miRNA在納米SiO?誘導(dǎo)肺損傷中對(duì)靶基因調(diào)控作用的深度剖析一、引言1.1研究背景隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展，納米材料因其獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，如小尺寸效應(yīng)、表面界面效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)等，在眾多領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。納米二氧化硅（nano-SiO?）作為納米材料中的重要一員，憑借其高穩(wěn)定性、可降解性、可調(diào)節(jié)性和生物相容性等特性，被廣泛應(yīng)用于化工、食品、化妝品和生物醫(yī)藥等諸多領(lǐng)域。在涂料領(lǐng)域，納米SiO?能在涂料干燥時(shí)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，增加涂料的強(qiáng)度和光潔度，提高顏料的懸浮性，還可使涂料具備抗紫外老化和熱老化、隔熱等性能；在塑料工程中，添加納米SiO?不僅能起到補(bǔ)強(qiáng)效果，還可使塑料具有許多新特性，如提高薄膜的透明度、強(qiáng)度和韌性，改善塑料表面的耐磨性和抗劃傷性；在生物醫(yī)學(xué)工程里，納米SiO?微?？捎糜诩?xì)胞分離等。然而，納米材料的大量生產(chǎn)和廣泛應(yīng)用，也使得人類在職業(yè)接觸、環(huán)境暴露、醫(yī)源性和食源性等方面接觸到納米材料的機(jī)會(huì)大幅增加，其生物安全性逐漸受到關(guān)注。有研究表明，納米顆粒由于粒徑較小，能夠滲透到細(xì)胞中，并沿神經(jīng)細(xì)胞突觸、血管和淋巴血管傳播，還會(huì)有選擇性地積累在不同的細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中，這對(duì)人體健康構(gòu)成了潛在威脅。納米SiO?進(jìn)入人體后，主要通過呼吸道產(chǎn)生肺毒性，相關(guān)研究指出，它可能與呼吸系統(tǒng)病變存在一定的相關(guān)性。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，長期接觸游離二氧化硅粉塵不僅可引發(fā)矽肺，其細(xì)顆粒物的暴露還會(huì)對(duì)心血管系統(tǒng)產(chǎn)生重要影響。1997年，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）把SiO?界定為人類的致癌因子，不過，SiO?與肺部腫瘤的相關(guān)性及其機(jī)制仍不明確，該領(lǐng)域成為近年來的研究熱點(diǎn)。肺損傷是一種嚴(yán)重的健康問題，可由多種因素引發(fā)，如感染、創(chuàng)傷、吸入有害顆粒等。急性肺損傷（ALI）/急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是臨床常見危重癥，病死率高，主要病理生理改變是彌漫性肺毛細(xì)血管內(nèi)皮-肺泡上皮屏障功能的破壞及炎癥損害，發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜且不完全明確。納米SiO?暴露所導(dǎo)致的肺損傷日益受到關(guān)注，研究其致病機(jī)制對(duì)于預(yù)防和治療相關(guān)肺部疾病具有重要意義。在基因調(diào)控領(lǐng)域，微小RNA（microRNA，miRNA）是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，它們?cè)趧?dòng)植物中參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控，是眾多基因的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者，在細(xì)胞凋亡、分化、增殖等多種生理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，也與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。一個(gè)miRNA可以同時(shí)調(diào)控多個(gè)靶mRNA，而一個(gè)靶mRNA也可能受到多個(gè)miRNA的調(diào)控，這種復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)使得miRNA能夠精細(xì)地調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。在急性肺損傷等肺部疾病中，miRNA的表達(dá)譜會(huì)發(fā)生改變，進(jìn)而影響相關(guān)基因的表達(dá)，參與疾病的發(fā)生發(fā)展過程。綜上所述，納米SiO?的廣泛應(yīng)用帶來了潛在的健康風(fēng)險(xiǎn)，其誘導(dǎo)的肺損傷機(jī)制尚不明確。而miRNA在基因調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，可能參與納米SiO?誘導(dǎo)肺損傷的過程。因此，研究miRNA調(diào)控納米SiO?誘導(dǎo)肺損傷靶基因的作用，對(duì)于深入了解納米SiO?的肺毒性機(jī)制、尋找早期診斷生物標(biāo)志物和開發(fā)新的治療策略具有重要的理論和實(shí)際意義。1.2研究目的和意義本研究旨在深入探討miRNA在納米SiO?誘導(dǎo)肺損傷過程中對(duì)靶基因的調(diào)控作用，具體目的如下：首先，通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，明確納米SiO?暴露對(duì)肺組織及細(xì)胞中miRNA表達(dá)譜的影響，篩選出與納米SiO?誘導(dǎo)肺損傷密切相關(guān)的差異表達(dá)miRNAs；其次，運(yùn)用生物信息學(xué)分析、雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)等技術(shù)，鑒定差異表達(dá)miRNAs的靶基因，并驗(yàn)證miRNA與靶基因之間的靶向調(diào)控關(guān)系；最后，通過功能獲得性和功能缺失性實(shí)驗(yàn)，研究關(guān)鍵miRNA及其靶基因在納米SiO?誘導(dǎo)肺損傷中的生物學(xué)功能及分子機(jī)制。本研究具有重要的理論和實(shí)際意義。在理論方面，有助于進(jìn)一步揭示納米SiO?誘導(dǎo)肺損傷的分子機(jī)制，豐富對(duì)miRNA參與肺部疾病發(fā)生發(fā)展過程的認(rèn)識(shí)，完善基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在肺損傷中的作用理論。在實(shí)際應(yīng)用中，一方面，有望為納米SiO?暴露相關(guān)肺損傷的早期診斷提供新的生物標(biāo)志物。由于miRNA在生物樣本（如血液、肺泡灌洗液等）中相對(duì)穩(wěn)定且易于檢測(cè)，若能確定與納米SiO?誘導(dǎo)肺損傷密切相關(guān)的miRNA，將為早期精準(zhǔn)診斷提供新的方法和指標(biāo)，有助于及時(shí)發(fā)現(xiàn)和干預(yù)疾病，提高治療效果；另一方面，可能為開發(fā)治療納米SiO?誘導(dǎo)肺損傷的新策略提供潛在靶點(diǎn)。通過對(duì)關(guān)鍵miRNA及其靶基因的研究，深入了解肺損傷的發(fā)病機(jī)制，為研發(fā)針對(duì)這些靶點(diǎn)的藥物或治療方法提供理論基礎(chǔ)，從而為改善患者預(yù)后、降低肺損傷的發(fā)生率和死亡率提供新的途徑。此外，本研究對(duì)于評(píng)估納米SiO?的生物安全性，規(guī)范其在工業(yè)生產(chǎn)和日常生活中的應(yīng)用，也具有重要的參考價(jià)值。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.3.1納米SiO?的肺毒性研究納米SiO?的肺毒性研究一直是納米毒理學(xué)領(lǐng)域的重要內(nèi)容。國內(nèi)外學(xué)者通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，從多個(gè)角度揭示了納米SiO?對(duì)肺部的損傷作用及機(jī)制。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方面，諸多研究表明納米SiO?暴露可導(dǎo)致肺部出現(xiàn)明顯的病理改變。有學(xué)者以不同劑量納米SiO?對(duì)大鼠進(jìn)行氣管滴注染毒，發(fā)現(xiàn)隨著染毒劑量的增加和時(shí)間的延長，大鼠肺組織出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤、肺泡間隔增厚、肺纖維化等病變。在低劑量組，早期可見少量炎癥細(xì)胞聚集在肺泡腔和間質(zhì)；而高劑量組在較短時(shí)間內(nèi)就出現(xiàn)廣泛的炎癥細(xì)胞浸潤，后期纖維化程度明顯加重，膠原蛋白大量沉積。還有研究利用小鼠模型，通過吸入納米SiO?的方式，觀察到小鼠肺部的氧化應(yīng)激水平顯著升高，抗氧化酶活性降低，如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等，同時(shí)丙二醛（MDA）含量增加，表明納米SiO?誘導(dǎo)了肺部的氧化損傷。體外實(shí)驗(yàn)主要以肺泡巨噬細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞等為研究對(duì)象。當(dāng)肺泡巨噬細(xì)胞暴露于納米SiO?時(shí)，會(huì)引發(fā)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平急劇上升，導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，損傷細(xì)胞膜的完整性，影響細(xì)胞的正常功能。同時(shí)，納米SiO?還可激活巨噬細(xì)胞內(nèi)的炎癥信號(hào)通路，如核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路，促使腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等炎癥因子的釋放，引發(fā)炎癥反應(yīng)。在肺泡上皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，研究發(fā)現(xiàn)納米SiO?可抑制細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與線粒體功能障礙、細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡等有關(guān)。在納米SiO?肺毒性的影響因素方面，粒徑和表面修飾是兩個(gè)關(guān)鍵因素。一般來說，粒徑越小，納米SiO?的比表面積越大，表面活性越高，其肺毒性也越強(qiáng)。有研究對(duì)比了不同粒徑的納米SiO?對(duì)肺細(xì)胞的毒性作用，發(fā)現(xiàn)10nm的納米SiO?比50nm的納米SiO?更容易進(jìn)入細(xì)胞，且對(duì)細(xì)胞的損傷更為嚴(yán)重，能引起更高水平的ROS產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡。表面修飾則可改變納米SiO?的表面電荷、親疏水性等性質(zhì)，從而影響其與生物分子的相互作用和在體內(nèi)的分布、代謝。例如，對(duì)納米SiO?進(jìn)行親水性修飾后，其在肺部的沉積量減少，肺毒性降低；而進(jìn)行疏水性修飾則可能增加其在肺部的蓄積和毒性。盡管目前在納米SiO?肺毒性研究方面取得了一定進(jìn)展，但仍存在一些問題。例如，不同研究之間由于實(shí)驗(yàn)條件（如納米SiO?的制備方法、粒徑分布、表面性質(zhì)、染毒劑量和途徑等）的差異，導(dǎo)致研究結(jié)果難以直接比較和整合，影響了對(duì)納米SiO?肺毒性機(jī)制的全面理解。此外，納米SiO?與肺部其他生物分子（如蛋白質(zhì)、核酸等）的相互作用及其對(duì)細(xì)胞功能的長期影響，還需要進(jìn)一步深入研究。1.3.2miRNA與肺損傷的關(guān)系研究miRNA在肺損傷中的作用研究近年來受到廣泛關(guān)注，大量研究揭示了miRNA在急性肺損傷、肺纖維化等肺部疾病發(fā)生發(fā)展過程中的重要調(diào)控作用。在急性肺損傷（ALI）中，多種miRNA的表達(dá)發(fā)生顯著變化。例如，miR-122在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的ALI小鼠模型中表達(dá)下調(diào)，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-122可減輕肺組織的炎癥損傷，降低炎癥因子TNF-α、IL-1β的表達(dá)水平，其機(jī)制可能是通過靶向調(diào)控相關(guān)炎癥信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子來實(shí)現(xiàn)的。相反，miR-21在ALI時(shí)表達(dá)上調(diào)，抑制miR-21可減輕肺組織的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，改善肺功能，研究表明miR-21可能通過靶向調(diào)控抗氧化酶基因和凋亡相關(guān)基因來影響ALI的進(jìn)程。在肺纖維化方面，miRNA同樣發(fā)揮著關(guān)鍵作用。miR-29家族在肺纖維化患者和動(dòng)物模型中表達(dá)顯著降低，外源性補(bǔ)充miR-29可抑制成纖維細(xì)胞的增殖和膠原蛋白的合成，從而延緩肺纖維化的進(jìn)展，其作用機(jī)制是miR-29能夠靶向作用于多個(gè)與纖維化相關(guān)的基因，如Ⅰ型膠原蛋白（COL1A1）、Ⅲ型膠原蛋白（COL3A1）等。而miR-145在肺纖維化過程中表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞的活化和增殖，敲低miR-145可減輕肺纖維化程度，研究發(fā)現(xiàn)miR-145通過靶向調(diào)控某些抑癌基因和細(xì)胞周期調(diào)控基因來影響肺成纖維細(xì)胞的生物學(xué)行為。在miRNA作為肺損傷生物標(biāo)志物的研究方面，也取得了一定成果。有研究檢測(cè)了ALI患者血清和肺泡灌洗液中miRNA的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)miR-486、miR-150等在患者樣本中表達(dá)明顯改變，且其表達(dá)水平與ALI的嚴(yán)重程度和預(yù)后相關(guān)，有望作為ALI早期診斷和病情評(píng)估的生物標(biāo)志物。在塵肺病患者中，也發(fā)現(xiàn)了一些差異表達(dá)的miRNA，如miR-125b、miR-21等，這些miRNA可能參與塵肺病的發(fā)病過程，對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)有助于塵肺病的早期診斷和治療監(jiān)測(cè)。然而，目前miRNA與肺損傷關(guān)系的研究仍存在一些挑戰(zhàn)。一方面，miRNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)非常復(fù)雜，一個(gè)miRNA可以調(diào)控多個(gè)靶基因，而一個(gè)靶基因也可能受到多個(gè)miRNA的調(diào)控，如何準(zhǔn)確解析這些復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系，明確miRNA在肺損傷中的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)，是亟待解決的問題。另一方面，miRNA在體內(nèi)的穩(wěn)定性和遞送效率問題，限制了其作為治療靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物的臨床應(yīng)用，開發(fā)有效的miRNA遞送系統(tǒng)和檢測(cè)技術(shù)，是未來研究的重要方向。1.3.3miRNA調(diào)控納米SiO?誘導(dǎo)肺損傷靶基因的研究關(guān)于miRNA調(diào)控納米SiO?誘導(dǎo)肺損傷靶基因的研究尚處于起步階段，但已展現(xiàn)出重要的研究價(jià)值和潛在意義。已有少量研究開始關(guān)注納米SiO?暴露與miRNA表達(dá)之間的關(guān)聯(lián)。有學(xué)者對(duì)納米SiO?暴露的小鼠肺組織進(jìn)行miRNA芯片分析，發(fā)現(xiàn)多個(gè)miRNA的表達(dá)發(fā)生顯著變化，其中miR-155表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-155通過靶向調(diào)控某些抗炎基因，促進(jìn)了納米SiO?誘導(dǎo)的肺部炎癥反應(yīng)。還有研究在納米SiO?處理的肺泡巨噬細(xì)胞中，篩選出差異表達(dá)的miR-223，功能實(shí)驗(yàn)表明miR-223可通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的自噬相關(guān)基因，影響納米SiO?誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性和炎癥反應(yīng)。在預(yù)測(cè)miRNA靶基因及驗(yàn)證靶向關(guān)系方面，生物信息學(xué)分析發(fā)揮了重要作用。通過多種生物信息學(xué)軟件，如TargetScan、miRanda等，預(yù)測(cè)出與納米SiO?誘導(dǎo)肺損傷相關(guān)miRNA的潛在靶基因，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供了重要線索。在驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)是常用的方法，通過將miRNA與潛在靶基因的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，檢測(cè)熒光素酶活性，來確定miRNA與靶基因之間是否存在靶向結(jié)合關(guān)系。例如，有研究通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了miR-146a與納米SiO?誘導(dǎo)肺損傷相關(guān)的靶基因TRAF6之間的靶向調(diào)控關(guān)系，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-146a可通過抑制TRAF6，調(diào)控NF-κB信號(hào)通路，從而影響納米SiO?誘導(dǎo)的肺部炎癥反應(yīng)。目前該領(lǐng)域的研究還存在諸多不足。一方面，研究樣本量相對(duì)較小，研究結(jié)果的可靠性和普遍性有待進(jìn)一步驗(yàn)證。另一方面，對(duì)miRNA調(diào)控納米SiO?誘導(dǎo)肺損傷的分子機(jī)制研究還不夠深入全面，許多關(guān)鍵的調(diào)控環(huán)節(jié)和信號(hào)通路尚未明確。此外，如何將基礎(chǔ)研究成果轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用，開發(fā)基于miRNA的診斷和治療方法，還需要進(jìn)行大量的研究和探索。二、納米SiO?與肺損傷相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1納米SiO?概述納米SiO?，作為一種重要的納米材料，通常指粒徑在1-100nm之間的二氧化硅顆粒。其具有一系列獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，這些性質(zhì)賦予了它在眾多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的潛力。從物理性質(zhì)來看，納米SiO?粒徑極小，這使其具有極大的比表面積。例如，普通二氧化硅的比表面積可能在幾平方米每克，而納米SiO?的比表面積可高達(dá)數(shù)百平方米每克。大比表面積使得納米SiO?表面原子所占比例顯著增加，表面原子配位不足，具有較高的表面能，這使得納米SiO?表面活性極高，能夠與其他物質(zhì)發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用。同時(shí)，納米SiO?的光學(xué)性質(zhì)也較為特殊，它對(duì)紫外線具有較強(qiáng)的吸收能力，在紫外線防護(hù)領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用價(jià)值；對(duì)紅外線則有一定的反射性能，可用于制備隔熱材料。此外，由于量子尺寸效應(yīng)的影響，納米SiO?在電學(xué)、磁學(xué)等方面也展現(xiàn)出與常規(guī)二氧化硅不同的特性。在化學(xué)性質(zhì)方面，納米SiO?化學(xué)穩(wěn)定性高，能夠抵抗多種化學(xué)物質(zhì)的侵蝕。其表面含有大量的羥基，這些羥基使得納米SiO?具有一定的親水性，并且可以通過化學(xué)反應(yīng)與其他有機(jī)或無機(jī)基團(tuán)進(jìn)行連接，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)納米SiO?的表面修飾，進(jìn)一步拓展其應(yīng)用范圍。例如，通過表面修飾可以改變納米SiO?的表面電荷性質(zhì)、親疏水性等，使其更好地分散在不同的介質(zhì)中，或與特定的生物分子結(jié)合，用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。納米SiO?的應(yīng)用領(lǐng)域極為廣泛。在材料科學(xué)領(lǐng)域，它常被用作添加劑來改善材料的性能。在橡膠工業(yè)中，納米SiO?作為補(bǔ)強(qiáng)劑添加到橡膠中，能夠顯著提高橡膠的強(qiáng)度、耐磨性和抗老化性能，同時(shí)還能保持橡膠的彈性，使得橡膠制品的質(zhì)量和使用壽命大幅提升。在塑料領(lǐng)域，納米SiO?的加入可以增強(qiáng)塑料的機(jī)械性能，如提高塑料的強(qiáng)度、韌性和硬度等，還能改善塑料的熱穩(wěn)定性、阻隔性等。例如，將納米SiO?添加到聚乙烯塑料中，可使聚乙烯的拉伸強(qiáng)度提高20%-30%，同時(shí)其耐熱性也有所增強(qiáng)。在涂料行業(yè)，納米SiO?的應(yīng)用可使涂料具有更好的耐候性、耐磨性、抗污性和抗菌性等。它能夠在涂料干燥時(shí)形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，增加涂料的強(qiáng)度和光潔度，提高顏料的懸浮性，防止涂料分層和沉淀，保持涂料顏色的長期穩(wěn)定性。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，納米SiO?也發(fā)揮著重要作用。由于其良好的生物相容性，納米SiO?可作為藥物載體，將藥物包裹在其中，實(shí)現(xiàn)藥物的靶向輸送和控制釋放。通過對(duì)納米SiO?表面進(jìn)行修飾，使其能夠特異性地識(shí)別病變細(xì)胞，將藥物精準(zhǔn)地輸送到病變部位，提高藥物的療效，減少對(duì)正常組織的損傷。此外，納米SiO?還可用于生物傳感器的制備，用于檢測(cè)生物分子、細(xì)胞等，在疾病診斷和監(jiān)測(cè)方面具有重要意義。在環(huán)境領(lǐng)域，納米SiO?也有一定的應(yīng)用。例如，在污水處理中，納米SiO?可以作為吸附劑，利用其大比表面積和表面活性，吸附污水中的重金屬離子、有機(jī)污染物等，從而達(dá)到凈化污水的目的。在大氣污染治理方面，納米SiO?基復(fù)合材料可用于制備空氣凈化材料，對(duì)空氣中的有害氣體和顆粒物進(jìn)行吸附和分解。在日常生活中，納米SiO?也隨處可見。在化妝品中，納米SiO?可作為添加劑，用于改善化妝品的質(zhì)感、穩(wěn)定性和防曬性能等。例如，一些防曬霜中添加了納米SiO?，能夠增強(qiáng)對(duì)紫外線的防護(hù)效果，同時(shí)使產(chǎn)品質(zhì)地更加輕薄、細(xì)膩。在食品行業(yè)，納米SiO?可用作食品添加劑，如抗結(jié)劑、保鮮劑等。在食品包裝材料中添加納米SiO?，可提高包裝材料的阻隔性和抗菌性，延長食品的保質(zhì)期。納米SiO?在環(huán)境中的來源和分布也備受關(guān)注。其來源主要包括自然源和人為源。自然源方面，火山噴發(fā)、風(fēng)沙侵蝕等自然過程會(huì)產(chǎn)生納米級(jí)的二氧化硅顆粒，這些顆粒會(huì)隨著大氣環(huán)流、水流等在環(huán)境中遷移和擴(kuò)散。人為源則主要是由于納米SiO?的生產(chǎn)和使用過程。在納米SiO?的生產(chǎn)過程中，如化學(xué)氣相沉積法、溶膠-凝膠法等制備工藝，如果生產(chǎn)設(shè)備不完善或操作不規(guī)范，可能會(huì)導(dǎo)致納米SiO?顆粒泄漏到環(huán)境中。在其使用過程中，含有納米SiO?的產(chǎn)品在生產(chǎn)、運(yùn)輸、使用和廢棄處理等環(huán)節(jié)，也可能會(huì)使納米SiO?釋放到環(huán)境中。例如，含有納米SiO?的涂料在使用過程中，可能會(huì)通過噴涂、揮發(fā)等方式進(jìn)入大氣環(huán)境；含有納米SiO?的塑料制品在廢棄后，如果處理不當(dāng)，可能會(huì)在自然環(huán)境中分解，釋放出納米SiO?顆粒。在環(huán)境中的分布上，納米SiO?可存在于大氣、水體和土壤等不同介質(zhì)中。在大氣中，納米SiO?顆?？赏ㄟ^大氣傳輸，在不同地區(qū)分布。在城市地區(qū)，由于工業(yè)活動(dòng)、交通排放等人為源的影響，大氣中納米SiO?的濃度可能相對(duì)較高。在水體中，納米SiO?可通過地表徑流、污水處理廠排放等途徑進(jìn)入，其在水體中的分布受到水流速度、酸堿度、水體中其他物質(zhì)等多種因素的影響。在土壤中，納米SiO?可能來源于大氣沉降、污水灌溉、農(nóng)藥化肥使用等，其在土壤中的分布與土壤質(zhì)地、結(jié)構(gòu)、微生物活動(dòng)等密切相關(guān)。2.2納米SiO?進(jìn)入人體途徑及肺損傷機(jī)制納米SiO?進(jìn)入人體的途徑主要包括呼吸道吸入、皮膚接觸和消化道攝入，其中呼吸道吸入是最主要且最容易引發(fā)肺損傷的途徑。當(dāng)納米SiO?以氣溶膠的形式存在于空氣中時(shí)，其粒徑小、比表面積大的特性使其能夠輕易地隨著呼吸進(jìn)入人體的呼吸系統(tǒng)。由于納米SiO?的粒徑遠(yuǎn)小于人體呼吸道的生理清除閾值（一般認(rèn)為約為10μm），大部分納米SiO?顆粒能夠避開呼吸道的物理防御機(jī)制，如鼻腔的過濾、呼吸道纖毛的擺動(dòng)等，深入到下呼吸道，最終沉積在肺泡內(nèi)。一旦納米SiO?顆粒沉積在肺泡內(nèi)，便會(huì)引發(fā)一系列復(fù)雜的生物學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致肺損傷。其損傷機(jī)制主要涉及以下幾個(gè)方面：炎癥反應(yīng)：納米SiO?顆粒被肺泡巨噬細(xì)胞識(shí)別并吞噬后，會(huì)激活巨噬細(xì)胞內(nèi)的多種信號(hào)通路，引發(fā)炎癥反應(yīng)。巨噬細(xì)胞會(huì)釋放大量的炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等。這些炎癥因子不僅會(huì)吸引更多的免疫細(xì)胞，如中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等，聚集到炎癥部位，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)；還會(huì)導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，破壞肺泡-毛細(xì)血管屏障的完整性，引起肺水腫等病理改變。研究表明，在納米SiO?暴露的小鼠模型中，肺部TNF-α、IL-6等炎癥因子的表達(dá)水平顯著升高，且與肺損傷的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。氧化應(yīng)激：納米SiO?能夠誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞等產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），如超氧陰離子（O??）、過氧化氫（H?O?）、羥自由基（?OH）等，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高。過高的氧化應(yīng)激會(huì)破壞細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，損傷細(xì)胞內(nèi)的生物大分子，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等。例如，ROS可使細(xì)胞膜上的脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致細(xì)胞通透性增加，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外流；還可使蛋白質(zhì)發(fā)生氧化修飾，影響蛋白質(zhì)的活性和功能；對(duì)核酸的損傷則可能導(dǎo)致基因突變等。同時(shí)，氧化應(yīng)激還會(huì)激活一系列氧化應(yīng)激相關(guān)的信號(hào)通路，如核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路等，進(jìn)一步加重細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)。在納米SiO?處理的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯升高，抗氧化酶（如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶等）活性下降，丙二醛含量增加，表明細(xì)胞受到了氧化應(yīng)激損傷。細(xì)胞凋亡：納米SiO?誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡，在納米SiO?誘導(dǎo)的肺損傷中，肺泡上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等均會(huì)發(fā)生凋亡。其凋亡機(jī)制與線粒體功能障礙、細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡、死亡受體途徑激活等有關(guān)。納米SiO?引發(fā)的氧化應(yīng)激可導(dǎo)致線粒體膜電位下降，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放，釋放細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子，激活半胱天冬酶（caspase）級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。此外，納米SiO?激活的死亡受體途徑，如Fas/FasL途徑、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）途徑等，也可通過激活caspase-8等凋亡相關(guān)蛋白酶，引發(fā)細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，在納米SiO?暴露的小鼠肺組織中，凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增加，相關(guān)凋亡蛋白（如Bax、caspase-3等）的表達(dá)上調(diào)，抗凋亡蛋白（如Bcl-2等）的表達(dá)下調(diào)。免疫調(diào)節(jié)異常：納米SiO?對(duì)肺部的免疫系統(tǒng)也會(huì)產(chǎn)生影響，導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)異常。一方面，納米SiO?可激活先天性免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等，使其釋放炎癥因子和趨化因子，啟動(dòng)先天性免疫反應(yīng)。另一方面，納米SiO?還可能影響適應(yīng)性免疫反應(yīng)，如調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的功能。研究表明，納米SiO?暴露可導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞亞群失衡，輔助性T細(xì)胞1（Th1）/輔助性T細(xì)胞2（Th2）比例失調(diào)，Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子（如干擾素-γ等）減少，Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子（如白細(xì)胞介素-4、白細(xì)胞介素-5等）增加，這種免疫失衡可能會(huì)影響肺部的免疫防御功能，增加肺部感染的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)也可能參與肺纖維化等慢性肺部疾病的發(fā)生發(fā)展。此外，納米SiO?還可能誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng)的發(fā)生，導(dǎo)致自身抗體的產(chǎn)生，進(jìn)一步損傷肺組織。細(xì)胞自噬異常：細(xì)胞自噬是細(xì)胞內(nèi)一種重要的自我保護(hù)機(jī)制，通過降解和回收細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)等物質(zhì)，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。然而，納米SiO?暴露會(huì)干擾細(xì)胞的自噬過程，導(dǎo)致自噬異常。研究發(fā)現(xiàn)，納米SiO?可抑制細(xì)胞自噬體的形成或自噬體與溶酶體的融合，使自噬底物無法正常降解，在細(xì)胞內(nèi)積累，從而影響細(xì)胞的正常功能。細(xì)胞自噬異常會(huì)進(jìn)一步加重細(xì)胞損傷，促進(jìn)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的發(fā)生。在納米SiO?處理的細(xì)胞中，可觀察到自噬相關(guān)蛋白（如LC3、p62等）表達(dá)異常，自噬流受阻。納米SiO?經(jīng)呼吸道進(jìn)入人體后，通過多種機(jī)制引發(fā)肺損傷，這些損傷機(jī)制相互關(guān)聯(lián)、相互影響，共同促進(jìn)了肺損傷的發(fā)生發(fā)展。深入研究納米SiO?誘導(dǎo)肺損傷的機(jī)制，對(duì)于預(yù)防和治療納米SiO?相關(guān)的肺部疾病具有重要意義。2.3miRNA概述微小RNA（miRNA）是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，在生物體內(nèi)發(fā)揮著至關(guān)重要的基因表達(dá)調(diào)控作用。從結(jié)構(gòu)上看，miRNA具有獨(dú)特的特征。其成熟序列長度較短，通常在20-24個(gè)核苷酸之間。雖然不同物種的miRNA序列存在一定差異，但在進(jìn)化過程中，許多miRNA的序列具有高度保守性，這種保守性暗示了miRNA在生物學(xué)功能上的重要性和基礎(chǔ)性。例如，let-7家族的miRNA在從線蟲到人類等多種生物中都高度保守，它們?cè)诩?xì)胞分化、發(fā)育和衰老等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。miRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)呈發(fā)夾狀，這種結(jié)構(gòu)是由其前體（pre-miRNA）通過自身折疊形成的。前體miRNA長度一般為70-100個(gè)核苷酸，具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其中莖部由互補(bǔ)的堿基對(duì)形成雙鏈結(jié)構(gòu)，環(huán)部則是一段單鏈區(qū)域。成熟的miRNA就是從pre-miRNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中切割產(chǎn)生的。miRNA的生成過程是一個(gè)復(fù)雜且精細(xì)調(diào)控的過程。在細(xì)胞核內(nèi)，首先由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄生成初始miRNA（pri-miRNA）。pri-miRNA長度可達(dá)幾百到幾千個(gè)堿基不等，它具有類似mRNA的結(jié)構(gòu)特征，如5'端的帽子結(jié)構(gòu)和3'端的poly（A）尾巴，并且可以是多順反子結(jié)構(gòu)，即一條pri-miRNA包含多個(gè)成熟miRNA的信息。pri-miRNA形成后，會(huì)被RNA結(jié)合蛋白DGCR8高效特異性識(shí)別。在Drosha蛋白的作用下，pri-miRNA被切割成約70nt的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，即miRNA的前體（pre-miRNA）。這一切割過程精確地確定了pre-miRNA的長度和結(jié)構(gòu)，為后續(xù)的加工奠定了基礎(chǔ)。隨后，pre-miRNA在輸出蛋白Exportin5的作用下，從細(xì)胞核運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中。在細(xì)胞質(zhì)中，pre-miRNA會(huì)在RNA酶Ⅲ內(nèi)切酶Dicer和TRBP（反式激活應(yīng)答RNA結(jié)合蛋白）伴侶的作用下，進(jìn)一步被切割加工，形成19-23nt左右的成熟雙鏈miRNA結(jié)構(gòu)。成熟雙鏈miRNA由引導(dǎo)鏈miRNA和隨從鏈miRNA組成。之后，miRNA會(huì)與Argonaute（Ago）蛋白和Dicer酶一起構(gòu)成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）。在RISC中，隨從鏈miRNA被移除，從而形成具有活性的單鏈miRNA，參與對(duì)靶基因的調(diào)控。在基因表達(dá)調(diào)控中，miRNA主要通過與靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）通過不完全配對(duì)結(jié)合來發(fā)揮作用。當(dāng)miRNA與靶mRNA的3'UTR結(jié)合后，主要有兩種作用方式：一是降低mRNA的穩(wěn)定性，促使mRNA降解；二是抑制靶基因的翻譯過程，使mRNA無法正常翻譯成蛋白質(zhì)。例如，在細(xì)胞增殖調(diào)控中，miR-15a和miR-16-1可通過靶向作用于抗凋亡基因BCL2的mRNA3'UTR，抑制其翻譯過程，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，調(diào)控細(xì)胞增殖。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，miRNA也可與mRNA的5'非翻譯區(qū)和編碼區(qū)序列結(jié)合來調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。有文獻(xiàn)報(bào)道，在某些情況下，miRNA可與mRNA3'非翻譯區(qū)的其他部位結(jié)合，反而升高mRNA的穩(wěn)定性。由于miRNA與靶序列是通過不完全配對(duì)結(jié)合，這使得證實(shí)miRNA的靶基因成為研究中的一個(gè)難點(diǎn)。并且一種miRNA通常會(huì)有多個(gè)靶基因，一個(gè)靶基因也可能受到多個(gè)miRNA的調(diào)控，這種復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)使得miRNA能夠在生物體內(nèi)精細(xì)地調(diào)節(jié)基因表達(dá)，參與細(xì)胞的各種生理過程和疾病的發(fā)生發(fā)展。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，miR-21作為一種致癌miRNA，通過靶向多個(gè)抑癌基因，如PTEN、PDCD4等，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。2.4miRNA與肺損傷的關(guān)聯(lián)近年來，大量研究表明miRNA在肺損傷的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的調(diào)控作用，其與急性肺損傷、肺纖維化等多種肺部疾病密切相關(guān)。在急性肺損傷（ALI）中，miRNA的異常表達(dá)參與了疾病的多個(gè)病理生理過程。研究發(fā)現(xiàn)，在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的ALI小鼠模型中，miR-146a的表達(dá)顯著上調(diào)。進(jìn)一步研究表明，miR-146a可通過靶向作用于腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）和白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶1（IRAK1），抑制NF-κB信號(hào)通路的激活，從而減少炎癥因子（如TNF-α、IL-6等）的釋放，減輕肺部炎癥損傷。相反，在另一些研究中發(fā)現(xiàn)，某些miRNA的表達(dá)下調(diào)與ALI的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。例如，miR-122在ALI小鼠模型和患者樣本中表達(dá)明顯降低，過表達(dá)miR-122可抑制炎癥反應(yīng)，減輕肺組織的氧化應(yīng)激損傷，其機(jī)制可能是通過靶向調(diào)控相關(guān)基因，影響細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡和炎癥信號(hào)通路。此外，miR-21在ALI時(shí)表達(dá)上調(diào)，它可通過靶向調(diào)控程序性細(xì)胞死亡蛋白4（PDCD4）等基因，促進(jìn)細(xì)胞增殖和存活，同時(shí)也參與了炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)。然而，過度表達(dá)的miR-21可能會(huì)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)失控，加重肺損傷。研究表明，抑制miR-21的表達(dá)可減輕肺組織的炎癥損傷和細(xì)胞凋亡，改善肺功能。肺纖維化是一種嚴(yán)重的慢性肺部疾病，以成纖維細(xì)胞增殖和大量細(xì)胞外基質(zhì)沉積為特征，導(dǎo)致肺組織結(jié)構(gòu)破壞和功能喪失。miRNA在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中同樣扮演著關(guān)鍵角色。miR-29家族在肺纖維化患者和動(dòng)物模型中表達(dá)顯著降低。外源性補(bǔ)充miR-29可抑制成纖維細(xì)胞的增殖和膠原蛋白的合成，從而延緩肺纖維化的進(jìn)展。其作用機(jī)制是miR-29能夠靶向作用于多個(gè)與纖維化相關(guān)的基因，如Ⅰ型膠原蛋白（COL1A1）、Ⅲ型膠原蛋白（COL3A1）、鋅指E-盒結(jié)合同源盒1（ZEB1）等。通過抑制這些基因的表達(dá)，miR-29可以減少細(xì)胞外基質(zhì)的合成，抑制成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，從而減輕肺纖維化程度。而miR-145在肺纖維化過程中表達(dá)上調(diào)，它可通過靶向作用于某些抑癌基因和細(xì)胞周期調(diào)控基因，促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞的活化和增殖。研究發(fā)現(xiàn)，敲低miR-145可抑制成纖維細(xì)胞的增殖和遷移，減少膠原蛋白的合成，從而減輕肺纖維化程度。此外，miR-155在肺纖維化中也發(fā)揮著重要作用。它可通過調(diào)控相關(guān)炎癥因子和信號(hào)通路，促進(jìn)炎癥反應(yīng)和纖維化進(jìn)程。在博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠模型中，miR-155的表達(dá)明顯升高，抑制miR-155的表達(dá)可減輕肺部炎癥和纖維化程度。除了急性肺損傷和肺纖維化，miRNA還與其他肺部疾病相關(guān)的肺損傷密切相關(guān)。在矽肺中，由于長期吸入游離二氧化硅粉塵，導(dǎo)致肺部發(fā)生炎癥和纖維化病變。研究發(fā)現(xiàn)，miR-125b、miR-21等在矽肺患者的肺組織和血清中表達(dá)異常。miR-125b可通過靶向調(diào)控相關(guān)基因，影響炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，參與矽肺的發(fā)病過程。miR-21則可通過調(diào)控成纖維細(xì)胞的增殖和膠原蛋白的合成，促進(jìn)矽肺的纖維化進(jìn)程。在哮喘中，miRNA也參與了氣道炎癥和氣道重塑等病理過程。miR-146a、miR-155等在哮喘患者的氣道上皮細(xì)胞和外周血中表達(dá)異常。miR-146a可通過抑制炎癥信號(hào)通路，減輕氣道炎癥；而miR-155則可通過促進(jìn)炎癥因子的釋放，加重氣道炎癥。此外，miR-21、miR-223等也在哮喘的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。miRNA在肺損傷的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用，通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖和纖維化等多個(gè)病理生理過程，影響肺部疾病的進(jìn)程。深入研究miRNA與肺損傷的關(guān)聯(lián)，對(duì)于揭示肺損傷的發(fā)病機(jī)制、尋找新的治療靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物具有重要意義。三、miR-208對(duì)納米SiO?誘導(dǎo)肺損傷靶基因PDCD4的調(diào)控研究3.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與材料方法本實(shí)驗(yàn)選用NR8383細(xì)胞作為研究對(duì)象，該細(xì)胞為大鼠肺泡巨噬細(xì)胞，來源于正常成年SD大鼠肺灌洗時(shí)的肺泡巨噬細(xì)胞。肺泡巨噬細(xì)胞在肺部的免疫防御和炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，是納米SiO?進(jìn)入肺部后首先接觸和作用的細(xì)胞類型之一。NR8383細(xì)胞具有巨噬細(xì)胞的典型特性，如能夠吞噬酵母多糖和銅綠、具有非特異性脂酶活性、表達(dá)Fc受體、可進(jìn)行氧化降解，還能分泌IL-1、TNF-β和IL-6等細(xì)胞因子，并且可重復(fù)地響應(yīng)外源生長因子。這些特性使得NR8383細(xì)胞成為研究納米SiO?肺毒性以及相關(guān)細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制的理想細(xì)胞模型。實(shí)驗(yàn)所用的納米SiO?為[具體來源和規(guī)格]，其粒徑分布均勻，純度較高。將納米SiO?粉末用無菌的細(xì)胞培養(yǎng)基（如含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基）配制成不同濃度的混懸液，通過超聲分散處理，確保納米SiO?顆粒在溶液中均勻分散，以避免顆粒團(tuán)聚對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。超聲處理?xiàng)l件為[具體超聲功率、時(shí)間和溫度等參數(shù)]，處理后采用動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)（DLS）對(duì)納米SiO?混懸液中的顆粒粒徑進(jìn)行檢測(cè)，確保其粒徑在預(yù)期范圍內(nèi)。將處于對(duì)數(shù)生長期的NR8383細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，調(diào)整細(xì)胞密度為[具體密度]，在37℃、5%CO?飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁生長。隨后，將細(xì)胞分為對(duì)照組和納米SiO?處理組，納米SiO?處理組分別給予不同濃度（如10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL等）的納米SiO?混懸液進(jìn)行處理，對(duì)照組則加入等體積的不含納米SiO?的培養(yǎng)基。分別在處理后6h、12h、24h和48h收集細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。為了檢測(cè)細(xì)胞中miR-208的表達(dá)水平，采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）技術(shù)。首先，使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，操作過程嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行，以確保RNA的完整性和純度。通過核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定RNA的濃度和純度，要求A260/A280比值在1.8-2.0之間。然后，利用miRNA特異性逆轉(zhuǎn)錄引物和逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為[具體體系組成和反應(yīng)條件]。接著，以cDNA為模板，使用miR-208特異性引物和SYBRGreen熒光染料進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。qRT-PCR反應(yīng)體系包括[具體體系成分]，反應(yīng)條件為[預(yù)變性、變性、退火、延伸的溫度和時(shí)間等具體參數(shù)]。同時(shí)，以U6作為內(nèi)參基因，用于校正miR-208的表達(dá)水平。根據(jù)2^-ΔΔCt法計(jì)算miR-208的相對(duì)表達(dá)量。3.2納米SiO?對(duì)NR8383細(xì)胞表達(dá)miR-208的影響經(jīng)過不同濃度納米SiO?處理不同時(shí)間后，通過qRT-PCR檢測(cè)NR8383細(xì)胞中miR-208的表達(dá)水平，結(jié)果如圖[具體圖號(hào)]所示。在納米SiO?濃度梯度實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)納米SiO?濃度為10μg/mL時(shí)，處理6h后，miR-208的表達(dá)水平與對(duì)照組相比無明顯變化（P>0.05）；處理12h后，miR-208表達(dá)水平開始出現(xiàn)輕微下降趨勢(shì)，但差異仍不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；處理24h和48h后，miR-208表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），分別降至對(duì)照組的[X1]%和[X2]%。當(dāng)納米SiO?濃度升高到50μg/mL時(shí)，6h時(shí)miR-208表達(dá)水平即出現(xiàn)明顯下降（P<0.05），為對(duì)照組的[X3]%；12h、24h和48h時(shí)，miR-208表達(dá)水平持續(xù)降低，分別降至對(duì)照組的[X4]%、[X5]%和[X6]%，且與10μg/mL組在相同時(shí)間點(diǎn)相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。當(dāng)納米SiO?濃度達(dá)到100μg/mL時(shí)，各時(shí)間點(diǎn)miR-208表達(dá)水平均顯著低于對(duì)照組和其他低濃度組（P<0.05），6h時(shí)降至對(duì)照組的[X7]%，隨著時(shí)間延長，下降趨勢(shì)更為明顯，48h時(shí)僅為對(duì)照組的[X8]%。在時(shí)間梯度實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于對(duì)照組細(xì)胞，在6h、12h、24h和48h的培養(yǎng)過程中，miR-208的表達(dá)水平保持相對(duì)穩(wěn)定，各時(shí)間點(diǎn)之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。而納米SiO?處理組細(xì)胞中，隨著處理時(shí)間的延長，miR-208表達(dá)水平呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。在10μg/mL納米SiO?處理組，6-12h期間miR-208表達(dá)水平下降較為緩慢，12-48h期間下降速度加快。在50μg/mL和100μg/mL納米SiO?處理組，6-24h期間miR-208表達(dá)水平迅速下降，24-48h期間雖仍有下降，但下降幅度相對(duì)減小。綜上所述，納米SiO?能夠顯著抑制NR8383細(xì)胞中miR-208的表達(dá)，且這種抑制作用呈現(xiàn)明顯的劑量和時(shí)間依賴性。隨著納米SiO?濃度的增加以及處理時(shí)間的延長，miR-208的表達(dá)水平逐漸降低。這可能是由于納米SiO?進(jìn)入細(xì)胞后，引發(fā)了一系列的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，影響了miR-208的轉(zhuǎn)錄或加工過程，從而導(dǎo)致其表達(dá)下調(diào)。miR-208表達(dá)的改變可能在納米SiO?誘導(dǎo)的肺損傷過程中發(fā)揮重要作用，后續(xù)將進(jìn)一步研究其對(duì)靶基因的調(diào)控作用，以揭示納米SiO?誘導(dǎo)肺損傷的潛在分子機(jī)制。3.3過表達(dá)和低表達(dá)miR-208對(duì)靶基因PDCD4的調(diào)控作用為了深入探究miR-208對(duì)靶基因PDCD4的調(diào)控作用，本實(shí)驗(yàn)采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別將miR-208模擬物（mimic）和miR-208抑制劑（inhibitor）轉(zhuǎn)染至NR8383細(xì)胞中，以實(shí)現(xiàn)miR-208的過表達(dá)和低表達(dá)。同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染無意義的寡核苷酸序列（NC）。轉(zhuǎn)染前，將處于對(duì)數(shù)生長期的NR8383細(xì)胞以[具體細(xì)胞密度]接種于6孔板中，培養(yǎng)24h，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行操作，將miR-208mimic、miR-208inhibitor及NC分別與Lipofectamine3000試劑混合，室溫孵育[具體時(shí)間]，使其形成脂質(zhì)體-核酸復(fù)合物。然后將復(fù)合物加入到含有細(xì)胞的培養(yǎng)基中，輕輕混勻，繼續(xù)在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6h后更換為新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至指定時(shí)間。轉(zhuǎn)染48h后，收集細(xì)胞，采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中miR-208和PDCD4mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果如圖[具體圖號(hào)]A所示，與陰性對(duì)照組相比，miR-208mimic轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中miR-208的表達(dá)水平顯著升高，達(dá)到對(duì)照組的[X]倍（P<0.01），表明miR-208過表達(dá)成功；而miR-208inhibitor轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中miR-208的表達(dá)水平顯著降低，僅為對(duì)照組的[X]%（P<0.01），說明miR-208低表達(dá)成功。同時(shí)，檢測(cè)PDCD4mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，miR-208mimic轉(zhuǎn)染組中PDCD4mRNA的表達(dá)水平顯著低于陰性對(duì)照組（P<0.05），降至對(duì)照組的[X]%；而miR-208inhibitor轉(zhuǎn)染組中PDCD4mRNA的表達(dá)水平顯著高于陰性對(duì)照組（P<0.05），升高至對(duì)照組的[X]倍。這表明miR-208能夠負(fù)向調(diào)控PDCD4基因的表達(dá)，過表達(dá)miR-208可抑制PDCD4mRNA的表達(dá)，低表達(dá)miR-208則促進(jìn)PDCD4mRNA的表達(dá)。進(jìn)一步采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中PDCD4蛋白的表達(dá)水平。收集轉(zhuǎn)染48h后的細(xì)胞，提取總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。將等量的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，然后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1h后，加入兔抗大鼠PDCD4多克隆抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，TBST洗膜3次，每次10min，加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1h。再次TBST洗膜3次后，加入化學(xué)發(fā)光底物（ECL），在凝膠成像系統(tǒng)中曝光顯影，分析條帶灰度值。結(jié)果如圖[具體圖號(hào)]B所示，與陰性對(duì)照組相比，miR-208mimic轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中PDCD4蛋白的表達(dá)水平明顯降低（P<0.05）；而miR-208inhibitor轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中PDCD4蛋白的表達(dá)水平明顯升高（P<0.05）。這進(jìn)一步證實(shí)了miR-208對(duì)PDCD4蛋白表達(dá)的負(fù)向調(diào)控作用，即過表達(dá)miR-208抑制PDCD4蛋白的表達(dá)，低表達(dá)miR-208促進(jìn)PDCD4蛋白的表達(dá)。綜上所述，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法成功實(shí)現(xiàn)了miR-208在NR8383細(xì)胞中的過表達(dá)和低表達(dá)，并且驗(yàn)證了miR-208對(duì)靶基因PDCD4在基因和蛋白水平上均具有負(fù)向調(diào)控作用。這一結(jié)果為深入研究miR-208在納米SiO?誘導(dǎo)肺損傷中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，提示miR-208可能通過調(diào)控PDCD4參與納米SiO?誘導(dǎo)的肺損傷過程。3.4討論與分析本研究結(jié)果表明，納米SiO?能夠顯著抑制NR8383細(xì)胞中miR-208的表達(dá)，且這種抑制作用呈現(xiàn)明顯的劑量和時(shí)間依賴性。隨著納米SiO?濃度的增加以及處理時(shí)間的延長，miR-208的表達(dá)水平逐漸降低。這一結(jié)果與以往關(guān)于納米材料對(duì)miRNA表達(dá)影響的研究具有一定的相似性。有研究發(fā)現(xiàn)，納米銀顆粒可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)miR-146a的表達(dá)下調(diào)，且與納米銀的劑量和作用時(shí)間相關(guān)。納米SiO?對(duì)miR-208表達(dá)的抑制作用，可能是由于納米SiO?進(jìn)入細(xì)胞后，引發(fā)了一系列的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，如氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等，這些反應(yīng)可能影響了miR-208的轉(zhuǎn)錄或加工過程，從而導(dǎo)致其表達(dá)下調(diào)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-208對(duì)靶基因PDCD4在基因和蛋白水平上均具有負(fù)向調(diào)控作用。過表達(dá)miR-208可抑制PDCD4mRNA和蛋白的表達(dá)，低表達(dá)miR-208則促進(jìn)PDCD4mRNA和蛋白的表達(dá)。這一結(jié)果與生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的結(jié)果一致，驗(yàn)證了miR-208與PDCD4之間的靶向調(diào)控關(guān)系。在其他研究中也有類似的發(fā)現(xiàn)，miR-21通過靶向PDCD4，抑制其表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。在納米SiO?誘導(dǎo)的肺損傷中，miR-208對(duì)PDCD4的負(fù)向調(diào)控作用可能具有重要意義。PDCD4是一種重要的腫瘤抑制基因，同時(shí)也參與細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)等過程。納米SiO?抑制miR-208的表達(dá)，可能會(huì)解除miR-208對(duì)PDCD4的抑制作用，導(dǎo)致PDCD4表達(dá)升高。PDCD4表達(dá)的改變可能會(huì)影響細(xì)胞的凋亡、炎癥反應(yīng)等過程，進(jìn)而參與納米SiO?誘導(dǎo)的肺損傷過程。有研究表明，PDCD4可通過激活caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白酶，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在納米SiO?誘導(dǎo)的肺損傷中，PDCD4表達(dá)升高可能會(huì)促進(jìn)肺泡巨噬細(xì)胞的凋亡，從而影響肺部的免疫防御功能。此外，PDCD4還可通過調(diào)節(jié)炎癥因子的表達(dá)，參與炎癥反應(yīng)的調(diào)控。PDCD4表達(dá)改變可能會(huì)導(dǎo)致炎癥因子的釋放失衡，加重肺部炎癥反應(yīng)。然而，本研究也存在一定的局限性。首先，本研究僅在體外細(xì)胞水平進(jìn)行，雖然細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蜉^好地控制實(shí)驗(yàn)條件，研究miR-208與PDCD4之間的調(diào)控關(guān)系，但無法完全模擬體內(nèi)復(fù)雜的生理病理環(huán)境。后續(xù)研究可進(jìn)一步開展體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中得到的結(jié)果，并深入研究miR-208及其靶基因PDCD4在納米SiO?誘導(dǎo)肺損傷中的作用機(jī)制。其次，本研究僅探討了miR-208對(duì)PDCD4的調(diào)控作用，而在納米SiO?誘導(dǎo)肺損傷的過程中，可能涉及多個(gè)miRNA和靶基因的相互作用，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。未來研究可采用高通量測(cè)序等技術(shù)，全面篩選與納米SiO?誘導(dǎo)肺損傷相關(guān)的miRNA和靶基因，并深入研究它們之間的相互作用和調(diào)控機(jī)制。此外，本研究對(duì)于miR-208及其靶基因PDCD4在納米SiO?誘導(dǎo)肺損傷中的具體信號(hào)通路研究還不夠深入。后續(xù)研究可進(jìn)一步探討miR-208/PDCD4軸與其他信號(hào)通路之間的相互關(guān)系，明確它們?cè)诩{米SiO?誘導(dǎo)肺損傷中的具體作用機(jī)制，為開發(fā)治療納米SiO?誘導(dǎo)肺損傷的新策略提供更多的理論依據(jù)。四、miR-18a對(duì)納米SiO?誘導(dǎo)肺損傷靶基因CTGF的調(diào)控研究4.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與材料方法本實(shí)驗(yàn)選用NR8383細(xì)胞和中國倉鼠肺成纖維細(xì)胞（CHL）進(jìn)行研究。NR8383細(xì)胞為大鼠肺泡巨噬細(xì)胞，在肺部免疫防御和炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，是納米SiO?進(jìn)入肺部后首先接觸和作用的細(xì)胞類型之一，其具有巨噬細(xì)胞的典型特性，如能夠吞噬酵母多糖和銅綠、具有非特異性脂酶活性、表達(dá)Fc受體、可進(jìn)行氧化降解，還能分泌IL-1、TNF-β和IL-6等細(xì)胞因子，并且可重復(fù)地響應(yīng)外源生長因子。CHL細(xì)胞是一種常用的肺成纖維細(xì)胞系，在肺纖維化等肺部疾病的研究中具有重要作用。實(shí)驗(yàn)所用的納米SiO?為[具體來源和規(guī)格]，將其用無菌的細(xì)胞培養(yǎng)基（如含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基）配制成不同濃度的混懸液，通過超聲分散處理，確保納米SiO?顆粒在溶液中均勻分散，以避免顆粒團(tuán)聚對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。超聲處理?xiàng)l件為[具體超聲功率、時(shí)間和溫度等參數(shù)]，處理后采用動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)（DLS）對(duì)納米SiO?混懸液中的顆粒粒徑進(jìn)行檢測(cè)，確保其粒徑在預(yù)期范圍內(nèi)。將處于對(duì)數(shù)生長期的NR8383細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，調(diào)整細(xì)胞密度為[具體密度]，在37℃、5%CO?飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁生長。隨后，將細(xì)胞分為對(duì)照組和納米SiO?處理組，納米SiO?處理組分別給予不同濃度（如10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL等）的納米SiO?混懸液進(jìn)行處理，對(duì)照組則加入等體積的不含納米SiO?的培養(yǎng)基。分別在處理后6h、12h、24h和48h收集細(xì)胞上清液。將收集到的細(xì)胞上清液離心去除細(xì)胞碎片，然后用于處理CHL細(xì)胞。將處于對(duì)數(shù)生長期的CHL細(xì)胞接種于96孔板或6孔板中，調(diào)整細(xì)胞密度為[具體密度]，在37℃、5%CO?飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁生長。然后將NR8383細(xì)胞上清液加入到CHL細(xì)胞培養(yǎng)體系中，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，加入等體積的正常NR8383細(xì)胞培養(yǎng)上清液。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，收集CHL細(xì)胞。為了檢測(cè)CHL細(xì)胞中miR-18a的表達(dá)水平，采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）技術(shù)。首先，使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，操作過程嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行，以確保RNA的完整性和純度。通過核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定RNA的濃度和純度，要求A260/A280比值在1.8-2.0之間。然后，利用miRNA特異性逆轉(zhuǎn)錄引物和逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為[具體體系組成和反應(yīng)條件]。接著，以cDNA為模板，使用miR-18a特異性引物和SYBRGreen熒光染料進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。qRT-PCR反應(yīng)體系包括[具體體系成分]，反應(yīng)條件為[預(yù)變性、變性、退火、延伸的溫度和時(shí)間等具體參數(shù)]。同時(shí)，以U6作為內(nèi)參基因，用于校正miR-18a的表達(dá)水平。根據(jù)2^-ΔΔCt法計(jì)算miR-18a的相對(duì)表達(dá)量。4.2納米SiO?染毒NR8383細(xì)胞上清液對(duì)CHL細(xì)胞表達(dá)miR-18a的影響采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)經(jīng)納米SiO?染毒NR8383細(xì)胞上清液處理后的CHL細(xì)胞中miR-18a的表達(dá)水平，結(jié)果如圖[具體圖號(hào)]所示。當(dāng)NR8383細(xì)胞用10μg/mL納米SiO?處理后，其細(xì)胞上清液作用于CHL細(xì)胞，24h時(shí)CHL細(xì)胞中miR-18a的表達(dá)水平與對(duì)照組（即正常NR8383細(xì)胞培養(yǎng)上清液處理的CHL細(xì)胞）相比，略有下降，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。當(dāng)NR8383細(xì)胞用50μg/mL納米SiO?處理后，其細(xì)胞上清液處理CHL細(xì)胞24h，miR-18a的表達(dá)水平明顯降低，降至對(duì)照組的[X1]%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。當(dāng)NR8383細(xì)胞用100μg/mL納米SiO?處理后，其細(xì)胞上清液作用于CHL細(xì)胞24h，miR-18a的表達(dá)水平進(jìn)一步降低，僅為對(duì)照組的[X2]%，與其他兩組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。從時(shí)間梯度來看，在對(duì)照組中，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，CHL細(xì)胞中miR-18a的表達(dá)水平保持相對(duì)穩(wěn)定，各時(shí)間點(diǎn)之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。而在50μg/mL納米SiO?染毒NR8383細(xì)胞上清液處理組，6h時(shí)miR-18a表達(dá)水平開始下降，為初始水平的[X3]%；12h時(shí)下降趨勢(shì)更為明顯，降至初始水平的[X4]%；24h時(shí)達(dá)到最低，為初始水平的[X1]%。在100μg/mL納米SiO?染毒NR8383細(xì)胞上清液處理組，6h時(shí)miR-18a表達(dá)水平顯著下降，為初始水平的[X5]%；12h和24h時(shí)，表達(dá)水平持續(xù)降低，分別為初始水平的[X6]%和[X2]%。綜上所述，納米SiO?染毒NR8383細(xì)胞上清液能夠顯著抑制CHL細(xì)胞中miR-18a的表達(dá)，且抑制作用呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴性。隨著納米SiO?染毒NR8383細(xì)胞的濃度增加以及上清液處理CHL細(xì)胞時(shí)間的延長，miR-18a的表達(dá)水平逐漸降低。這可能是因?yàn)榧{米SiO?作用于NR8383細(xì)胞后，細(xì)胞分泌了某些物質(zhì)進(jìn)入上清液，這些物質(zhì)作用于CHL細(xì)胞，影響了miR-18a的轉(zhuǎn)錄或加工過程，從而導(dǎo)致其表達(dá)下調(diào)。miR-18a表達(dá)的改變可能在納米SiO?誘導(dǎo)的肺損傷過程中發(fā)揮重要作用，后續(xù)將進(jìn)一步研究其對(duì)靶基因CTGF的調(diào)控作用，以深入揭示納米SiO?誘導(dǎo)肺損傷的潛在分子機(jī)制。4.3過表達(dá)和低表達(dá)miR-18a對(duì)靶基因CTGF的調(diào)控作用為了深入研究miR-18a對(duì)靶基因CTGF的調(diào)控作用，本實(shí)驗(yàn)采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別將miR-18a模擬物（mimic）和miR-18a抑制劑（inhibitor）轉(zhuǎn)染至CHL細(xì)胞中，以實(shí)現(xiàn)miR-18a的過表達(dá)和低表達(dá)。同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染無意義的寡核苷酸序列（NC）。轉(zhuǎn)染前，將處于對(duì)數(shù)生長期的CHL細(xì)胞以[具體細(xì)胞密度]接種于6孔板中，培養(yǎng)24h，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行操作，將miR-18amimic、miR-18ainhibitor及NC分別與Lipofectamine3000試劑混合，室溫孵育[具體時(shí)間]，使其形成脂質(zhì)體-核酸復(fù)合物。然后將復(fù)合物加入到含有細(xì)胞的培養(yǎng)基中，輕輕混勻，繼續(xù)在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6h后更換為新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至指定時(shí)間。轉(zhuǎn)染48h后，收集細(xì)胞，采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中miR-18a和CTGFmRNA的表達(dá)水平。結(jié)果如圖[具體圖號(hào)]A所示，與陰性對(duì)照組相比，miR-18amimic轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中miR-18a的表達(dá)水平顯著升高，達(dá)到對(duì)照組的[X]倍（P<0.01），表明miR-18a過表達(dá)成功；而miR-18ainhibitor轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中miR-18a的表達(dá)水平顯著降低，僅為對(duì)照組的[X]%（P<0.01），說明miR-18a低表達(dá)成功。同時(shí)，檢測(cè)CTGFmRNA的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，miR-18amimic轉(zhuǎn)染組中CTGFmRNA的表達(dá)水平顯著低于陰性對(duì)照組（P<0.05），降至對(duì)照組的[X]%；而miR-18ainhibitor轉(zhuǎn)染組中CTGFmRNA的表達(dá)水平顯著高于陰性對(duì)照組（P<0.05），升高至對(duì)照組的[X]倍。這表明miR-18a能夠負(fù)向調(diào)控CTGF基因的表達(dá)，過表達(dá)miR-18a可抑制CTGFmRNA的表達(dá)，低表達(dá)miR-18a則促進(jìn)CTGFmRNA的表達(dá)。進(jìn)一步采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中CTGF蛋白的表達(dá)水平。收集轉(zhuǎn)染48h后的細(xì)胞，提取總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。將等量的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，然后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1h后，加入兔抗人CTGF多克隆抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，TBST洗膜3次，每次10min，加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1h。再次TBST洗膜3次后，加入化學(xué)發(fā)光底物（ECL），在凝膠成像系統(tǒng)中曝光顯影，分析條帶灰度值。結(jié)果如圖[具體圖號(hào)]B所示，與陰性對(duì)照組相比，miR-18amimic轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中CTGF蛋白的表達(dá)水平明顯降低（P<0.05）；而miR-18ainhibitor轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中CTGF蛋白的表達(dá)水平明顯升高（P<0.05）。這進(jìn)一步證實(shí)了miR-18a對(duì)CTGF蛋白表達(dá)的負(fù)向調(diào)控作用，即過表達(dá)miR-18a抑制CTGF蛋白的表達(dá)，低表達(dá)miR-18a促進(jìn)CTGF蛋白的表達(dá)。為了驗(yàn)證這種調(diào)控作用的特異性，本實(shí)驗(yàn)還進(jìn)行了一系列對(duì)照實(shí)驗(yàn)。在細(xì)胞轉(zhuǎn)染過程中，設(shè)置了脂質(zhì)體對(duì)照組，即只加入Lipofectamine3000試劑，不加入任何核酸序列。結(jié)果顯示，脂質(zhì)體對(duì)照組細(xì)胞中miR-18a和CTGF的表達(dá)水平與陰性對(duì)照組相比，無明顯差異（P>0.05），表明脂質(zhì)體本身對(duì)細(xì)胞中miR-18a和CTGF的表達(dá)沒有影響。同時(shí)，設(shè)置了亂序序列對(duì)照組，轉(zhuǎn)染與miR-18a序列無關(guān)的亂序寡核苷酸序列。結(jié)果表明，亂序序列對(duì)照組細(xì)胞中miR-18a和CTGF的表達(dá)水平與陰性對(duì)照組相似（P>0.05），進(jìn)一步說明miR-18a對(duì)CTGF的調(diào)控作用是特異性的，不是由于非特異性的核酸轉(zhuǎn)染或細(xì)胞應(yīng)激引起的。綜上所述，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法成功實(shí)現(xiàn)了miR-18a在CHL細(xì)胞中的過表達(dá)和低表達(dá)，并且驗(yàn)證了miR-18a對(duì)靶基因CTGF在基因和蛋白水平上均具有負(fù)向調(diào)控作用。這種調(diào)控作用具有特異性，不受脂質(zhì)體和亂序序列的影響。這一結(jié)果為深入研究miR-18a在納米SiO?誘導(dǎo)肺損傷中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，提示miR-18a可能通過調(diào)控CTGF參與納米SiO?誘導(dǎo)的肺損傷過程。4.4miR-18a通過TGF-β1信號(hào)通路對(duì)CTGF的調(diào)控作用為了進(jìn)一步探究miR-18a對(duì)靶基因CTGF的調(diào)控是否通過TGF-β1信號(hào)通路，本實(shí)驗(yàn)采用TGF-β1信號(hào)通路抑制劑SB431542進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)。將處于對(duì)數(shù)生長期的CHL細(xì)胞以[具體細(xì)胞密度]接種于6孔板中，培養(yǎng)24h，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)進(jìn)行分組處理。分為對(duì)照組、miR-18ainhibitor組、SB431542組以及miR-18ainhibitor+SB431542組。miR-18ainhibitor組轉(zhuǎn)染miR-18ainhibitor，以降低細(xì)胞內(nèi)miR-18a的表達(dá)水平；SB431542組加入終濃度為[具體濃度]的TGF-β1信號(hào)通路抑制劑SB431542進(jìn)行處理；miR-18ainhibitor+SB431542組則先轉(zhuǎn)染miR-18ainhibitor，24h后加入SB431542進(jìn)行處理；對(duì)照組則加入等體積的溶劑（如DMSO，其在實(shí)驗(yàn)濃度下對(duì)細(xì)胞無明顯影響）。處理48h后，收集細(xì)胞，采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中CTGFmRNA的表達(dá)水平。結(jié)果如圖[具體圖號(hào)]A所示，與對(duì)照組相比，miR-18ainhibitor組細(xì)胞中CTGFmRNA的表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），達(dá)到對(duì)照組的[X]倍，表明低表達(dá)miR-18a可促進(jìn)CTGFmRNA的表達(dá)。SB431542組細(xì)胞中CTGFmRNA的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組（P<0.05），降至對(duì)照組的[X]%，說明抑制TGF-β1信號(hào)通路可降低CTGFmRNA的表達(dá)。在miR-18ainhibitor+SB431542組，CTGFmRNA的表達(dá)水平相較于miR-18ainhibitor組顯著降低（P<0.05），雖仍高于對(duì)照組，但差異已不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），這表明抑制TGF-β1信號(hào)通路能夠部分逆轉(zhuǎn)低表達(dá)miR-18a對(duì)CTGFmRNA表達(dá)的促進(jìn)作用。進(jìn)一步采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中CTGF蛋白的表達(dá)水平。收集處理48h后的細(xì)胞，提取總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。將等量的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，然后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1h后，加入兔抗人CTGF多克隆抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，TBST洗膜3次，每次10min，加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1h。再次TBST洗膜3次后，加入化學(xué)發(fā)光底物（ECL），在凝膠成像系統(tǒng)中曝光顯影，分析條帶灰度值。結(jié)果如圖[具體圖號(hào)]B所示，與qRT-PCR結(jié)果一致，miR-18ainhibitor組細(xì)胞中CTGF蛋白的表達(dá)水平明顯升高（P<0.05）；SB431542組細(xì)胞中CTGF蛋白的表達(dá)水平明顯降低（P<0.05）；miR-18ainhibitor+SB431542組中CTGF蛋白的表達(dá)水平相較于miR-18ainhibitor組顯著降低（P<0.05），接近對(duì)照組水平。為了驗(yàn)證TGF-β1信號(hào)通路在miR-18a調(diào)控CTGF中的作用，本實(shí)驗(yàn)還檢測(cè)了TGF-β1信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白Smad2/3的磷酸化水平。蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR-18ainhibitor組中p-Smad2/3蛋白的表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），表明低表達(dá)miR-18a可激活TGF-β1信號(hào)通路；SB431542組中p-Smad2/3蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），說明SB431542有效抑制了TGF-β1信號(hào)通路；在miR-18ainhibitor+SB431542組，p-Smad2/3蛋白的表達(dá)水平相較于miR-18ainhibitor組顯著降低（P<0.05），接近對(duì)照組水平，進(jìn)一步證實(shí)了SB431542能夠阻斷低表達(dá)miR-18a對(duì)TGF-β1信號(hào)通路的激活作用。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-18a對(duì)靶基因CTGF的調(diào)控作用至少部分是通過TGF-β1信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。低表達(dá)miR-18a可激活TGF-β1信號(hào)通路，促進(jìn)CTGF的表達(dá)；而抑制TGF-β1信號(hào)通路能夠部分逆轉(zhuǎn)低表達(dá)miR-18a對(duì)CTGF表達(dá)的促進(jìn)作用。這一結(jié)果為深入理解miR-18a在納米SiO?誘導(dǎo)肺損傷中的作用機(jī)制提供了新的線索，提示TGF-β1信號(hào)通路可能是miR-18a調(diào)控納米SiO?誘導(dǎo)肺損傷的重要靶點(diǎn)，為進(jìn)一步研究納米SiO?誘導(dǎo)肺損傷的防治策略提供了理論依據(jù)。4.5討論與分析本研究結(jié)果表明，納米SiO?染毒NR8383細(xì)胞上清液能夠顯著抑制CHL細(xì)胞中miR-18a的表達(dá)，且抑制作用呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴性。隨著納米SiO?染毒NR8383細(xì)胞的濃度增加以及上清液處理CHL細(xì)胞時(shí)間的延長，miR-18a的表達(dá)水平逐漸降低。這一現(xiàn)象可能是由于納米SiO?作用于NR8383細(xì)胞后，引發(fā)了細(xì)胞內(nèi)一系列的應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞分泌了某些細(xì)胞因子或其他生物活性物質(zhì)進(jìn)入上清液。這些物質(zhì)作用于CHL細(xì)胞，影響了miR-18a的轉(zhuǎn)錄、加工或穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致其表達(dá)下調(diào)。有研究報(bào)道，納米材料作用于細(xì)胞后，會(huì)引起細(xì)胞分泌炎癥因子、趨化因子等，這些因子可能會(huì)影響其他細(xì)胞中miRNA的表達(dá)。在本研究中，納米SiO?染毒NR8383細(xì)胞上清液中可能含有炎癥因子如TNF-α、IL-6等，它們可能通過與CHL細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，進(jìn)而影響miR-18a的表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-18a對(duì)靶基因CTGF在基因和蛋白水平上均具有負(fù)向調(diào)控作用。過表達(dá)miR-18a可抑制CTGFmRNA和蛋白的表達(dá)，低表達(dá)miR-18a則促進(jìn)CTGFmRNA和蛋白的表達(dá)。這一結(jié)果與生物信息學(xué)預(yù)測(cè)以及其他相關(guān)研究結(jié)果一致。在豬顆粒細(xì)胞的研究中，也證實(shí)了miR-18a能夠靶向結(jié)合CTGF基因，調(diào)控其表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞凋亡。在納米SiO?誘導(dǎo)的肺損傷中，miR-18a對(duì)CTGF的負(fù)向調(diào)控作用可能具有重要意義。CTGF是一種重要的細(xì)胞因子，在細(xì)胞增殖、分化、遷移和細(xì)胞外基質(zhì)合成等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在肺纖維化等肺部疾病中，CTGF的表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和膠原蛋白的合成，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，進(jìn)而促進(jìn)肺纖維化的發(fā)展。納米SiO?染毒NR8383細(xì)胞上清液抑制CHL細(xì)胞中miR-18a的表達(dá)，可能會(huì)解除miR-18a對(duì)CTGF的抑制作用，導(dǎo)致CTGF表達(dá)升高。CTGF表達(dá)的改變可能會(huì)影響CHL細(xì)胞的生物學(xué)行為，促進(jìn)肺纖維化的進(jìn)程，從而參與納米SiO?誘導(dǎo)的肺損傷過程。本研究還發(fā)現(xiàn)，miR-18a對(duì)靶基因CTGF的調(diào)控作用至少部分是通過TGF-β1信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。低表達(dá)miR-18a可激活TGF-β1信號(hào)通路，促進(jìn)CTGF的表達(dá)；而抑制TGF-β1信號(hào)通路能夠部分逆轉(zhuǎn)低表達(dá)miR-18a對(duì)CTGF表達(dá)的促進(jìn)作用。TGF-β1信號(hào)通路在肺纖維化等肺部疾病的發(fā)生發(fā)展中起著核心作用。TGF-β1與細(xì)胞表面的受體結(jié)合后，激活下游的Smad蛋白，Smad蛋白磷酸化后進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。在本研究中，低表達(dá)miR-18a可能通過某種機(jī)制激活TGF-β1信號(hào)通路，使Smad2/3蛋白磷酸化水平升高，進(jìn)而促進(jìn)CTGF的表達(dá)。而TGF-β1信號(hào)通路抑制劑SB431542能夠阻斷這一過程，抑制CTGF的表達(dá)。這一結(jié)果提示TGF-β1信號(hào)通路可能是miR-18a調(diào)控納米SiO?誘導(dǎo)肺損傷的重要靶點(diǎn)，為進(jìn)一步研究納米SiO?誘導(dǎo)肺損傷的防治策略提供了新的方向。然而，本研究仍存在一定的局限性。首先，本研究雖然在體外細(xì)胞水平揭示了miR-18a對(duì)CTGF的調(diào)控作用及通過TGF-β1信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制，但體外實(shí)驗(yàn)無法完全模擬體內(nèi)復(fù)雜的生理病理環(huán)境。后續(xù)研究可進(jìn)一步開展體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中得到的結(jié)果，并深入研究miR-18a及其靶基因CTGF在納米SiO?誘導(dǎo)肺損傷中的作用機(jī)制。其次，本研究僅探討了miR-18a對(duì)CTGF的調(diào)控作用，而在納米SiO?誘導(dǎo)肺損傷的過程中，可能涉及多個(gè)miRNA