生化DNA生物合成演示文稿第一頁，共八十九頁。生化DNA生物合成第二頁，共八十九頁。DNA是生物遺傳信息的載體1869年，Johann.F.Miescher首次從從萊茵河鱒魚細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)DNA肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗：1928年，F(xiàn)rederickGriffth實驗J.F.MiescherF.Griffth第三頁，共八十九頁。1928,Griffth肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗第四頁，共八十九頁。DNA是遺傳信息載體的證明肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗1944年，OswaldAvery,ColinMacLeod,MaclynMcCarty證明DNA為生物遺傳信息的載體OswaldAveryColinMacLeodMaclynMcCarty第五頁，共八十九頁。1944年，肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗第六頁，共八十九頁。DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)Watson&CrickNature

171,737-738(1953)第七頁，共八十九頁。中心法則：解釋遺傳信息在生物大分子之間傳遞順序的框架第八頁，共八十九頁。中心法則朊病毒DNA復(fù)制RNA復(fù)制第九頁，共八十九頁。DNA的生物合成DNA復(fù)制（replication）DNA修復(fù)（repair）逆轉(zhuǎn)錄（reversetranscription）第十頁，共八十九頁。DNA復(fù)制以母鏈DNA為模板合成子鏈DNA的過程，使親代的遺傳信息得以準(zhǔn)確傳遞到子代。第十一頁，共八十九頁。DNA復(fù)制機制的實驗驗證半保留模型（Semiconservetivemodel）

全保留復(fù)制模型(Conservetivemodel)

分散模型

(Dispersivemodel)第十二頁，共八十九頁。DNA復(fù)制方式的三種假說(半保留復(fù)制)(全保留復(fù)制)(混合式)第十三頁，共八十九頁。DNA的半保留復(fù)制半保留復(fù)制（semi-conservativereplication）即子代DNA雙鏈分子中，一股鏈來自親代模板，一股鏈為新合成的。半保留復(fù)制的意義：保證親代的遺傳信息準(zhǔn)確傳遞給子代，體現(xiàn)了遺傳的高度保真性。第十四頁，共八十九頁。原核生物：Meselson-Stahl實驗

FranklinStahl半保留復(fù)制的實驗證明第十五頁，共八十九頁。第十六頁，共八十九頁。原核生物復(fù)制的起點和方向E.coli，固定起始點、雙向?qū)ΨQ復(fù)制。T7，一端的17％處開始，向兩端延伸?？莶輻U菌有固定的起始點，雙向不對稱復(fù)制。質(zhì)粒R6K早期為單向復(fù)制，復(fù)制了約1/5基因組時進(jìn)行雙向復(fù)制。質(zhì)粒ColE1有固定起始點，但卻為單向復(fù)制。mtDNA進(jìn)行D環(huán)復(fù)制（displacedloop）。

真核有多個復(fù)制起點，雙向等速復(fù)制。第十七頁，共八十九頁。D環(huán)復(fù)制第十八頁，共八十九頁。DNA的半不連續(xù)復(fù)制

第十九頁，共八十九頁。復(fù)制時DNA鏈延伸可能有三種方式123第二十頁，共八十九頁。DNA復(fù)制的半不連續(xù)性一條鏈連續(xù)合成，稱前導(dǎo)鏈(LeadingStrand),另一條鏈分段合成，稱滯后鏈(LaggingStrand)。原因：DNA雙螺旋分子兩條鏈方向相反，新鏈合成的方向只能5’→3’一個方向合成。第二十一頁，共八十九頁。1967年，岡崎實驗脈沖標(biāo)記和脈沖追蹤岡崎令治第二十二頁，共八十九頁。1978年，Olivera實驗細(xì)胞內(nèi)存在dTTP和dUTP，而DNA聚合酶Ⅲ不能區(qū)分它們。dUTPase酶，使dUTP變成dUMP，其不能作為DNA合成的底物。尿嘧啶N-糖苷酶（uracilN-glycosylase），切斷混入尿苷的糖苷鍵，形成AP位點。AP內(nèi)切酶，在AP位點切出一個缺口，進(jìn)行切除修復(fù)。BaldomeroM.Olivera第二十三頁，共八十九頁。參與DNA復(fù)制的酶類及蛋白質(zhì)因子1.DNA聚合酶（DNApolymerase）雙鏈DNA解鏈、解旋酶

3.引物酶4.連接酶第二十四頁，共八十九頁。DNA聚合酶(DNApolymerase)1957年，由ArthurKornberg,WashingtonUniversityatSt.Louis,從大腸桿菌(E.coli)中發(fā)現(xiàn)。1959，獲得NobelPrizeinPhysiologyorMedicine.依賴DNA的DNA聚合酶(DNAdependentDNApolymerase)第二十五頁，共八十九頁。原核生物復(fù)制的酶系統(tǒng)DNA聚合酶的共同特點：需要提供合成模板不能起始新的DNA鏈，必須要有引物提供3'－OH合成的方向都是5’→3’除聚合酶功能外，還有其他功能，如3’-5’,5’-3’外切酶功能。第二十六頁，共八十九頁。

大腸桿菌中的三種DNA多聚酶

DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶ⅡDNA聚合酶Ⅲ不同種類亞基數(shù)目1≥7≥10相對分子質(zhì)量103000880009000005′→3′核酸聚合酶活性+++3′→5′核酸外切酶活性+++5′→3′核酸外切酶活性+--聚合速度（核苷酸/分）1000~1200240015000~60000持續(xù)合成能力3~2001500≥500000分子數(shù)/細(xì)胞40010010~20功能切除引物，修復(fù)修復(fù)復(fù)制第二十七頁，共八十九頁。DNA聚合酶I的結(jié)構(gòu)與功能DNA聚合酶I有6個結(jié)合位點：(1)模板結(jié)合位點；(2)引物結(jié)合位點；(3)引物3‘－OH結(jié)合位點；(4)底物dNTP結(jié)合位點；(5)5‘→3’外切酶結(jié)合位點；(6)3'→5'校正位點。

第二十八頁，共八十九頁。DNA聚合酶Ⅰ的功能5’→3’聚合功能3’→5’外切活性3.5’→3’外切活性(1)切口平移（nicktranslation）(2)鏈的置換(3)模板轉(zhuǎn)換（template-switching）4.內(nèi)切酶活性第二十九頁，共八十九頁。原核生物復(fù)制的酶系統(tǒng)第三十頁，共八十九頁。DNA聚合酶I功能第三十一頁，共八十九頁。切口平移(nicktranslation)第三十二頁，共八十九頁。原核細(xì)胞的DNA聚合酶聚合酶II活性弱,作用不詳

有從5’——3’延伸多核苷酸鏈的聚合酶活性有從3’——5’外切酶的活性第三十三頁，共八十九頁。DNA聚合酶Ⅲ的結(jié)構(gòu)與功能第三十四頁，共八十九頁。DNA聚合酶III的結(jié)構(gòu)第三十五頁，共八十九頁。連接酶（ligase）將不連續(xù)的DNA片段的5’-PO4與相鄰的3’-OH以3’-5’磷酸二酯鍵連接起來。原核生物通過分解NAD為NMN和Pi提供能量，真核生物則消耗ATP。第三十六頁，共八十九頁。單鏈結(jié)合蛋白（singlestrandbindingprotein）負(fù)責(zé)與DNA單鏈區(qū)域結(jié)合防止新形成的單鏈DNA重新配對形成雙鏈DNA防止新形成的單鏈DNA被核酸酶降解E.coli為四聚體，177aa第三十七頁，共八十九頁。雙鏈DNA解鏈、解旋酶解旋酶(helicase):

把DNA雙鏈的氫鍵打開，催化雙螺旋解鏈

需消耗ATP第三十八頁，共八十九頁。雙鏈DNA解鏈、解旋酶拓?fù)洚悩?gòu)酶（topoisomerase）I型，切斷DNA單鏈;II型，切斷DNA雙鏈。需消耗ATP。兼有內(nèi)切酶和連接酶活性,可迅速使DNA兩條鏈斷開又接上,消除解鏈酶產(chǎn)生的拓?fù)鋸埩Α．?dāng)引入負(fù)超螺旋時需要由ATP提供能量,同復(fù)制有關(guān)。第三十九頁，共八十九頁。引物酶（primase）依賴DNA的RNA聚合酶，但不同于轉(zhuǎn)錄的RNA聚合酶，以復(fù)制起點的DNA序列為模板，合成5’-3’的RNA短片段第四十頁，共八十九頁。復(fù)制起始區(qū)的結(jié)構(gòu)特點富含A－T，雙鏈易于解開，起始復(fù)制；含有多個回文結(jié)構(gòu)(9－14個GATC),8個GATC較保守,CATC中的“A”已甲基化;具有4個反向重復(fù)順序，作為蛋白結(jié)合位點；此順序的右側(cè)毗鄰區(qū)域有兩個起動子，其可能的作用是：①轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生引物；②產(chǎn)生復(fù)制必要的蛋白；③產(chǎn)生調(diào)節(jié)功能的RNA；④起轉(zhuǎn)錄激活作用。第四十一頁，共八十九頁。第四十二頁，共八十九頁。原核生物DNA復(fù)制過程

復(fù)制的起始

原核生物只有一個起始點（origin,ori）

真核生物有多個起始點。1.DNA解為單鏈解旋酶：進(jìn)行解鏈，形成超螺旋。拓?fù)洚悩?gòu)酶：超螺旋的轉(zhuǎn)型，把正超螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)槔趶?fù)制的負(fù)超螺旋，形成復(fù)制叉（replicationfork）。第四十三頁，共八十九頁。第四十四頁，共八十九頁。原核生物DNA復(fù)制過程

2.引物合成：促進(jìn)引物合成的蛋白質(zhì)因子與復(fù)制起始點(ori)結(jié)合，形成引發(fā)體前體（preprimosome）。引物酶與引發(fā)體前體結(jié)合，形成引發(fā)體（primosome），合成與模板DNA鏈3’端互補的RNA引物。

第四十五頁，共八十九頁。原核生物DNA復(fù)制過程3.復(fù)制的延長由DNA聚合酶III催化，是主要的復(fù)制酶。前導(dǎo)鏈（leadingchain）：模板DNA鏈為3’—5’方向，新鏈按5’—3’方向連續(xù)合成，合成方向與解鏈方向一致。滯后鏈（laggingchain）：模板DNA鏈為5’—3’方向，合成方向與解鏈方向相反，不能連續(xù)合成新鏈。DNA復(fù)制是半不連續(xù)的過程。第四十六頁，共八十九頁。第四十七頁，共八十九頁。原核生物DNA復(fù)制過程4.復(fù)制的終止:由DNA聚合酶I和DNA連接酶催化完成。DNA聚合酶I切除引物，并且填補空隙DNA連接酶把DNA片段連接起來。第四十八頁，共八十九頁。第四十九頁，共八十九頁。真核生物的五種DNA聚合酶

αβγδε酶活性

5′→3′聚合酶+++++3′→5′外切核酸酶-++++5′→3′外切核酸酶---++構(gòu)成（亞基）44425分子量（kD）30036～38160～300170250細(xì)胞內(nèi)定位細(xì)胞核細(xì)胞核線粒體細(xì)胞核細(xì)胞核主要功能引發(fā)修復(fù)復(fù)制復(fù)制修復(fù)第五十頁，共八十九頁。真核生物的DNA聚合酶DNA聚合酶α，負(fù)責(zé)新鏈的起始合成DNA聚合酶δ，負(fù)責(zé)前導(dǎo)鏈的延伸聚合酶ε，可能負(fù)責(zé)滯后鏈的延伸，也可能有其他功能DNA聚合酶γ，負(fù)責(zé)線粒體DNA的復(fù)制DNA聚合酶β，修復(fù)功能第五十一頁，共八十九頁。真核生物復(fù)制的特點：1.復(fù)制起始點多2.引物RNA短3.岡崎片段短4.DNA聚合酶不同5.連接酶作用時需要ATP提供AMP第五十二頁，共八十九頁。DNA的損傷與修復(fù)第五十三頁，共八十九頁。DNA損傷多數(shù)是自發(fā)性突變，是遺傳進(jìn)化的基礎(chǔ)。環(huán)境的理化因素誘導(dǎo)，如紫外線、化學(xué)誘導(dǎo)劑如亞硝酸鹽等。

UV，胸腺嘧啶二聚體

第五十四頁，共八十九頁。DNA損傷類型1.點突變（堿基錯配）DNA聚合酶復(fù)制錯誤產(chǎn)生第五十五頁，共八十九頁。DNA損傷類型2.堿基的缺失或插入。第五十六頁，共八十九頁。DNA損傷類型3.DNA分子斷裂 DNA單鏈斷裂 DNA雙鏈斷裂

放射線，重金屬，病毒整合，DNA重排第五十七頁，共八十九頁。DNA損傷的修復(fù)光修復(fù)：通過光復(fù)活酶,修復(fù)嘧啶二聚體，廣泛存在在于生物界,但人類缺乏。第五十八頁，共八十九頁。切除修復(fù)：依靠特異內(nèi)切核酸酶，識別損傷結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行修復(fù)、合成和連接。第五十九頁，共八十九頁。重組修復(fù):依靠重組蛋白A,先將同源母鏈DNA上相應(yīng)的核苷酸片段轉(zhuǎn)移替補，然后再合成一段序列填充缺口第六十頁，共八十九頁。SOS修復(fù):DNA損傷廣泛，難以繼續(xù)復(fù)制時的一種應(yīng)急修復(fù)。包括切除修復(fù)和重組修復(fù)，有多種酶和蛋白參與。

特點：快而粗糙，錯誤率高，故而突變率高。第六十一頁，共八十九頁。逆轉(zhuǎn)錄作用中心法則的重要補充第六十二頁，共八十九頁。逆轉(zhuǎn)錄和逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)實驗現(xiàn)象：1964年，Temin等首次發(fā)現(xiàn)：DNA合成抑制劑可以遏制鳥類肉瘤病毒(ASV)等RNA腫瘤病毒所造成的感染

表明在RNA腫瘤病毒的RNA復(fù)制過程中需要合成DNA。2.ASV子代病毒顆粒的產(chǎn)生被放線菌素D所抑制

說明轉(zhuǎn)錄對于RNA腫瘤病毒增殖可能是必須的。第六十三頁，共八十九頁。假說DNA是RNA腫瘤病毒在復(fù)制和致癌過程中的中間物這一過程大致為：RNA腫瘤病毒－DNA原病毒（或前病毒）－RNA腫瘤病毒。第六十四頁，共八十九頁。1970年，Temin和Baltimore分別在RNA腫瘤病毒中發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）

HowardTeminDavidBaltimore逆轉(zhuǎn)錄的證明第六十五頁，共八十九頁。逆轉(zhuǎn)錄病毒（retrovirus）1.定義：含逆轉(zhuǎn)錄酶的RNA病毒稱為逆轉(zhuǎn)錄病毒。所有的RNA腫瘤病毒都是逆轉(zhuǎn)錄病毒，但是，并不是所有的逆轉(zhuǎn)錄病毒都致癌。2.逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組：逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組由兩條相同的

正鏈RNA分子組成，其5‘端有cap，3’端有ployA尾。第六十六頁，共八十九頁。第六十七頁，共八十九頁。逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）定義：是RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶。具有三種酶活性，即RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶、DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶和RNaseH的活性。合成DNA的方向：逆轉(zhuǎn)錄酶合成DNA的方向為5’－3’。第六十八頁，共八十九頁。合成DNA的引物：不能從頭合成DNA。引物為逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝時從宿主細(xì)胞獲得的tRNA分子。一些鳥類逆轉(zhuǎn)錄病毒以宿主tRNATrp（色氨酸）為引物，鼠類逆轉(zhuǎn)病毒則以宿主細(xì)胞tRNAPro（脯氨酸）為引物。RNaseH活性：是指逆轉(zhuǎn)錄酶可以從5’－3’和3’－5’兩個方向水解DNA-RNA雜合分子中的RNA。第六十九頁，共八十九頁。逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄（reversetranscription）：是指在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下以RNA為模板合成DNA的過程。逆轉(zhuǎn)錄是對中心法則的重要修正和補充！RNA同樣具有遺傳信息的存儲、傳遞和表達(dá)功能第七十頁，共八十九頁。逆轉(zhuǎn)錄作用圖第七十一頁，共八十九頁。逆轉(zhuǎn)錄原理的應(yīng)用－RT-PCR反轉(zhuǎn)錄PCR（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCR）：是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U增反應(yīng)（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。第七十二頁，共八十九頁。RT-PCR過程首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶，以RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。然后以cDNA為模板，PCR擴增合成目的基因片段。第七十三頁，共八十九頁。RT-PCR的用途

1.檢測細(xì)胞中基因表達(dá)水平；2.檢測細(xì)胞中RNA病毒的含量；3.直接克隆特定基因的cDNA序列。第七十四頁，共八十九頁。端粒與端粒酶端粒是真核細(xì)胞線狀染色體末端的一小段DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體。第七十五頁，共八十九頁。端粒與端粒酶端粒是短的多重復(fù)的非轉(zhuǎn)錄序列（TTAGGG）及一些結(jié)合蛋白組成特殊結(jié)構(gòu)。穩(wěn)定染色體末端結(jié)構(gòu)，防止染色體間末端連接，并可補償滯后鏈5'末端在消除RNA引物后造成的空缺第七十六頁，共八十九頁。滯后鏈末端的復(fù)制困境第七十七頁，共八十九頁。端粒酶的發(fā)現(xiàn)1983年Blackburn實驗：纖毛蟲有兩個核，一個二倍體的小核，一個多倍體的大核。纖毛蟲在有性生殖過程中，大核由小核發(fā)育而來，其中小核rRNA基因為單拷貝。ElizabethBlackburn第七十八頁，共八十九頁。體外切下rRNA基因，成為游離基因，經(jīng)過擴增達(dá)到一萬拷貝；發(fā)現(xiàn)：這些經(jīng)過擴增的rDNA小分子末端都有端粒，也就是具有（G4T2）n重復(fù)片段；但小核rDNA基因的兩端原來沒有這段重復(fù)序列，這些末端重復(fù)序列，是切下后在纖毛蟲細(xì)胞內(nèi)加上去的。1983年Blackburn實驗第七十九頁，共八十九頁。端粒酶1984年，Blackburn等構(gòu)建了線性質(zhì)粒，進(jìn)行了加尾實驗結(jié)果表明：端粒復(fù)制的模板并不在端粒上第八十頁，共八十九頁。加尾和末端結(jié)構(gòu)的內(nèi)在聯(lián)系1985年實驗：以酵母的末端重復(fù)序列作為引物時，用四膜蟲抽提物加上的仍然是四膜蟲的端粒當(dāng)加熱到90度或用蛋白酶處理后，也不能延長末端第八十一頁，共八十九頁。端粒酶的結(jié)構(gòu)與功能1987年，Greider和Blackbrun分離出端粒酶，其分子量在200-500KD。端粒酶是一種含有RNA的蛋白質(zhì)，RNA長159bp，其中有一段保守序列CAACCCCAA，核酸酶對此區(qū)域不能剪切。端粒酶具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，依逆轉(zhuǎn)錄機制恢復(fù)端粒處DNA長度。第八十二頁，共八十九頁。端粒酶RNA的二級結(jié)構(gòu)端粒酶RNA的核心序列是復(fù)制端粒DNA的模板。第八十三頁，共八十九頁。端粒的復(fù)制模型1989年，GreiderandBlackburn提出端粒的復(fù)制模型：首先是端粒酶與端粒DN