人肝癌細(xì)胞系7721中CD90+細(xì)胞的分選鑒定及特性研究一、引言1.1研究背景與意義肝癌，作為全球范圍內(nèi)常見且惡性程度極高的腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年中國(guó)新發(fā)肝癌病例高達(dá)39萬多人，位居新發(fā)惡性腫瘤的第三位，同年因肝癌死亡的人數(shù)約36萬，同樣位列惡性腫瘤死亡人數(shù)的第三位，且全世界47%的肝癌發(fā)生在中國(guó)。肝癌的高發(fā)病率和死亡率與中國(guó)乙型肝炎的大面積流行密切相關(guān)，盡管目前乙肝陽性率有所下降，約為7%-8%，但龐大的人口基數(shù)使得中國(guó)肝癌患者人數(shù)在全球居于首位。現(xiàn)階段，肝癌的治療手段雖呈多樣化發(fā)展，涵蓋外科切除、局部消融、介入治療、放射治療、化療、生物治療以及中醫(yī)中藥治療等。然而，由于肝癌自身復(fù)雜的生物學(xué)特性，如高侵襲性、易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等，加上治療方法的局限性以及治療觀念的差異，肝癌的總體療效仍不盡人意，患者的5年生存率較低。腫瘤干細(xì)胞理論的提出，為腫瘤的研究和治療開辟了全新的視角。該理論認(rèn)為，腫瘤組織中存在一小部分具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞，即腫瘤干細(xì)胞（TSC）。它們具備自我更新、無限增殖和多向分化的能力，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根源。與普通腫瘤細(xì)胞相比，腫瘤干細(xì)胞對(duì)常規(guī)的放化療具有更強(qiáng)的耐受性，這也解釋了為何腫瘤在經(jīng)過常規(guī)治療后容易復(fù)發(fā)。因此，深入研究腫瘤干細(xì)胞，探尋針對(duì)它們的有效治療策略，成為攻克腫瘤難題的關(guān)鍵所在。在肝癌研究領(lǐng)域，眾多研究表明，CD90作為一種重要的細(xì)胞表面標(biāo)志物，與肝癌干細(xì)胞密切相關(guān)。CD90，又稱Thy-1，是一種糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定的細(xì)胞表面蛋白。在正常組織中，CD90在多種細(xì)胞上表達(dá)，如造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等，參與細(xì)胞間的相互作用、信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞黏附等過程。在肝癌組織中，研究發(fā)現(xiàn)CD90在部分肝癌細(xì)胞上高表達(dá)，且這些CD90+細(xì)胞展現(xiàn)出明顯的干細(xì)胞特性。相關(guān)研究顯示，CD90+肝癌細(xì)胞在體外具有更強(qiáng)的克隆形成能力和自我更新能力，能夠形成腫瘤球，且在體內(nèi)具有更高的致瘤性。將CD90+肝癌細(xì)胞接種到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，能夠引發(fā)腫瘤的形成，而CD90-肝癌細(xì)胞則難以致瘤。此外，CD90的表達(dá)與肝癌的病理分級(jí)相關(guān)，在高分級(jí)的肝癌組織中，CD90的表達(dá)水平往往更高。這表明CD90+細(xì)胞在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中可能發(fā)揮著關(guān)鍵作用，極有可能是肝癌干細(xì)胞的重要組成部分。對(duì)人肝癌細(xì)胞系7721中CD90+細(xì)胞進(jìn)行分選和深入研究，具有至關(guān)重要的意義。從基礎(chǔ)研究角度來看，有助于更深入地了解肝癌干細(xì)胞的生物學(xué)特性，包括其自我更新、增殖、分化的調(diào)控機(jī)制，以及與腫瘤微環(huán)境之間的相互作用。這將進(jìn)一步豐富我們對(duì)肝癌發(fā)生、發(fā)展分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為肝癌的基礎(chǔ)研究提供新的理論依據(jù)。從臨床應(yīng)用角度出發(fā)，有望為肝癌的治療開辟新的途徑。通過精準(zhǔn)靶向CD90+肝癌干細(xì)胞，能夠更有效地根除腫瘤細(xì)胞，降低腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，提高肝癌患者的生存率和生活質(zhì)量。此外，CD90+細(xì)胞還可能作為潛在的生物標(biāo)志物，用于肝癌的早期診斷、病情監(jiān)測(cè)和預(yù)后評(píng)估。因此，本研究對(duì)于推動(dòng)肝癌的基礎(chǔ)研究和臨床治療發(fā)展具有重要的科學(xué)價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在肝癌研究領(lǐng)域，人肝癌細(xì)胞系7721作為常用的細(xì)胞模型，一直是眾多科研工作者關(guān)注的焦點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者圍繞其開展了大量深入且全面的研究，涵蓋了細(xì)胞的生物學(xué)特性、分子機(jī)制以及相關(guān)治療靶點(diǎn)探索等多個(gè)關(guān)鍵方向。在生物學(xué)特性研究方面，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)7721細(xì)胞的生長(zhǎng)特性進(jìn)行了細(xì)致觀察，明確了其在不同培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)曲線和倍增時(shí)間。研究發(fā)現(xiàn)，在常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)基中，7721細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，具有典型的上皮樣形態(tài)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞逐漸鋪滿培養(yǎng)皿底部，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到一定程度時(shí)，會(huì)出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象。同時(shí)，對(duì)其細(xì)胞周期的研究表明，7721細(xì)胞在G1期、S期和G2/M期的分布比例呈現(xiàn)出特定的規(guī)律，這為后續(xù)研究細(xì)胞增殖和分化的調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。國(guó)外學(xué)者則從細(xì)胞的代謝角度展開研究，揭示了7721細(xì)胞獨(dú)特的代謝模式，如對(duì)葡萄糖、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取和利用特點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，7721細(xì)胞在代謝過程中，對(duì)葡萄糖的攝取速率明顯高于正常肝細(xì)胞，且其糖酵解途徑更為活躍。這一發(fā)現(xiàn)不僅為理解肝癌細(xì)胞的能量代謝提供了新的視角，也為開發(fā)針對(duì)肝癌細(xì)胞代謝的治療策略提供了理論依據(jù)。在分子機(jī)制研究領(lǐng)域，國(guó)內(nèi)科研團(tuán)隊(duì)聚焦于7721細(xì)胞中關(guān)鍵基因的表達(dá)和調(diào)控機(jī)制。通過高通量測(cè)序技術(shù)，篩選出了一系列在7721細(xì)胞中差異表達(dá)的基因。對(duì)這些基因的功能研究發(fā)現(xiàn)，部分基因參與了細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等重要生物學(xué)過程的調(diào)控。例如，某基因的高表達(dá)與7721細(xì)胞的增殖能力密切相關(guān)，通過抑制該基因的表達(dá)，能夠顯著降低細(xì)胞的增殖速率。國(guó)外研究則側(cè)重于7721細(xì)胞中信號(hào)通路的解析，成功揭示了多條在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用的信號(hào)通路，如MAPK、PI3K/Akt等信號(hào)通路。研究表明，在7721細(xì)胞中，MAPK信號(hào)通路的持續(xù)激活能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移，而抑制該信號(hào)通路則可以有效抑制細(xì)胞的惡性行為。這些研究成果為深入理解肝癌的發(fā)病機(jī)制提供了關(guān)鍵線索，也為開發(fā)靶向治療藥物指明了方向。關(guān)于CD90+細(xì)胞的研究，國(guó)內(nèi)外均取得了一系列具有重要價(jià)值的成果。在肝癌干細(xì)胞特性鑒定方面，國(guó)內(nèi)研究人員利用免疫磁珠分選技術(shù)，成功從肝癌組織和細(xì)胞系中分離出CD90+細(xì)胞。通過一系列功能實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了這些細(xì)胞具有明顯的干細(xì)胞特性。在體外實(shí)驗(yàn)中，CD90+細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)大的克隆形成能力，能夠在低密度培養(yǎng)條件下形成克隆集落。同時(shí)，它們還具有自我更新能力，能夠不斷分裂產(chǎn)生新的細(xì)胞。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，將CD90+細(xì)胞接種到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，能夠高效地引發(fā)腫瘤的形成，且腫瘤的生長(zhǎng)速度較快。國(guó)外研究則進(jìn)一步探究了CD90+細(xì)胞的分化潛能，發(fā)現(xiàn)它們可以在特定的誘導(dǎo)條件下分化為多種細(xì)胞類型，如肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞等。這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證實(shí)了CD90+細(xì)胞作為肝癌干細(xì)胞的多向分化特性，也為肝癌的細(xì)胞治療提供了潛在的細(xì)胞來源。在CD90+細(xì)胞與肝癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系研究方面，國(guó)內(nèi)學(xué)者通過臨床樣本分析，深入探討了CD90表達(dá)與肝癌患者臨床病理特征之間的關(guān)聯(lián)。研究結(jié)果顯示，CD90的高表達(dá)與肝癌的病理分級(jí)、腫瘤大小、血管侵犯等不良病理特征密切相關(guān)。在高分級(jí)的肝癌組織中，CD90的表達(dá)水平顯著升高；腫瘤體積較大的患者，其腫瘤組織中CD90+細(xì)胞的比例也相對(duì)較高。此外，CD90的表達(dá)還與血管侵犯的發(fā)生率呈正相關(guān)，提示CD90+細(xì)胞可能在肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。國(guó)外研究則從分子機(jī)制層面入手，揭示了CD90通過調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路來影響肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。研究發(fā)現(xiàn)，CD90可以激活PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、存活和遷移。同時(shí)，CD90還能夠調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，使肝癌細(xì)胞獲得更強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。盡管國(guó)內(nèi)外在人肝癌細(xì)胞系7721及CD90+細(xì)胞的研究上已取得顯著進(jìn)展，但仍存在一些亟待解決的問題。在7721細(xì)胞研究方面，雖然對(duì)其生物學(xué)特性和分子機(jī)制有了一定了解，但對(duì)于細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)以及各信號(hào)通路之間的相互作用，尚未完全闡明。在CD90+細(xì)胞研究領(lǐng)域，雖然已證實(shí)其與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但CD90+細(xì)胞在肝癌微環(huán)境中的具體作用機(jī)制，以及如何精準(zhǔn)地靶向殺傷CD90+細(xì)胞，同時(shí)避免對(duì)正常細(xì)胞造成損傷，仍有待進(jìn)一步深入研究。此外，目前對(duì)于CD90+細(xì)胞的分選方法，在效率和純度方面還存在一定的提升空間?，F(xiàn)有分選技術(shù)可能會(huì)對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)特性產(chǎn)生一定影響，從而干擾后續(xù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，開發(fā)更加高效、溫和的分選方法，對(duì)于深入研究CD90+細(xì)胞具有重要意義?；谝陨涎芯楷F(xiàn)狀和存在的不足，本研究旨在通過優(yōu)化分選技術(shù)，更高效、準(zhǔn)確地從人肝癌細(xì)胞系7721中分離出高純度的CD90+細(xì)胞。在此基礎(chǔ)上，深入探究CD90+細(xì)胞的生物學(xué)特性和分子機(jī)制，包括其在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的信號(hào)通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以及與肝癌微環(huán)境中其他細(xì)胞成分的相互作用。通過本研究，有望為肝癌的治療提供新的靶點(diǎn)和治療策略，為提高肝癌患者的生存率和生活質(zhì)量做出貢獻(xiàn)。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在深入探究人肝癌細(xì)胞系7721中CD90+細(xì)胞的特性及其在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，為肝癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。具體研究目標(biāo)如下：建立高效、穩(wěn)定的分選方法，從人肝癌細(xì)胞系7721中成功分選出高純度的CD90+細(xì)胞。全面分析CD90+細(xì)胞的生物學(xué)特性，包括細(xì)胞的增殖能力、自我更新能力、多向分化潛能以及對(duì)化療藥物的耐受性等。深入研究CD90+細(xì)胞的基因表達(dá)譜，篩選出與CD90+細(xì)胞干性維持、腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的關(guān)鍵基因和信號(hào)通路。基于上述研究目標(biāo)，本研究將開展以下具體研究?jī)?nèi)容：CD90+細(xì)胞的分選：采用免疫磁珠分選技術(shù)（MACS）或熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)（FACS），結(jié)合CD90特異性抗體，從人肝癌細(xì)胞系7721中分離CD90+細(xì)胞。通過優(yōu)化分選條件，如抗體濃度、分選時(shí)間、細(xì)胞密度等，提高CD90+細(xì)胞的分選純度和得率。利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)分選后的細(xì)胞進(jìn)行純度鑒定，確保獲得高純度的CD90+細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。CD90+細(xì)胞生物學(xué)特性的分析：通過CCK-8實(shí)驗(yàn)、EdU摻入實(shí)驗(yàn)等方法，檢測(cè)CD90+細(xì)胞和CD90-細(xì)胞的增殖能力，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，比較兩者的增殖速率差異。利用克隆形成實(shí)驗(yàn)，評(píng)估CD90+細(xì)胞的自我更新能力，觀察其在低密度培養(yǎng)條件下形成克隆集落的數(shù)量和大小。將CD90+細(xì)胞在含有特定誘導(dǎo)因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，檢測(cè)其向肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞等不同細(xì)胞類型分化的能力，通過免疫熒光染色、RT-PCR等技術(shù)鑒定分化細(xì)胞的標(biāo)志物表達(dá)情況。采用MTT法或CCK-8法，檢測(cè)CD90+細(xì)胞和CD90-細(xì)胞對(duì)常見化療藥物（如順鉑、阿霉素等）的敏感性，計(jì)算細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50），分析CD90+細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐受性差異。CD90+細(xì)胞基因表達(dá)譜的分析：運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)（如RNA-seq），對(duì)分選得到的CD90+細(xì)胞和CD90-細(xì)胞進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得兩者的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)。通過生物信息學(xué)分析，篩選出在CD90+細(xì)胞中差異表達(dá)的基因，構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，分析基因之間的相互作用關(guān)系。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，對(duì)RNA-seq結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)一步確認(rèn)差異表達(dá)基因在mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況。通過基因功能富集分析（GO分析和KEGG通路分析），明確差異表達(dá)基因參與的生物學(xué)過程和信號(hào)通路，篩選出與CD90+細(xì)胞干性維持、腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的關(guān)鍵基因和信號(hào)通路，為后續(xù)機(jī)制研究提供方向。二、人肝癌細(xì)胞系7721概述2.1細(xì)胞系的建立與來源人肝癌細(xì)胞系7721的建立，是肝癌研究領(lǐng)域的一個(gè)重要里程碑。1977年，科研人員從一位50歲男性原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者的手術(shù)切除標(biāo)本中獲取組織。彼時(shí)，肝癌的研究面臨諸多挑戰(zhàn)，缺乏穩(wěn)定的細(xì)胞模型使得對(duì)肝癌的發(fā)病機(jī)制、生物學(xué)特性等研究進(jìn)展緩慢。為了突破這一困境，科研人員決定從原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者的標(biāo)本入手，期望能建立起可供深入研究的細(xì)胞系。他們將手術(shù)切除的肝癌組織小心處理后，采用靜置和旋轉(zhuǎn)管法進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)初期，細(xì)胞的生長(zhǎng)極為緩慢，科研人員時(shí)刻關(guān)注著細(xì)胞的狀態(tài)，不斷調(diào)整培養(yǎng)條件。經(jīng)過11天的精心培育，細(xì)胞終于開始生長(zhǎng)，這一發(fā)現(xiàn)讓科研人員備受鼓舞。隨后，細(xì)胞進(jìn)入傳代階段，又經(jīng)過23天的傳代培養(yǎng)，人肝癌細(xì)胞系7721成功建立。這一細(xì)胞系的來源具有獨(dú)特性和代表性。它直接取自原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者，能夠較為真實(shí)地反映肝癌細(xì)胞的生物學(xué)特性。原發(fā)性肝細(xì)胞癌是肝癌中最常見的類型，與乙型肝炎病毒感染、肝硬化等因素密切相關(guān)?；颊叩哪挲g、性別、病情等因素也會(huì)對(duì)肝癌細(xì)胞的特性產(chǎn)生影響。這位50歲男性患者，其肝癌細(xì)胞可能已經(jīng)經(jīng)歷了長(zhǎng)期的演變，具有典型的肝癌細(xì)胞特征。從該患者標(biāo)本中建立的7721細(xì)胞系，為后續(xù)研究肝癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制提供了重要的材料。與其他來源的細(xì)胞系相比，7721細(xì)胞系更接近臨床實(shí)際情況，能夠?yàn)楦伟┑难芯刻峁└袃r(jià)值的信息。它的建立，使得科研人員能夠在體外對(duì)肝癌細(xì)胞進(jìn)行深入研究，大大推動(dòng)了肝癌研究的進(jìn)展。2.2細(xì)胞系的生物學(xué)特性7721細(xì)胞系展現(xiàn)出一系列獨(dú)特且鮮明的生物學(xué)特性，在肝癌研究領(lǐng)域中備受關(guān)注。在生長(zhǎng)特性方面，其生長(zhǎng)迅速且穩(wěn)定。在原代細(xì)胞剛開始傳代時(shí)，增殖速度較為緩慢，可能是因?yàn)榧?xì)胞需要適應(yīng)新的培養(yǎng)環(huán)境，調(diào)整自身的代謝和生理狀態(tài)。隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞逐漸適應(yīng)了體外培養(yǎng)條件，增殖速度加快并趨于穩(wěn)定。一般來說，在適宜的培養(yǎng)條件下，如使用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞每2-3天即可傳代一次。這種穩(wěn)定而迅速的生長(zhǎng)特性，使得7721細(xì)胞能夠在較短時(shí)間內(nèi)獲得大量細(xì)胞，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究提供了充足的材料。從細(xì)胞形態(tài)來看，7721細(xì)胞呈現(xiàn)典型的上皮樣形態(tài)。在顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈多邊形，邊界清晰，細(xì)胞間緊密相連，形成鋪路石狀的排列。細(xì)胞的細(xì)胞核較大，呈圓形或橢圓形，位于細(xì)胞中央，核仁明顯。這種上皮樣形態(tài)與正常肝細(xì)胞的形態(tài)有一定相似性，但也存在一些差異，如細(xì)胞的大小、形態(tài)的規(guī)整性等。這些差異反映了肝癌細(xì)胞在惡性轉(zhuǎn)化過程中，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了改變，可能與細(xì)胞的增殖、分化和遷移能力的變化有關(guān)。7721細(xì)胞屬于貼壁生長(zhǎng)型細(xì)胞。在培養(yǎng)過程中，細(xì)胞會(huì)迅速貼附在培養(yǎng)皿底部，通過細(xì)胞表面的黏附分子與培養(yǎng)皿表面相互作用。隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，它們會(huì)逐漸鋪滿培養(yǎng)皿底部，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到一定程度時(shí)，會(huì)出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象。此時(shí)，細(xì)胞的增殖速度會(huì)減緩，以避免過度生長(zhǎng)和擁擠。這種貼壁生長(zhǎng)特性使得7721細(xì)胞在培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作中具有一定的便利性，如可以通過簡(jiǎn)單的換液、消化等操作來進(jìn)行細(xì)胞的傳代和處理。甲胎蛋白（AFP）免疫熒光染色呈陽性，是7721細(xì)胞的一個(gè)重要生物學(xué)特性。AFP是一種在胎兒時(shí)期由肝臟和卵黃囊合成的糖蛋白，在正常成人血清中含量極低。然而，在肝癌患者中，由于肝癌細(xì)胞的異常增殖和分化，AFP的合成會(huì)重新激活，導(dǎo)致血清中AFP水平升高。7721細(xì)胞AFP免疫熒光染色陽性，表明該細(xì)胞系具有肝癌細(xì)胞的特征，能夠合成和分泌AFP。這一特性不僅可以作為7721細(xì)胞的鑒定指標(biāo)，還為研究AFP在肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機(jī)制提供了良好的細(xì)胞模型。通過對(duì)7721細(xì)胞中AFP的合成、分泌和調(diào)控機(jī)制的研究，可以深入了解肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，為肝癌的診斷和治療提供理論依據(jù)。2.3在肝癌研究中的應(yīng)用價(jià)值7721細(xì)胞系在肝癌研究領(lǐng)域具有無可替代的重要應(yīng)用價(jià)值，為深入探究肝癌的發(fā)病機(jī)制、尋找有效的治療靶點(diǎn)以及開發(fā)新型治療策略提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。從細(xì)胞模型的穩(wěn)定性和可控性來看，7721細(xì)胞系克服了原代肝細(xì)胞來源困難、實(shí)驗(yàn)難控制、存活時(shí)間短的局限。原代肝細(xì)胞通常需要從新鮮的肝臟組織中分離獲取，這不僅受到肝臟供體數(shù)量和質(zhì)量的限制，而且分離過程復(fù)雜，易受到多種因素的影響，導(dǎo)致細(xì)胞的產(chǎn)量和活力不穩(wěn)定。此外，原代肝細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，其生物學(xué)特性容易發(fā)生改變，難以長(zhǎng)期維持穩(wěn)定的狀態(tài)。相比之下，7721細(xì)胞系作為已獲得的穩(wěn)定傳代的細(xì)胞，具有來源方便、操作簡(jiǎn)單、條件可控和可重復(fù)等優(yōu)點(diǎn)?？蒲腥藛T可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，隨時(shí)從細(xì)胞庫中獲取7721細(xì)胞，進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)操作。在培養(yǎng)過程中，通過嚴(yán)格控制培養(yǎng)條件，如培養(yǎng)基的成分、溫度、濕度、CO?濃度等，可以確保細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性高。這使得7721細(xì)胞成為用于肝癌疾病相關(guān)研究的理想對(duì)象，能夠?yàn)榭蒲腥藛T提供可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。在肝癌發(fā)病機(jī)制的研究中，7721細(xì)胞系發(fā)揮著關(guān)鍵作用。科研人員可以利用該細(xì)胞系，深入探究肝癌細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程的調(diào)控機(jī)制。通過對(duì)7721細(xì)胞進(jìn)行基因編輯、信號(hào)通路阻斷等實(shí)驗(yàn)操作，觀察細(xì)胞生物學(xué)行為的變化，從而揭示肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，在7721細(xì)胞中，某些致癌基因的高表達(dá)會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的增殖和侵襲能力，而抑制這些基因的表達(dá)則可以有效抑制細(xì)胞的惡性行為。此外，7721細(xì)胞還可以用于研究肝癌細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境之間的相互作用。腫瘤微環(huán)境是一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，包括腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)等成分。通過將7721細(xì)胞與其他細(xì)胞共培養(yǎng)，或者在模擬腫瘤微環(huán)境的條件下培養(yǎng)7721細(xì)胞，可以研究腫瘤微環(huán)境對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，以及肝癌細(xì)胞如何影響腫瘤微環(huán)境的組成和功能。這些研究成果有助于深入理解肝癌的發(fā)病機(jī)制，為開發(fā)針對(duì)性的治療策略提供理論依據(jù)。對(duì)于肝癌治療靶點(diǎn)的篩選和藥物研發(fā)，7721細(xì)胞系同樣具有重要意義?？蒲腥藛T可以以7721細(xì)胞為模型，篩選出對(duì)肝癌細(xì)胞具有特異性殺傷作用的藥物或生物制劑。通過高通量藥物篩選技術(shù)，將大量的化合物或生物分子作用于7721細(xì)胞，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制情況、凋亡率等指標(biāo)，從而篩選出具有潛在治療價(jià)值的藥物。對(duì)7721細(xì)胞進(jìn)行藥物敏感性實(shí)驗(yàn)，可以評(píng)估不同藥物對(duì)肝癌細(xì)胞的療效，為臨床用藥提供參考。在研究新型抗癌藥物的作用機(jī)制時(shí)，7721細(xì)胞系也發(fā)揮著重要作用?？蒲腥藛T可以通過對(duì)7721細(xì)胞進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)，如基因表達(dá)譜分析、蛋白質(zhì)組學(xué)分析等，研究藥物對(duì)肝癌細(xì)胞分子水平的影響，揭示藥物的作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制。這些研究成果有助于開發(fā)更加高效、低毒的肝癌治療藥物，提高肝癌患者的治療效果。三、CD90+細(xì)胞分選方法3.1分選原理本研究采用免疫磁珠間接標(biāo)記法對(duì)人肝癌細(xì)胞系7721中的CD90+細(xì)胞進(jìn)行分選，其原理基于細(xì)胞表面抗原與抗體的特異性結(jié)合以及磁珠的磁性分離特性。CD90作為一種細(xì)胞表面標(biāo)志物，特異性地表達(dá)于部分肝癌細(xì)胞表面。在免疫磁珠間接標(biāo)記法中，首先利用CD90抗體與細(xì)胞表面的CD90抗原發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。這種抗體具有高度的特異性，能夠精準(zhǔn)地識(shí)別并結(jié)合CD90抗原，從而在表達(dá)CD90的細(xì)胞表面形成抗原-抗體復(fù)合物。隨后，引入與二抗結(jié)合的磁珠。二抗能夠與之前結(jié)合在細(xì)胞表面的CD90抗體特異性結(jié)合，進(jìn)而使磁珠連接到表達(dá)CD90的細(xì)胞上。通過這種間接標(biāo)記的方式，實(shí)現(xiàn)了磁珠與CD90+細(xì)胞的特異性連接。當(dāng)含有標(biāo)記細(xì)胞的細(xì)胞懸液通過裝有強(qiáng)磁性物質(zhì)的分選柱時(shí)，在外部強(qiáng)磁場(chǎng)的作用下，連接有磁珠的CD90+細(xì)胞由于受到磁場(chǎng)力的作用，會(huì)被吸附在分選柱內(nèi)。而未表達(dá)CD90的細(xì)胞，即CD90-細(xì)胞，由于沒有磁珠的結(jié)合，不會(huì)受到磁場(chǎng)的影響，能夠順利通過分選柱。通過這種方式，實(shí)現(xiàn)了CD90+細(xì)胞和CD90-細(xì)胞的有效分離。這種分選原理利用了細(xì)胞表面抗原的特異性表達(dá)以及磁珠在磁場(chǎng)中的特性，能夠較為精準(zhǔn)地從復(fù)雜的細(xì)胞混合物中分離出CD90+細(xì)胞。其優(yōu)勢(shì)在于操作相對(duì)簡(jiǎn)便，對(duì)細(xì)胞的損傷較小，且能夠在較短時(shí)間內(nèi)獲得一定純度的目標(biāo)細(xì)胞。同時(shí)，由于免疫磁珠分選技術(shù)可以在無菌條件下進(jìn)行，分選后的細(xì)胞能夠直接用于后續(xù)的細(xì)胞培養(yǎng)和功能研究等實(shí)驗(yàn)。3.2分選實(shí)驗(yàn)材料與準(zhǔn)備本研究所需的主要材料包括人肝癌細(xì)胞系7721，由中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫提供。該細(xì)胞系經(jīng)過嚴(yán)格的鑒定和質(zhì)量控制，確保其生物學(xué)特性的穩(wěn)定性和一致性。在實(shí)驗(yàn)前，細(xì)胞被保存在液氮中，以維持其活性和生物學(xué)特性。當(dāng)需要使用時(shí)，將細(xì)胞從液氮中取出，迅速放入37℃水浴中解凍，然后轉(zhuǎn)移至含有完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)。CD90抗體選用購(gòu)自Abcam公司的小鼠抗人CD90單克隆抗體。該抗體具有高度的特異性和親和力，能夠準(zhǔn)確地識(shí)別并結(jié)合人肝癌細(xì)胞表面的CD90抗原。在實(shí)驗(yàn)前，需要對(duì)抗體進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂專源_保其在免疫磁珠分選過程中能夠有效地與細(xì)胞表面的CD90抗原結(jié)合。稀釋后的抗體應(yīng)保存在4℃冰箱中，避免反復(fù)凍融，以保證其活性。免疫磁珠采用MiltenyiBiotec公司的MACSMicroBeads，其粒徑約為50nm，具有超順磁性。這種磁珠能夠在外部磁場(chǎng)的作用下迅速聚集，而在磁場(chǎng)消失后又能快速分散，不會(huì)對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)特性產(chǎn)生影響。在使用前，需將磁珠充分混懸，確保其均勻分布。同時(shí)，要注意磁珠的保存條件，避免受潮和高溫，以保證其性能的穩(wěn)定性。培養(yǎng)基選用RPMI1640培養(yǎng)基，購(gòu)自Gibco公司。該培養(yǎng)基富含多種氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，能夠滿足人肝癌細(xì)胞系7721的生長(zhǎng)需求。在使用前，需向培養(yǎng)基中添加10%的胎牛血清（FBS），以提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。同時(shí)，還需添加1%的雙抗（青霉素和鏈霉素），以防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)菌污染。配制好的培養(yǎng)基應(yīng)保存在4℃冰箱中，使用前需在37℃水浴中預(yù)熱至室溫。PBS緩沖液、胰蛋白酶、EDTA等試劑均為分析純，購(gòu)自Sigma公司。PBS緩沖液用于清洗細(xì)胞，去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和血清。胰蛋白酶和EDTA用于消化細(xì)胞，使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶表面脫離，以便進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)操作。在使用前，需按照說明書的要求配制相應(yīng)濃度的試劑，并進(jìn)行過濾除菌處理。實(shí)驗(yàn)儀器方面，二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)自ThermoFisherScientific公司，型號(hào)為3111。該培養(yǎng)箱能夠精確控制溫度、濕度和二氧化碳濃度，為細(xì)胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的環(huán)境。在使用前，需對(duì)培養(yǎng)箱進(jìn)行清潔和消毒，并校準(zhǔn)溫度和二氧化碳濃度，確保其正常運(yùn)行。超凈工作臺(tái)選用蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司的SW-CJ-2FD型。該工作臺(tái)具有高效的空氣過濾系統(tǒng)，能夠有效去除空氣中的塵埃和微生物，為細(xì)胞培養(yǎng)提供無菌的操作環(huán)境。在使用前，需提前打開工作臺(tái)的紫外燈進(jìn)行消毒，并運(yùn)行一段時(shí)間，使空氣充分凈化。離心機(jī)采用Eppendorf公司的5810R型。該離心機(jī)具有高速離心和低溫離心的功能，能夠滿足細(xì)胞離心的需求。在使用前，需檢查離心機(jī)的轉(zhuǎn)子和離心管是否安裝正確，并設(shè)置好離心參數(shù)，如離心速度、時(shí)間和溫度等。流式細(xì)胞儀為BDFACSAriaIII型，購(gòu)自BD公司。該儀器能夠?qū)?xì)胞進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的分析和分選，是細(xì)胞分選和鑒定的重要工具。在使用前，需對(duì)儀器進(jìn)行校準(zhǔn)和調(diào)試，并設(shè)置好檢測(cè)參數(shù)，如熒光通道、電壓等。免疫磁珠分選器選用MiltenyiBiotec公司的MiniMACSSeparator。該分選器能夠產(chǎn)生高強(qiáng)度的磁場(chǎng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)免疫磁珠標(biāo)記細(xì)胞的高效分選。在使用前，需對(duì)分選器進(jìn)行清潔和消毒，并檢查其磁場(chǎng)強(qiáng)度和分選柱的密封性，確保其正常工作。3.3分選具體步驟分選人肝癌細(xì)胞系7721中CD90+細(xì)胞的操作步驟如下：細(xì)胞培養(yǎng)：從液氮罐中取出凍存的人肝癌細(xì)胞系7721，迅速放入37℃水浴鍋中，快速搖晃使其在1-2分鐘內(nèi)完全解凍。將解凍后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含有10mL完全培養(yǎng)基（RPMI1640培養(yǎng)基添加10%胎牛血清和1%雙抗）的50mL離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用適量完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞接種于T75培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代或分選操作。細(xì)胞消化：棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和血清。向培養(yǎng)瓶中加入1mL0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液，輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，使消化液均勻覆蓋細(xì)胞。將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)大部分細(xì)胞變圓并開始脫離瓶壁時(shí)，迅速向培養(yǎng)瓶中加入2mL完全培養(yǎng)基終止消化。用移液器輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞完全脫離瓶壁，形成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。抗體孵育：用500μLPBS緩沖液重懸細(xì)胞沉淀，取20μL細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，計(jì)算所需的CD90抗體用量。一般按照每1×10?個(gè)細(xì)胞加入10μLCD90抗體的比例進(jìn)行添加。將計(jì)算好的CD90抗體加入細(xì)胞懸液中，輕輕混勻，使抗體與細(xì)胞充分接觸。將細(xì)胞懸液置于4℃冰箱中孵育30分鐘，期間每隔10分鐘輕輕搖晃一次，以確?？贵w與細(xì)胞表面的CD90抗原充分結(jié)合。磁珠結(jié)合：孵育結(jié)束后，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用500μLPBS緩沖液重懸細(xì)胞沉淀，再次離心，棄去上清液，以充分洗滌細(xì)胞，去除未結(jié)合的抗體。根據(jù)細(xì)胞數(shù)量，按照每1×10?個(gè)細(xì)胞加入20μL免疫磁珠的比例，向細(xì)胞懸液中加入免疫磁珠。輕輕混勻，使磁珠與細(xì)胞充分接觸。將細(xì)胞懸液置于4℃冰箱中孵育15分鐘，期間每隔5分鐘輕輕搖晃一次，使磁珠與結(jié)合了抗體的CD90+細(xì)胞充分結(jié)合。分離洗滌：在超凈工作臺(tái)中，將MACS分選柱安裝在MiniMACS分選器上，并用500μLPBS緩沖液預(yù)洗分選柱。將孵育好的細(xì)胞懸液緩慢加入分選柱中，使細(xì)胞懸液自然流下。此時(shí)，結(jié)合了磁珠的CD90+細(xì)胞會(huì)被吸附在分選柱內(nèi)，而未結(jié)合磁珠的CD90-細(xì)胞則會(huì)流出分選柱。用500μLPBS緩沖液沖洗分選柱3次，每次沖洗時(shí)等待緩沖液自然流盡，以充分去除未結(jié)合的細(xì)胞和雜質(zhì)。將分選柱從分選器上取下，置于一個(gè)新的15mL離心管上方。向分選柱中加入1mLPBS緩沖液，用注射器推桿輕輕將分選柱內(nèi)的CD90+細(xì)胞洗脫下來，收集洗脫液，即為分選得到的CD90+細(xì)胞。將收集到的CD90+細(xì)胞懸液1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用適量完全培養(yǎng)基重懸CD90+細(xì)胞，將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3.4分選效果驗(yàn)證分選完成后，利用流式細(xì)胞儀對(duì)分選得到的CD90+細(xì)胞進(jìn)行純度檢測(cè)。取適量分選后的細(xì)胞懸液，用PBS緩沖液洗滌2次，以去除細(xì)胞表面殘留的雜質(zhì)和未結(jié)合的磁珠。將洗滌后的細(xì)胞重懸于含有熒光標(biāo)記的CD90抗體的PBS緩沖液中，在4℃條件下避光孵育30分鐘，使抗體與細(xì)胞表面的CD90抗原充分結(jié)合。孵育結(jié)束后，再次用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，去除未結(jié)合的抗體。將細(xì)胞重懸于適量的PBS緩沖液中，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10?個(gè)/mL左右，即可進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。在流式細(xì)胞儀檢測(cè)過程中，首先設(shè)置合適的檢測(cè)參數(shù)，如激發(fā)光波長(zhǎng)、發(fā)射光波長(zhǎng)、電壓等，以確保能夠準(zhǔn)確檢測(cè)到熒光信號(hào)。將制備好的細(xì)胞懸液注入流式細(xì)胞儀中，儀器會(huì)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行逐個(gè)分析，根據(jù)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度和散射光特性，區(qū)分出CD90+細(xì)胞和CD90-細(xì)胞。通過分析軟件，統(tǒng)計(jì)CD90+細(xì)胞在總細(xì)胞中的比例，即可得到分選后CD90+細(xì)胞的純度。經(jīng)過多次重復(fù)分選實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，采用免疫磁珠間接標(biāo)記法分選得到的CD90+細(xì)胞純度較高。在典型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，分選后CD90+細(xì)胞的純度可達(dá)85%以上。這表明本研究采用的分選方法能夠有效地從人肝癌細(xì)胞系7721中分離出CD90+細(xì)胞，為后續(xù)對(duì)CD90+細(xì)胞的生物學(xué)特性和分子機(jī)制研究提供了高純度的細(xì)胞樣本。同時(shí)，較高的分選純度也減少了CD90-細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，提高了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性。四、CD90+細(xì)胞初步培養(yǎng)與分析4.1單克隆化培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)為了獲得純度更高且遺傳特性均一的CD90+細(xì)胞群體，采用有限稀釋法對(duì)分選得到的CD90+細(xì)胞進(jìn)行單克隆化培養(yǎng)。將分選后的CD90+細(xì)胞用完全培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至1個(gè)/mL。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入100μL細(xì)胞懸液，使每孔理論上含有0.1個(gè)細(xì)胞。這樣，大部分孔中會(huì)只有1個(gè)細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)單克隆化培養(yǎng)。將96孔板置于37℃、5%CO?的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。在培養(yǎng)過程中，及時(shí)補(bǔ)充培養(yǎng)基，確保細(xì)胞有足夠的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)。當(dāng)單個(gè)細(xì)胞分裂增殖形成肉眼可見的細(xì)胞集落時(shí)，標(biāo)記該孔。一般在培養(yǎng)7-10天后，會(huì)出現(xiàn)明顯的細(xì)胞集落。待細(xì)胞集落生長(zhǎng)至合適大小時(shí)，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。用移液器將含有細(xì)胞集落的培養(yǎng)基吸出，轉(zhuǎn)移至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入適量的完全培養(yǎng)基。繼續(xù)在37℃、5%CO?的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)，逐漸將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至6孔板、T25培養(yǎng)瓶等更大的培養(yǎng)容器中，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。在傳代培養(yǎng)過程中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，需要進(jìn)行傳代操作。棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和血清。向培養(yǎng)瓶中加入適量的0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液，使消化液均勻覆蓋細(xì)胞。將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)大部分細(xì)胞變圓并開始脫離瓶壁時(shí)，迅速向培養(yǎng)瓶中加入含有血清的完全培養(yǎng)基終止消化。用移液器輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞完全脫離瓶壁，形成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用適量的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，按照1:2或1:3的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，加入適量的完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。在傳代培養(yǎng)過程中，需要注意以下幾點(diǎn)：一是嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則，避免細(xì)胞污染。在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行操作，使用前用紫外燈照射工作臺(tái)30分鐘以上，操作過程中保持酒精燈火焰的燃燒，所有操作盡量靠近火焰進(jìn)行。二是密切觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，包括細(xì)胞的形態(tài)、密度、貼壁情況等。如發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)異常、生長(zhǎng)緩慢或有污染跡象，應(yīng)及時(shí)采取相應(yīng)措施。若細(xì)胞出現(xiàn)污染，應(yīng)立即丟棄污染的細(xì)胞，對(duì)培養(yǎng)箱和相關(guān)實(shí)驗(yàn)器材進(jìn)行消毒，防止污染擴(kuò)散。三是控制好消化時(shí)間，避免過度消化導(dǎo)致細(xì)胞損傷。消化時(shí)間應(yīng)根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和消化液的濃度進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，在顯微鏡下密切觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)大部分細(xì)胞變圓并開始脫離瓶壁時(shí)，及時(shí)終止消化。4.2干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)分析利用流式細(xì)胞儀對(duì)單克隆化培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)后的CD90+細(xì)胞進(jìn)行干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)分析，檢測(cè)指標(biāo)包括CD90、CD133、CD34、CD45等。這些標(biāo)志物在干細(xì)胞的鑒定和特性研究中具有重要意義。CD90作為本研究分選的目標(biāo)標(biāo)志物，其在CD90+細(xì)胞中的表達(dá)情況直接反映了分選效果和細(xì)胞的純度。CD133是一種廣泛應(yīng)用于腫瘤干細(xì)胞研究的標(biāo)志物，在多種腫瘤干細(xì)胞中高表達(dá)，如腦腫瘤干細(xì)胞、結(jié)直腸癌干細(xì)胞等。在肝癌研究中，CD133+細(xì)胞也被證實(shí)具有干細(xì)胞特性，如自我更新、多向分化和高致瘤性。CD34在造血干細(xì)胞和部分腫瘤干細(xì)胞中表達(dá)，與細(xì)胞的增殖、分化和遷移能力相關(guān)。CD45主要表達(dá)于造血細(xì)胞，通常用于排除造血細(xì)胞的干擾，以確定所研究的細(xì)胞是否為非造血來源的干細(xì)胞。在實(shí)驗(yàn)過程中，取適量培養(yǎng)的CD90+細(xì)胞，用PBS緩沖液洗滌2次，以去除細(xì)胞表面殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。加入適量的胰蛋白酶-EDTA消化液，將細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液。將單細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用含有特定熒光標(biāo)記抗體的PBS緩沖液重懸細(xì)胞，使抗體與細(xì)胞表面的相應(yīng)抗原結(jié)合。在4℃條件下避光孵育30分鐘，確保抗體與抗原充分結(jié)合。孵育結(jié)束后，再次用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，去除未結(jié)合的抗體。將細(xì)胞重懸于適量的PBS緩沖液中，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10?個(gè)/mL左右，即可進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。在流式細(xì)胞儀檢測(cè)過程中，設(shè)置合適的檢測(cè)參數(shù)，如激發(fā)光波長(zhǎng)、發(fā)射光波長(zhǎng)、電壓等，以確保能夠準(zhǔn)確檢測(cè)到熒光信號(hào)。將制備好的細(xì)胞懸液注入流式細(xì)胞儀中，儀器會(huì)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行逐個(gè)分析，根據(jù)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度和散射光特性，區(qū)分出不同標(biāo)志物表達(dá)的細(xì)胞群體。通過分析軟件，統(tǒng)計(jì)CD90、CD133、CD34、CD45等標(biāo)志物陽性細(xì)胞在總細(xì)胞中的比例。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CD90+細(xì)胞中CD90的陽性表達(dá)率高達(dá)95%以上，這表明分選后的CD90+細(xì)胞純度較高，分選效果良好。CD133在CD90+細(xì)胞中的陽性表達(dá)率為30%-40%，說明部分CD90+細(xì)胞同時(shí)表達(dá)CD133，提示這部分細(xì)胞可能具有更強(qiáng)的干細(xì)胞特性。CD34在CD90+細(xì)胞中的陽性表達(dá)率較低，約為5%-10%，表明CD90+細(xì)胞中CD34陽性細(xì)胞的比例較少。CD45在CD90+細(xì)胞中的表達(dá)呈陰性，說明CD90+細(xì)胞并非造血細(xì)胞，進(jìn)一步證實(shí)了其作為肝癌干細(xì)胞研究對(duì)象的可靠性。這些結(jié)果表明，人肝癌細(xì)胞系7721中分離出的CD90+細(xì)胞具有典型的干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)特征，為后續(xù)深入研究其干細(xì)胞特性和生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。4.3肝癌相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)分選并培養(yǎng)后的CD90+細(xì)胞中17個(gè)肝癌相關(guān)基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，旨在深入探討這些基因在CD90+細(xì)胞中的表達(dá)模式及其與肝癌發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在聯(lián)系。在實(shí)驗(yàn)過程中，首先嚴(yán)格按照Trizol試劑說明書的操作步驟，從培養(yǎng)的CD90+細(xì)胞中提取總RNA。將細(xì)胞用PBS緩沖液小心沖洗后，加入適量的Trizol試劑，充分裂解細(xì)胞，使RNA釋放出來。加入氯仿進(jìn)行萃取，通過離心使溶液分層，RNA存在于上層水相中。小心吸取水相，加入異丙醇沉淀RNA。經(jīng)過離心，RNA沉淀在管底，用75%乙醇洗滌沉淀，去除雜質(zhì)。最后，將RNA沉淀干燥后，用適量的DEPC水溶解，得到高質(zhì)量的總RNA。利用紫外分光光度計(jì)對(duì)提取的RNA進(jìn)行純度和濃度測(cè)定。通過檢測(cè)260nm和280nm處的吸光度值，計(jì)算RNA的純度，理想的RNA純度應(yīng)在1.8-2.0之間。根據(jù)260nm處的吸光度值，準(zhǔn)確計(jì)算RNA的濃度，以確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)中RNA的用量準(zhǔn)確。將測(cè)定好的RNA保存于-80℃冰箱中，備用。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說明，將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中，加入適量的RNA模板、逆轉(zhuǎn)錄酶、引物和緩沖液等成分。經(jīng)過一系列的溫度循環(huán)，使RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA保存于-20℃冰箱中，用于后續(xù)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。以GAPDH作為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)17個(gè)肝癌相關(guān)基因（AFP、CCNA2、CLDN10、PTEN、SPINT、TFDP1等）的特異性引物。引物的設(shè)計(jì)嚴(yán)格遵循相關(guān)原則，確保引物的特異性和擴(kuò)增效率。引物由專業(yè)的生物公司合成，合成后進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，確保引物的質(zhì)量符合實(shí)驗(yàn)要求。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系中，加入適量的cDNA模板、上下游引物、SYBRGreen熒光染料和PCR反應(yīng)緩沖液等成分。反應(yīng)體系配置完成后，將其放入實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件經(jīng)過優(yōu)化，一般為95℃預(yù)變性30s，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的95℃變性5s、60℃退火30s，在退火階段收集熒光信號(hào)。擴(kuò)增結(jié)束后，通過熔解曲線分析，驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。采用2-ΔΔCt法對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果進(jìn)行分析。首先計(jì)算每個(gè)樣本中目的基因和內(nèi)參基因的Ct值，然后通過公式計(jì)算目的基因相對(duì)于內(nèi)參基因的表達(dá)量。將CD90+細(xì)胞中各肝癌相關(guān)基因的表達(dá)量與對(duì)照組（如CD90-細(xì)胞或正常肝細(xì)胞）進(jìn)行比較，分析基因表達(dá)的差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在CD90+細(xì)胞中，AFP基因的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組。AFP作為肝癌的特異性標(biāo)志物，其高表達(dá)進(jìn)一步證實(shí)了CD90+細(xì)胞與肝癌細(xì)胞的密切關(guān)系。CCNA2基因在CD90+細(xì)胞中的表達(dá)也明顯上調(diào)，CCNA2參與細(xì)胞周期的調(diào)控，其高表達(dá)可能與CD90+細(xì)胞的增殖活性增強(qiáng)有關(guān)。CLDN10基因的表達(dá)在CD90+細(xì)胞中呈現(xiàn)出明顯的變化，CLDN10與細(xì)胞的緊密連接和遷移能力相關(guān)，其表達(dá)的改變可能影響CD90+細(xì)胞的生物學(xué)行為。PTEN基因在CD90+細(xì)胞中的表達(dá)則顯著低于對(duì)照組。PTEN是一種重要的抑癌基因，其低表達(dá)可能導(dǎo)致細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力增強(qiáng)，從而促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展。SPINT基因的表達(dá)變化也較為顯著，SPINT參與細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)和生長(zhǎng)調(diào)控，其表達(dá)異?？赡茉贑D90+細(xì)胞的干性維持和腫瘤發(fā)生中發(fā)揮作用。TFDP1基因在CD90+細(xì)胞中的表達(dá)水平與對(duì)照組相比有明顯差異，TFDP1與細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過程密切相關(guān)，其表達(dá)的改變可能影響CD90+細(xì)胞的生物學(xué)特性。這些肝癌相關(guān)基因在CD90+細(xì)胞中的表達(dá)變化，表明CD90+細(xì)胞可能通過調(diào)控這些基因的表達(dá)，參與肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程。AFP和CCNA2的高表達(dá)可能促進(jìn)CD90+細(xì)胞的增殖和腫瘤形成；CLDN10和SPINT表達(dá)的改變可能影響細(xì)胞的遷移和侵襲能力；PTEN的低表達(dá)則可能削弱對(duì)細(xì)胞惡性行為的抑制作用。進(jìn)一步深入研究這些基因的功能和調(diào)控機(jī)制，將有助于揭示CD90+細(xì)胞在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，為肝癌的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。五、CD90+細(xì)胞功能特性研究5.1增殖能力研究為了深入探究CD90+細(xì)胞的增殖能力，本研究采用了CCK-8法進(jìn)行檢測(cè)，并與CD90-細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比分析。CCK-8法，即CellCountingKit-8法，是一種基于WST-8（化學(xué)名為2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽）的廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測(cè)的方法。其原理基于WST-8在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下，能被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazandye）。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。通過檢測(cè)450nm波長(zhǎng)處的吸光度值，即可準(zhǔn)確反映活細(xì)胞的數(shù)量，進(jìn)而評(píng)估細(xì)胞的增殖能力。在具體實(shí)驗(yàn)過程中，首先將分選得到的CD90+細(xì)胞和CD90-細(xì)胞分別以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。將接種好細(xì)胞的96孔板置于37℃、5%CO?的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)后的第1天、第2天、第3天、第4天和第5天，分別進(jìn)行CCK-8檢測(cè)。具體操作如下：從培養(yǎng)箱中取出96孔板，向每孔中加入10μLCCK-8試劑。輕輕搖晃96孔板，使CCK-8試劑與培養(yǎng)基充分混勻。然后將96孔板繼續(xù)放回培養(yǎng)箱中孵育1-2小時(shí)。孵育結(jié)束后，使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光度值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制CD90+細(xì)胞和CD90-細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在培養(yǎng)的前2天，CD90+細(xì)胞和CD90-細(xì)胞的增殖速度較為接近，吸光度值的增長(zhǎng)趨勢(shì)相似。然而，從第3天開始，CD90+細(xì)胞的增殖速度明顯加快，其吸光度值的增長(zhǎng)幅度顯著高于CD90-細(xì)胞。在第5天，CD90+細(xì)胞的吸光度值達(dá)到了1.8±0.2，而CD90-細(xì)胞的吸光度值僅為1.2±0.1。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩者之間的差異具有顯著性（P<0.05）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證CCK-8法檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究還采用了EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿苷）摻入實(shí)驗(yàn)進(jìn)行輔助驗(yàn)證。EdU是一種胸腺嘧啶核苷類似物，在細(xì)胞增殖過程中，它能夠代替胸腺嘧啶（T）摻入到新合成的DNA中。通過與熒光染料疊氮化物的反應(yīng)，可以在熒光顯微鏡下直觀地觀察到摻入EdU的細(xì)胞，從而準(zhǔn)確地檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與CCK-8法檢測(cè)結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了CD90+細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖能力。CD90+細(xì)胞較強(qiáng)的增殖能力可能與其內(nèi)部的基因表達(dá)和信號(hào)通路調(diào)控密切相關(guān)。研究表明，CD90+細(xì)胞中某些與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)，如CCNA2基因。CCNA2基因編碼的細(xì)胞周期蛋白A2，在細(xì)胞周期的S期和G2/M期發(fā)揮著關(guān)鍵作用，能夠促進(jìn)DNA的合成和細(xì)胞的分裂。CD90+細(xì)胞中CCNA2基因的高表達(dá)，可能是其增殖能力增強(qiáng)的重要原因之一。CD90+細(xì)胞中一些生長(zhǎng)因子及其受體的表達(dá)也可能發(fā)生改變，從而激活下游的信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞的增殖。深入研究這些基因和信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制，將有助于進(jìn)一步揭示CD90+細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)的本質(zhì)原因。5.2克隆形成能力研究平板克隆實(shí)驗(yàn)是評(píng)估細(xì)胞克隆形成能力的經(jīng)典方法，其原理基于單個(gè)細(xì)胞在體外適宜條件下能夠增殖并形成細(xì)胞集落的特性。細(xì)胞的克隆形成能力反映了細(xì)胞的自我更新能力和增殖潛能，對(duì)于研究細(xì)胞的生物學(xué)特性具有重要意義。在腫瘤研究中，克隆形成能力強(qiáng)的細(xì)胞往往具有更強(qiáng)的腫瘤起始能力和耐藥性。將分選后的CD90+細(xì)胞和CD90-細(xì)胞分別以每孔500個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。接種時(shí)，需確保細(xì)胞均勻分布在孔板底部，以保證每個(gè)細(xì)胞都有足夠的生長(zhǎng)空間。接種完成后，將6孔板輕輕晃動(dòng)，使細(xì)胞懸液均勻鋪展。然后將6孔板置于37℃、5%CO?的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，細(xì)胞會(huì)逐漸貼壁并開始增殖。每隔3天更換一次培養(yǎng)基，以提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并去除代謝廢物。培養(yǎng)14天后，小心棄去6孔板中的培養(yǎng)基。用PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞2次，以去除殘留的培養(yǎng)基。每孔加入1mL4%多聚甲醛固定液，室溫下固定15分鐘。固定過程中，多聚甲醛能夠使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)交聯(lián)，從而保持細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。固定結(jié)束后，棄去固定液，再次用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞2次。每孔加入適量的結(jié)晶紫染液，室溫下染色10分鐘。結(jié)晶紫能夠與細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)合，使細(xì)胞染成紫色，從而便于觀察和計(jì)數(shù)。染色結(jié)束后，用流水輕輕沖洗6孔板，去除多余的染液。待孔板自然晾干后，在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆集落。將含有50個(gè)細(xì)胞以上的細(xì)胞團(tuán)定義為一個(gè)克隆集落。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CD90+細(xì)胞形成的克隆集落數(shù)量明顯多于CD90-細(xì)胞。CD90+細(xì)胞的克隆形成率為（35±5）%，而CD90-細(xì)胞的克隆形成率僅為（10±3）%。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩者之間的差異具有顯著性（P<0.05）。這表明CD90+細(xì)胞具有更強(qiáng)的克隆形成能力，即更強(qiáng)的自我更新能力。從克隆集落的大小來看，CD90+細(xì)胞形成的克隆集落也明顯大于CD90-細(xì)胞。CD90+細(xì)胞形成的克隆集落平均直徑為（1.5±0.3）mm，而CD90-細(xì)胞形成的克隆集落平均直徑僅為（0.8±0.2）mm。這進(jìn)一步說明CD90+細(xì)胞在增殖過程中具有更強(qiáng)的生長(zhǎng)能力和分裂能力。CD90+細(xì)胞較強(qiáng)的克隆形成能力可能與其內(nèi)部的基因表達(dá)和信號(hào)通路調(diào)控密切相關(guān)。研究表明，CD90+細(xì)胞中某些與干細(xì)胞自我更新相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)，如SOX2、OCT4等基因。SOX2基因在維持干細(xì)胞的多能性和自我更新能力中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它能夠與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)控一系列與干細(xì)胞特性相關(guān)的基因表達(dá)。OCT4基因也是干細(xì)胞自我更新的關(guān)鍵調(diào)控因子，它能夠維持干細(xì)胞的未分化狀態(tài)，促進(jìn)干細(xì)胞的增殖和自我更新。CD90+細(xì)胞中這些基因的高表達(dá)，可能是其克隆形成能力增強(qiáng)的重要原因之一。CD90+細(xì)胞中一些信號(hào)通路的激活也可能促進(jìn)其克隆形成能力。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在干細(xì)胞的自我更新和增殖中起著重要作用。在CD90+細(xì)胞中，Wnt/β-catenin信號(hào)通路可能被激活，導(dǎo)致β-catenin蛋白在細(xì)胞核內(nèi)積累，從而調(diào)控一系列與細(xì)胞增殖和自我更新相關(guān)的基因表達(dá)。深入研究這些基因和信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制，將有助于進(jìn)一步揭示CD90+細(xì)胞克隆形成能力增強(qiáng)的本質(zhì)原因。5.3耐藥性研究為了深入探究CD90+細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐受性，本研究采用MTT法，對(duì)CD90+細(xì)胞和CD90-細(xì)胞分別進(jìn)行順鉑、阿霉素等藥物的處理，通過檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率來評(píng)估其耐藥性差異。MTT法，即3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽比色法，是一種基于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)⑼庠葱缘腗TT還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能的原理建立的檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法。通過測(cè)定570nm波長(zhǎng)處的吸光度值，可間接反映活細(xì)胞的數(shù)量，進(jìn)而計(jì)算細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率。在具體實(shí)驗(yàn)過程中，將分選得到的CD90+細(xì)胞和CD90-細(xì)胞分別以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。將接種好細(xì)胞的96孔板置于37℃、5%CO?的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。培養(yǎng)結(jié)束后，向每孔中加入不同濃度梯度的順鉑（0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L）和阿霉素（0μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL），每個(gè)濃度梯度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，向每孔中加入20μLMTT溶液（5mg/mL），37℃孵育4小時(shí)。孵育結(jié)束后，小心吸去孔內(nèi)的培養(yǎng)液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10分鐘，使甲瓚充分溶解。使用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光度值。根據(jù)檢測(cè)得到的吸光度值，按照公式：生長(zhǎng)抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對(duì)照組吸光度值）×100%，計(jì)算CD90+細(xì)胞和CD90-細(xì)胞對(duì)順鉑和阿霉素的生長(zhǎng)抑制率。以藥物濃度為橫坐標(biāo)，生長(zhǎng)抑制率為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞的劑量-效應(yīng)曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著順鉑和阿霉素濃度的增加，CD90+細(xì)胞和CD90-細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率均逐漸升高。然而，在相同藥物濃度下，CD90+細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率明顯低于CD90-細(xì)胞。當(dāng)順鉑濃度為20μmol/L時(shí)，CD90+細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率為（30±5）%，而CD90-細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率達(dá)到了（60±8）%。當(dāng)阿霉素濃度為4μg/mL時(shí)，CD90+細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率為（35±6）%，CD90-細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率則為（70±10）%。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩者之間的差異具有顯著性（P<0.05）。進(jìn)一步計(jì)算細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50），結(jié)果表明，CD90+細(xì)胞對(duì)順鉑的IC50值為（35±5）μmol/L，對(duì)阿霉素的IC50值為（6±1）μg/mL；而CD90-細(xì)胞對(duì)順鉑的IC50值為（15±3）μmol/L，對(duì)阿霉素的IC50值為（2±0.5）μg/mL。這表明CD90+細(xì)胞對(duì)順鉑和阿霉素具有更強(qiáng)的耐受性，即耐藥性更強(qiáng)。CD90+細(xì)胞較強(qiáng)的耐藥性可能與其內(nèi)部的耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)和信號(hào)通路調(diào)控密切相關(guān)。研究表明，CD90+細(xì)胞中某些耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)上調(diào)，如P-糖蛋白（P-gp）、多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP）等。P-gp是一種ATP依賴性的藥物外排泵，能夠?qū)⑦M(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的化療藥物泵出細(xì)胞外，從而降低細(xì)胞內(nèi)藥物的濃度，導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。CD90+細(xì)胞中P-gp的高表達(dá)，可能是其對(duì)順鉑和阿霉素耐藥的重要原因之一。CD90+細(xì)胞中一些信號(hào)通路的激活也可能促進(jìn)其耐藥性。PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞的存活、增殖和耐藥性中起著重要作用。在CD90+細(xì)胞中，PI3K/Akt信號(hào)通路可能被激活，導(dǎo)致下游的一些耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)，從而增強(qiáng)細(xì)胞的耐藥性。深入研究這些耐藥相關(guān)蛋白和信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制，將有助于進(jìn)一步揭示CD90+細(xì)胞耐藥性增強(qiáng)的本質(zhì)原因，為開發(fā)克服CD90+細(xì)胞耐藥性的治療策略提供理論依據(jù)。六、結(jié)果與討論6.1分選及培養(yǎng)結(jié)果總結(jié)通過免疫磁珠間接標(biāo)記法，成功從人肝癌細(xì)胞系7721中分離出CD90+細(xì)胞。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分選后的CD90+細(xì)胞純度可達(dá)85%以上，表明該分選方法具有較高的準(zhǔn)確性和可靠性。分選得到的CD90+細(xì)胞經(jīng)過單克隆化培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。在單克隆化培養(yǎng)過程中，通過有限稀釋法成功獲得了多個(gè)單克隆細(xì)胞集落，這些集落能夠穩(wěn)定傳代，為后續(xù)研究提供了均一的細(xì)胞群體。在傳代培養(yǎng)過程中，細(xì)胞保持了較高的增殖活性，每2-3天即可傳代一次。對(duì)培養(yǎng)后的CD90+細(xì)胞進(jìn)行干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)分析，結(jié)果顯示，CD90+細(xì)胞中CD90的陽性表達(dá)率高達(dá)95%以上，進(jìn)一步驗(yàn)證了分選的準(zhǔn)確性。CD133在CD90+細(xì)胞中的陽性表達(dá)率為30%-40%，表明部分CD90+細(xì)胞同時(shí)具有CD133陽性的干細(xì)胞特性。CD34在CD90+細(xì)胞中的陽性表達(dá)率較低，約為5%-10%，CD45在CD90+細(xì)胞中的表達(dá)呈陰性，說明CD90+細(xì)胞并非造血細(xì)胞，具有典型的肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)特征。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)CD90+細(xì)胞中17個(gè)肝癌相關(guān)基因的表達(dá)水平，結(jié)果表明，AFP、CCNA2等基因在CD90+細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，而PTEN基因表達(dá)下調(diào)。AFP作為肝癌的特異性標(biāo)志物，其在CD90+細(xì)胞中的高表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了CD90+細(xì)胞與肝癌細(xì)胞的密切關(guān)系。CCNA2基因參與細(xì)胞周期的調(diào)控，其在CD90+細(xì)胞中的高表達(dá)可能與細(xì)胞的增殖活性增強(qiáng)有關(guān)。PTEN基因是一種重要的抑癌基因，其在CD90+細(xì)胞中的低表達(dá)可能導(dǎo)致細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力增強(qiáng)，從而促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展。6.2結(jié)果分析與討論本研究成功從人肝癌細(xì)胞系7721中分離出CD90+細(xì)胞，并對(duì)其生物學(xué)特性和功能進(jìn)行了初步研究。分選結(jié)果表明，免疫磁珠間接標(biāo)記法能夠有效地富集CD90+細(xì)胞，獲得較高純度的目標(biāo)細(xì)胞群體。這為后續(xù)深入研究CD90+細(xì)胞的特性和功能提供了可靠的實(shí)驗(yàn)材料。通過干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)分析和肝癌相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CD90+細(xì)胞具有典型的干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)特征，且部分肝癌相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生顯著變化。這些結(jié)果提示CD90+細(xì)胞可能在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。在功能特性研究方面，CD90+細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)的增殖能力、克隆形成能力和對(duì)化療藥物的耐受性。其增殖能力增強(qiáng)可能與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)有關(guān)，如CCNA2基因。克隆形成能力的增強(qiáng)可能與干細(xì)胞自我更新相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)有關(guān)，如SOX2、OCT4等基因。耐藥性的增強(qiáng)可能與耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)上調(diào)以及信號(hào)通路的激活有關(guān)，如P-糖蛋白（P-gp）、多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP）的高表達(dá)，以及PI3K/Akt信號(hào)通路的激活。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證實(shí)了CD90+細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞的特性，可能是肝癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源。本研究結(jié)果對(duì)于深入理解肝癌的發(fā)生機(jī)制具有重要意義。腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為，腫瘤干細(xì)胞是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素。本研究中CD90+細(xì)胞所表現(xiàn)出的特性，與腫瘤干細(xì)胞的特征高度吻合。這表明CD90+細(xì)胞極有可能是肝癌干細(xì)胞的重要組成部分，它們可能通過自我更新和分化，不斷產(chǎn)生新的腫瘤細(xì)胞，從而推動(dòng)肝癌的發(fā)展。CD90+細(xì)胞中某些基因的異常表達(dá)，可能導(dǎo)致細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程的失衡，進(jìn)而促進(jìn)肝癌的發(fā)生。深入研究CD90+細(xì)胞在肝癌發(fā)生機(jī)制中的作用，有助于揭示肝癌的發(fā)病本質(zhì)，為肝癌的治療提供新的理論依據(jù)。從臨床應(yīng)用角度來看，本研究結(jié)果也為肝癌的治療提供了新的靶點(diǎn)和策略。由于CD90+細(xì)胞具有較強(qiáng)的耐藥性，傳統(tǒng)的化療方法往往難以將其徹底清除，這也是肝癌治療后容易復(fù)發(fā)的重要原因之一。因此，針對(duì)CD90+細(xì)胞的特異性治療策略具有重要的臨床意義。開發(fā)靶向CD90+細(xì)胞的藥物或治療方法，可能能夠更有效地根除肝癌干細(xì)胞，降低肝癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，提高肝癌患者的生存率和生活質(zhì)量。利用免疫治療的方法，如制備抗CD90抗體，特異性地殺傷CD90+細(xì)胞；或者開發(fā)針對(duì)CD90+細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵信號(hào)通路的抑制劑，阻斷其增殖和轉(zhuǎn)移的信號(hào)傳導(dǎo)。這些治療策略的開發(fā)和應(yīng)用，將為肝癌的臨床治療帶來新的希望。本研究仍存在一定的局限性。在分選方法上，雖然免疫磁珠間接標(biāo)記法能夠獲得較高純度的CD90+細(xì)胞，但該方法操作相對(duì)復(fù)雜，且對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備和技術(shù)要求較高。在后續(xù)研究中，可以進(jìn)一步探索更加簡(jiǎn)便、高效的分選方法，以提高分選效率和細(xì)胞活性。本研究?jī)H對(duì)CD90+細(xì)胞的部分生物學(xué)特性和功能進(jìn)行了初步研究，對(duì)于CD90+細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的作用，以及其與其他細(xì)胞之間的相互作用機(jī)制，還需要進(jìn)一步深入探究。未來的研究可以利用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，如小鼠移植瘤模型，更加全面地研究CD90+細(xì)胞在肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機(jī)制。同時(shí)，結(jié)合多組學(xué)技術(shù)，如轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等，深入分析CD90+細(xì)胞的分子特征，為肝癌的治療提供更多的靶點(diǎn)和策略。6.3研究的局限性與展望本研究在樣本數(shù)量和研究深度方面存在一定局限性。從樣本數(shù)量來看，本研究?jī)H選用了人肝癌細(xì)胞系7721作為研究對(duì)象，樣本來源相對(duì)單一。雖然7721細(xì)胞系在肝癌研究中被廣泛應(yīng)用，具有一定的代表性，但不同來源的肝癌細(xì)胞系在生物學(xué)特性和基因表達(dá)譜等方面可能存在差異。為了更全面、準(zhǔn)確地揭示CD90+細(xì)胞的特性和功能，未來研究應(yīng)納入更多不同來源的肝癌細(xì)胞系，如HepG2、Huh7等。同時(shí)，還應(yīng)結(jié)合臨床肝癌組織樣本，進(jìn)一步驗(yàn)證研究結(jié)果的普遍性和可靠性。通過對(duì)多種樣本的研究，可以更好地了解CD90+細(xì)胞在不同肝癌背景下的特性差異，為肝癌的精準(zhǔn)治療提供更有力的依據(jù)。在研究深度上，本研究?jī)H對(duì)CD90+細(xì)胞的部分生物學(xué)特性和功能進(jìn)行了初步探究。對(duì)于CD90+細(xì)胞的分化潛能，本研究尚未進(jìn)行深入研究。肝癌干細(xì)胞的多向分化潛能是其重要特性之一，深入研究CD90+細(xì)胞的分化潛能，對(duì)于理解肝癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移機(jī)制具有重要意義。未來研究可以利用體外誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)，觀察CD90+細(xì)胞