酶的應(yīng)用

——生物技術(shù)領(lǐng)域生物技術(shù)又稱生物工程，主要包括基因工程、細(xì)胞工程、酶工程和發(fā)酵工程等四個方面的內(nèi)容，這些內(nèi)容都是以生物體及其代謝產(chǎn)物為主要研究對象。酶是生物催化劑，在生物體及其代謝過程中是必不可少的?，F(xiàn)在介紹酶在細(xì)胞工程和基因工程中起著關(guān)鍵性作用的幾個方面的應(yīng)用情況。酶在生物技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用主要有三種：用酶除去細(xì)胞壁用酶進(jìn)行大分子切割用酶進(jìn)行分子拼接一、酶在除去細(xì)胞壁方面的應(yīng)用微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞的表層都有細(xì)胞壁。細(xì)胞壁對微生物和植物維持其細(xì)胞的形狀和結(jié)構(gòu)起著重要作用，可保護(hù)細(xì)胞遭外界因素的破壞。但在生物工程方面，很多時候都需要除去細(xì)胞壁。

例如：胞內(nèi)物質(zhì)的提取

微生物和植物細(xì)胞的許多物質(zhì)，如胞內(nèi)酶、胰島素及干擾素等基因工程菌的產(chǎn)物，天然抗氧化劑等植物細(xì)胞次級代謝產(chǎn)物都存在于細(xì)胞內(nèi)。為了將這些細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)提取出來,很多時候都需要將細(xì)胞壁破壞或除去。

原生質(zhì)體的制備

在制備原生質(zhì)體或提取胞內(nèi)某些穩(wěn)定性較差的活性物質(zhì)時,既要除去細(xì)胞壁,又要不損傷其他成分。這樣就不能采用激烈的破碎方法,而只能利用各種具有專一性的酶。根據(jù)不同細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞壁組分的不同,除去細(xì)胞壁時所采用的酶也有所區(qū)別。①除去細(xì)菌細(xì)胞壁細(xì)菌的細(xì)胞壁主要成分是肽多糖。革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁除了肽多糖以外，還有一層脂多糖。除去革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁是采用從蛋清中分離得到的溶菌酶。該酶專一地作用于細(xì)菌細(xì)胞壁的肽多糖分子中N-乙酰胞壁酸與N-乙酰氨基葡萄糖之間的α-1，4-鍵。而對于革蘭氏陰性菌需由溶菌酶和EDTA共同作用才能達(dá)到較好地除去細(xì)胞壁的效果。這是由于EDTA可作用于脂多糖的緣故。②除去酵母細(xì)胞壁酵母的細(xì)胞壁分為兩層，外層由磷酸甘露糖和蛋白質(zhì)組成，內(nèi)層由β-葡聚糖構(gòu)成細(xì)胞壁的骨架。除去酵母細(xì)胞壁主要采用β-1，3-葡聚糖酶。該酶作用于細(xì)胞壁內(nèi)層的β-葡聚糖分子中β-1，3-糖苷鍵，使作為細(xì)胞壁骨架的β-葡聚糖水解，而使細(xì)胞壁破壞。由于蝸牛的消化液中含有較多的β-1，3-葡聚糖酶，故常用于酵母的破壁。此外，若β-葡聚糖酶與磷酸甘露糖酶及蛋白酶聯(lián)合作用，則可使細(xì)胞壁的內(nèi)外兩層同時被破壞，而顯著提高破壁效果。③除去霉菌細(xì)胞壁毛霉、根霉等藻菌綱霉菌的細(xì)胞壁主要由幾丁質(zhì)(N-乙酰-D-氨基葡萄糖以β-1，4-鍵結(jié)合而成)和殼多糖(氨基葡萄糖以β-1，4鍵結(jié)合而成)等多種物質(zhì)組成。破壁時主要采用放線菌或細(xì)菌產(chǎn)生的殼多糖酶、幾丁質(zhì)酶及蛋白酶等多種酶的混合物。這些混合多酶制劑一般稱之為細(xì)胞壁溶解酶

。米曲霉、黑曲霉和青霉等半知菌綱霉菌的細(xì)胞壁的主要組分是幾丁質(zhì)和β-葡聚糖等。破壁時主要使用β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶的混合物。④植物細(xì)胞壁的破除植物細(xì)胞壁主要由纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和果膠等組成。破除植物細(xì)胞壁主要采用纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶組成的混合酶。這幾種酶大多數(shù)是由霉菌發(fā)酵產(chǎn)生。利用酶除去細(xì)胞壁，除了要根據(jù)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特點選用適宜的酶之外，還必須控制好酶作用條件和時間。此外，若用酶除去細(xì)胞壁以制備原生質(zhì)體時，必須在反應(yīng)系統(tǒng)中添加滲透壓穩(wěn)定劑，維持高滲狀態(tài)而使制備得到的原生質(zhì)體不致破裂。二、酶在大分子切割方面的應(yīng)用

生物工程經(jīng)常與生物大分子打交道。在許多情況下需要把大分子切割成較小的分子或片斷，以便在生物工程的有關(guān)領(lǐng)域使用。在生物大分子的切割過程中往往要求在特定的位點上進(jìn)行，這就只能借助于具有專一性的各種水解酶或其他酶類才能做到①限制性核酸內(nèi)切酶

限制性核酸內(nèi)切酶在基因工程中用以從雙鏈DNA分子中切取所需的基因，并用同一種酶將質(zhì)粒DNA或噬菌體DNA切開,以便進(jìn)行DNA的體外重組。在應(yīng)用時可根據(jù)需要選用適宜的限制性核酸內(nèi)切酶。如：1）AluI酶識別順序有4個堿基，作用位點在識別順序內(nèi)(箭頭表示切點位置)，作用后產(chǎn)生平整末端：2）AsuI酶識別順序有5個核苷酸，作用后產(chǎn)生黏性末端：②DNA外切核酸酶

DNA外切核酸酶在基因工程中用于載體或基因片段的切割加工。當(dāng)獲得的基因載體或基因片段太大時，可利用DNA外切酶從兩條鏈的末端各除去若干個核苷酸，而使DNA片段變小一些,以滿足使用的需要;當(dāng)獲得的DNA片段為平整末端時,為使它變成粘性末端,可以采用從5′端或3′端作用的DNA外切酶,以獲得所需的帶有粘性末端的DNA片段,以利于體外重組DNA。該酶還可從DNA生產(chǎn)脫氧核苷酸這是一類以脫氧核糖核酸(DNA)分子末端開始逐個除去末端核苷酸的酶。這些酶中有些可以從DNA鏈的5‘-末端開始作用，有些從3’-末端開始作用，有些則可同時作用于5‘-末端和3’-末端。它們的作用方式如圖所示。③堿性磷酸酶

堿性磷酸酶可以除去DNA或RNA鏈中的5＇-磷酸。在基因工程中主要用在為防止質(zhì)粒DNA的自我環(huán)化而除去5＇-磷酸，或在用32P對DNA或RNA進(jìn)行5＇-末端標(biāo)記之前除去5＇-磷酸。堿性磷酸酶還可以用于水解核苷酸生成核苷，并在酶標(biāo)免疫測定方面應(yīng)用。④核酸酶S1

該酶作用于單鏈DNA或RNA。在基因工程中，用于從具有單鏈末端的DNA分子中除去單鏈部分的核苷酸，而變成平整末端的雙鏈DNA。在以mRNA為模板，合成互補DNA(cDNA)時，往往會發(fā)生“發(fā)夾狀環(huán)”，用核酸酶S，就可使這些“發(fā)夾狀環(huán)”除去。⑤自我剪切酶

自我剪切酶(self-cleavageribozyme)是一類催化本身RNA分子進(jìn)行剪切反應(yīng)的核酸類酶。具有自我剪切功能的R酶RNA的前體。它可以在一定條件下催化本身RNA進(jìn)行剪切反應(yīng)，使RNA前體生成成熟的RNA分子和另一個RNA片段。

1984年，阿比利安(Apirion)發(fā)現(xiàn)T4噬菌體RNA前體可以進(jìn)行自我剪切，將含有215個核苷酸(nt)的前體剪切成為含139個核苷酸的成熟RNA和另一個76核苷酸的片段。已發(fā)現(xiàn)的具有自我剪切功能的R酶越來越多，通過自我剪切酶對自身RNA的剪切作用，可以獲得各種所需的RNA或多聚核苷酸。⑥RNA剪切酶RNA剪切酶是催化其它RNA分子驚醒剪切反應(yīng)的核酸類酶。例如：核糖核酸類酶P（RNaseP）的核酸組分M1RNA在高濃度鎂離子存在的條件下，可催化tRNA前體的剪切反應(yīng)，除去部分RNA片段，而成為成熟的tRNA分子。三、酶在分子拼接方面的應(yīng)用①DNA連接酶

DNA連接酶是1967年發(fā)現(xiàn)的能使雙鏈DNA的缺口封閉的酶。它催化DNA片斷的5＇-磷酸基與另一DNA片斷的3＇-OH生成磷酸二酯鍵。在基因工程中，主要采用的是T4-DNA連接酶，該酶是由T4-噬菌體感染大腸桿菌細(xì)胞后產(chǎn)生的，可用于具黏性末端的兩個DNA片斷的連接，也可用于有平整末端的兩個DNA片段的連接。故此可將由同一種限制性核酸內(nèi)切酶切出的載體DNA和目的基因連接起來，成為重組DNA。該酶是基因工程中常用的工具酶。許多酶都具有分子拼接能力，能將兩個或多個分子連接在一起而合成較大的分子。這些酶類在生物體內(nèi)是至關(guān)重要的，它們催化各種各樣的生物合成反應(yīng)。②DNA聚合酶

DNA聚合酶是一類催化DNA復(fù)制和修復(fù)DNA分子損傷的酶。主要包括大腸桿菌DNA聚合酶I，大腸桿菌DNA聚合酶Ⅱ，大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ和T4-DNA聚合酶，水棲耐熱菌(Thermus

aquaticus)耐熱DNA聚合酶(TaqDNApolymerase)等。這類酶的作用方式基本相同，即催化一個脫氧核苷三磷酸加到模板或引物的3‘-OH上，并放出一個焦磷酸分子。

DNA聚合酶的共同特點：(1)需要模板或引物。(2)不能起始新的DNA鏈的合成。(3)催化脫氧核苷三磷酸加到DNA鏈的3’—OH末端。(4)合成的方向是從5’—末端至3’—末端。③末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TDT)從小牛胸腺分離得到，其作用是向DNA的3’-OH末端轉(zhuǎn)移脫氧核苷酸。在基因工程中是利用該酶給DNA片段加上一段同聚體，形成附加末端。采用32P或者熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸進(jìn)行3‘-末端標(biāo)記，以便與DNA的分離檢測。④反轉(zhuǎn)錄酶

該酶又稱依賴于RNA的DNA聚合酶，它以RNA為模板，以脫氧核苷三磷酸為底物，合成DNA。該酶在基因工程中廣泛應(yīng)用于從mRNA反轉(zhuǎn)錄生成互補的DNA(cDNA)，以獲得所需的基因?，F(xiàn)在利用各種反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR，可以簡便、快速地獲得所需的基因。在使用時，首先要經(jīng)過分離純化，獲得單一的RNA作為模板使用，如果RNA不純，將會產(chǎn)生錯誤反轉(zhuǎn)錄。此外需要設(shè)計和合成一段由15～30個堿基組成的與模板RNA互補的PCR引物，才能進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

⑤蛋白酶利用蛋白酶進(jìn)行有機(jī)的研究非常引人注目，并取得顯著成果。例如，用金屬蛋白酶催化N-末端經(jīng)修飾保護(hù)的L-天冬氨酸與L-苯丙氨酸縮合生成甜味劑天苯肽或稱為阿斯巴甜。利用α-胰凝乳蛋白酶催化苯丙氨酸與丙氨酸合成二肽等。

⑥

脂肪酶和酯酶脂肪酶和酯酶在水溶液中催化脂類水解成為有機(jī)酸和醇，而在非水相介質(zhì)或微水有機(jī)介質(zhì)中卻可催化其逆反應(yīng)，使醇和酸合成酯。利用這種技術(shù)可以在含微量水的有機(jī)介質(zhì)中獲得大量不飽和脂肪酸的油脂以及其它酯類，有著極其廣闊的應(yīng)用前景。⑦自我剪接酶

自我剪接酶(self-splicingribozyme)是在一定條件下催化其本身RNA分子同時進(jìn)行剪切和連接反應(yīng)的核酸類酶。自我剪接酶都是RNA前體。根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點和催化特性的不同，該亞類可分為兩個小類，即含I型IVS的R酶和含Ⅱ型IVS的R