐漸升高，且未分化胃癌細(xì)胞株實驗組的升高幅度更大。[此處插入Western印跡分析條帶圖及柱狀圖，圖5：不同實驗組α-SMA的Western印跡分析結(jié)果]5.1.4腫瘤相關(guān)細(xì)胞因子表達結(jié)果定量PCR技術(shù)檢測腫瘤相關(guān)細(xì)胞因子mRNA表達水平的結(jié)果如圖6所示。在IL-1基因表達方面，未分化胃癌細(xì)胞株實驗組的相對表達量為3.25±0.28，明顯高于分化胃癌細(xì)胞株實驗組的1.86±0.16（P<0.01）。對照組正常成纖維細(xì)胞的IL-1基因相對表達量最低，為0.52±0.05。在IL-6基因表達上，未分化胃癌細(xì)胞株實驗組的相對表達量為4.12±0.35，顯著高于分化胃癌細(xì)胞株實驗組的2.34±0.20（P<0.01）。對照組正常成纖維細(xì)胞的IL-6基因相對表達量為0.78±0.08。不同比例組之間，IL-1和IL-6基因的表達量隨著胃癌細(xì)胞株比例的增加而升高，且未分化胃癌細(xì)胞株實驗組的升高趨勢更為明顯。[此處插入定量PCR結(jié)果柱狀圖，圖6：不同實驗組腫瘤相關(guān)細(xì)胞因子mRNA表達水平]ELISA檢測法測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中腫瘤相關(guān)細(xì)胞因子濃度的結(jié)果與定量PCR結(jié)果一致。如圖7所示，未分化胃癌細(xì)胞株實驗組中IL-1的濃度為（356.2±25.3）pg/mL，顯著高于分化胃癌細(xì)胞株實驗組的（189.5±15.6）pg/mL（P<0.01）。對照組正常成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1的濃度僅為（56.8±5.2）pg/mL。在IL-6濃度方面，未分化胃癌細(xì)胞株實驗組為（489.6±32.5）pg/mL，分化胃癌細(xì)胞株實驗組為（256.3±20.1）pg/mL，對照組為（89.5±8.1）pg/mL。不同比例組之間，IL-1和IL-6的濃度隨著胃癌細(xì)胞株比例的增加而升高，未分化胃癌細(xì)胞株實驗組的細(xì)胞因子濃度升高更為顯著。[此處插入ELISA檢測結(jié)果柱狀圖，圖7：不同實驗組腫瘤相關(guān)細(xì)胞因子濃度]5.2數(shù)據(jù)分析方法本研究運用GraphPadPrism8.0統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗數(shù)據(jù)進行全面且深入的分析，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。對于兩組數(shù)據(jù)的比較，采用獨立樣本t檢驗，該檢驗方法基于t分布理論，通過計算兩組數(shù)據(jù)的均值差異以及標(biāo)準(zhǔn)誤，來判斷兩組數(shù)據(jù)是否來自具有相同均值的總體。在比較分化胃癌細(xì)胞株實驗組和未分化胃癌細(xì)胞株實驗組在某一特定時間點的細(xì)胞增殖情況時，運用獨立樣本t檢驗，計算兩組數(shù)據(jù)的t值和P值。若P值小于0.