ICS65.020.20CCSB6154IDB54/T0489.3—XXXX前言 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語(yǔ)和定義 4場(chǎng)地要求 25培養(yǎng)基配制 26組織培養(yǎng) 37煉苗移栽 4 49建檔 5附錄A（資料性）MS培養(yǎng)基配制 6附錄B（規(guī)范性）瓶苗質(zhì)量分級(jí)表 7附錄C（規(guī)范性）病蟲(chóng)害防治表 8附錄D（規(guī)范性）出圃苗質(zhì)量分級(jí)表 9參考文獻(xiàn) DB54/T0489.3—XXXX本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專(zhuān)利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專(zhuān)利的責(zé)任。本文件由西藏自治區(qū)林業(yè)和草原標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)提出并歸口。本文件起草單位：中國(guó)電建集團(tuán)成都勘測(cè)設(shè)計(jì)研究院有限公司、國(guó)家林業(yè)和草原局中南調(diào)查規(guī)劃院、四川省林業(yè)科學(xué)研究院、拉薩市林業(yè)和草原局林業(yè)勘察設(shè)計(jì)所本文件主要起草人：馬建華、欒麗、姜躍良、左有璐、劉盛赟、胡雪柳、程海燕、唐宇軒、何建良、劉洪強(qiáng)、李丕軍、汪詩(shī)平DB54/T0489.3—XXXX巨柏（學(xué)名：CupressusgiganteaChengetL.K.Fu）是國(guó)家一級(jí)保護(hù)野生植物，已被列入《中——易危（VU）種，巨柏同時(shí)也是雅江特有種。根據(jù)巨柏年齡情況分析研究，現(xiàn)有雅江分布的巨柏多為100年以上的古樹(shù)。開(kāi)展巨柏?zé)o性繁殖技術(shù)研究并形成技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，能較好的保留母本遺傳資源。同時(shí)，巨柏是西藏自治區(qū)較好的造林樹(shù)種和綠化樹(shù)種，開(kāi)展相關(guān)研究并建立技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)能夠?yàn)榫薨氐馁Y源開(kāi)發(fā)利用提供技術(shù)支撐。本文件擬由三個(gè)部分組成。——第1部分：嫁接。目的在于確定巨柏嫁接繁殖的相關(guān)技術(shù)操作規(guī)程。——第2部分：扦插。目的在于確定巨柏扦插繁殖的相關(guān)技術(shù)操作規(guī)程?！?部分：組培。目的在于確定巨柏組培繁殖的相關(guān)技術(shù)操作規(guī)程。巨柏的嫁接、扦插、組培三種方式同為無(wú)性繁殖技術(shù)方式，在巨柏的人工繁殖上根據(jù)材料來(lái)源、季節(jié)、成本、成品苗要求等可以選擇不同的繁殖方式。三種方式即為互補(bǔ)又協(xié)同，共同服務(wù)于巨柏的資源保護(hù)和種苗的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。DB54/T0489.3—XXXX1巨柏?zé)o性繁殖技術(shù)規(guī)程第3部分：組培本文件規(guī)定了巨柏組培快繁的場(chǎng)地要求、培養(yǎng)基配制、組織培養(yǎng)、煉苗移栽及出圃、建檔等。本文件適用于西藏自治區(qū)巨柏組培快繁育苗。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。3GB5749GB/T6001LY/T1882術(shù)語(yǔ)和定義生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)育苗技術(shù)規(guī)程林木組織培養(yǎng)育苗技術(shù)規(guī)程下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1柏科柏木屬喬木，高30m～45m，胸徑1m～3m.，稀達(dá)6m。產(chǎn)于西藏雅魯藏布江流域的郎縣、米林等地，甲格以西分布較多。[來(lái)源：中國(guó)植物志,有修改]3.2外植體用于植物組織培養(yǎng)的離體植物器官、組織、細(xì)胞以及原生質(zhì)體。[來(lái)源：LY/T1882]3.3培養(yǎng)基根據(jù)植物營(yíng)養(yǎng)原理和植物組織培養(yǎng)的要求人工配制的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。[來(lái)源：LY/T1882]3.4接種在無(wú)菌條件下將經(jīng)體表滅菌后的外植體置入培養(yǎng)基的過(guò)程。[來(lái)源：LY/T1882]3.5繼代培養(yǎng)外植體經(jīng)初代培養(yǎng)后，再次以及以后各次接種于新培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)的過(guò)程。DB54/T0489.3—XXXX24場(chǎng)地要求4.1組培室4.1.1操作間操作間主要進(jìn)行培養(yǎng)基和培養(yǎng)母液的配制及培養(yǎng)基滅菌工作?？杉?xì)分為儲(chǔ)藏室，稱(chēng)量室，操作室，滅菌室，培養(yǎng)基儲(chǔ)藏室。配制培養(yǎng)基所需化學(xué)試劑為附錄A所列及氫氧化鈉（Sodiumhydroxide，NaOH鹽酸（Hydrochloricacid，HCl），蔗糖，瓊脂等化學(xué)試劑。4.1.2緩沖間是從外部環(huán)境到內(nèi)部潔凈環(huán)境的過(guò)度空間。包括風(fēng)淋室和操作人員的清洗、換衣設(shè)備。所需的儀器設(shè)備為風(fēng)淋室。4.1.3接種室是開(kāi)展巨柏組培苗滅菌、接種和繼代工作的空間。要求為無(wú)菌潔凈空間。4.1.4培養(yǎng)間是巨柏組培苗進(jìn)行培養(yǎng)生長(zhǎng)的空間。要求能控溫控濕，并控制光培養(yǎng)和暗培養(yǎng)的時(shí)間，為無(wú)菌潔凈空間。4.2煉苗區(qū)是巨柏組培瓶苗材料移栽前的過(guò)度空間。搭建蔭棚，有遮蔭噴水設(shè)施。保持溫度37℃以下，濕度50%以上。4.3苗圃栽植床排水良好，栽植床采用深溝高畦，畦寬1.6m～2.0m，溝深20cm～30cm，寬20cm，溝與溝之間相連，利于排水。應(yīng)有定時(shí)噴灌設(shè)施，排水設(shè)施，降溫設(shè)施，增溫設(shè)施，補(bǔ)光設(shè)施。大田苗床須搭建小拱棚，保持溫度25℃~30℃,濕度85%以上。苗圃的建設(shè)按照GB/T6001的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。5培養(yǎng)基配制5.1培養(yǎng)容器和接種器械的清洗使用洗滌劑浸泡30min后，對(duì)培養(yǎng)容器和接種器械進(jìn)行刷洗，采用清水清洗3遍后干燥備用。清水標(biāo)準(zhǔn)參照GB5749生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。5.2培養(yǎng)基配制5.2.1培養(yǎng)基母液的配制培養(yǎng)基采用Murashige和Skoog（MurashigandSkoogMedium，MS）基本培養(yǎng)基，所需各元素見(jiàn)附錄A。配制方法按照LY/T1882的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。5.2.2激素母液配制DB54/T0489.3—XXXX3激素采用萘乙酸（1-Naphthaleneaceticacid，NAA）和吲哚-3NAA和IAA激素母液配制方法為：使用電子天平稱(chēng)取100mg激素原裝粉末，使用95%酒精預(yù)溶，在100ml容量瓶中加入超純水定容，蓋上蓋子后上下?lián)u晃15次以上，配制成1mg/ml的激素母液放置于100ml避光玻璃容器中備用。5.2.3初代培養(yǎng)基的配制初代培養(yǎng)基配方為MS培養(yǎng)基。用1mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值為6.5.分裝至240ml組培瓶中。配制方法按照LY/T1882的4.2.1培養(yǎng)基配制的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。5.2.4繼代培養(yǎng)基的配制繼代培養(yǎng)基配方為MS+0.3mg/LNAA+0.05mg/LIAA。用氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值為6.5，分裝至240ml組培瓶中。配制方法按照LY/T1882的4.2.1培養(yǎng)基配制的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。5.2.5生根培養(yǎng)基的配制生根培養(yǎng)基配方為MS+0.3mg/LNAA+0.05mg/LIAA。用1mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值為6.5.分裝至240ml組培瓶中。配制方法按照LY/T1882的4.2.1培養(yǎng)基配制的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。5.3培養(yǎng)基滅菌將分裝好的培養(yǎng)基放入滅菌鍋中，在121℃,0.5MPa的環(huán)境中滅菌25min后，冷卻凝固后，保存在無(wú)菌環(huán)境中備用。6組織培養(yǎng)6.1外植體來(lái)源選用巨柏健康植株上的種子。6.2外植體準(zhǔn)備6.2.1采集a)巨柏為國(guó)家一級(jí)保護(hù)野生植物，外植體的采集應(yīng)按程序辦理并獲得“采集證”。b)外植體的采集時(shí)間為晴天。選用生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害母株的果實(shí)，晾曬脫殼后獲得巨柏種子。c)以生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)浸泡種子，去掉水面漂浮種子，下沉種子晾干備用。6.2.2預(yù)處理將種子用紗布包裹，在流水下沖洗30min～120min。用干紗布吸水濾干備用。6.2.3表面消毒將處理好的種子在超凈工作臺(tái)上，用75%的酒精處理60s，無(wú)菌后的超純水清洗兩遍，再用30%次氯酸鈉處理10min，無(wú)菌水清洗5遍后，用無(wú)菌濾紙吸干多余水分備用。6.3初代培養(yǎng)DB54/T0489.3—XXXX4在超凈工作臺(tái)上，將滅菌好的種子平放于初代培養(yǎng)基中，使種子平鋪于培養(yǎng)基之上。選用240ml的組培瓶進(jìn)行初代培養(yǎng)，每瓶培養(yǎng)基20ml～30ml，接種密度為5株/瓶。在光照2000Lux，光培養(yǎng)/暗培養(yǎng)為14h/10h，溫度24℃±2℃,濕度70%±10%的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)周期40d。6.4繼代培養(yǎng)待萌發(fā)的無(wú)菌苗長(zhǎng)至8cm以上，在超凈工作臺(tái)上將無(wú)菌苗剪成2cm左右的帶芽莖段，接種到增殖培養(yǎng)基上。選用240ml的組培瓶進(jìn)行繼代增殖，每瓶培養(yǎng)基20ml～30ml，接種密度為5株/瓶，在光照2000Lux，光培養(yǎng)/暗培養(yǎng)為14h/10h，溫度24℃±2℃,濕度70%±10%的培養(yǎng)室中培養(yǎng)。增殖周期40d。6.5生根培養(yǎng)待增殖后的叢生芽單芽長(zhǎng)至3cm～5cm時(shí)，在超凈工作臺(tái)上切割單芽或莖段轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基上，切割長(zhǎng)度3cm以上。在光照2000Lux，光培養(yǎng)/暗培養(yǎng)為14h/10h，溫度24℃±2℃,濕度70%±10%的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)20d～30d。7煉苗移栽7.1煉苗選取高度7cm左右生根組培苗，單株根系數(shù)和葉片數(shù)均為5以上的組培苗進(jìn)行煉苗。組培瓶苗的質(zhì)量分級(jí)見(jiàn)附錄B。在煉苗區(qū)先閉瓶煉苗7d，再開(kāi)瓶煉苗5d。7.2移栽a)取出組培苗，用生活飲用水洗去基部培養(yǎng)基，用1g/L多菌靈浸泡3s～5s后移栽至苗床或育苗容器中，移栽基質(zhì)為V泥炭土：V珍珠巖=2：1的輕基質(zhì)。b)移栽后噴足定根水，遮蔭保濕，防止前期高溫灼傷，后期逐漸放寬溫光條件，使其與外界環(huán)境一致。每隔5d～7d用1g/L的多菌靈或0.8g/L代森銨或0.6g/L百菌清等噴灑防病。7.3后期管理7.3.1水分管理移栽前期保持土壤濕潤(rùn)，不可偏干。夏季應(yīng)在早晚澆水，入秋后土壤稍干為宜，冬季盡量減少水分。7.3.2施肥管理移栽前期避免施肥，移栽一月后可視苗木情況適當(dāng)施肥。夏季以氮肥為主，秋季以磷、鉀混合肥為主。每隔30d～45d淋施一次。7.3.3病蟲(chóng)害管理按照附錄C的相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。8.1出圃要求a)苗高12cm以上，具10條以上完整根，根長(zhǎng)3cm以上。DB54/T0489.3—XXXX5b)要求苗生長(zhǎng)健壯，無(wú)病蟲(chóng)害，無(wú)黃葉、爛葉。c)出圃苗移栽時(shí)須保護(hù)好根系。8.2出圃苗質(zhì)量分級(jí)出圃苗的質(zhì)量分級(jí)見(jiàn)附錄C。9建檔9.1檔案內(nèi)容a)組培室基本情況b)組培育苗技術(shù)及管理措施、苗木產(chǎn)量質(zhì)量、苗木成本。c)各項(xiàng)試驗(yàn)設(shè)計(jì)、病蟲(chóng)害調(diào)查。9.2檔案記載和保存應(yīng)指定專(zhuān)人記錄并保存，積累數(shù)據(jù)，及時(shí)分析，為提高組培育苗技術(shù)和經(jīng)營(yíng)管理水平提供依據(jù)。DB54/T0489.3—XXXX6MS培養(yǎng)基配制下面給出了MS培養(yǎng)基的配制配方。表A.1MS培養(yǎng)基配制母液濃度NH4NO3MgSO4·7H2OKH2PO4H3BO3MnSO4·4H2OZnSO4·7H2ONa2MnO4·2H2OCoCl2·6H2OFeSO4·7H2ONa2-