遺傳修飾動(dòng)物模型演示文稿2025/7/261第一頁，共228頁。第一節(jié)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的概念及其發(fā)展簡史轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(transgenicanimal)：是指基因組中整合有外源基因、外源基因能夠表達(dá)并按孟德爾定律遺傳的一類動(dòng)物。轉(zhuǎn)基因(transgene)：將外源基因整合入動(dòng)物基因組中的操作。嵌合體動(dòng)物(chimera)：部分組織中整合有外源基因的動(dòng)物。2025/7/262第二頁，共228頁。第一節(jié)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的概念及其發(fā)展簡史轉(zhuǎn)基因的三個(gè)層次：細(xì)菌轉(zhuǎn)基因離體真核細(xì)胞轉(zhuǎn)基因生物轉(zhuǎn)基因2025/7/263第三頁，共228頁。第一節(jié)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的概念及其發(fā)展簡史

人類疾病動(dòng)物模型(Animalmodelsofhumandiseases)是指在醫(yī)學(xué)研究中，在動(dòng)物身上建立，或形成類似人類疾病動(dòng)物。通過動(dòng)物模型直接，或間接反映疾病的發(fā)生和發(fā)展過程，在了解疾病的基礎(chǔ)上開創(chuàng)和改進(jìn)、優(yōu)化疾病的治療。

2025/7/264第四頁，共228頁。第一節(jié)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的概念及其發(fā)展簡史轉(zhuǎn)基因技術(shù)是在基因工程和胚胎工程的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的1961年，Tarkowski等將小鼠卵裂期不同品系的胚胎細(xì)胞融合后，形成了嵌合體小鼠；1974年，Jaenisch和Mintz將SV40DNA注射入小鼠囊胚中，在小鼠的體細(xì)胞檢測到病毒DNA序列；1980年，Gordon首次將重組的DNA注射到小鼠體細(xì)胞中；2025/7/265第五頁，共228頁。第一節(jié)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的概念及其發(fā)展簡史1982年，Palmiter將金屬巰基(MTI)基因啟動(dòng)子控制的大鼠生長激素基因轉(zhuǎn)入侏儒小鼠的受精卵，得到的7只轉(zhuǎn)基因鼠中，有6只生長明顯加快，體重遠(yuǎn)大于正常對(duì)照，被稱為“超級(jí)小鼠”(Supermice)。82年以后，轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到了大力的推廣和研究，至今已制備出小鼠、大鼠、雞、兔、豬、羊、魚等轉(zhuǎn)基因品系。2025/7/266第六頁，共228頁。1、第一例嵌合體小鼠1974年最早把猿猴病毒40(SV40)注入小鼠囊胚腔中得到部分組織中含有SV40DNA的嵌合體小鼠。但無任何表型改變。2、第一個(gè)轉(zhuǎn)基因小鼠系

1976年建立了世界上第一個(gè)轉(zhuǎn)基因小鼠系，這些小鼠基因組中插人了莫氏白血病病毒基因。他們是運(yùn)用反轉(zhuǎn)錄病毒與小鼠卵裂球共培養(yǎng)把外源DNA插入到小鼠的基因組中。3、第一例顯微注射法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠

1980年，Gordn等把SV40DNA顯微注射到小鼠受精卵的原核中，獲得了兩只轉(zhuǎn)基因小鼠，創(chuàng)建了顯微注射轉(zhuǎn)基因方法。2025/7/267第七頁，共228頁。4、“超級(jí)鼠”

1982年，Palmiter和Brinster用此方法把大鼠的生長激素基因?qū)胄∈笫芫?，獲得了成年體重是對(duì)照組小鼠2倍的“超級(jí)鼠”，首先證明外源基因可在受體中表達(dá)，并且表達(dá)產(chǎn)物具有生物活性。5、轉(zhuǎn)基因家畜的產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因家兔、綿羊和豬(Hammer等，1985)、牛(Bondioli等，1988)和山羊(Ebert等，1991)等相繼出世。2025/7/268第八頁，共228頁。2025/7/269第九頁，共228頁。2025/7/2610第十頁，共228頁。6、利用轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)重組蛋白

1987年，Simons等在轉(zhuǎn)基因小鼠的乳汁中得到綿羊的β-球蛋白，1988年，該研究小組又從轉(zhuǎn)基因綿羊的乳汁中得到了α-抗胰蛋白酶。目前，已有數(shù)十種蛋白實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)。7、轉(zhuǎn)YAC的轉(zhuǎn)基因小鼠近10年內(nèi)，陸續(xù)出現(xiàn)用全長酵母人工染色體（YAC）DNA來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠。2025/7/2611第十一頁，共228頁。東北農(nóng)業(yè)大學(xué)－國內(nèi)首例綠色熒光蛋白“轉(zhuǎn)基因”克隆豬綠色熒光蛋白－豬胎兒成纖維細(xì)胞－克隆2025/7/2612第十二頁，共228頁。1987年，世界上第一只商業(yè)化轉(zhuǎn)基因綿羊在英國著名的羅斯林研究所誕生。轉(zhuǎn)基因母羊的乳汁中可以分泌α-抗胰蛋白酶。2025/7/2613第十三頁，共228頁。2010年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因鮭魚2025/7/2614第十四頁，共228頁。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的意義：基因的整體功能的闡明只有在活體內(nèi)通過整體動(dòng)物的研究才能達(dá)到；轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是生物醫(yī)學(xué)研究、新藥開發(fā)、毒理學(xué)、安全性評(píng)價(jià)的重要工具。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物用途：（l）疾病型轉(zhuǎn)基因動(dòng)物；（2）利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制藥；（3）動(dòng)物改良型；（4）基礎(chǔ)生物學(xué)研究第一節(jié)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的概念及其發(fā)展簡史2025/7/2615第十五頁，共228頁。（l）疾病型轉(zhuǎn)基因動(dòng)物替代：避免了人體實(shí)驗(yàn)造成的風(fēng)險(xiǎn)和倫理問題。潛伏期長，病程長和發(fā)病率低的疾病可控：品系，感染病原體實(shí)驗(yàn)環(huán)境方便：樣品收集結(jié)果分析容易（統(tǒng)計(jì)）；人畜共患病比較，研究疾病機(jī)理2025/7/2616第十六頁，共228頁。（2）利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制藥：生物反應(yīng)器重組蛋白藥物歐洲醫(yī)藥評(píng)價(jià)署人用醫(yī)藥產(chǎn)品委員會(huì)2006年6月2日首次批準(zhǔn)了用轉(zhuǎn)基因山羊奶研制而成的抗血栓藥物Atryn（抗凝血酶）上市

目前世界上還有利用轉(zhuǎn)基因綿羊、牛和兔乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)的人α-抗胰蛋白酶（抗蛋白酶缺乏性肺氣腫藥物）、重組組織血纖維蛋白溶酶原激活劑（抗栓藥）和人C1抑制劑（治療血管神經(jīng)性水腫的藥物）等重組蛋白藥物也已經(jīng)完成或進(jìn)入臨床Ⅲ期試驗(yàn)，特別是治療性抗體藥物，發(fā)展?jié)摿Ω蟆?025/7/2617第十七頁，共228頁。目前已在下列動(dòng)物的乳汁中生產(chǎn)出一些人類蛋白質(zhì)藥物：牛：抗凝血酶、纖維蛋白原、人血清白蛋白、膠原蛋白、乳鐵蛋白、糖基轉(zhuǎn)移酶、蛋白C等；山羊：抗凝血酶原、抗胰蛋白酶、血清白蛋白、組織纖溶原激活因子、單克隆抗體等；綿羊：抗胰蛋白酶、凝血因子Ⅸ、蛋白C；豬：凝血因子Ⅸ、蛋白C、纖維蛋白原、血紅蛋白。2025/7/2618第十八頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟1.轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建2.將外源基因引入受體胚胎3.通過胚胎移植和基因型鑒定獲得攜帶外源基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物4.通過轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的表型分析研究外源基因的功能2025/7/2619第十九頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟基本原理將改建后的目的基因用顯微注射等方法注入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的受精卵，然后將此受精卵再植入受體動(dòng)物的輸卵管中，使其發(fā)育成攜帶有外源基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，人們可以通過轉(zhuǎn)入外源基因培育優(yōu)良品種的工程動(dòng)物等。2025/7/2620第二十頁，共228頁。目的基因的分離與克隆表達(dá)載體構(gòu)建卵母細(xì)胞的收集體外成熟培養(yǎng)基因?qū)朕D(zhuǎn)基因胚胎的獲得獲得子代動(dòng)物轉(zhuǎn)基因胚胎的移植轉(zhuǎn)基因整合表達(dá)的檢測獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物受體動(dòng)物的選擇2025/7/2621第二十一頁，共228頁。構(gòu)建轉(zhuǎn)基因載體含有外源目的基因的重組載體導(dǎo)入受體胚胎轉(zhuǎn)基因胚胎的發(fā)育及鑒定通過轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表型分析研究外源基因的功能2025/7/2622第二十二頁，共228頁。

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的技術(shù)路線經(jīng)典的技術(shù)路線

目的基因

顯微注射

已交配的受體動(dòng)物

供體動(dòng)物輸卵管轉(zhuǎn)基因動(dòng)物取出

移植妊娠

缺點(diǎn)：注入目的基因的命中率低，目的基因的整合率低，受精卵移植的受孕率低。受精卵2025/7/2623第二十三頁，共228頁。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的技術(shù)路線(續(xù))

整合胚胎移植的技術(shù)路線轉(zhuǎn)基因動(dòng)物受體動(dòng)物子宮

目的基因非手術(shù)

胚胎移植

體外受精

體外培養(yǎng)

檢測

卵子受精卵多細(xì)胞胚胎整合外源基因

精子或囊胚的胚胎優(yōu)點(diǎn)：受精卵的成活率高達(dá)90％以上，外源基因整合率高，提高受孕率。2025/7/2624第二十四頁，共228頁。

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的技術(shù)路線（續(xù)）整合卵受精的技術(shù)路線：

目的基因轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

導(dǎo)入

逆轉(zhuǎn)錄病毒妊娠

精子

感染

體外受精

胚胎移植

卵母細(xì)胞成熟卵細(xì)胞囊胚受體動(dòng)物子宮

特點(diǎn)：卵母細(xì)胞導(dǎo)入目的基因后再與精子受精。2025/7/2625第二十五頁，共228頁。

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的技術(shù)路線（續(xù)）核移植（克?。┑募夹g(shù)路線

目的基因轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

導(dǎo)入

動(dòng)物胚胎成纖維細(xì)胞妊娠

取核

動(dòng)物

重組的

囊胚期

受體動(dòng)物

卵細(xì)胞受精卵胚胎子宮

去核體外培養(yǎng)胚胎移植特點(diǎn)：體細(xì)胞核移植；核移植前導(dǎo)入目的基因。2025/7/2626第二十六頁，共228頁。表達(dá)調(diào)控元件＋目的基因＋報(bào)告基因如果觀察外源基因表達(dá)所引起的生物學(xué)效應(yīng)，可選擇表達(dá)水平高而無組織特異性的強(qiáng)啟動(dòng)子，如CMV、pGK等；如果希望觀察外源基因在特定組織器官中的功能，應(yīng)選用組織特異性啟動(dòng)子，如肝蛋白啟動(dòng)子、胰島素啟動(dòng)子等；可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子調(diào)控外源基因的表達(dá)。2025/7/2627第二十七頁，共228頁。1.外源目的基因的分離2.外源目的基因與轉(zhuǎn)性基因表達(dá)啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、報(bào)告基因等構(gòu)件的拼接重組3.重組DNA導(dǎo)入生殖細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞4.胚胎移植技術(shù)5.鑒定及篩選6.目的基因整合率及表達(dá)效率的檢測轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的關(guān)鍵技術(shù)包括2025/7/2628第二十八頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建及制備轉(zhuǎn)基因載體的要求：啟動(dòng)子目的基因報(bào)告基因多聚腺苷酸化信號(hào)絕緣子2025/7/2629第二十九頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟啟動(dòng)子：①組成型啟動(dòng)子②組織特異型啟動(dòng)子③誘導(dǎo)型啟動(dòng)子④誘導(dǎo)型組織特異型啟動(dòng)子2025/7/2630第三十頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟Kozak序列（ACCAUGG）：核糖體能夠識(shí)別mRNA上的這段序列，并把它作為翻譯起始位點(diǎn)。注意這段序列并不是ribosomalbindingsite(RBS)核糖體結(jié)合位點(diǎn)，而是帽子結(jié)構(gòu)。

真核生物基因中起始密碼子上下游的最佳序列為，-3位為嘌呤堿基；+4位為G，起始密碼子AUG中的A處于+1位。A/GCCAUGG被稱為kozak序列或掃描序列。

2025/7/2631第三十一頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟KOZAK是一個(gè)女科學(xué)家，她研究過起始密碼子AUG周邊堿基定點(diǎn)突變后對(duì)轉(zhuǎn)錄和翻譯所造成的影響，并總結(jié)出在真核生物中，起始密碼子兩端序列為：——G/N-C/N-C/N-ANNAUGG——，如GCCACCAUGG、GCCAUGAUGG時(shí)，轉(zhuǎn)錄和翻譯效率最高，特別是-3位的A對(duì)翻譯效率非常重要。該序列被后人稱為Kozak序列，并被應(yīng)用于表達(dá)載體的構(gòu)建中。

2025/7/2632第三十二頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟Kozak規(guī)則，即第一個(gè)AUG側(cè)翼序列的堿基分布所滿足的統(tǒng)計(jì)規(guī)律，若將第一個(gè)AUG中的堿基A，U，G分別標(biāo)為1，2，3位，則Kozak規(guī)則可描述如下：

(1)第4位的偏好堿基為G；(2)AUG的5’端約15bp范圍的側(cè)翼序列內(nèi)不含堿基T；(3)在-3，-6和-9位置，G是偏好堿基；(4)除-3，-6和-9位，在整個(gè)側(cè)翼序列區(qū)，C是偏好堿基。

2025/7/2633第三十三頁，共228頁。2025/7/2634第三十四頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟絕緣子：在基因組內(nèi)建立獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄活性結(jié)構(gòu)域的邊界DNA序列稱為絕緣子/隔離子（insulator）。絕緣子能夠阻止鄰近的增強(qiáng)子或沉默子對(duì)其界定的基因的啟動(dòng)子發(fā)揮調(diào)控作用。

2025/7/2635第三十五頁，共228頁。絕緣子元件阻斷鄰近增強(qiáng)子的活性

2025/7/2636第三十六頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟目的基因以往構(gòu)件目的基因時(shí)一般使用基因文庫中的cDNA序列，實(shí)踐證明僅有cDNA序列往往難以得到有效表達(dá)，至少一個(gè)內(nèi)含子與cDNA序列結(jié)合會(huì)使基因得到更好的表達(dá)，常使用基因組DNA。2025/7/2637第三十七頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟報(bào)告基因是一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因，也就是說，是一個(gè)其表達(dá)產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。常用LacZ、EGFP等便于觀察多聚腺苷酸化信號(hào)2025/7/2638第三十八頁，共228頁。2025/7/2639第三十九頁，共228頁。2025/7/2640第四十頁，共228頁。2025/7/2641第四十一頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟轉(zhuǎn)基因的方法:1、受精卵雄原核顯微注射法（最常用）2、胚胎干細(xì)胞（ES）法3、逆轉(zhuǎn)錄病毒法4、體細(xì)胞核移植法5、精子載體法6、YAC法2025/7/2642第四十二頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟轉(zhuǎn)基因常用細(xì)胞：1）受精卵：受精卵→基因操作→注射假孕動(dòng)物子宮→胚胎→個(gè)體。2）胚胎干細(xì)胞：從著床前的動(dòng)物胚胎中分離多功能胚胎干細(xì)胞→基因操作→注射入動(dòng)物囊胚→形成嵌合體胚胎→嵌合個(gè)體。2025/7/2643第四十三頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟受精卵雄原核顯微注射法：以單細(xì)胞受精卵為靶細(xì)胞，利用顯微注射技術(shù)將構(gòu)建好的載體DNA直接注射入受精卵的雄原核，再將接受注射的受精卵移入假孕母體輸卵管繼續(xù)發(fā)育獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物個(gè)體。2025/7/2644第四十四頁，共228頁。2025/7/2645第四十五頁，共228頁。2025/7/2646第四十六頁，共228頁。2025/7/2647第四十七頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟載體DNA制備胚胎操作過程

ａ受精卵準(zhǔn)備ｂ顯微注射ｃ假孕母鼠準(zhǔn)備(養(yǎng)母)ｄ胚胎移植對(duì)幼鼠鑒定2025/7/2648第四十八頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟目的基因可以來源于：①通過限制性內(nèi)切酶預(yù)先分離的某一基因。②逆轉(zhuǎn)錄法得到的cDNA。③人工合成的DNA片段。④聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增的特定基因片段。2025/7/2649第四十九頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟目的基因的克隆可以通過載體方式進(jìn)行，通常選擇質(zhì)粒作為載體。將目的基因與質(zhì)粒結(jié)合形成重組因子，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，擴(kuò)增質(zhì)粒，再分離純化重組質(zhì)粒DNA，用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化，制備成線狀基因片段備用。2025/7/2650第五十頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟胚胎操作過程卵供體母鼠和假孕母鼠的準(zhǔn)備定期準(zhǔn)備相當(dāng)數(shù)量的卵供體母鼠和假孕母鼠以及一批相對(duì)穩(wěn)定的正常公鼠與結(jié)扎公鼠。這些鼠的有關(guān)要求如下表2025/7/2651第五十一頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟超排卵與取卵

選擇4~6周齡母鼠，注射孕馬血清促性腺激素（PMSG）后，隔42~48h再注射人絨毛膜促性腺激素（HCG），注射HCG后10~13h剖腹取卵，用培養(yǎng)液保存，置CO2培養(yǎng)箱備用。2025/7/2652第五十二頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟基因顯微注射

用專門的持卵管和注射針，在顯微注射儀上操作，將純化的目的基因（DNA）注射到受精卵的雄性原核內(nèi)。2025/7/2653第五十三頁，共228頁。operationpanel

holdingpipette

microneedle.

eyelens2025/7/2654第五十四頁，共228頁。顯微注射法

顯微注射法是在顯微注射儀上，一側(cè)用吸管固定受精卵，另一側(cè)將注射針插入受精卵原核（一般是雄原核）。拔出顯微注射針解除固定管的負(fù)壓，操作完成。

2025/7/2655第五十五頁，共228頁。2025/7/2656第五十六頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟受精卵移植

轉(zhuǎn)基因受精卵在單細(xì)胞至桑椹胚階段移植到受孕后0.5d的假孕母鼠的輸卵管，在囊胚期則移植到受孕后2.5d的假孕母鼠子宮。每只假孕母鼠移植20~30個(gè)轉(zhuǎn)基因卵為宜。2025/7/2657第五十七頁，共228頁。X1-cellpronuclearstagemouseembryo.PMS+HCGtosuperovulate

PregnantFosterMotherOviductTransfer++2-cellstageembryoHoldingPipetteInjectionPipette2025/7/2658第五十八頁，共228頁。EventsDuringTransgenesisDAYFertilization12

AM12

AM12

AM12

AM12

AM12

AM12

AMReimplantationMatingMicroinjectionCell

DivisionGestationBirthEmbryoRecoveryE1E2E2112345hCGPMS2025/7/2659第五十九頁，共228頁。1.結(jié)扎公鼠的制備為了獲得同步發(fā)情的假孕母鼠，要準(zhǔn)備結(jié)扎公鼠，通常選用5周齡公鼠做手術(shù)，分籠飼養(yǎng)，每籠一只。術(shù)后2～3周即完全康復(fù)，可用其生產(chǎn)假孕母鼠。目的：為了產(chǎn)生同期發(fā)情的母鼠第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟2025/7/2660第六十頁，共228頁。2025/7/2661第六十一頁，共228頁。2.超數(shù)排卵供體母鼠（不動(dòng)情的25g母鼠）腹腔注射PMSG10U（馬血清促性腺激素），一般選擇在中午注射，間隔48小時(shí)后注射HCG（人絨毛膜促性腺激素），光照周期保持12～14h；第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟2025/7/2662第六十二頁，共228頁。2025/7/2663第六十三頁，共228頁。3.同期發(fā)情將注射HCG后的母鼠與正常公鼠合籠，并于第二天早上檢查陰道栓，如果見栓說明已經(jīng)配上種了，計(jì)做懷孕0天。受體母鼠(普通發(fā)情母鼠)與結(jié)扎公鼠合籠，第二天早上檢查陰道栓，有栓的母鼠可用于胚胎移植（假孕母鼠）。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟2025/7/2664第六十四頁，共228頁。2025/7/2665第六十五頁，共228頁。計(jì)算時(shí)間與結(jié)扎公鼠2025/7/2666第六十六頁，共228頁。4.胚胎收集和預(yù)處理（1）受精卵的收集和處理見栓當(dāng)日的胚胎處于1細(xì)胞期。以脫頸椎法殺死母鼠，暴露子宮、輸卵管；剪下子宮、輸卵管，并置于平皿中；在滅菌平皿中剪下輸卵管置入盛有沖卵液的集卵杯中，在體視顯微鏡下撕開壺腹部，釋放受精卵并用新鮮的培養(yǎng)液洗1–2次。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟2025/7/2667第六十七頁，共228頁。2025/7/2668第六十八頁，共228頁。2025/7/2669第六十九頁，共228頁。

用透明質(zhì)酸酶處理受精卵細(xì)胞團(tuán)2025/7/2670第七十頁，共228頁。2025/7/2671第七十一頁，共228頁。

（2）2～8細(xì)胞胚胎的收集交配后20–60小時(shí)，輸卵管中存在有2–8細(xì)胞期胚胎。此時(shí)卵丘細(xì)胞已經(jīng)脫掉，可用1ml的注射器自輸卵管傘口沖得胚胎。其基本步驟如下：取輸卵管，在體視顯微鏡下找到輸卵管傘口，傘口呈平截狀，周邊略顯粗糙。然后，用鑷子輕輕夾住傘口下部位，慢慢將沖卵針插入傘口，再用鑷子輕輕夾住針頭，推壓注射器，胚胎從另一端沖出。洗滌胚胎：收集沖得的胚胎，用新鮮的培養(yǎng)液洗1–2次，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)過程。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟沖卵2025/7/2672第七十二頁，共228頁。

5.胚胎移植（1）輸卵管移植根據(jù)胚胎數(shù)，確定供胚胎移植的受體母鼠數(shù)，并做好手術(shù)準(zhǔn)備。手術(shù)切口位于兩側(cè)腰部距背正中線1cm處，左右各一個(gè)相互平行的切口。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟2025/7/2673第七十三頁，共228頁。2025/7/2674第七十四頁，共228頁。小鼠麻醉、剪毛、消毒后，用手術(shù)剪切開小鼠的皮膚、肌肉、打開腹腔，暴露卵巢、卵巢脂肪墊，并用鑷子夾住脂肪組織，把卵巢、輸卵管和一部分子宮角慢慢拉出，通過用紗布保護(hù)的切口置于紗布上。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟2025/7/2675第七十五頁，共228頁。2025/7/2676第七十六頁，共228頁。2025/7/2677第七十七頁，共228頁。在體視顯微鏡下觀察輸卵管傘，并用移卵管吸取胚胎，次序?yàn)槭炗汀⒖諝馀?、培養(yǎng)液、空氣泡2、胚胎(盡可能少帶入培養(yǎng)液)。空氣泡3、培養(yǎng)液。2025/7/2678第七十八頁，共228頁。2025/7/2679第七十九頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟用顯微注射方法制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，操作技術(shù)性很強(qiáng)，即使是受過嚴(yán)格訓(xùn)練的專業(yè)人員操作，發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的受精卵也只占注射卵的5％。因此人們往往來用增大微注射受精卵的數(shù)目的辦法來彌補(bǔ)這一缺陷。2025/7/2680第八十頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟優(yōu)點(diǎn)：外源DNA大小基本不受限制（1-50kb）；導(dǎo)入過程直觀；整合率高；不依賴載體缺點(diǎn)：儀器貴重，技術(shù)要求高，效率低，隨機(jī)整合，卵細(xì)胞傷害大，胚胎易損傷2025/7/2681第八十一頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟胚胎干細(xì)胞（ES）法：（ES細(xì)胞，Embryo

stem

cell）是指囊胚期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中尚未進(jìn)行分化的細(xì)胞，這種細(xì)胞具有類似癌細(xì)胞無限繁殖和高度分化的潛能。將攜帶有外源基因的ES細(xì)胞注入到動(dòng)物的早期胚胎內(nèi)，可產(chǎn)生嵌合體及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。2025/7/2682第八十二頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟胚胎干細(xì)胞的特點(diǎn)：它本身是二倍體，能在體外培養(yǎng)，具有高度的全能性，可以形成包括生殖細(xì)胞在內(nèi)的所有組織，并且在不同的培養(yǎng)條件下表現(xiàn)出不同的功能狀態(tài)。2025/7/2683第八十三頁，共228頁。2025/7/2684第八十四頁，共228頁。2025/7/2685第八十五頁，共228頁。2025/7/2686第八十六頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟步驟：1、分離ES細(xì)胞2、將包含目的基因載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入ES細(xì)胞3、體外培養(yǎng)篩選陽性克隆4、陽性克隆轉(zhuǎn)入受體囊胚并移植入假孕養(yǎng)母子宮5、子代嵌合體的鑒定，雜交生成純合子2025/7/2687第八十七頁，共228頁。EScellCultureTargetedESCellsPurePopulationofTargetedESCellsTargetedESCellsInjectedintoBlastocyst

PregnantFosterMotherXChimeraBlastocystderivedfrommousewithwhitecoat.BreedtoWTwhitemouseGermlinetransmissionofEScell-derivedgenome.UterineTransfer2025/7/2688第八十八頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟利用胚胎干細(xì)胞生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的主要策略及方法1.胚胎嵌合法2.細(xì)胞核移植法：移植到卵母細(xì)胞核中3.體外誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化為卵母細(xì)胞和精子4.利用成體干細(xì)胞中的精原干細(xì)胞生成”轉(zhuǎn)基因精子“：遷移入精巢的原始生殖細(xì)胞，是一種干細(xì)胞，通過減數(shù)分裂可形成精子。2025/7/2689第八十九頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟步驟：1、分離ES細(xì)胞2、將包含目的基因載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入ES細(xì)胞3、體外培養(yǎng)篩選陽性克隆4、陽性克隆轉(zhuǎn)入受體囊胚并移植入假孕養(yǎng)母子宮5、子代嵌合體的鑒定，雜交生成純合子2025/7/2690第九十頁，共228頁。2025/7/2691第九十一頁，共228頁。囊胚固定細(xì)胞注入內(nèi)細(xì)胞團(tuán)

2025/7/2692第九十二頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟優(yōu)點(diǎn)：外源基因整合情況的可控性高可預(yù)先在細(xì)胞水平檢測外源基因的拷貝數(shù)、定位、表達(dá)的水平及插入的穩(wěn)定性外源基因?qū)隕S細(xì)胞的方法多樣，細(xì)胞鑒定及篩選方便2025/7/2693第九十三頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟缺點(diǎn)：ES細(xì)胞系建立及培養(yǎng)困難維持ES細(xì)胞的未分化及多向分化潛能不易所得個(gè)體為嵌合體2025/7/2694第九十四頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟生殖細(xì)胞載體法

有體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)染生殖細(xì)胞的兩種方法，前者又包括精子載體法、卵子載體法、受精卵載體法、胞漿內(nèi)精子注射法等。

精子載體法是將成熟的精子與外源DNA的載體共同孵育，使精子攜帶外源DNA，受精后外源DNA整合至染色體中。

此法理論上是可行的、也有成功的先例，但成功率不高、效果不穩(wěn)定，有待繼續(xù)探索、完善。2025/7/2695第九十五頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟逆轉(zhuǎn)錄和慢病毒轉(zhuǎn)染法將目的基因重組到逆轉(zhuǎn)錄病毒（或慢病毒）載體上，制成高滴度病毒顆粒，人為感染著床前后的胚胎（也可直接將胚胎與能釋放逆轉(zhuǎn)錄病毒的單層培養(yǎng)細(xì)胞共同培養(yǎng)以達(dá)到感染目的),獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法。2025/7/2696第九十六頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟慢病毒（Lentiviruses）屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科。慢病毒核蛋白質(zhì)前整合復(fù)合物具有噬核特性，病毒基因組運(yùn)輸至細(xì)胞核，從而使慢病毒可以感染和在非有絲分裂細(xì)胞中復(fù)制。這一特性使慢病毒成為基因治療的轉(zhuǎn)移載體。2025/7/2697第九十七頁，共228頁。慢病毒載體是指以人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)來源的一種病毒載體，慢病毒載體包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息，是慢病毒載體系統(tǒng)的主要組成部分。攜帶有外源基因的慢病毒載體在慢病毒包裝質(zhì)粒、細(xì)胞系的輔助下，經(jīng)過病毒包裝成為有感染力的病毒顆粒，通過感染細(xì)胞或活體組織，實(shí)現(xiàn)外源基因在細(xì)胞或活體組織中表達(dá)。

第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟2025/7/2698第九十八頁，共228頁。2025/7/2699第九十九頁，共228頁。2025/7/26100第一百頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟HIV（Humanimmunodeficiencyvirus）EIAV（Equineinfectiousanemiavirus）

FIV（Felineimmunodeficiencyvirus）SIV（Simianimmunodeficiencyvirus）其中研究最多最為透徹的是HIV。

2025/7/26101第一百零一頁，共228頁。2025/7/26102第一百零二頁，共228頁。2025/7/26103第一百零三頁，共228頁。2025/7/26104第一百零四頁，共228頁。gag,-----群抗原基因，編碼核心蛋白p24pol-----多聚酶基因，編碼多聚酶；

env-----包膜蛋白基因，編碼包膜蛋白gp120及gp41；

tat-----基因反式激活因子對(duì)HIV-1基因其正調(diào)控作用

rev,-----病毒蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)因子，能增加gag和env基因?qū)Y(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)

vif,-----病毒感染因子,其作用是在一些細(xì)胞因子的協(xié)下促進(jìn)HIV-1在細(xì)胞內(nèi)復(fù)

Vpr,-----R蛋白能使HIV在巨噬細(xì)胞中增殖

vpu,-----U蛋白，能促進(jìn)HIV從細(xì)胞膜上釋放

nef,----負(fù)因子，具有抑制HIV-1增殖作用2025/7/26105第一百零五頁，共228頁。慢病毒載體的發(fā)展經(jīng)歷了3個(gè)階段第一代慢病毒載體系統(tǒng)是以三質(zhì)粒系統(tǒng)為代表。在構(gòu)建時(shí)把HIV-1基因組中進(jìn)行包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的順式作用元件與編碼反式作用蛋白的序列分離，分別構(gòu)建在三個(gè)獨(dú)立的質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)上，即包裝質(zhì)粒（一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子如CMV作用下，控制除env以外所有病毒結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)）、包膜質(zhì)粒（包含VSV-G基因）和載體質(zhì)粒（包含目的基因），僅去除包膜蛋白2025/7/26106第一百零六頁，共228頁。慢病毒載體的發(fā)展經(jīng)歷了3個(gè)階段第二代慢病毒載體系統(tǒng)從安全性角度又刪去了HIV的所有附屬基因，僅包含gag、pol、tat、rev基因。第三代慢病毒載體又進(jìn)一步做了些安全方面的改進(jìn)，如刪除了U3區(qū)的3′LTR和tat基因，將rev基因分離稱為四質(zhì)粒系統(tǒng)2025/7/26107第一百零七頁，共228頁。病毒載體系統(tǒng)中，病毒感染目的細(xì)胞后不會(huì)再感染其他細(xì)胞，也不會(huì)利用宿主細(xì)胞產(chǎn)生新的病毒顆粒，也就是假型病毒。pHelper負(fù)責(zé)編碼病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白，特異性的酶，基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子，提供病毒包裝所需要的包膜蛋白等。通常分為兩質(zhì)粒和三質(zhì)粒系統(tǒng)兩種。

第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟2025/7/26108第一百零八頁，共228頁。ψ包裝質(zhì)粒包膜質(zhì)粒2025/7/26109第一百零九頁，共228頁。2025/7/26110第一百一十頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟優(yōu)點(diǎn)：受精卵攜帶外源基因的陽性率高；外源基因多單拷貝整合；操作簡單，避免注射法對(duì)卵子的損害；宿主范圍廣；可同時(shí)感染大量胚胎，感染率及胚胎存活率高2025/7/26111第一百一十一頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟缺點(diǎn)：容納大小有限（≤10kb）；潛在致癌性,載體復(fù)雜；整合率不高,胚胎自我保護(hù)機(jī)制對(duì)其有抗性2025/7/26112第一百一十二頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟存在問題：1、重組病毒的滴度還不夠高，均在101TU/ml～103TU/ml之間，難以達(dá)到體內(nèi)應(yīng)用的需要；2、建立穩(wěn)定的HIV載體包裝細(xì)胞十分困難，已建立的包裝細(xì)胞均不理想。據(jù)報(bào)道，Vpr是一種使細(xì)胞進(jìn)入靜止期的強(qiáng)誘導(dǎo)劑，也是建立包裝細(xì)胞的主要障礙之一。2025/7/26113第一百一十三頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟步驟：1.逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建2.選擇和培養(yǎng)包裝細(xì)胞系3.重組病毒DNA導(dǎo)入包裝細(xì)胞4.收集重組病毒顆粒5.感染胚胎細(xì)胞，使細(xì)胞轉(zhuǎn)化2025/7/26114第一百一十四頁，共228頁。2025/7/26115第一百一十五頁，共228頁。2025/7/26116第一百一十六頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟體細(xì)胞核移植法（轉(zhuǎn)基因＋克?。⑼庠椿?qū)氲襟w細(xì)胞中，再將該細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，選擇其中帶有外源基因的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，用這種細(xì)胞的細(xì)胞核進(jìn)行核移植（把體細(xì)胞核植入一個(gè)去了核的卵母細(xì)胞中，融合并激活），將重組胚進(jìn)行體外培養(yǎng)或者植入同步化的假孕動(dòng)物的輸卵管。2025/7/26117第一百一十七頁，共228頁。2025/7/26118第一百一十八頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟優(yōu)點(diǎn)：對(duì)體細(xì)胞進(jìn)行基因改造后，用于核移植可以提高轉(zhuǎn)基因的效率，不僅具有“ES細(xì)胞途徑”的全部優(yōu)點(diǎn)，且物種適用面廣。無需經(jīng)過嵌合體育種就可獲得純合個(gè)體，周期短，效率高。2025/7/26119第一百一十九頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟缺點(diǎn)：技術(shù)上難度大，成功率極低，胚胎死亡率高，非一般實(shí)驗(yàn)室可以開展。2025/7/26120第一百二十頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟精子載體法直接以精子為載體的轉(zhuǎn)基因方法：將成熟精子與外源DNA共培養(yǎng)，成熟精子與外源DNA預(yù)培養(yǎng)之后，使精子有能力攜帶外源DNA進(jìn)入卵子中，使之受精，并使外源DNA整合到染色體中。2025/7/26121第一百二十一頁，共228頁。外源DNA導(dǎo)入精細(xì)胞的方法有DNA與精子共育法、電穿孔導(dǎo)入法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法。2025/7/26122第一百二十二頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟受體介導(dǎo)法：是將外源DNA與受體分子連接后與胚胎細(xì)胞共培養(yǎng)，受體可以介導(dǎo)外源DNA進(jìn)入受體細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移。2025/7/26123第一百二十三頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟YAC和BAC介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移酵母人工染色體（YAC）載體是近年來發(fā)展起來的新型載體,能克隆百萬對(duì)堿基的大片段DNA。優(yōu)點(diǎn)：保證大片段DNA的完整性保證較長外源片段在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究中的整合率高保證了目的基因上下游的側(cè)翼序列的完整性因而可以消除或減弱基因整合后的位置效應(yīng)。2025/7/26124第一百二十四頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟YAC：基于ARS、CEN、TEL是線性染色體穩(wěn)定的功能序列,人們利用這些序列構(gòu)建載體,重組后的DNA以線性狀態(tài)存在,這樣不僅穩(wěn)定,而且大大提高了插入外源基因的能力,并且可以像天然染色體一樣在寄主細(xì)胞中穩(wěn)定復(fù)制和遺傳，稱為人工染色體。如利用從酵母染色體上分離的ARS、CEN、TEL序列構(gòu)建載體，然后用這種載體構(gòu)建的染色體即稱為酵母人工染色體。YAC載體的裝載量為350-400kb2025/7/26125第一百二十五頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟YAC的主要功能成份有三：1）著絲粒：mitosis姊妹染色單體和減I同源染色體分離之必需。2）端粒：保護(hù)染色體末端免受核酸酶的侵襲，防止粘附到其他斷裂端，保證了染色體的穩(wěn)定存在。3）自主復(fù)制序列（ARS）元件：是染色體自主復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)。

構(gòu)建YAC需要4個(gè)短序列：2個(gè)端粒，著絲粒，ARS元件，與外源DNA連接成線性DNA分子，導(dǎo)入酵母細(xì)胞克隆。2025/7/26126第一百二十六頁，共228頁。2025/7/26127第一百二十七頁，共228頁。2025/7/26128第一百二十八頁，共228頁。2025/7/26129第一百二十九頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟YAC的缺點(diǎn)：1、內(nèi)部存在嵌合及重組等現(xiàn)象，即在一個(gè)YAC克隆里含有兩個(gè)本來不相連的獨(dú)立片段；2、某些克隆不穩(wěn)定，在轉(zhuǎn)代培養(yǎng)時(shí)可能會(huì)缺失或重排其中的片段；3、此外，由于YAC與酵母染色體具有相似的結(jié)構(gòu)，因此YAC很難與酵母染色體區(qū)分開，并且在轉(zhuǎn)基因操作時(shí)必須特別小心,以防染色體機(jī)械切割。2025/7/26130第一百三十頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟BAC為環(huán)形質(zhì)粒，其復(fù)制子來源于單拷貝質(zhì)粒F因子，故BAC在宿主菌內(nèi)只有極少數(shù)拷貝數(shù)，可穩(wěn)定遺傳，無缺失，重組和嵌合現(xiàn)象，能容納300kb的DNA分子。2025/7/26131第一百三十一頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟BAC以E.coli為宿主，轉(zhuǎn)化效率較高，常規(guī)方法(堿裂解)即可分離BAC：藍(lán)白斑，抗生素，菌落原位雜交等均可用于目的基因篩選；可對(duì)克隆在BAC的DNA直接測序2025/7/26132第一百三十二頁，共228頁。2025/7/26133第一百三十三頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟轉(zhuǎn)入基因的整合、表達(dá)及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的鑒定外源基因?qū)牒蟮拇嬖诜绞?.整合到染色體內(nèi)隨機(jī)整合（非同源重組）定點(diǎn)整合（同源重組）2.游離在細(xì)胞漿內(nèi)暫態(tài)表達(dá)3.在核酸酶的作用下降解。2025/7/26134第一百三十四頁，共228頁。外源基因?qū)牒蟮谋磉_(dá)表達(dá)影響因素1.外源基因本身的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)2.附帶的原核載體順序3.染色體位置4.甲基化5.外源基因在受體細(xì)胞中的表達(dá)方式表現(xiàn)為組織特異性和發(fā)育階段特異性第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟2025/7/26135第一百三十五頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的鑒定從小鼠尾尖提取基因組DNA為模版進(jìn)行如下鑒定1、DNA水平的檢測：①PCR鑒定：引物設(shè)計(jì)應(yīng)區(qū)分內(nèi)源外源基因；②Southern印跡雜交和FISH(熒光原位雜交)：確定整合位置；2、mRNA的檢測:northern-blot、RT-PCR3、蛋白產(chǎn)物的檢測：Westernblot等4、表型檢測：血液生化，病理、免疫組織化學(xué)5、報(bào)告基因檢測2025/7/26136第一百三十六頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟DNA水平PCR、shouthernblot、Dot-blot。原位雜交：PCR原位和染色體原位Protein水平（表型檢測）血液生化、病理、ELISA、westernblot、免疫組化

RNA水平northern-blot、原位雜交報(bào)告基因檢測2025/7/26137第一百三十七頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟經(jīng)過篩選得到的原代轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(founder)仍然只能算作實(shí)驗(yàn)材料。常用PCR進(jìn)行篩選提取鼠尾DNAPCR檢測出陽性第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟2025/7/26138第一百三十八頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟原代轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（founder）只能算作過渡材料有很大一部分founder都屬于嵌合體，由轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因兩種細(xì)胞組成。且轉(zhuǎn)入基因在founder動(dòng)物中都呈半合子狀態(tài)。2025/7/26139第一百三十九頁，共228頁。用founder動(dòng)物與已知的非轉(zhuǎn)基因動(dòng)物交配，產(chǎn)生F1代后，再經(jīng)過基因整合和表達(dá)的檢測，證明轉(zhuǎn)入的基因可以遺傳給后代，并且在后代中得到表達(dá)，才能宣布獲得了真正意義上的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟2025/7/26140第一百四十頁，共228頁。當(dāng)繁殖到陽性率為50%左右時(shí)，即基本上可以判斷出外源目的基因?yàn)閱我晃稽c(diǎn)的整合。經(jīng)擴(kuò)大繁殖，從中選擇外源目的基因表達(dá)效果好、適應(yīng)性好的轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行近親繁殖。然后從子代中選擇理想的純合子個(gè)體進(jìn)行全同胞兄妹，建立遺傳基因小鼠近交系。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟2025/7/26141第一百四十一頁，共228頁。2025/7/26142第一百四十二頁，共228頁。G0代編號(hào)檢測（3周齡）PCRSouthern2025/7/26143第一百四十三頁，共228頁。G0代整合檢測--：棄去+：保留X野生型G1代--：棄去+：半合子X半合子--：棄去+：純合子G2代表型檢測founder鼠互交2025/7/26144第一百四十四頁，共228頁。2025/7/26145第一百四十五頁，共228頁。heterozygote2025/7/26146第一百四十六頁，共228頁。2025/7/26147第一百四十七頁，共228頁。2025/7/26148第一百四十八頁，共228頁。第二節(jié)研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本步驟動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)面臨著一些問題生產(chǎn)效率低基因整合效率不高生產(chǎn)周期長，成本高轉(zhuǎn)基因動(dòng)物死亡率高常出現(xiàn)不育導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因難以傳代無法大規(guī)模生產(chǎn)2025/7/26149第一百四十九頁，共228頁。第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型概念：基因打靶是利用DNA同源重組原理，在基因組中的某一特定部位進(jìn)行定點(diǎn)的基因重組，是研究基因的功能的有效手段。包括基因敲除（geneknockout）和基因敲入（geneknockin）。2025/7/26150第一百五十頁，共228頁。三種技術(shù)的融合firstsecondthird2025/7/26151第一百五十一頁，共228頁?；蛱蕹?GeneKnockout)基因敲除是指對(duì)一個(gè)結(jié)構(gòu)已知但功能未知或未完全知道的基因，從分子水平上設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，將該基因從動(dòng)物的原基因組中去除，或用其它無功能的DNA片斷取代，然后從整體觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物表型，推測相應(yīng)基因的功能。第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型2025/7/26152第一百五十二頁，共228頁。GeneKnockout

采用同源重組的方法,用體外合成的無效基因或突變基因取代相應(yīng)正?；?再應(yīng)用轉(zhuǎn)基因方法孵育出轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,即為基因敲除動(dòng)物。第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型2025/7/26153第一百五十三頁，共228頁。同源重組的分子過程1、兩段較長的同源DNA或同源染色體彼此靠攏，在二條相同極性上斷裂2、產(chǎn)生交叉結(jié)構(gòu)3、在交叉處橫斷內(nèi)切，產(chǎn)生4種含有異源雙鏈的重組產(chǎn)物4、同源重組發(fā)生于兩個(gè)較長的同源DNA或同源染色體之間，且需要重組蛋白A（RecA）參與第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型2025/7/26154第一百五十四頁，共228頁。2025/7/26155第一百五十五頁，共228頁。外源基因

宿主基因組

同源重組后的基因組

同源重組模式HollidayStructure

2025/7/26156第一百五十六頁，共228頁。2025/7/26157第一百五十七頁，共228頁。IfyouknowsomeoftheDNAsequenceflankingaparticulargene,itispossibletodesignvectorsthatreplacethatgene.2025/7/26158第一百五十八頁，共228頁。通常意義上的基因敲除主要是應(yīng)用DNA同源重組原理，用設(shè)計(jì)的同源片段替代靶基因片段，從而達(dá)到基因敲除的目的。2025/7/26159第一百五十九頁，共228頁?；蚯萌耄╣eneknockin）是利用基因同源重組，將外源有功能基因（基因組原先不存在、或已失活的基因），轉(zhuǎn)入細(xì)胞與基因組中的同源序列進(jìn)行同源重組，插入到基因組中，在細(xì)胞內(nèi)獲得表達(dá)的技術(shù)。第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型2025/7/26160第一百六十頁，共228頁。為什么有轉(zhuǎn)基因技術(shù)還要開展基因打靶技術(shù)？轉(zhuǎn)基因技術(shù)的缺陷：1)由于轉(zhuǎn)基因隨機(jī)插入,相鄰基因組序列可能對(duì)其產(chǎn)生影響.2)整合轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)有很高的差異.3)為保證轉(zhuǎn)基因表達(dá),注入的DNA帶有所有的調(diào)控成分,調(diào)控成分可能遠(yuǎn)離編碼序列或位于復(fù)雜基因的內(nèi)含子中,難以操作.4)不能研究具有顯性致死表型的轉(zhuǎn)基因.2025/7/26161第一百六十一頁，共228頁?；虼虬屑夹g(shù)不但可以克服以上問題，還有如下優(yōu)點(diǎn)：1)可以通過同源重組精確控制整合位點(diǎn),2)可以檢測隨機(jī)整合的ES細(xì)胞克隆的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)和轉(zhuǎn)基因的表達(dá).第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型2025/7/26162第一百六十二頁，共228頁?；蚯贸d體策略：插入型和置換型插入型載體設(shè)計(jì)時(shí),選擇基因在同源序列之外或之內(nèi),導(dǎo)入宿主細(xì)胞前,需將打靶載體在同源區(qū)制造一個(gè)線性化缺口,這樣會(huì)使同源重組效率提高。插入型載體與靶基因在同源區(qū)發(fā)生一次單交換后,將造成整個(gè)載體插入染色體同源區(qū),從而使同源序列增加一個(gè)拷貝。第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型2025/7/26163第一百六十三頁，共228頁。缺點(diǎn)：1、不能區(qū)分隨機(jī)整合與同源插入2、留下的選擇標(biāo)記及其啟動(dòng)子、增強(qiáng)子可能會(huì)影響鄰近基因的表達(dá)3、串聯(lián)重復(fù)序列不穩(wěn)定第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型2025/7/26164第一百六十四頁，共228頁。2025/7/26165第一百六十五頁，共228頁。置換型載體同時(shí)存在正負(fù)兩個(gè)篩選標(biāo)記，當(dāng)發(fā)生同源重組時(shí),同源區(qū)發(fā)生雙交換，負(fù)選擇基因?qū)⒈粊G棄;而在隨機(jī)插入時(shí),負(fù)選擇基因也將被插入基因組中,帶有tk基因的細(xì)胞會(huì)被培養(yǎng)基中的毒性核苷酸類似物的代謝產(chǎn)物殺死,這樣就可以篩選出定點(diǎn)整合的細(xì)胞。第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型2025/7/26166第一百六十六頁，共228頁。目前較多采用的是后者：用完全失活的或無效的打靶基因，取代核基因組上的野生型的目標(biāo)基因。第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型2025/7/26167第一百六十七頁，共228頁。2025/7/26168第一百六十八頁，共228頁。2025/7/26169第一百六十九頁，共228頁。2025/7/26170第一百七十頁，共228頁。二者主要區(qū)別在于線性化位點(diǎn)不同。置換型載體的線性化位點(diǎn)在同源臂的外側(cè)，插入型載體的線性化位點(diǎn)在同源臂序列的內(nèi)部。2025/7/26171第一百七十一頁，共228頁。第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型“四步走”第一步構(gòu)建打靶載體第二步篩選中靶細(xì)胞第三步囊胚注射和胚胎移植第四步篩選knockout動(dòng)物和表形分析2025/7/26172第一百七十二頁，共228頁。同源重組分解特定基因的定向基因要考慮特定基因產(chǎn)物的精確分析基因載體的構(gòu)建：把目的基因和與細(xì)胞內(nèi)靶基因特異片段同源的DNA分子都重組到帶有標(biāo)記基因(如neo基因，TK基因等)的載體上，成為重組載體?；蚯贸菫榱耸鼓骋换蚴テ渖砉δ埽砸话阍O(shè)計(jì)為替換型載體。第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型2025/7/26173第一百七十三頁，共228頁。如何獲得剔除小鼠?-剔除目的基因2025/7/26174第一百七十四頁，共228頁。Positive-NegativeSelectionVector正負(fù)選擇載體Neo抗性基因HSVtk基因2025/7/26175第一百七十五頁，共228頁。通用型打靶載體Mousegenomelibrary（129strain）篩選出含目的基因的克隆HRHR選擇合適的同源區(qū)2025/7/26176第一百七十六頁，共228頁。1、構(gòu)建打靶載體1）同源序列：常規(guī)的打靶載體是在篩選基因的兩端加上和目標(biāo)基因同源的序列，兩個(gè)同源序列的放置必須根據(jù)目標(biāo)基因的前后順序并且方向一致，選擇同源序列的標(biāo)準(zhǔn)常根據(jù)具體對(duì)象和實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩ǖ谌?jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型2025/7/26177第一百七十七頁，共228頁。一般兩個(gè)同源序列相加的長度要大于5kb，單側(cè)序列不小于0.5kb，被刪除的目的片段長度不宜大于10kb。第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型2）打靶載體的篩選標(biāo)志⑴新霉素抗性和胸苷激酶正負(fù)雙向選擇法⑵hprt正負(fù)雙向選擇法⑶正向選擇法2025/7/26178第一百七十八頁，共228頁。為了更好地篩選發(fā)生同源重組的克隆，1988年Mansour等人設(shè)計(jì)了正負(fù)雙向選擇系統(tǒng)(positive-negative-selection,PNS),解決了定點(diǎn)整合與隨機(jī)整合的鑒別問題。

第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型2025/7/26179第一百七十九頁，共228頁。⑴新霉素抗性和胸苷激酶正負(fù)雙向選擇法①neor：新霉素抗性基因，陽性篩選標(biāo)志，neor基因插入用于打靶的外源DNA中，當(dāng)重組后，細(xì)胞能在含新霉素（G418)的培養(yǎng)基中生長。第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型2025/7/26180第一百八十頁，共228頁。②HSV-TK：單純皰疹病毒的胸腺嘧啶激酶基因，陰性篩選標(biāo)志，該基因產(chǎn)物可分解單核苷酸類似物而生成毒性產(chǎn)物，產(chǎn)生自殺效果。第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型2025/7/26181第一百八十一頁，共228頁。HSV-TK基因插入外源基因外側(cè)的載體序列中。同源重組時(shí)，TK基因通常丟失；隨機(jī)整合時(shí)，TK基因連同打靶載體整合到核基因組上，而同時(shí)獲得neo和HSV-TK兩個(gè)基因的打靶細(xì)胞，此時(shí)加入更昔洛韋（GCV）可使細(xì)胞死亡。第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型2025/7/26182第一百八十二頁，共228頁。neo-/tk-：無外源基因整合，細(xì)胞在G418中死亡；neo＋/tk＋：隨機(jī)整合，在GCV中死亡；neo＋/tk-：同源重組，在G418和GCV中存活。用G418正向選擇neo，而用GCV負(fù)向選擇HSV-tk第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型2025/7/26183第一百八十三頁，共228頁。2025/7/26184第一百八十四頁，共228頁。普通“正負(fù)篩選”置換型基因打靶載體同源序列（總長度5-8kb，斷臂不少于2kb）HSV-tkNeo被刪除的靶基因2025/7/26185第一百八十五頁，共228頁。⑵正負(fù)雙向選擇法（用標(biāo)志基因作報(bào)告基因）基因打靶經(jīng)典實(shí)驗(yàn)常用次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（hprt）基因（Xq26.1）作為基因打靶的靶基因。內(nèi)源性hprt基因可作為正向和負(fù)向選擇的標(biāo)記基因。第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型2025/7/26186第一百八十六頁，共228頁。hprt＋和hprt－細(xì)胞可分別用HAT（次黃嘌呤、氨甲蝶呤、胸腺嘧啶核苷培養(yǎng)基）或6-TG（6-巰基鳥嘌呤）選擇培養(yǎng)基篩選出來。只有hprt＋細(xì)胞能在HAT培養(yǎng)基中生存，此為正向選擇只有hprt－細(xì)胞能在6-TG培養(yǎng)基中生存，此為負(fù)向選擇第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型2025/7/26187第一百八十七頁，共228頁。⑶正向選擇法promoterATGneor同源序列1同源序列2同源序列1neor同源序列2同源序列1neor同源序列2以往的基因打靶載體正向選擇的打靶載體隨機(jī)插入：neo無啟動(dòng)子和起始密碼子，在G418中死亡同源序列1同源序列2promoterATGtargetgene同源序列1同源序列2promoterATGneor同源重組：neo有啟動(dòng)子和ATG，在G418中生存2025/7/26188第一百八十八頁，共228頁。正向選擇打靶基因進(jìn)入細(xì)胞后的命運(yùn)①無整合：目標(biāo)載體隨傳代丟失②隨機(jī)整合：則neor無啟動(dòng)子，neor表達(dá)受阻或因整個(gè)位點(diǎn)旁側(cè)基因啟動(dòng)子作用使neor表達(dá)。③同源重組：可借助自然存在的靶基因啟動(dòng)子和AUG使neor高表達(dá)用G418篩選抗性細(xì)胞，Southernblot和PCR區(qū)分同源重組和隨機(jī)重組的細(xì)胞克隆，G418只需一次篩選。第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型2025/7/26189第一百八十九頁，共228頁。如何獲得剔除小鼠?－胚胎工程2025/7/26190第一百九十頁，共228頁。簡要過程129系2025/7/26191第一百九十一頁，共228頁。2、將載體導(dǎo)入ES細(xì)胞選取發(fā)育第4-5天的胚胎干細(xì)胞(ES)。把外來基因轉(zhuǎn)入胚胎干細(xì)胞。體外篩選打靶成功的細(xì)胞。第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型2025/7/26192第一百九十二頁，共228頁。3、將基因敲除ES細(xì)胞注射入胚泡，形成嵌合胚胎4、將10-20個(gè)胚泡植入假孕小鼠子宮。5、獲得子代小鼠，篩選帶有靶基因的小鼠。常有的方法有：Southern印記、Northern印記6、雜合小鼠（+/-）間雜交，獲得子二代小鼠（+/+、-/-、+/-）。7、篩選的-/-、+/-子二代小鼠。第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型2025/7/26193第一百九十三頁，共228頁。2025/7/26194第一百九十四頁，共228頁?；虼虬械牟呗缘谌?jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型完全基因剔除（completeknockout）大規(guī)模隨機(jī)基因剔除—基因捕獲(genetrapping)精細(xì)突變的引入時(shí)空上可調(diào)節(jié)的基因打靶染色體組大片段的刪除和重排基因敲入法研制轉(zhuǎn)基因小鼠2025/7/26195第一百九十五頁，共228頁。完全基因剔除（completeknockout）將陽性選擇標(biāo)記基因插入到靶基因功能最關(guān)鍵的外顯子中，或通過同源重組篩除靶基因的最重要功能域。第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型2025/7/26196第一百九十六頁，共228頁。大規(guī)模隨機(jī)基因剔除—基因捕獲(genetrapping)基因誘捕(genetrap)是基于小鼠胚胎干細(xì)胞、報(bào)道載體(誘捕載體)建立的一種基因突變方法。誘捕載體在整合位點(diǎn)利用內(nèi)源基因調(diào)控元件模仿內(nèi)源基因表達(dá),使其表達(dá)終止,從而可以闡明內(nèi)源基因的功能。第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型2025/7/26197第一百九十七頁，共228頁。此法利用某些能隨機(jī)插入基因序列的病毒，細(xì)菌或其他基因載體，在目標(biāo)細(xì)胞基因組中進(jìn)行隨機(jī)插入突變，建立一個(gè)攜帶隨機(jī)插入突變的細(xì)胞庫，然后通過相應(yīng)的標(biāo)記進(jìn)行篩選獲得相應(yīng)的基因敲除細(xì)胞。第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型根據(jù)細(xì)胞的不同，插入載體的選擇也有所不同。逆轉(zhuǎn)錄病毒可用于動(dòng)植物細(xì)胞的插入；農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)座子常用植物細(xì)胞；噬菌體可用于細(xì)菌基因敲除。2025/7/26198第一百九十八頁，共228頁。建立一個(gè)攜帶隨機(jī)插入突變的ES細(xì)胞庫通常基因捕獲載體是一個(gè)無啟動(dòng)子的報(bào)道基因，通常是neo基因；neo基因插入到ES細(xì)胞染色體組中，并利用捕獲基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件實(shí)現(xiàn)表達(dá)的ES克隆可以很容易地在含G418的選擇培養(yǎng)基中篩選出來。從理論上講，在選擇培養(yǎng)基中存活的克隆應(yīng)該100％地含有中靶基因。中靶基因的信息可以通過篩選標(biāo)記基因側(cè)翼cDNA或染色體組序列分析來獲得。第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型2025/7/26199第一百九十九頁，共228頁?；蛘T捕載體的特點(diǎn):①無啟動(dòng)子②報(bào)道基因上游有一個(gè)剪接受體位點(diǎn)在內(nèi)源性基因的順式調(diào)控元件啟動(dòng)子、增強(qiáng)子的轉(zhuǎn)錄活性作用下,通過mRNA前體的剪接,上游編碼基因與報(bào)道基因產(chǎn)生融合轉(zhuǎn)錄,內(nèi)源性基因表達(dá)受阻,報(bào)道基因以內(nèi)源基因模式進(jìn)行表達(dá)。第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型2025/7/26200第二百頁，共228頁。2025/7/26201第二百零一頁，共228頁。2025/7/26202第二百零二頁，共228頁。由于誘捕載體及其報(bào)道基因的特點(diǎn),基因誘捕技術(shù)可用于高通量生產(chǎn),便于小鼠基因功能的大規(guī)模研究,為各類疾病動(dòng)物模型的建立奠定良好基礎(chǔ)。第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型2025/7/26203第二百零三頁，共228頁。利用基因捕獲可以建立一個(gè)攜帶隨機(jī)插入突變的ES細(xì)胞庫,節(jié)省大量篩選染色體組文庫以及構(gòu)建特異打靶載體的工作及費(fèi)用,更有效和更迅速地進(jìn)行小鼠染色體組的功能分析。用基因捕獲法在單次實(shí)驗(yàn)中可以獲得數(shù)以百計(jì)的帶有單基因剔除的ES克隆。第三節(jié)用基因打靶建立動(dòng)物模型2025/7/26204第二百零四頁，共228頁。精細(xì)突變的引入插入法和置換法共同的缺點(diǎn)是靶位點(diǎn)上最終留下了有轉(zhuǎn)錄活性的外源