**基因工程制藥

**一、基因工程概論二、基因工程工具酶和載體三、基因的克隆與分離（目的基因的獲得）四、克隆基因的表達(dá)五、基因工程菌的代謝、不穩(wěn)定性、中試基因工程制藥**第二節(jié)基因工程的工具酶限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶DNA聚合酶核酸酶核酸修飾酶**一、限制性核酸內(nèi)切酶是一類能識(shí)別特殊核甘酸序列，并水解DNA分子的磷酸二酯鍵,從而切斷雙鏈DNA的核酸水解酶。主要存在于原核細(xì)菌中，幫助細(xì)菌限制外來DNA的入侵作用。**（一）限制性內(nèi)切酶的來源寄主控制的限制（restriction）與修飾(modification)現(xiàn)象：人們發(fā)現(xiàn)侵染大腸桿菌的噬菌體都存在著一些功能性障礙。即所謂的寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象簡(jiǎn)稱（R/M體系）。細(xì)菌的R/M體系類似于免疫系統(tǒng)，能辨別自身的DNA與外來的DNA，并能使后者降解掉。**R/M體系：是由兩種酶活性配合完成的：一種是修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶另一種是核酸內(nèi)切限制酶**E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶※當(dāng)λ(k)噬菌體侵染E.coliB時(shí)，由于其DNA中有EcoB核酸酶特異識(shí)別的堿基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中雖然也存在這種特異序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）將甲基轉(zhuǎn)移給限制酶識(shí)別序列的特定堿基，使之甲基化。

※EcoB(大腸桿菌B株)的核酸酶不能識(shí)別已甲基化的序列。**

R/M體系的作用：保護(hù)自身的DNA不受限制；破壞外源DNA使之迅速降解TGAN8TGCTACTN8ACGATGAN8TGCTACTN8ACGAECOB核酸酶甲基化酶CH3CH3CH3CH3噬菌體來源序列宿主來源序列**※限制性內(nèi)切酶本是微生物細(xì)胞中用于專門水解外源ＤＮＡ的一類酶，其功能是避免外源ＤＮＡ的干擾或噬菌體的感染，是細(xì)胞中的一種防御機(jī)制?！捎赗/M現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)使得核酸內(nèi)切酶成為基因工程重要的工具酶。**※1968年，阿爾伯證明了一種特別的限制酶的存在，它只分裂那些含有為噬菌體所特有的某種序列的核苷酸；※

這一工作經(jīng)過內(nèi)森斯和史密斯的發(fā)展，從流感嗜血桿菌d株中分離出HindII和HindIII?！?/p>

限制性核酸酶的發(fā)現(xiàn)，為基因結(jié)構(gòu)、DNA堿基順序分析和基因工程的研究開辟了途徑。**阿爾伯WernerArber瑞士巴塞爾Biozentrum大學(xué)史密斯HamiltonO.Smith美國(guó)霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院內(nèi)森斯DanielNathans美國(guó)霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院為此，W.阿爾伯，H.史密斯和D.內(nèi)森斯三人共同獲得了1978年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。**（二）限制性內(nèi)切酶的分類與命名根據(jù)酶的功能、大小和反應(yīng)條件，及切割ＤＮＡ的特點(diǎn)，可以將限制性內(nèi)切酶分為三類：

Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、Ⅲ型酶**Ⅰ型酶：※1968年，M.Meselson和R.Yuan在E.coliB和E.coliK中分離出的核酸內(nèi)切酶。如EcoK

和EcoB

※分子量較大，反應(yīng)需Mg++、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸（SAM）、ATP等。RSMR亞基：限制酶M亞基：甲基化酶S亞基：識(shí)別DNA序列**Ⅰ類酶雖然能夠在一定序列上識(shí)別DNA分子,并能同DNA分子作用,因其識(shí)別DNA后,要朝一個(gè)方向或兩個(gè)方向移動(dòng)一段距離(通常為1000個(gè)堿基左右)，并且要形成一個(gè)環(huán)才能切割DNA,所以識(shí)別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)不一致，產(chǎn)生的片段較大。

**這類酶有特異的識(shí)別位點(diǎn)但沒有特異的切割位點(diǎn)，而且切割是隨機(jī)的，所以在基因工程中應(yīng)用不大。TGAN8TGCTACTN8ACGAECOB核酸酶1000bp**Ⅱ型酶※1970年，H.O.Smith和K.W.Wilcox在流感嗜血Rd株中分離出來的限制酶?！肿恿枯^小（105Da），只有一種多肽，通常以同源二聚體的形式存在。反應(yīng)只需Mg++的存在，并且具有以下兩個(gè)特點(diǎn)，使這類酶在基因工程研究中，得到廣泛的應(yīng)用。識(shí)別位點(diǎn)是一個(gè)回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)，并且切割位點(diǎn)也在這一回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)上。許多Ⅱ型酶切割ＤＮＡ后，可在ＤＮＡ上形成粘性末端，有利于ＤＮＡ片段的重組。******兩條鏈上的斷裂位置是交錯(cuò)地、但又是對(duì)稱地圍繞著一個(gè)對(duì)稱軸排列，這種形式的斷裂結(jié)果形成具有粘性末端的DNA片段；

兩條鏈上的斷裂位置是處在一個(gè)對(duì)稱結(jié)構(gòu)的中心，這樣形式的斷裂是形成具有平末端的DNA片段。

**粘性末端(stickyends;cohensiveends)，是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互補(bǔ)堿基的單鏈延伸末端結(jié)構(gòu)。它們能夠通過互補(bǔ)堿基間的配對(duì)而重新環(huán)化起來。具平末端的DNA片段則不易于重新環(huán)化。限制酶都可以產(chǎn)生兩種粘性末端，一種是形成具有3′-OH單鏈延伸的粘性末端，另一種則是形成具有5′-P單鏈延伸的粘性末端，

************Ⅲ型酶這類酶可識(shí)別特定堿基順序，并在這一順序的下游的24~26bp處切開ＤＮＡ，所以它的切割位點(diǎn)也是沒有特異性的。Eco57I

CTGAAGNNNNNNNNNNNNNNNN^GACTTCNNNNNNNNNNNNNN^**ⅡⅠⅢ酶分子內(nèi)切酶與甲基化酶分子不在一起三亞基雙功能酶二亞基雙功能酶識(shí)別位點(diǎn)4-6bp,大多數(shù)為回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)二分非對(duì)稱5-7bp非對(duì)稱切割位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)中或靠近識(shí)別位點(diǎn)無特異性，至少在識(shí)別位點(diǎn)外1000bp在識(shí)別位點(diǎn)下游24-26bp各種限制與修飾系統(tǒng)的比較

**限制性核酸內(nèi)切酶的命名限制性核酸內(nèi)切酶的命名原則：

第一個(gè)字母：大寫，表示所來自的微生物的屬名的第一個(gè)字母。第二、三字母：小寫，表示所來自的微生物種名的第一、二個(gè)字母。其它字母：大寫或小寫，表示所來自的微生物的菌株號(hào)。羅馬數(shù)字：表示該菌株發(fā)現(xiàn)的限制酶的編號(hào)。例：EcoRI:來自于EscheriacoliRY13的第一個(gè)限制酶。**限制性核酸內(nèi)切酶的命名屬名 種名 株名Haemophilus

influenzae

d嗜血流感桿菌d株

HindIIId株中發(fā)現(xiàn)的第三個(gè)酶同一菌株中所含的多個(gè)不同的限制性核酸內(nèi)切酶**（三）II型限制性內(nèi)切酶的基本特征1.基本特征1.識(shí)別雙鏈DNA分子中4-8對(duì)堿基的特定序列2.大部分酶的切割位點(diǎn)在識(shí)別序列內(nèi)部或兩側(cè)3.識(shí)別切割序列呈典型的旋轉(zhuǎn)對(duì)稱型回文結(jié)構(gòu)5‘…GCTGAATTCGAG…3’3‘…CGACTTAAGCTC…5EcoRI的識(shí)別序列EcoRI的切割位點(diǎn)**？？II型限制性內(nèi)切酶的基本特征粘性末端平末端同裂酶同尾酶兩條鏈圍繞著一個(gè)對(duì)稱結(jié)構(gòu)中心交錯(cuò)地?cái)嗔褍蓷l鏈在一個(gè)對(duì)稱結(jié)構(gòu)的中心上的斷裂識(shí)別相同靶序列的核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生相同的粘性末端的核酸內(nèi)切酶**限制性內(nèi)切酶在DNA克隆中的應(yīng)用**gacggatcgggagaagcttcccgatcccctatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgagctcagaatctggagctcaagctt**第二節(jié)基因工程的工具酶一、限制性核酸內(nèi)切酶二、DNA連接酶

三、DNA聚合酶四、核酸酶五、核酸修飾酶****ＤＮＡ連接酶

能夠?qū)NA鏈上彼此相鄰的3’-羥基（OH）和5’-磷酸基團(tuán)（-P），在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二酯鍵。只能連接缺口（nick），不能連接裂口（gap）。而且被連接的DNA鏈必須是雙螺旋DNA分子的一部分。****連接酶的作用機(jī)理連接酶先與ATP作用，以共價(jià)鍵相連生成E-AMP中間體。中間體即與一個(gè)DNA片段的5‘-磷酸相連接形成E-AMP-5’-DNA。然后再與另一個(gè)DNA片段的3‘-OH末端作用，E和AMP脫下，兩個(gè)DNA片段以3’,5‘-磷酸二酯鍵相連接。此反應(yīng)是由焦磷酸(ppi)的水解作用激發(fā)的，需要花費(fèi)兩個(gè)高能磷酸鍵。**DNA的腺苷酸復(fù)合物3’-OH對(duì)P原子作親核攻擊形成磷酸二酯鍵連接酶的作用機(jī)理此反應(yīng)是由焦磷酸

(ppi)的水解作用激發(fā)的需要花費(fèi)兩個(gè)高能磷酸鍵（賴氨酸殘基）****1.大腸桿菌的DNA連接酶是一條分子量為75KD的多肽鏈?？梢苑忾]雙螺旋DNA上具有5‘-磷?；?’-羥基的缺口（nick），不能封閉裂口（gap）；因此，只能連接粘性末端的DNA片段，不能拼接DNA平頭末端；用于粘性末端DNA或切口間連接。**2.Ｔ４ＤＮＡ連接酶（DNAligase）

該酶常從Ｔ４噬菌體的受感細(xì)胞中提取，是由Ｔ４噬菌體基因組所編碼的，它可催化ＤＮＡ中磷酸二脂鍵的形成，從而使兩個(gè)片段以共價(jià)鍵的形式結(jié)合起來?；蚬こ讨谐Ｓ玫倪B接酶是Ｔ４連接酶。

DNA連接酶對(duì)具有粘性末端的DNA分子經(jīng)退火后能很好地連接，對(duì)平末端的DNA分子也可以進(jìn)行連接，但連接效率較低，必須加大酶的用量。**第二節(jié)基因工程的工具酶一、限制性核酸內(nèi)切酶二、DNA連接酶三、DNA聚合酶

四、核酸酶五、核酸修飾酶**三、DNA聚合酶DNA聚合酶 催化dNTP聚合到核酸鏈上的酶。是DNA復(fù)制的主要酶。全稱叫依賴DNA的DNA聚合酶（DNA-dependentDNApolymerase）或DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶（DNA-directedDNApolymerase），均縮寫為DDDP。****常用的DNA聚合酶：

大腸桿菌DNA聚合酶、大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow大片段酶、

T4DNA聚合酶、

T7DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶等。**共同點(diǎn)：

把脫氧核糖核苷酸連續(xù)的加到雙鏈DNA分子引物鏈的3’-OH末端，催化核苷酸的聚合作用。**常用幾種DNA聚合酶的特性比較**（一）大腸桿菌DNA聚合酶DNA聚合酶Ⅰ（PolI）、

DNA聚合酶Ⅱ（PolⅡ）、

DNA聚合酶Ⅲ（PolⅢ）、

PolI和PolⅡ的主要功能參與DNA的合成；

PolⅢ的功能同DNA的復(fù)制有關(guān)；

Pol

Ⅰ

同DNA分子克隆的關(guān)系最為密切。**1.大腸桿菌DNA聚合酶I1957年，美國(guó)的生物學(xué)家A.Kornberg首次證實(shí)，在大腸桿菌提取物中存在一種DNA聚合酶，即現(xiàn)在所說的DNA聚合酶I。由polI基因編碼的一種單鏈多肽蛋白質(zhì)。

DNA聚合酶I，可以被蛋白酶切割成兩個(gè)片斷:一個(gè)具有全部的3’→5’的外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性;另一個(gè)具有全部5’→3’的外切酶活性。**DNA聚合酶Ⅰ的酶活性：

5’→3’的聚合酶活性；

5’→3’的外切酶活性；

3’→5’的外切酶活性（較低）。**核酸外切酶活性

3′5′3′→5′外切酶活性5′→3′外切酶活性

3′5′

3′5′5′

3′**（1）5’→3’的聚合酶活性DNA聚合酶Ｉ發(fā)揮作用的條件：底物：四種脫氧核苷5’-三磷酸（dNTP）；Mg＋＋離子；帶有3’-OH游離基團(tuán)的引物鏈；DNA模板：?jiǎn)捂?，雙鏈（糖-磷酸主鍵上有一個(gè)或多個(gè)斷裂）。**（2）5’→3’的核酸外切酶活性5’→3’的外切酶活性，所切割的DNA鏈必須是位于雙螺旋的區(qū)段上；切割部位可以是末端磷酸二酯鍵，也可以是在距5’末端數(shù)個(gè)核苷酸遠(yuǎn)的一個(gè)鍵上發(fā)生；DNA的合成可以增強(qiáng)5’→3’的核酸外切酶活性；5’→3’核酸外切酶的活性位點(diǎn)同聚合作用的活性位點(diǎn)以及3’→5’的水解作用位點(diǎn)是分開的。****（3）3’→5’核酸外切酶活性能催化DNA鏈發(fā)生水解作用，從DNA鏈3’-OH末端開始向5’的方向水解DNA，并釋放出單核苷酸分子。對(duì)酶活的影響：反應(yīng)物中缺乏dNTPs時(shí)，大腸桿菌DNA聚合酶Ｉ的3’→5’核酸外切酶活性，將會(huì)發(fā)揮作用。但對(duì)于底物是雙鏈的DNA，在具有dNTPs時(shí)，這種降解活性將會(huì)被5’→3’的聚合酶活性所抑制。****DNA聚合酶在分子克隆中的主要用途：通過DNA缺口轉(zhuǎn)移，制備供核酸分子雜交用的帶放射性標(biāo)記的DNA探針。

DNA缺口轉(zhuǎn)移（nicktranslation）在DNA分子的單鏈缺口上，DNA聚合酶Ⅰ的5’→3’核酸外切酶活性和聚合作用可以同時(shí)發(fā)生。當(dāng)外切酶活性從缺口的5’一側(cè)移去一個(gè)5’核苷酸之后，聚合酶作用就會(huì)在缺口的3’一側(cè)補(bǔ)上一個(gè)新的核苷酸，但polⅠ不能在3’-OH和5’-P之間形成一個(gè)鍵，隨著5’一側(cè)的核苷酸不斷移去，3’一側(cè)的核苷酸又按序列增補(bǔ)，缺口便沿著DNA分子合成的方向移動(dòng)。**切口平移**2.Klenow

聚合酶Klenow片段（Klenowfragment）：E.coliDNA聚合酶I經(jīng)部分水解生成的C末端605個(gè)氨基酸殘基片段。該片段保留了DNA聚合酶I的5ˊ→3ˊ聚合酶和3ˊ→5ˊ外切酶活性，但失去了5ˊ→3ˊ外切酶活性。

5’→3’聚合酶活性；

5’→3’外切酶活性；

3’→5’外切酶活性。5’→3’聚合酶活性；

3’→5’外切