人呼吸道合胞病毒中和抗體檢測(cè)技術(shù)指南2025-04-23實(shí)施2025-04-23實(shí)施中國疫苗行業(yè)協(xié)會(huì)中國標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)聯(lián)合發(fā)布I 1范圍 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 14縮略語 15試劑材料 16器材和設(shè)備 27實(shí)驗(yàn)操作 28結(jié)果觀察與判定 49實(shí)驗(yàn)室生物安全要求 4附錄A(資料性)試劑配制 5附錄B(資料性)血清稀釋及96孔細(xì)胞培養(yǎng)板加樣示例 6參考文獻(xiàn) 7本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所提出。本文件由中國疫苗行業(yè)協(xié)會(huì)歸口。本文件起草單位：中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所、北京市疾病預(yù)防控制中心、內(nèi)蒙古自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心、江蘇省疾病預(yù)防控制中心、湖北省疾病預(yù)防控制中心、廣州海關(guān)技術(shù)中心、長春百克生物科技股份公司、江西省疾病預(yù)防控制中心、廣州市婦女兒童醫(yī)療中心。本文件主要起草人：張燕、房瓊瓊、李海、朱貞、田曉靈、毛乃穎、崔愛利、潘紅星、楊北方、張璐、姜春來、曹蕾、夏百成、胡宏俏、袁若森、劉師文、朱冰。人呼吸道合胞病毒是全球范圍內(nèi)嬰幼兒急性呼吸道感染的主要病原體之一。盡管疫苗和單克隆抗包括微量中和實(shí)驗(yàn)和噬斑減少中和實(shí)驗(yàn)。微量中和實(shí)驗(yàn)對(duì)于某些病變不明顯的人呼吸道合胞病毒毒株化沉淀，能夠高效且直觀地檢測(cè)血清中的中和抗體滴度。該方法具有較高的精密度、特異1本文件規(guī)定了用于人呼吸道合胞病毒血清中和抗體測(cè)定的噬斑減少中和實(shí)驗(yàn)的操作流程及結(jié)果判HRSV:人呼吸道合胞病毒(HumanRespiratorySyHEp-2:人喉表皮樣癌細(xì)胞(HumanLarynxEpidPBST:含0.05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(Phosphate-BufferedSalinewith0.05%Tween20)5.3維持液：配制參照附錄A.3。5.4培養(yǎng)液：配制參照附錄A.4。5.6水：GB/T6682-2008,二級(jí)水。5.7固定液：4%多聚甲醛。5.9HEp-2細(xì)胞5.10一抗：單克隆抗體Palivizumab。25.11二抗：HRP標(biāo)記山羊抗人IgG。6.196孔細(xì)胞培養(yǎng)板。6.3CO?培養(yǎng)箱。6.5Ⅱ級(jí)生物安全柜。培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h～16h。將HRSV接種于HEp-2細(xì)胞，37℃吸附1h后，加入維持液繼續(xù)培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞病變，細(xì)胞圓化、皺縮且融合形成合胞體，隨后逐漸脫落。當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)90毒上清，加入等體積的FBS,分裝至凍存管(1mL/管),超低溫保存?zhèn)溆?。液，?7℃5%CO?培養(yǎng)箱培養(yǎng)10h～12h,第二天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，確保細(xì)胞形態(tài)正常、貼壁細(xì)胞為單層且面積達(dá)到90%以上才可以使用。病毒液起始稀釋度為1:10(將100μL病毒液加入到900μL維持液中),采用維持液進(jìn)行10倍倍比稀釋(10-1~10-10)。于37℃5%CO?培養(yǎng)箱培養(yǎng)40h～48h。細(xì)胞培養(yǎng)板中的4%多聚甲醛，用PBST洗3次。置于37℃恒溫水浴箱內(nèi)孵育1h。3棄去96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的單克隆抗體Palivizumab,用PBST洗3次，HRP標(biāo)記山羊抗人IgG抗體稀釋T——病毒滴度(PFU/mL);V——接種體積(mL)。中，每孔加入100μL細(xì)胞懸液，置于37℃5%CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10h～12h。鋪板后第二天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，確保細(xì)胞形態(tài)正常、貼壁細(xì)胞為單層且覆蓋面積達(dá)到90%以上才可以使用。取40μL滅活血清加入到120μL維持液中，進(jìn)行4倍倍比稀釋(參照附錄于37℃5%CO?培養(yǎng)箱中和2h。每個(gè)稀釋度2孔。96孔細(xì)胞培養(yǎng)板同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照和病毒對(duì)照(參照附錄B.2)。于37℃5%CO?培養(yǎng)箱吸附1h后吸去接種物，每孔加入200μL覆蓋物，于37℃5%CO?培養(yǎng)箱培養(yǎng)40h～48h。細(xì)胞培養(yǎng)板中的4%多聚甲醛，用PBST洗3次。于37℃恒溫水浴箱內(nèi)孵育1h。棄去96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的單克隆抗體Palivizumab,用PBST洗3次，HRP標(biāo)記山羊抗人4棄去96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的二抗，用PBST洗3次，每孔加入TrueBlue顯色液30μL,輕輕晃動(dòng)以確保記錄每個(gè)孔的噬斑數(shù)，用Karber法計(jì)算中和抗體滴度。中和抗體滴度以與陽性對(duì)照相比減少了50%9.1根據(jù)《人間傳染的病原微生物目錄》(2023版)的規(guī)定，人呼吸道合胞病毒實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在生物安9.2實(shí)驗(yàn)室應(yīng)遵循GB19489和WS9.3個(gè)人防護(hù)和實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)生的所有廢棄物應(yīng)遵循GB19489的相關(guān)規(guī)定。5(資料性)即配成含0.05%吐溫20的洗滌緩沖液(PBST),4無菌量取DMEM培養(yǎng)基480mL,加入10mLFBS、5mL7.5%碳酸氫鈉溶液、5mL青-鏈霉素溶液(A.2),即配成含2%FBS的DMEM液體培養(yǎng)基，4℃保存?zhèn)溆?。無菌量取DMEM培養(yǎng)基440mL,加入(A.2),即配成含10%FBS的DMEM液體培養(yǎng)基，4℃保存?zhèn)溆谩?(資料性)血清稀釋及96孔細(xì)胞培養(yǎng)板加樣示例B.1血清稀釋示例可參照?qǐng)DB.1。40μL40μL40μL40μL40μL40μL40μL圖B.1