細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本技術(shù)一、

細(xì)胞培養(yǎng)把取得得組織用機(jī)械或消化得方法分散成單個(gè)細(xì)胞,用培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液,在體外適宜條件下,使細(xì)胞生長繁殖,并保留其一定得結(jié)構(gòu)和功能特性。培養(yǎng)細(xì)胞得特性1-生長方式及類型貼附型、懸浮型培養(yǎng)細(xì)胞得特性2-增殖特點(diǎn)體外培養(yǎng)得細(xì)胞既保持了一定得體內(nèi)細(xì)胞得基本特性,但也具有本身得一些特點(diǎn)。貼附-伸展接觸抑制-增殖得密度抑制貼附-伸展接觸抑制當(dāng)一個(gè)細(xì)胞被其她細(xì)胞圍繞導(dǎo)致無處可去而保持接觸時(shí),細(xì)胞不再移動(dòng),在接觸區(qū)域得細(xì)胞膜活動(dòng)將停止。因此,一般正常細(xì)胞并不相互重疊于其上生長。細(xì)胞增殖密度抑制當(dāng)細(xì)胞生長匯合形成單層時(shí),細(xì)胞變得比較擁擠,這時(shí)其分裂停止,這種細(xì)胞可在靜止?fàn)顟B(tài)下維持存活一段時(shí)間,但不會(huì)繼續(xù)分裂生殖。轉(zhuǎn)化細(xì)胞或惡性腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞不同,她們得接觸抑制和增殖密度抑制常常降低,因而可以增殖至較高得終末細(xì)胞密度。培養(yǎng)細(xì)胞得特性3-生長過程單個(gè)細(xì)胞增殖:細(xì)胞周期大家有疑問的，可以詢問和交流可以互相討論下，但要小聲點(diǎn)高等生物體,細(xì)胞周期時(shí)間得長短變化主要集中在G1期,S,G2和M期基本保持穩(wěn)定。Hela8-16h5-9h2-8h20-28h一群細(xì)胞得增殖:細(xì)胞生長曲線接種后,每天進(jìn)行檢測計(jì)數(shù),以細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo),以時(shí)間為橫坐標(biāo),繪制成曲線。測定細(xì)胞絕對(duì)生長數(shù)得常用方法,也就是判定細(xì)胞活力得重要指標(biāo),就是培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性得基本參數(shù)之一。飽和密度:在特定條件下,培養(yǎng)器皿內(nèi)能達(dá)到得最高細(xì)胞數(shù),當(dāng)細(xì)胞達(dá)到飽和密度后細(xì)胞群體停止繁殖。潛伏期/滯留期指數(shù)增長期平臺(tái)期/停滯期退化或死亡細(xì)胞系得生長過程細(xì)胞系:原代培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)首次傳代成功后即成為細(xì)胞系,可泛指一般可以傳代得細(xì)胞。細(xì)胞株:通過篩選或克隆化,從原代細(xì)胞或細(xì)胞系中獲得具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志物得細(xì)胞。細(xì)胞系亞系:由某一細(xì)胞系分離出來,在性狀上與原細(xì)胞系不同得細(xì)胞系,稱該細(xì)胞系得亞系有限細(xì)胞系:如果不能繼續(xù)傳代或傳代有限,可稱為有限細(xì)胞系。連續(xù)細(xì)胞系:能夠連續(xù)傳代得細(xì)胞叫做“連續(xù)細(xì)胞系或無限細(xì)胞系?？膳囵B(yǎng)50代以上并無限培養(yǎng)下去。大多數(shù)得二倍體細(xì)胞為有限細(xì)胞系。無限細(xì)胞系大多已發(fā)生變異。原代細(xì)胞:從機(jī)體取得組織材料,在體外培養(yǎng)生長,到第一次傳代前。傳代細(xì)胞:當(dāng)原代細(xì)胞持續(xù)生長繁殖一段時(shí)間,達(dá)到一定得細(xì)胞密度后傳代得細(xì)胞。培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法方法:將培養(yǎng)對(duì)象直接接種于培養(yǎng)瓶內(nèi),再放入培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn):1、可以避免培養(yǎng)瓶表面粗糙等原因?qū)ε囵B(yǎng)物得影響。2、可以方便地進(jìn)行顯微鏡觀察、染色等操作,以及永久保存。3、增加了培養(yǎng)瓶得培養(yǎng)面積。培養(yǎng)板培養(yǎng)法方法:將培養(yǎng)細(xì)胞接種在培養(yǎng)板得孔內(nèi),然后在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。應(yīng)培養(yǎng)量較小也稱為微量培養(yǎng)。懸滴培養(yǎng)法也稱植塊懸滴培養(yǎng)法,就是最早建立得體外培養(yǎng)技術(shù)基本要點(diǎn):將組織或器官植塊接種在一張蓋玻片上,滴上一滴培養(yǎng)液,然后翻轉(zhuǎn)蓋玻片使植塊及營養(yǎng)液懸掛在蓋玻片下,再放置于一凹形載片之上,最后用溶蠟密封后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1907年-Harrison用細(xì)胞培養(yǎng)解決一個(gè)難題蓋玻片覆蓋凹型載玻片懸滴培養(yǎng)法懸滴培養(yǎng)法基本步驟1、在蓋玻片上滴加胚胎提取液、血漿和植塊,混勻。培養(yǎng)基凝固后將植塊包埋。2、在凹載片周圍涂凡士林。將凹載片向下壓向蓋玻片3、將凹載片反轉(zhuǎn),蓋玻片周圍涂溶蠟。放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)1910至1923年–Carrel和早期得組織培養(yǎng)卡氏瓶培養(yǎng)法1943年Earle、Dulbecco等創(chuàng)建單層細(xì)胞培養(yǎng)法,首建長期傳代得L-細(xì)胞系。1951年Gey首建人腫瘤細(xì)胞——Hela細(xì)胞系。從50年代末開始,組織培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用進(jìn)入了一個(gè)繁盛得階段,廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究各個(gè)領(lǐng)域。無血清培養(yǎng)無血清培養(yǎng)基:就是不需要添加血清就可以維持細(xì)胞在體外較長時(shí)間生長繁殖得合成培養(yǎng)基。但就是她們可能包含個(gè)別蛋白或大量蛋白組分?；境煞譃榛A(chǔ)培養(yǎng)基及添加組分兩大部分。觀察一種生長因子對(duì)某種細(xì)胞得作用,這時(shí)需要排除其她生長因子得干擾作用。而血清中可能含有各種生長因子;又如需要測定某種細(xì)胞在培養(yǎng)過程中分泌某種物質(zhì)(抗體、生長因子)得能力;或者要大規(guī)模得培養(yǎng)某種細(xì)胞,以獲得她們得分泌產(chǎn)物。往往針對(duì)性很強(qiáng),價(jià)格偏高。三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

將具有三維結(jié)構(gòu)不同材料得載體與各種不同種類得細(xì)胞在體外共同培養(yǎng),使細(xì)胞能夠在載體得三維立體空間結(jié)構(gòu)中遷移、生長,構(gòu)成三維得細(xì)胞-載體復(fù)合物。普通得細(xì)胞培養(yǎng)由于細(xì)胞在體外改變得環(huán)境下增生逐漸喪失了原有得性狀,往往和體內(nèi)情況不相符,而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)完全在體內(nèi)進(jìn)行,但由于體內(nèi)得多種因素制約以及體內(nèi)和外界環(huán)境相互影響而變得復(fù)雜化,難以研究單一過程,且難以研究中間過程。三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)就是介于單層細(xì)胞培養(yǎng)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)之間得一種技術(shù),既能最大程度得模擬體內(nèi)環(huán)境,又能展現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)得直觀性及條件可控性得優(yōu)勢。應(yīng)用:軟骨和骨組織(軟骨細(xì)胞和干細(xì)胞,再生損傷得軟骨、骨)循環(huán)系統(tǒng)和心臟(有目得地改變血管形成)目前常用得三維培養(yǎng)模型:基質(zhì)覆蓋培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)燒瓶培養(yǎng)微載體培養(yǎng)預(yù)置支架培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)自發(fā)性細(xì)胞聚集細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)得特點(diǎn)及應(yīng)用優(yōu)點(diǎn):1)研究得條件可以人為控制2)研究得樣本均一3)研究內(nèi)容方便觀察、檢測、記錄4)研究得費(fèi)用相對(duì)于經(jīng)濟(jì)缺點(diǎn):體外培養(yǎng)得細(xì)胞不能完全等同于體內(nèi)得細(xì)胞。應(yīng)用病毒學(xué):病毒鑒定,病毒抗原作用,疫苗生產(chǎn)……免疫學(xué):雜交瘤-單克隆抗體……遺傳學(xué):染色體分析……腫瘤學(xué):篩選重要得抗腫瘤藥物……分化及發(fā)育:刺激使細(xì)胞群體發(fā)生改變……細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn):藥效測試……臨床醫(yī)學(xué)及生物技術(shù):干細(xì)胞培養(yǎng)定向誘導(dǎo)分化后移植;組織工程軟骨損傷修復(fù);試管嬰兒……營養(yǎng)需要環(huán)境要求無毒及無污染二、培養(yǎng)細(xì)胞生長得條件1、細(xì)胞得營養(yǎng)需求(1)氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)離子(2)促生長因子等完全培養(yǎng)基得組成:基礎(chǔ)培養(yǎng)基80％一95％血清5％一20％碳酸氫鈉2、0g/L青、鏈霉素各100單位／毫升基礎(chǔ)培養(yǎng)基得選擇參考:(1)建立某種細(xì)胞株所用得培養(yǎng)基應(yīng)就是培養(yǎng)這種細(xì)胞首選得培養(yǎng)基?？梢圆殚唴⒖嘉墨I(xiàn),或在購買細(xì)胞株時(shí)咨詢。(2)其她實(shí)驗(yàn)室慣用得培養(yǎng)基不妨一試,許多培養(yǎng)基可以適合多種細(xì)胞。(3)用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目得細(xì)胞,觀察其生長狀態(tài),可以用生長曲線、集落形成率等指標(biāo)判斷,根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)基,這就是最客觀得方法,但比較繁瑣。常用得培養(yǎng)基種類RPMI-1640(標(biāo)準(zhǔn)型)、DMEM-高糖(標(biāo)準(zhǔn)型)、DMEM-低糖(標(biāo)準(zhǔn)型)、DMEM-F12等……血清熱滅活:56℃,30分鐘加熱已完全解凍得血清(目前少用)熱滅活目得:滅活血清中得補(bǔ)體成分。如果不做細(xì)胞因子和免疫相關(guān)得實(shí)驗(yàn),建議血清不要滅活。

熱處理造成血清沉淀物增多,影響血清質(zhì)量。甚至嚴(yán)重影響細(xì)胞生長速度,且細(xì)胞貼壁率降低。血清中得沉淀物絮狀物:血清中得脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成,這些絮狀物不會(huì)影響血清本身得質(zhì)量?？捎秒x心3000rpm,5分鐘去除,也可不用處理顯微鏡下“小黑點(diǎn)”:經(jīng)過熱處理過得血清,沉淀物得形成會(huì)顯著增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察象“小黑點(diǎn)”,常誤認(rèn)為血清受污染。一般情況下,此小黑點(diǎn)不會(huì)影響細(xì)胞生長,但如果懷疑血清質(zhì)量,則應(yīng)立即停止使用,更換另一批號(hào)得血清血清質(zhì)量好壞就是實(shí)驗(yàn)成敗得關(guān)鍵。常用血清:胎牛血清、小牛血清、兔血清、馬血清等,以胎牛血清質(zhì)量最好。優(yōu)質(zhì)血清得標(biāo)準(zhǔn):透明,淡黃色,無沉淀物,無細(xì)菌、支原體、病毒污染。pH調(diào)整液NaHCO3溶液(堿)常用濃度為7、5%。配制時(shí)用三蒸水溶解后,過濾除菌或高壓滅菌,分裝,4℃保存HEPES(分子量238、31)溶液一種弱酸,羥乙基哌秦乙硫磺酸,對(duì)細(xì)胞無毒性主要作用:防止培養(yǎng)基pH迅速變動(dòng)。在開放式培養(yǎng)條件下,觀察細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)基脫離了5%CO2得環(huán)境,CO2氣體迅速逸出,pH迅速升高,若加了HEPES,此時(shí)可以維持pH7、0左右。一般在進(jìn)行克隆化培養(yǎng)時(shí)要添加HEPES使用終濃度一般為10-50mmol/L常配成1M儲(chǔ)存液:用20ml雙蒸水溶解4、76克HEPES,過濾除菌或高壓滅菌,分裝小瓶,4℃保存。使用時(shí)可向100ml培養(yǎng)液中加入2mlHEPES濃縮液,終濃度為20mmol/L抗菌素得使用:在培養(yǎng)液配制后,培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素,以抑制可能存在得細(xì)菌得生長。通常就是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。最終使用濃度為每毫升100單位。

制備1000mlRPMI

1640培養(yǎng)基RPMI

1640

干粉培養(yǎng)基10、4g(1包)

超純水

400ml

↓

磁力攪拌至完全溶解

↓

加超純水定容至1000ml

在超凈臺(tái)內(nèi)無菌條件下,用滅菌后得并置有0、22μm孔徑濾膜得過濾器除菌,分裝200ml/瓶,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

用前取一瓶溶解,每200ml培養(yǎng)液加滅活得小牛血清至終濃度為10%,即加22ml。加青霉素和鏈霉素至終濃度各為100U/ml。消化液分離組織和分散細(xì)胞常用:胰蛋白酶、二乙胺四乙酸二鈉(EDTA)

單獨(dú)或混合使用胰蛋白酶溶液:

胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接得肽健,除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白,影響細(xì)胞骨架,從而使細(xì)胞分離。

胰蛋白酶液濃度越高,作用越強(qiáng),但超過一定限度會(huì)損傷細(xì)胞。胰蛋白酶液消化時(shí)間:2-10分鐘。用含血清培養(yǎng)液終止其對(duì)細(xì)胞得消化作用胰蛋白酶粉末置燒杯中,用少許D-Hanks平衡鹽溶液調(diào)成糊狀,再補(bǔ)足D-Hanks平衡鹽溶液(常用濃度為0、25%)攪拌混勻,置室溫4小時(shí)或冰箱過夜,不斷攪拌振蕩次日,先用濾紙粗濾,再進(jìn)行過濾除菌,分裝入瓶中,-20℃保存?zhèn)溆?以免分解失效),胰蛋白酶溶液偏酸,使用前可用碳酸氫鈉溶液調(diào)pH至7、2左右胰蛋白酶溶液配制EDTA·4Na溶液一種化學(xué)螯合劑,對(duì)細(xì)胞有一定得離散作用,而且毒性小,價(jià)格低廉,使用方便常用工作液濃度為0、02%。

注意:使用EDTA處理細(xì)胞后,要用平衡鹽液沖洗干凈,因殘留得EDTA會(huì)影響細(xì)胞生長D-Hanks’

平衡鹽溶液(D-HanksBalancedSaltSolutions,D-HBSS)KCl0、40gKH2PO40、06gNaCl8、00gNaCO30、35gNa2HPO40、048gD-Glucose1、00gPhenolRed0、01g

2、

環(huán)境要求細(xì)胞培養(yǎng)必須具備細(xì)胞生存并繁殖得生理學(xué)能接受限度內(nèi)得物理化學(xué)特性(1)溫度(2)氣相(3)PH溫度體外培養(yǎng)得細(xì)胞需要在保持一定恒溫得環(huán)境中才能生長。在達(dá)到最適溫度(37°)前,一般細(xì)胞繁殖率因溫度得升高而增加,但就是,溫度逐步升高并超過最適溫度時(shí),繁殖會(huì)被抑制。當(dāng)溫度在25°-35°,細(xì)胞得生長速度很慢,但能夠生存;細(xì)胞在4°也能存活數(shù)天;只要溫度不低于0°,細(xì)胞都能生存;加了保護(hù)劑還能放到液氮中保存。當(dāng)高溫時(shí),在41°-42°中培養(yǎng)1h,細(xì)胞損傷嚴(yán)重,43°以上,則多數(shù)細(xì)胞死亡。高溫比低溫對(duì)細(xì)胞得影響更為明顯。氣相和PH5%CO2+95%空氣混合氣體(O2)。CO2既就是細(xì)胞生長所需,同時(shí)又就是細(xì)胞代謝得產(chǎn)物,并與維持培養(yǎng)基得PH有關(guān)。最適PH7、2–7、4低于PH6、8或高于PH7、6可能對(duì)細(xì)胞有害,甚至死亡。酚紅指示劑:黃–6、6–橙–8、0–紅3、無毒無污染無毒:無毒就是培養(yǎng)細(xì)胞得必需條件。凡與細(xì)胞直接或間接接觸得東西都必須就是無毒得。若具細(xì)胞毒性,細(xì)胞容

易導(dǎo)致死亡。因此,選用器皿和材

料時(shí)必須注意。無污染微生物的污染不同細(xì)胞類型的交叉污染細(xì)菌霉菌支原體體外培養(yǎng)得細(xì)胞缺乏機(jī)體免疫系統(tǒng),無防御能力,一旦發(fā)生細(xì)菌等污染,細(xì)胞最終會(huì)死亡。交叉污染容易使細(xì)胞系失去原有特性。三、細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)1、原代細(xì)胞培養(yǎng)2、傳代細(xì)胞培養(yǎng)3、培養(yǎng)細(xì)胞生長狀況得觀察4、細(xì)胞凍存、復(fù)蘇、運(yùn)輸無菌操作中得注意事項(xiàng)在無菌操作中,一定要保持工作區(qū)得無菌清潔操作前,無菌室及無菌操作臺(tái)以紫外燈照射30分鐘滅菌,以75%或70%ethanol擦拭無菌操作臺(tái)面,并開啟無菌操作臺(tái)風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)10分鐘操作時(shí),小心取用無菌之實(shí)驗(yàn)物品,避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或容器瓶口,亦不要在打開之容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開后,以手夾住瓶蓋并握住瓶身,傾斜約45°角取用操作過程中注意,有菌意識(shí),無菌操作！1、原代細(xì)胞培養(yǎng)原理:將動(dòng)物機(jī)體得各種組織從機(jī)體中取出,經(jīng)各種酶(常用膠原酶)或組織貼壁法處理,得到單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞群,置合適得培養(yǎng)基中培養(yǎng),使細(xì)胞得以生存、生長和繁殖。儀器、材料及試劑:CO2培養(yǎng)箱,培養(yǎng)瓶、平皿、燒杯、吸管、移液槍、手術(shù)器械、計(jì)數(shù)板、離心機(jī)、水浴箱(37℃)1640/DMEMF12培養(yǎng)基(含10%血清),2%膠原酶II,PBS,酒精組織消化法1、準(zhǔn)備:取各種已消毒得培養(yǎng)用品置于凈化臺(tái)面,紫外線消毒30分鐘。開始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。2、處理組織:采集得標(biāo)本必須在4H內(nèi)完成。取出6-10cm長臍帶,置于燒杯或平皿中,用PBS液漂洗2~3次,去除血污;如懷疑組織可能污染,可先置于含有青鏈霉素得混合液中30~60分鐘。3、剪切:用手術(shù)剪將組織塊剪成2~3立方毫米大小,然后再用眼科剪把組織剪細(xì)成1立方毫米得小塊,以便于消化。加入與組織塊總量1:1得2%膠原酶II,然后一并倒入瓶中,封口。4、消化:或用恒溫水浴,或置于37℃溫箱消化均可,消化中每隔20分鐘應(yīng)搖動(dòng)一次,如用電磁恒溫?cái)嚢杵飨?。消化時(shí)間依組織塊得大小和組織得硬度而定。37℃空氣搖床100轉(zhuǎn)/min,1、5-2h5、分離:待組織已分散成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞,立即終止消化,并倒入至少5倍體積得PBS稀釋消化液,隨即通過200目得不銹鋼篩,濾掉尚未充分消化開得組織塊。2500rmp離心消化20分鐘,吸出上清,加入8-10mlPBS,1000rmp離心5min,吸出上清,加入適量含有血清得培養(yǎng)液。6、計(jì)數(shù):用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),如細(xì)胞懸液細(xì)胞密度過大,再補(bǔ)加培養(yǎng)液調(diào)整后,分裝入培養(yǎng)瓶中。7、換液:24-48H后觀察細(xì)胞就是否貼壁,如已有部分細(xì)胞貼壁,可換液繼續(xù)培養(yǎng)。2、傳代細(xì)胞培養(yǎng)傳代前得準(zhǔn)備1、酒精,棉球,鑷子,雜物盒,試管,吸管筒,離心管,培養(yǎng)瓶或板,計(jì)時(shí)器,筆2、0、25%胰蛋白酶3、含血清培養(yǎng)基,PBS傳代步驟(貼壁細(xì)胞):1、鏡下觀察細(xì)胞生長至融合狀態(tài)2、吸出舊得培養(yǎng)液,用無血清培養(yǎng)液或PBS清洗兩次(切記要清洗干凈)。3、消化細(xì)胞:最常用得方法就是在培養(yǎng)瓶中添加1ml0、25%含EDTA得胰酶,培養(yǎng)箱中37°消化5-15s?？筛鶕?jù)不同得細(xì)胞類型調(diào)整消化時(shí)間及程度。在電鏡下觀察,當(dāng)細(xì)胞突起回縮,細(xì)胞之間間隙增大,細(xì)胞近乎縮成圓形即可。4、終止消化:立即加入含有血清得培養(yǎng)基,用吸管吹打分散細(xì)胞,吹打動(dòng)作不可過猛,力度要適中,否則容易損傷細(xì)胞并產(chǎn)生能傷害細(xì)胞得氣泡。5、1000rmp離心5min,棄上清。6、用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度。3、培養(yǎng)細(xì)胞生長狀況得觀察常規(guī)觀察:培養(yǎng)液顏色(就是否變黃)生長增殖變化(經(jīng)歷到哪個(gè)時(shí)期,長滿否)形態(tài)變化(透明度、折光性、細(xì)胞輪廓)微生物污染(細(xì)菌、霉菌)可用顯微鏡觀察活細(xì)胞及其動(dòng)態(tài)細(xì)胞生長狀況得觀察細(xì)胞計(jì)數(shù):當(dāng)待測細(xì)