DB44032020-11-23發(fā)布深圳市市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布I 1 1 1 3 3 4 6 9 201人源腫瘤細(xì)胞系建立技術(shù)規(guī)范本文件確立了人源腫瘤細(xì)胞系建立過(guò)程中樣本獲取、細(xì)胞建系以及質(zhì)量檢測(cè)的操作程序和一般原SZDB/Z238短串聯(lián)重復(fù)序列基因分型法鑒定人源細(xì)胞系2密度梯度離心densitygradientcentrifu懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過(guò)重力或離心力場(chǎng)的作用使細(xì)胞分層、分離細(xì)胞接種動(dòng)物后在注射部位和（或）轉(zhuǎn)移部位由接種細(xì)胞本身形成腫遺傳信息的載體，由DNA、RNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成的，其形態(tài)和數(shù)目具有種注：在細(xì)胞間期核中，以染色質(zhì)絲形式存在。在細(xì)胞分裂時(shí)，染色質(zhì)絲經(jīng)過(guò)螺旋化、折疊、包裝成為染色體，為核型分析karyotypeana3通過(guò)DNA互補(bǔ)雙鏈解鏈、退火和聚合延伸的多次循環(huán)來(lái)擴(kuò)增DNA特定將免疫學(xué)方法(抗原抗體特異結(jié)合)與熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合起來(lái)研究特異蛋白抗原在細(xì)胞分布細(xì)胞半數(shù)致瘤量50%tumorprodu4縮略語(yǔ)BPV：牛細(xì)小病毒（BovineparvovirCMV：巨細(xì)胞病毒（CytomegalovDMSO：二甲基亞砜(DimethylSulfoxiDNA：脫氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAciEBV：人類皰疹病毒四型（Epstein—BarrvEDTA：乙二胺四乙酸（EthylenediaminetetraaceticAHBV：乙型肝炎病毒（HepatitisBViruHCV：丙型肝炎病毒（HepatitisCViruHIV：人類免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyViruHTLV：人類嗜T細(xì)胞病毒（HumanT—lymphotropicVirPBS：磷酸鹽緩沖溶液（PhosphateBufferSaliPCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReactPPV：豬細(xì)小病毒（PorcineParvoviRNA：核糖核酸（Ribonucleic5.1倫理審批和知情同意45.1.1樣本采集前應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的準(zhǔn)備工作，嚴(yán)格設(shè)計(jì)樣本采集方案，并按照樣本采集方的倫理審查要5.1.2樣本采集應(yīng)遵循“知情同意、自愿”的原則。工作人員（包括醫(yī)生、樣本操作技術(shù)人員等）應(yīng)與捐贈(zèng)者溝通，詳細(xì)講解項(xiàng)目背景、意義，采集的樣本量、用途、潛在風(fēng)險(xiǎn)以及捐贈(zèng)的權(quán)利、義務(wù)5.2信息收集5.2.1樣本采集前應(yīng)收集捐贈(zèng)者信息，包括但不限于姓名、年齡、性別、住院號(hào)、病歷號(hào)等基本信息及既往病史、家族史、用藥史、過(guò)敏史等臨床信息。捐獻(xiàn)者基本信息表參見附5.2.2樣本采集后應(yīng)詳細(xì)記錄所采集的腫瘤樣本信5.2.3應(yīng)建立嚴(yán)格有效的樣本捐獻(xiàn)者信息保護(hù)制度，對(duì)捐獻(xiàn)者健康信息的隱私權(quán)加以保護(hù)。5.3供體篩選5.3.1用于腫瘤細(xì)胞分離培養(yǎng)的組織應(yīng)進(jìn)行篩選，宜排除下列情況的供體：5.4樣本采集前準(zhǔn)備5.4.2采集前應(yīng)先準(zhǔn)備所需的儀器、試劑和耗材，并確認(rèn)儀器可以正常使用。主要儀器耗材列表見附錄C。5.5樣本采集5.5.1.1樣本應(yīng)首先滿足捐贈(zèng)者的診斷和治療需求，剩余樣本才能用于建立腫瘤細(xì)胞系。5.5.1.2應(yīng)采集具有典型生物學(xué)特征的腫瘤組織、癌旁組織和正常組織，實(shí)體瘤樣本的直徑宜不低于當(dāng)胸腹水樣本中存在較多腫瘤細(xì)胞時(shí)，可在無(wú)菌條件下抽取5.6樣本保存與運(yùn)輸5.6.2實(shí)體瘤樣本保存和運(yùn)輸時(shí)間應(yīng)不超過(guò)12h，運(yùn)輸溫度4℃~10℃。胸腹水樣本處理保存與運(yùn)輸5濃度二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h～4h。6.1.2.4將培養(yǎng)瓶輕輕平放，加入完全培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中繼6.1.3.1充分去除血液、脂肪、6.2.2細(xì)胞培養(yǎng)12h～72h，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行首次換液，去除脫落的組織塊和未貼壁細(xì)胞。6.3.1腫瘤細(xì)胞的純化宜采用機(jī)械刮除法、反復(fù)貼壁法、消化排除法、密度梯度離心法中的一種或多6.3.2.2棄掉培養(yǎng)液，顯微鏡下采用無(wú)菌細(xì)胞刮刮除無(wú)標(biāo)記區(qū)域的雜細(xì)胞；采用平衡鹽溶液清洗雜細(xì)66.3.3.2收集未貼壁的腫瘤細(xì)胞懸液，接種至新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)5min～20min。6.3.4.2采用平衡鹽溶液清洗處理后，更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，若雜細(xì)胞未被除凈，宜再次重復(fù)處6.5.4凍存管宜放入程序降溫盒中，置于-80℃冰箱過(guò)夜。亦或遵循程序降溫原則采用程序降溫儀將細(xì)胞梯度降溫至-80℃。亦或?qū)⒓?xì)胞置于含速凍保存液的微毛細(xì)管中，直接放置于液氮保存。降溫完宜采用脫氧核糖核酸（DNA）條形碼分析或同工酶法。DNA條形表見附錄F。細(xì)胞流式分析前處理宜依據(jù)特異性抗體說(shuō)明書進(jìn)行，流式細(xì)胞儀操作宜參考YY/T077.1.2.1細(xì)胞存活率宜采用臺(tái)盼藍(lán)染色法，通過(guò)手動(dòng)計(jì)數(shù)或自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行檢測(cè)。手動(dòng)計(jì)數(shù)檢測(cè)細(xì)胞存活率宜參考附錄G，自動(dòng)計(jì)數(shù)儀檢測(cè)細(xì)胞存活率宜依據(jù)儀7.1.2.2腫瘤細(xì)胞系凍存前的存活檢測(cè)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)操作宜參考YY/T0588；腫瘤細(xì)胞系任意單個(gè)標(biāo)記物陽(yáng)性率應(yīng)不低于90%，任意雙標(biāo)記物共陽(yáng)性率應(yīng)不低于7.1.4.1新建腫瘤細(xì)胞系宜進(jìn)行細(xì)胞倍增動(dòng)物細(xì)胞基質(zhì)制備及質(zhì)量控制”關(guān)于群體倍增水平計(jì)算的規(guī)定進(jìn)行檢測(cè)，并記錄于細(xì)胞生物學(xué)特征檔宜依據(jù)ISCN2013建立的G顯帶法或Q顯帶法對(duì)細(xì)胞染色體進(jìn)行分析和描述，并記錄于細(xì)胞生物7.1.7.2成瘤性檢測(cè)宜依據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典（三部）》（2020年版）生物制品通則4實(shí)施。7.1.7.3對(duì)檢測(cè)后具有成瘤性的腫瘤細(xì)胞，需釆用定量的方法進(jìn)一步分析細(xì)胞成瘤性的大小，并計(jì)算7.2.1.1細(xì)胞系在凍存前應(yīng)進(jìn)行7.2.1.3腫瘤細(xì)胞系的無(wú)菌檢測(cè)結(jié)果87.2.3.1使用含牛源和豬源生物制品而新建的細(xì)胞系應(yīng)進(jìn)HBV、HCV進(jìn)行檢測(cè)；宜采用經(jīng)批準(zhǔn)的基于酶聯(lián)免疫法檢測(cè)的酶聯(lián)免疫試劑盒對(duì)HTLV—1/2、EBV、CMV7.2.3.3宜采用經(jīng)批準(zhǔn)的基于酶聯(lián)免疫法檢測(cè)的酶聯(lián)免疫試劑盒對(duì)豬細(xì)小病毒或牛細(xì)小病毒進(jìn)行檢7.2.3.4除特殊研究要求外（如研究材料即為攜帶致病因子的細(xì)胞），細(xì)胞系內(nèi)與外源病毒因子檢測(cè)9簡(jiǎn)要病情及手術(shù)原因介紹:）：冷藏冰箱（2℃~8℃)冷藏冰箱（2℃~8℃)冷凍離心機(jī)（-20℃~40℃；最高離心力達(dá)15000g以上）D.3.1用50mL離心管，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，并用平衡鹽溶液清洗細(xì)胞1～2次，以免剩余培養(yǎng)液影響胰D.3.2向瓶?jī)?nèi)加入1mL消化液（含0.05%～0.25%Trypsin—EDTA置于37℃下進(jìn)行消化1min～3min，消化期后把培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察，當(dāng)發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大后，立即終止消D.3.3向細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)用移液管加入等D.3.4使用吸管，吸取瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，按順序反復(fù)輕輕吹打瓶壁細(xì)胞，使之從瓶壁脫離形成細(xì)胞D.3.5用吸管轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液至離心管中，以300g～500g轉(zhuǎn)速離心5min。D.3.6去掉細(xì)胞上清液，加入適量平衡鹽溶液清洗細(xì)胞2～3次，采用臺(tái)盼藍(lán)染色進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和檢D.3.7去掉細(xì)胞上清液，在離心管中加入3mL完全D.3.9根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的狀態(tài)進(jìn)行換液。一般2～3天后應(yīng)換一次培養(yǎng)液。待細(xì)胞長(zhǎng)至85%以上融合度，最高離心力達(dá)15000g以上）、生物安全柜、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、凝膠器、電子天平（0.1mg～220g）、4℃冰箱、pH計(jì)（分辨率：0.001pH；玻璃電極）、微波爐、多用電1mol/L乳酸鈉1mL，0.1mol/L氯化鈉（NaCl）0.5mL，0.5mol/L的三羥甲基氨基甲烷—鹽酸（Tris—HClpH8.0）1.5mL，加水定容至10mL。E.2.4葡萄糖—6—磷酸脫氫酶（G煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）3mg，噻唑藍(lán)溴化四唑（MTT）2mg，吩嗪硫酸甲酯（PMS）0.4mg，葡萄糖—6—磷酸脫氫酶(G6PD)50mg，氯化鎂（MgCL2）10mg，0.5mol/L的三羥甲基氨基甲烷—鹽酸（Tris—HClpH8.0）2mL，加水定容10mL?！狧C1（pH7.5）1mL，加水E.3.1.1將待檢腫瘤細(xì)胞系、人源標(biāo)準(zhǔn)參考細(xì)胞系分別在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，當(dāng)生長(zhǎng)至鋪滿瓶底時(shí)，吸出2mL含10％小牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基終止胰蛋白酶的作用，并將其轉(zhuǎn)移E.3.1.3300g離心10min，棄去上清，加E.3.1.4估算細(xì)胞的體積，加等體積的細(xì)胞裂解液，室溫反應(yīng)2min～3min，冰上反應(yīng)30min，4℃,E.3.2.1將2片0.175mm厚的市售透明膠片夾在兩塊膠槽中問，用文件夾將膠槽和膠E.3.2.2將瓊脂糖凝膠用注射器緩緩從膠槽上的小孔注入膠槽與膠片之間，注入凝膠時(shí)注意避免氣泡E.3.3.1小心將凝膠剝離膠板，將載有凝膠的膠片放入電泳槽內(nèi)，然后將細(xì)胞裂解上清液按照每孔1E.3.3.2乳酸脫氫酶電泳電壓為95V，電泳時(shí)間為1.5h；葡萄糖—6—磷酸脫氫酶電泳電壓為90V，電泳時(shí)間為1h；核苷酸磷酸脫氫酶電泳電壓為85V，電泳時(shí)間為1h。為保證同工酶的活性，電泳過(guò)程E.3.4.1停止電泳后，取出凝膠膠片，放置在暗盒內(nèi)，注入3mL～5mL對(duì)應(yīng)底物的顯色液，37℃反應(yīng)E.3.4.2酶譜出現(xiàn)后，在清水中清洗E.4.1若待檢細(xì)胞與標(biāo)準(zhǔn)參考細(xì)胞的三種同工酶條帶數(shù)目均相同，且條帶的遷移距離與標(biāo)準(zhǔn)參考細(xì)胞E.4.2若待檢細(xì)胞與標(biāo)準(zhǔn)參考細(xì)胞的三種同工酶條帶數(shù)目相同，但條帶的遷移距離與標(biāo)準(zhǔn)參考細(xì)胞不E.4.3若待檢細(xì)胞與標(biāo)準(zhǔn)參考細(xì)胞的三種同工酶條帶數(shù)目不同，判定待檢細(xì)胞系存在種屬間細(xì)胞交叉CYFRA21—1、NSE、SCC、CECEA、Ki67、CK20、CK7、CAG.4.1對(duì)于懸浮細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，充分清洗后，用適當(dāng)緩沖液如PBS，重懸制成單細(xì)胞G.4.2取0.5mL單細(xì)胞懸液，按照1:1比例與0.5mL濃度為0.4%的臺(tái)盼藍(lán)染色液充分混勻，室溫染色3G.4.3取少量上述染色細(xì)胞加入血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，于顯微鏡低倍鏡下計(jì)數(shù)，分別計(jì)算著色細(xì)胞（即損傷V——細(xì)胞懸液體積（mL）；二氧化碳培養(yǎng)箱（溫度：5℃~65℃,容積不小于80L）、離心機(jī)（溫度：-20℃~40℃；最高離75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶、腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血H.3.1腫瘤細(xì)胞系凝集試驗(yàn)設(shè)計(jì)包括空包對(duì)照組、腫瘤細(xì)胞系的試驗(yàn)組和人成纖維細(xì)胞的陰性對(duì)照組。刀豆蛋白濃度梯度包括0μg/mL、12.5μg/H.3.2取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的腫瘤細(xì)胞，采用傳統(tǒng)胰酶消化法收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/H.3.3向若干凹孔板凹中加細(xì)胞懸液，每凹孔加0.1mL，再分別加入刀豆蛋白—PBS溶液0.1mL，使刀豆蛋白的最終濃度依次為：100μg/mLH.3.4置微型振蕩器上振蕩混勻，靜止5min～10min，觀察凝集現(xiàn)象。H.4.1若空白對(duì)照和陰性對(duì)照組在刀豆蛋白低濃度（小于50μg/mL）均無(wú)凝集現(xiàn)象產(chǎn)生，判斷該試驗(yàn)H.4.2在試驗(yàn)有效的前提下，觀察腫瘤細(xì)胞系檢測(cè)組發(fā)生凝集反應(yīng)的刀豆蛋白濃度，記錄試驗(yàn)數(shù)據(jù)并），[4]郭建華,張吉才,李曉強(qiáng),等.胸腹水細(xì)胞學(xué)前檢查各環(huán)節(jié)因素分析[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,AmericanJournalofPathologycancercelllines[J].Oncogen[10]ANSI/ATCC,AuthenticationofHumanCellLinpredictivemodellingofanticancerdrugsensitivity.[J].Nature,2012,483(7391):603.Cancerresearch,2007Cancer