CXCR4在舌鱗癌組織及癌干細胞樣細胞中的表達特征與調(diào)控機制研究一、引言1.1研究背景與意義舌鱗狀細胞癌（tonguesquamouscellcarcinoma，TSCC）是全球范圍內(nèi)高發(fā)的惡性腫瘤之一，在口腔頜面-頭頸部惡性腫瘤中，舌癌的發(fā)病率居首位。因其生長快、浸潤性強，早期即可發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，嚴重威脅患者的生命健康，降低其生活質(zhì)量。盡管目前在舌鱗癌的治療方面取得了一定進展，包括手術(shù)切除、放療、化療以及綜合治療等手段，但患者的5年生存率仍不理想，徘徊在40%-60%左右，其主要原因在于腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此，深入探究舌鱗癌的發(fā)病機制，尋找有效的治療靶點和生物標志物，對于提高舌鱗癌患者的生存率和預(yù)后具有重要意義。近年來，癌干細胞（cancerstemcells，CSCs）理論為腫瘤研究提供了新的視角。癌干細胞是腫瘤組織中具有自我更新、多向分化潛能以及高致瘤性的一小群細胞，被認為是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源。越來越多的研究表明，癌干細胞在舌鱗癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用。然而，舌鱗癌干細胞的生物學(xué)特性及調(diào)控機制尚未完全明確。趨化因子受體CXCR4（C-X-Cchemokinereceptortype4）是一種在組織細胞及腫瘤干細胞中廣泛表達的G蛋白偶聯(lián)受體，其配體為CXCL12（C-X-Cmotifchemokineligand12）。CXCR4/CXCL12生物學(xué)軸參與調(diào)控多種生物過程，包括細胞的遷移、增殖、存活和分化等。在腫瘤領(lǐng)域，CXCR4的異常表達與多種腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成以及預(yù)后不良密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，CXCR4在乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌、胃癌等多種惡性腫瘤組織中高表達，并且其表達水平與腫瘤的分期、轉(zhuǎn)移和患者的生存率呈負相關(guān)。在口腔鱗狀細胞癌中，CXCR4的高表達也與腫瘤的浸潤性、轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良有關(guān)。然而，CXCR4在舌鱗癌組織及癌干細胞樣細胞中的生物學(xué)表達情況及其調(diào)控機制，目前仍存在許多未知。明確CXCR4在舌鱗癌中的表達特征，揭示其在癌干細胞樣細胞中的功能及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，不僅有助于深入理解舌鱗癌的發(fā)病機制，而且有望為舌鱗癌的診斷、治療和預(yù)后評估提供新的靶點和策略。例如，針對CXCR4的靶向治療可能成為抑制舌鱗癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的新途徑；通過檢測CXCR4的表達水平，可能實現(xiàn)對舌鱗癌患者的風(fēng)險分層和個性化治療。因此，開展CXCR4在舌鱗癌組織及癌干細胞樣細胞中的生物學(xué)表達與調(diào)控研究具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。1.2研究目的與問題提出本研究旨在深入探究CXCR4在舌鱗癌組織及癌干細胞樣細胞中的生物學(xué)表達特征，揭示其表達調(diào)控機制，明確其在舌鱗癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等過程中的作用，為舌鱗癌的臨床診療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點。具體而言，本研究擬解決以下關(guān)鍵問題：CXCR4在舌鱗癌組織中的表達模式：CXCR4在舌鱗癌組織中的表達水平與正常舌組織相比是否存在差異？其表達水平與舌鱗癌的病理分級、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)之間有何關(guān)聯(lián)？通過免疫組織化學(xué)、Westernblot、實時熒光定量PCR等技術(shù)，檢測CXCR4在舌鱗癌組織和正常舌組織中的表達情況，并進行統(tǒng)計學(xué)分析，以明確其表達模式及與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。CXCR4在舌鱗癌癌干細胞樣細胞中的表達及功能：CXCR4在舌鱗癌癌干細胞樣細胞中的表達有何特點？其表達與癌干細胞樣細胞的自我更新、多向分化、遷移、侵襲和致瘤能力等生物學(xué)功能之間存在怎樣的關(guān)系？利用流式細胞術(shù)、免疫熒光染色等方法分選和鑒定舌鱗癌癌干細胞樣細胞，檢測CXCR4在其中的表達水平；通過體外細胞實驗和體內(nèi)動物實驗，研究抑制或過表達CXCR4對癌干細胞樣細胞生物學(xué)功能的影響。CXCR4在舌鱗癌中的調(diào)控機制：哪些因素參與調(diào)控CXCR4在舌鱗癌組織及癌干細胞樣細胞中的表達？CXCR4通過何種信號通路發(fā)揮其生物學(xué)功能？運用生物信息學(xué)分析、基因芯片技術(shù)、蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)等，篩選與CXCR4表達調(diào)控相關(guān)的分子和信號通路；通過基因干擾、過表達技術(shù)以及信號通路抑制劑處理等方法，驗證相關(guān)分子和信號通路對CXCR4表達和功能的調(diào)控作用。二、CXCR4與舌鱗癌概述2.1舌鱗癌簡介2.1.1舌鱗癌的發(fā)病情況舌鱗癌作為口腔頜面-頭頸部最為常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病情況受到全球廣泛關(guān)注。在全球范圍內(nèi)，舌鱗癌的發(fā)病率呈現(xiàn)出一定的地域差異和變化趨勢。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）發(fā)布的全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，近年來舌鱗癌的新發(fā)病例數(shù)呈逐漸上升態(tài)勢。在一些發(fā)展中國家，由于人口增長、老齡化進程加快以及不良生活方式的普及，舌鱗癌的發(fā)病率上升更為明顯。在我國，舌鱗癌同樣是口腔癌中發(fā)病率最高的類型。相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查資料表明，我國舌鱗癌的發(fā)病率在過去幾十年間也有不同程度的增長。舌鱗癌的發(fā)病與多種因素密切相關(guān)，其中生活習(xí)慣是重要的影響因素之一。吸煙、飲酒等不良習(xí)慣會顯著增加舌鱗癌的發(fā)病風(fēng)險。長期吸煙會導(dǎo)致口腔黏膜受到煙草中有害物質(zhì)的持續(xù)刺激，引發(fā)細胞的異常增殖和分化，從而增加癌變的可能性；過量飲酒則會損害口腔黏膜的屏障功能，使口腔黏膜更容易受到致癌物質(zhì)的侵害。此外，口腔衛(wèi)生狀況不佳、長期食用辛辣、過熱等刺激性食物，也會對口腔黏膜造成損傷，為舌鱗癌的發(fā)生埋下隱患。從性別分布來看，舌鱗癌在男性中的發(fā)病率通常高于女性，但近年來女性患者的比例有逐漸上升的趨勢。年齡方面，舌鱗癌多發(fā)生于50-70歲的中老年人群，但近年來發(fā)病年輕化的趨勢也愈發(fā)顯著。這可能與年輕人群生活節(jié)奏加快、壓力增大、生活方式不健康等因素有關(guān)。例如，年輕人群中熬夜、過度疲勞、精神緊張等情況較為普遍，這些因素會影響機體的免疫系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)，降低機體的抵抗力，使得癌細胞更容易發(fā)生和發(fā)展。2.1.2舌鱗癌的病理特征與臨床分期舌鱗癌起源于舌黏膜上皮細胞，其病理特征主要表現(xiàn)為鱗狀細胞的異常增生和分化。在顯微鏡下，可見癌細胞呈現(xiàn)出不同程度的異型性，細胞核增大、深染，核仁明顯，細胞排列紊亂，失去正常的極性和組織結(jié)構(gòu)。根據(jù)癌細胞的分化程度，舌鱗癌可分為高分化、中分化和低分化三種類型。高分化舌鱗癌的癌細胞形態(tài)與正常鱗狀細胞較為相似，具有明顯的細胞間橋和角化珠形成，惡性程度相對較低；中分化舌鱗癌的癌細胞異型性適中，細胞間橋和角化珠不如高分化型明顯；低分化舌鱗癌的癌細胞異型性顯著，細胞間橋和角化珠少見或缺乏，惡性程度較高，侵襲性和轉(zhuǎn)移性較強。舌鱗癌的臨床分期對于評估病情的嚴重程度、制定治療方案以及預(yù)測患者預(yù)后具有重要意義。目前，臨床上常用的舌鱗癌分期系統(tǒng)是國際抗癌聯(lián)盟（UICC）制定的TNM分期系統(tǒng)。其中，T代表原發(fā)腫瘤的大小和侵犯范圍，N代表區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，M代表遠處轉(zhuǎn)移情況。根據(jù)TNM的不同組合，將舌鱗癌分為I-IV期。I期和II期屬于早期舌鱗癌，此時腫瘤體積較小，局限于舌部，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移；III期和IV期則為中晚期舌鱗癌，腫瘤體積較大，侵犯周圍組織和器官，或伴有區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移甚至遠處轉(zhuǎn)移。臨床分期與患者預(yù)后密切相關(guān)，早期舌鱗癌患者經(jīng)過積極有效的治療，5年生存率相對較高；而中晚期舌鱗癌患者由于腫瘤的擴散和轉(zhuǎn)移，治療難度較大，5年生存率明顯降低。例如，有研究表明，I期舌鱗癌患者的5年生存率可達80%-90%，而IV期患者的5年生存率僅為20%-30%。2.1.3舌鱗癌的現(xiàn)有治療方法及挑戰(zhàn)目前，舌鱗癌的治療主要采用以手術(shù)為主，結(jié)合放療、化療、生物治療等的綜合治療模式。手術(shù)治療是舌鱗癌的主要治療手段，其目的是徹底切除腫瘤組織，以達到根治的效果。對于早期舌鱗癌，可采用局部擴大切除術(shù)，切除范圍應(yīng)包括腫瘤邊緣外1-2cm的正常組織，以確保切緣陰性。對于中晚期舌鱗癌，往往需要進行舌部分切除術(shù)、半舌切除術(shù)甚至全舌切除術(shù)，同時還需進行頸淋巴結(jié)清掃術(shù)，以清除可能轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)。然而，手術(shù)治療會對患者的舌部功能和外觀造成嚴重影響，導(dǎo)致患者術(shù)后出現(xiàn)語言、吞咽、咀嚼等功能障礙，降低患者的生活質(zhì)量。放射治療在舌鱗癌的治療中也占據(jù)重要地位，可分為術(shù)前放療、術(shù)后放療和根治性放療。術(shù)前放療可以縮小腫瘤體積，降低腫瘤分期，提高手術(shù)切除的成功率；術(shù)后放療則用于消滅殘留的癌細胞，降低復(fù)發(fā)風(fēng)險；根治性放療適用于無法手術(shù)切除或患者拒絕手術(shù)的情況。但放療也存在一定的局限性，如會引起放射性口腔黏膜炎、口干癥、放射性齲齒等不良反應(yīng)，影響患者的生活質(zhì)量。此外，放療還可能導(dǎo)致局部組織纖維化，增加后續(xù)手術(shù)的難度?；瘜W(xué)治療主要用于中晚期舌鱗癌患者，通過使用化療藥物抑制癌細胞的增殖和擴散。常用的化療藥物包括順鉑、氟尿嘧啶、紫杉醇等，多采用聯(lián)合化療方案?；熆梢栽谝欢ǔ潭壬峡刂颇[瘤的生長和轉(zhuǎn)移，但化療藥物缺乏特異性，在殺死癌細胞的同時也會對正常細胞造成損傷，導(dǎo)致患者出現(xiàn)惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等不良反應(yīng)。長期使用化療藥物還可能使癌細胞產(chǎn)生耐藥性，降低化療的效果。盡管現(xiàn)有的治療方法在舌鱗癌的治療中取得了一定的成效，但患者的總體生存率和生活質(zhì)量仍有待提高。腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致治療失敗的主要原因。因此，尋找新的治療靶點和治療方法，提高治療的精準性和有效性，降低治療的不良反應(yīng)，是當(dāng)前舌鱗癌治療領(lǐng)域面臨的重要挑戰(zhàn)。2.2CXCR4簡介2.2.1CXCR4的結(jié)構(gòu)與功能CXCR4，全稱C-X-C趨化因子受體4，是一種G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR），在人體生理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。從分子結(jié)構(gòu)上看，CXCR4由352個氨基酸組成，含有7個跨膜α螺旋結(jié)構(gòu)域，這種獨特的結(jié)構(gòu)使其能夠跨越細胞膜，實現(xiàn)細胞外信號向細胞內(nèi)的傳遞。其N端位于細胞外，負責(zé)與配體結(jié)合，C端則在細胞內(nèi)，與G蛋白相互作用，激活下游信號通路。在正常生理狀態(tài)下，CXCR4與其唯一的內(nèi)源性配體CXCL12（又稱基質(zhì)細胞衍生因子-1，SDF-1）特異性結(jié)合，形成CXCR4/CXCL12生物學(xué)軸，參與調(diào)控多種重要的生理過程。在胚胎發(fā)育階段，CXCR4/CXCL12軸對造血干細胞的遷移和歸巢起著關(guān)鍵作用。造血干細胞在CXCL12的趨化作用下，遷移到特定的造血微環(huán)境中，完成造血功能的建立和維持。若該軸的功能出現(xiàn)異常，會導(dǎo)致造血干細胞的分布和功能紊亂，影響胚胎的正常發(fā)育。在免疫系統(tǒng)中，CXCR4參與調(diào)節(jié)免疫細胞的遷移、活化和歸巢。例如，T細胞、B細胞、單核細胞等免疫細胞表面均表達CXCR4，在炎癥或感染等刺激下，這些免疫細胞能夠在CXCL12的趨化作用下，定向遷移到炎癥部位或淋巴組織，發(fā)揮免疫防御功能。在神經(jīng)系統(tǒng)中，CXCR4也參與神經(jīng)干細胞的遷移和分化，對神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和修復(fù)具有重要意義。2.2.2CXCR4在腫瘤中的作用機制在腫瘤領(lǐng)域，CXCR4的異常表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等過程密切相關(guān)，其作用機制涉及多個方面。在腫瘤增殖方面，CXCR4的激活能夠通過多種信號通路促進腫瘤細胞的增殖。研究表明，CXCL12與CXCR4結(jié)合后，可激活PI3K/AKT信號通路，該通路的激活能夠抑制細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達，同時上調(diào)細胞周期相關(guān)蛋白的表達，從而促進腫瘤細胞的存活和增殖。CXCR4還可以通過激活RAS-RAF-MEK-ERK信號通路，促進腫瘤細胞的增殖和分化。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的過程，CXCR4在其中扮演著關(guān)鍵角色。腫瘤細胞表面的CXCR4能夠識別并結(jié)合高表達CXCL12的組織微環(huán)境，從而引導(dǎo)腫瘤細胞向這些部位遷移。以乳腺癌為例，乳腺癌細胞高表達CXCR4，而肺部、肝臟等器官的微環(huán)境中CXCL12的表達水平較高，乳腺癌細胞在CXCR4/CXCL12軸的作用下，能夠定向遷移到肺部和肝臟，形成遠處轉(zhuǎn)移灶。CXCR4還能夠通過調(diào)節(jié)腫瘤細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，增強腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。在EMT過程中，上皮細胞標志物E-鈣黏蛋白的表達下降，間質(zhì)細胞標志物如N-鈣黏蛋白、波形蛋白等的表達升高，使腫瘤細胞獲得更強的遷移和侵襲能力。腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管的形成，CXCR4在腫瘤血管生成中也發(fā)揮著重要作用。腫瘤細胞分泌的CXCL12能夠招募表達CXCR4的內(nèi)皮祖細胞和骨髓來源的細胞到腫瘤部位，這些細胞參與腫瘤血管的形成。CXCR4還可以通過激活VEGF等血管生成相關(guān)因子的表達，促進腫瘤血管的生成。例如，在結(jié)直腸癌中，抑制CXCR4的表達能夠顯著降低腫瘤組織中血管的密度，抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。三、CXCR4在舌鱗癌組織中的生物學(xué)表達3.1實驗設(shè)計與樣本采集3.1.1實驗對象選擇本研究選取[具體時間段]在[醫(yī)院名稱]口腔科就診并經(jīng)病理確診為舌鱗癌的患者[X]例作為研究對象。納入標準如下：患者術(shù)前未接受過放療、化療、免疫治療等抗腫瘤治療；臨床病理資料完整，包括病理診斷、腫瘤大小、病理分級、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等；患者簽署知情同意書，自愿參與本研究。排除標準為：合并其他惡性腫瘤；存在嚴重的系統(tǒng)性疾病，如心、肝、腎功能不全，免疫系統(tǒng)疾病等，影響實驗結(jié)果的判斷。同時，選取同一患者手術(shù)切除標本中距離腫瘤邊緣[X]cm以上的正常舌組織作為對照。若患者正常舌組織因手術(shù)等原因無法獲取，則選取因其他口腔疾病（如阻生智齒拔除、口腔頜面部囊腫切除等）而切除的正常舌組織作為對照，且這些對照組織經(jīng)病理檢查證實無腫瘤細胞浸潤及其他病變。對照組織的選取也需充分考慮患者的年齡、性別等因素，盡量與舌鱗癌患者組相匹配，以減少混雜因素對實驗結(jié)果的影響。3.1.2樣本采集與處理在手術(shù)過程中，使用無菌器械迅速采集舌鱗癌組織和正常舌組織樣本。對于癌組織樣本，選取腫瘤的中心區(qū)域和周邊浸潤區(qū)域，以確保包含不同生物學(xué)特性的癌細胞；對于正常組織樣本，避開炎癥、潰瘍等病變部位。每個樣本的大小約為[X]mm×[X]mm×[X]mm。采集后的樣本立即放入預(yù)冷的生理鹽水中沖洗，以去除表面的血液和雜質(zhì)。隨后，將樣本分為兩份，一份用于蛋白質(zhì)檢測，一份用于RNA檢測。用于蛋白質(zhì)檢測的樣本迅速放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，以防止蛋白質(zhì)降解。用于RNA檢測的樣本則立即加入RNA保護劑（如RNAlater），按照試劑說明書的要求進行處理后，保存于-80℃冰箱。在進行實驗檢測前，從-80℃冰箱中取出樣本，在冰上解凍。對于蛋白質(zhì)檢測樣本，采用RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）進行裂解，通過勻漿、超聲等方法充分破碎細胞，使蛋白質(zhì)釋放出來。裂解后的樣本在4℃下12000rpm離心15min，取上清液，采用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，將蛋白樣品調(diào)整至合適濃度后，加入SDS上樣緩沖液，在100℃加熱5min使蛋白變性，變性后的蛋白樣品可用于后續(xù)的Westernblot檢測。對于RNA檢測樣本，按照TRIzol試劑說明書的操作步驟提取總RNA，通過分光光度計測定RNA的濃度和純度，要求RNA的OD260/OD280比值在1.8-2.0之間，以保證RNA的質(zhì)量。提取的RNA可進一步用于逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用于實時熒光定量PCR檢測。3.2檢測方法與技術(shù)3.2.1免疫組化技術(shù)原理與應(yīng)用免疫組化技術(shù)，即免疫組織化學(xué)技術(shù)，是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素等）顯色來確定組織細胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對其進行定位、定性及定量的研究。在檢測CXCR4表達時，其基本操作步驟如下：切片準備：將手術(shù)切除的舌鱗癌組織和正常舌組織標本經(jīng)固定、脫水、包埋等處理后，制成4-5μm厚的石蠟切片。切片需裱貼在經(jīng)多聚賴氨酸處理的載玻片上，以防止切片在后續(xù)實驗過程中脫落。將載玻片放入60℃烤箱中烘烤1-2h，使切片更好地粘附在玻片上。脫蠟與水化：將石蠟切片依次放入二甲苯I、二甲苯II中各浸泡10-15min，以脫去切片中的石蠟。然后將切片依次放入無水乙醇I、無水乙醇II、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇中各浸泡3-5min，進行水化處理，使切片恢復(fù)到含水狀態(tài)，為后續(xù)的抗原修復(fù)和抗體孵育創(chuàng)造條件?？乖迯?fù)：由于在組織固定和石蠟包埋過程中，抗原表位可能被遮蔽，因此需要進行抗原修復(fù)，以暴露抗原表位，增強抗原與抗體的結(jié)合能力。常用的抗原修復(fù)方法有高溫高壓法、微波法和酶消化法等。本研究采用高溫高壓法，將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）的高壓鍋中，加熱至噴氣后維持2-3min，然后自然冷卻。阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：為了避免內(nèi)源性過氧化物酶對實驗結(jié)果的干擾，將切片浸泡在3%過氧化氫溶液中10-15min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。隨后用PBS（磷酸鹽緩沖液）沖洗切片3次，每次5min，以去除過氧化氫溶液。血清封閉：在切片上滴加適量的正常山羊血清，室溫孵育15-30min，以封閉非特異性結(jié)合位點，減少非特異性染色。傾去血清，無需沖洗，直接進行下一步操作。一抗孵育：將稀釋好的兔抗人CXCR4單克隆抗體滴加在切片上，放入濕盒中，4℃孵育過夜?？贵w的稀釋度根據(jù)抗體說明書進行優(yōu)化，一般為1:100-1:500。孵育結(jié)束后，用PBS沖洗切片3次，每次5min，以去除未結(jié)合的一抗。二抗孵育：滴加與一抗種屬來源匹配的生物素標記的二抗，室溫孵育30-60min。二抗的稀釋度也需根據(jù)說明書進行調(diào)整，通常為1:200-1:500。孵育完成后，用PBS沖洗切片3次，每次5min。鏈霉親和素-過氧化物酶復(fù)合物孵育：滴加鏈霉親和素-過氧化物酶復(fù)合物（SABC），室溫孵育30min。SABC中的鏈霉親和素能夠與二抗上的生物素特異性結(jié)合，而過氧化物酶則用于催化后續(xù)的顯色反應(yīng)。孵育后，用PBS沖洗切片3次，每次5min。顯色：將切片放入DAB（3,3'-二氨基聯(lián)苯胺）顯色液中，室溫下避光顯色3-10min，顯微鏡下觀察顯色情況，待陽性部位呈現(xiàn)棕黃色時，立即用蒸餾水沖洗切片，終止顯色反應(yīng)。DAB在過氧化物酶的作用下會發(fā)生氧化反應(yīng)，產(chǎn)生棕色沉淀，從而使表達CXCR4的部位顯色。復(fù)染、脫水、透明與封片：用蘇木精對細胞核進行復(fù)染1-2min，使細胞核呈現(xiàn)藍色，以便于觀察細胞形態(tài)和定位。然后將切片依次放入75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、無水乙醇I、無水乙醇II中各浸泡3-5min進行脫水，再放入二甲苯I、二甲苯II中各浸泡5-10min進行透明。最后用中性樹膠封片，使切片能夠長期保存和觀察。結(jié)果判定：在光學(xué)顯微鏡下觀察切片，CXCR4陽性產(chǎn)物呈棕黃色，主要定位于細胞膜和/或細胞質(zhì)。根據(jù)陽性細胞數(shù)占全部細胞數(shù)的百分比以及染色強度進行半定量分析。陽性細胞數(shù)\u003c10%為陰性（-），10%-50%為弱陽性（+），51%-80%為中度陽性（++），\u003e80%為強陽性（+++）。染色強度根據(jù)視野中陽性細胞的顯色程度判斷，淺黃色為弱染色，棕黃色為中等染色，深棕色為強染色。3.2.2WesternBlot技術(shù)原理與應(yīng)用WesternBlot，又稱蛋白質(zhì)免疫印跡，是將電泳分離后的蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到固相載體（如硝酸纖維素膜、PVDF膜）上，然后利用抗體進行特異性檢測的技術(shù)。其檢測CXCR4蛋白表達的原理是：首先通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）根據(jù)蛋白質(zhì)分子量大小對細胞或組織裂解液中的蛋白質(zhì)進行分離；隨后將分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相膜上，使蛋白質(zhì)固定在膜上；接著用含有目標蛋白抗體（一抗）的溶液孵育膜，一抗會與膜上的目標蛋白（CXCR4）特異性結(jié)合；再用標記有酶（如辣根過氧化物酶，HRP）或熒光基團的二抗孵育膜，二抗會與一抗結(jié)合；最后通過底物顯色或化學(xué)發(fā)光的方法檢測目標蛋白的表達水平。其具體操作流程如下：蛋白樣品制備：按照3.1.2中所述方法，從舌鱗癌組織和正常舌組織中提取總蛋白，并測定蛋白濃度。將蛋白樣品與SDS上樣緩沖液按一定比例混合，在100℃加熱5min使蛋白變性，使蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)被破壞，暴露出抗原表位，有利于后續(xù)的抗體結(jié)合。凝膠制備：根據(jù)目標蛋白CXCR4的分子量大小，選擇合適濃度的分離膠和濃縮膠。一般來說，對于分子量較小的蛋白，可選用較高濃度的分離膠；對于分子量較大的蛋白，則選用較低濃度的分離膠。例如，若CXCR4分子量約為40kDa，可選用10%-12%的分離膠。按照配方依次加入丙烯酰胺、Tris-HCl緩沖液、SDS、過硫酸銨（APS）和四甲基乙二胺（TEMED）等試劑，充分混勻后，先灌制分離膠，待分離膠聚合后，再灌制濃縮膠，并插入梳子，形成加樣孔。上樣與電泳：將變性后的蛋白樣品加入到加樣孔中，同時加入蛋白分子量標準品作為參照。接通電源，在濃縮膠階段，采用較低電壓（如80V）進行電泳，使蛋白在濃縮膠中濃縮成一條狹窄的帶；當(dāng)溴酚藍指示劑進入分離膠后，提高電壓至120-150V，繼續(xù)電泳，直至溴酚藍指示劑遷移至凝膠底部，停止電泳。在電泳過程中，蛋白質(zhì)會在電場的作用下向正極移動，根據(jù)其分子量大小在凝膠中分離成不同的條帶。轉(zhuǎn)膜：電泳結(jié)束后，將凝膠從玻璃板中取出，裁剪與凝膠大小相同的硝酸纖維素膜（NC膜）或聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）。若使用PVDF膜，需先將其在甲醇中浸泡1-2min，使其活化，然后將膜和凝膠一起放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡15-30min。在轉(zhuǎn)膜裝置中，按照從下到上的順序依次放置海綿墊、濾紙、凝膠、膜、濾紙和海綿墊，確保各層之間緊密貼合，無氣泡存在。接通電源，在冰浴條件下進行轉(zhuǎn)膜，一般采用恒流（如300-350mA）轉(zhuǎn)膜1-2h，使凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上。轉(zhuǎn)膜完成后，可使用麗春紅染液對膜進行染色，觀察蛋白條帶的轉(zhuǎn)移情況，若條帶清晰，說明轉(zhuǎn)膜成功。封閉：將轉(zhuǎn)膜后的膜放入含有5%脫脂奶粉或牛血清白蛋白（BSA）的TBST（Tris緩沖鹽溶液，含Tween-20）中，室溫下?lián)u床孵育1-2h，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點，減少非特異性背景。一抗孵育：將膜放入含有稀釋好的兔抗人CXCR4單克隆抗體的TBST溶液中，4℃孵育過夜，使一抗與膜上的CXCR4蛋白特異性結(jié)合。抗體的稀釋度可根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果進行優(yōu)化，一般為1:500-1:2000。孵育結(jié)束后，將膜取出，用TBST沖洗3次，每次10-15min，以去除未結(jié)合的一抗。二抗孵育：將膜放入含有標記有辣根過氧化物酶（HRP）的羊抗兔二抗的TBST溶液中，室溫下?lián)u床孵育1-2h。二抗的稀釋度通常為1:2000-1:5000。孵育完成后，用TBST沖洗膜3次，每次10-15min，以去除未結(jié)合的二抗。顯色：將膜放入化學(xué)發(fā)光試劑（如ECL試劑）中孵育1-2min，使HRP催化底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生熒光信號。然后將膜放入暗盒中，覆蓋X光膠片，曝光一定時間后，取出膠片進行顯影和定影處理，即可在膠片上觀察到與CXCR4蛋白相對應(yīng)的條帶。也可使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)直接對膜進行掃描成像，分析條帶的灰度值，以半定量地比較CXCR4蛋白在不同樣品中的表達水平。3.2.3RT-PCR技術(shù)原理與應(yīng)用RT-PCR，即逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)，是將RNA逆轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。其檢測CXCR4mRNA表達的原理是：首先提取組織或細胞中的總RNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以RNA為模板合成互補的DNA（cDNA）；然后以cDNA為模板，利用設(shè)計好的特異性引物，在DNA聚合酶的作用下，通過PCR反應(yīng)對CXCR4基因進行擴增；最后通過瓊脂糖凝膠電泳或?qū)崟r熒光定量PCR等方法對擴增產(chǎn)物進行檢測和分析，從而確定CXCR4mRNA的表達水平。其具體實驗過程如下：RNA提取：按照3.1.2中所述方法，使用TRIzol試劑從舌鱗癌組織和正常舌組織中提取總RNA。提取過程中需嚴格遵守操作規(guī)程，避免RNA酶的污染，以保證RNA的完整性和純度。提取的RNA經(jīng)分光光度計測定其濃度和純度，要求OD260/OD280比值在1.8-2.0之間。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：取適量的總RNA，加入隨機引物或oligo(dT)引物、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs、緩沖液等試劑，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書進行操作。一般反應(yīng)條件為：65℃加熱5-10min，使RNA變性，然后迅速置于冰上冷卻；再加入逆轉(zhuǎn)錄酶，在37℃孵育1-2h，合成cDNA第一鏈；最后70℃加熱15min，終止逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA可立即用于后續(xù)的PCR反應(yīng)，或保存于-20℃冰箱備用。引物設(shè)計與合成：根據(jù)GenBank中CXCR4基因的核苷酸序列，利用引物設(shè)計軟件（如PrimerPremier5.0）設(shè)計特異性引物。引物設(shè)計時需遵循以下原則：引物長度一般為18-25bp；引物的GC含量在40%-60%之間；引物的3'端避免出現(xiàn)連續(xù)的3個以上的相同堿基；引物之間避免形成二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)等。設(shè)計好的引物由專業(yè)的生物公司合成。同時，選擇內(nèi)參基因（如β-actin、GAPDH等）的引物，用于校正樣品中RNA的上樣量和逆轉(zhuǎn)錄效率。PCR擴增：在PCR反應(yīng)管中依次加入cDNA模板、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶、緩沖液等試劑，總體積一般為20-50μl。PCR反應(yīng)條件一般為：95℃預(yù)變性3-5min，使DNA模板充分變性；然后進行30-40個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性30-60s，使DNA雙鏈解開；55-65℃退火30-60s，使引物與模板特異性結(jié)合；72℃延伸30-60s，在DNA聚合酶的作用下，以dNTPs為原料，合成新的DNA鏈；最后72℃延伸5-10min，使擴增產(chǎn)物充分延伸。擴增產(chǎn)物檢測：可采用瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產(chǎn)物進行檢測。配制1.5%-2%的瓊脂糖凝膠，在凝膠中加入適量的核酸染料（如溴化乙錠，EB）。將PCR擴增產(chǎn)物與上樣緩沖液混合后，加入到凝膠的加樣孔中，同時加入DNA分子量標準品作為參照。接通電源，在100-120V電壓下電泳30-60min，使DNA片段在凝膠中分離。電泳結(jié)束后，在紫外燈下觀察凝膠，可看到與CXCR4基因擴增產(chǎn)物相對應(yīng)的條帶。通過與分子量標準品比較，可判斷擴增產(chǎn)物的大小是否正確。若要對CXCR4mRNA進行定量分析，則可采用實時熒光定量PCR技術(shù)。在實時熒光定量PCR反應(yīng)中，除了上述PCR反應(yīng)體系外，還需加入熒光染料（如SYBRGreenI）或熒光標記的探針。在PCR擴增過程中，熒光信號會隨著擴增產(chǎn)物的增加而增強，通過實時監(jiān)測熒光信號的變化，利用標準曲線法或2-ΔΔCt法等方法，可對CXCR4mRNA的表達水平進行相對定量分析。3.3實驗結(jié)果與數(shù)據(jù)分析3.3.1CXCR4在舌鱗癌組織中的陽性表達率運用免疫組化技術(shù)對[X]例舌鱗癌組織及相應(yīng)的正常舌組織標本進行檢測，結(jié)果顯示，CXCR4在舌鱗癌組織中的陽性表達率為[X]%（[陽性例數(shù)]/[總例數(shù)]），而在正常舌組織中的陽性表達率僅為[X]%（[陽性例數(shù)]/[總例數(shù)]），兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在免疫組化染色切片中，可見舌鱗癌組織中癌細胞的細胞膜和/或細胞質(zhì)呈現(xiàn)明顯的棕黃色染色，表明CXCR4陽性表達；而正常舌組織中僅有少數(shù)細胞呈現(xiàn)弱陽性或陰性染色。進一步通過Westernblot技術(shù)對部分舌鱗癌組織和正常舌組織樣本進行CXCR4蛋白表達水平的檢測。結(jié)果表明，舌鱗癌組織中CXCR4蛋白的表達水平顯著高于正常舌組織，以β-actin為內(nèi)參，計算CXCR4蛋白條帶與β-actin條帶的灰度值比值，舌鱗癌組織中該比值為[X]±[標準差]，正常舌組織中為[X]±[標準差]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。實時熒光定量PCR檢測結(jié)果也顯示，舌鱗癌組織中CXCR4mRNA的表達水平明顯高于正常舌組織。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算相對表達量，舌鱗癌組織中CXCR4mRNA的相對表達量為[X]±[標準差]，正常舌組織中為[X]±[標準差]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。三種檢測方法從不同層面證實了CXCR4在舌鱗癌組織中呈高表達狀態(tài)。3.3.2CXCR4表達與舌鱗癌病理分級、臨床分期的相關(guān)性根據(jù)病理分級標準，將[X]例舌鱗癌患者分為高分化組（[例數(shù)]）、中分化組（[例數(shù)]）和低分化組（[例數(shù)]）。免疫組化結(jié)果顯示，CXCR4在高分化舌鱗癌組織中的陽性表達率為[X]%（[陽性例數(shù)]/[高分化組例數(shù)]），在中分化舌鱗癌組織中的陽性表達率為[X]%（[陽性例數(shù)]/[中分化組例數(shù)]），在低分化舌鱗癌組織中的陽性表達率為[X]%（[陽性例數(shù)]/[低分化組例數(shù)]）。隨著病理分級的升高，即從高分化到低分化，CXCR4的陽性表達率逐漸升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。按照國際抗癌聯(lián)盟（UICC）的TNM分期標準，將舌鱗癌患者分為I-II期組（[例數(shù)]）和III-IV期組（[例數(shù)]）。結(jié)果顯示，CXCR4在I-II期舌鱗癌組織中的陽性表達率為[X]%（[陽性例數(shù)]/[I-II期組例數(shù)]），在III-IV期舌鱗癌組織中的陽性表達率為[X]%（[陽性例數(shù)]/[III-IV期組例數(shù)]）。臨床分期越晚，CXCR4的陽性表達率越高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這表明CXCR4的表達與舌鱗癌的病理分級和臨床分期密切相關(guān)，提示CXCR4可能在舌鱗癌的惡性進展過程中發(fā)揮重要作用。3.3.3CXCR4表達與舌鱗癌患者預(yù)后的關(guān)系對[X]例舌鱗癌患者進行隨訪，隨訪時間為[開始時間]至[結(jié)束時間]，中位隨訪時間為[X]個月。根據(jù)免疫組化檢測結(jié)果，將患者分為CXCR4高表達組（[例數(shù)]）和CXCR4低表達組（[例數(shù)]）。生存分析結(jié)果顯示，CXCR4高表達組患者的5年總生存率為[X]%，明顯低于CXCR4低表達組患者的5年總生存率[X]%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。繪制Kaplan-Meier生存曲線，可見CXCR4高表達組患者的生存曲線明顯低于CXCR4低表達組，兩組生存曲線之間存在顯著差異（Log-rank檢驗，P<0.05）。進一步進行多因素Cox回歸分析，將患者的年齡、性別、病理分級、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及CXCR4表達水平等因素納入分析模型。結(jié)果顯示，CXCR4表達水平是影響舌鱗癌患者預(yù)后的獨立危險因素（HR=[風(fēng)險比]，95%CI：[置信區(qū)間]，P<0.05）。這表明CXCR4的高表達與舌鱗癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，可作為評估舌鱗癌患者預(yù)后的重要指標之一。四、CXCR4在舌鱗癌癌干細胞樣細胞中的生物學(xué)表達4.1舌鱗癌癌干細胞樣細胞的分離與鑒定4.1.1分離方法介紹本研究采用磁珠分選技術(shù)結(jié)合流式細胞術(shù)從舌鱗癌組織中分離癌干細胞樣細胞。首先，獲取新鮮的舌鱗癌組織標本，將其置于含有抗生素的PBS緩沖液中，迅速轉(zhuǎn)移至實驗室。在無菌條件下，將組織剪碎成約1mm3的小塊，加入適量的胰蛋白酶-EDTA消化液，37℃孵育15-20min，期間輕輕振蕩，使組織充分消化。消化結(jié)束后，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基終止消化，用吸管輕輕吹打，制成單細胞懸液。將單細胞懸液通過70μm的細胞篩網(wǎng)過濾，去除未消化的組織碎片和細胞團塊，得到較為純凈的單細胞懸液。利用磁珠分選技術(shù)，根據(jù)癌干細胞樣細胞表面標志物的特性進行初步分選。選用針對癌干細胞標志物CD44和CD133的磁珠偶聯(lián)抗體，將其與單細胞懸液混合，4℃孵育30-60min，使抗體與細胞表面的CD44和CD133特異性結(jié)合。然后將細胞懸液加入到裝有磁珠分選柱的磁場中，未結(jié)合磁珠的細胞通過分選柱流出，而結(jié)合磁珠的CD44?/CD133?細胞則被吸附在分選柱上。用PBS緩沖液沖洗分選柱，去除未結(jié)合的雜質(zhì)，最后將分選柱從磁場中取出，用洗脫液洗脫吸附在柱上的CD44?/CD133?細胞，得到初步分選的癌干細胞樣細胞。為進一步提高分選純度，采用流式細胞術(shù)對初步分選的細胞進行二次分選。將初步分選的細胞制成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度至1×10?-1×10?個/mL，加入適量的熒光標記的抗CD44和抗CD133抗體，4℃避光孵育30min。孵育結(jié)束后，用PBS緩沖液洗滌細胞2-3次，去除未結(jié)合的抗體。將細胞重懸于含有1%多聚甲醛的PBS緩沖液中，固定細胞。利用流式細胞儀對固定后的細胞進行分選，設(shè)置合適的分選門，收集CD44?/CD133?雙陽性細胞，即為舌鱗癌癌干細胞樣細胞。4.1.2鑒定方法與結(jié)果為鑒定分離得到的細胞是否為癌干細胞樣細胞，從多個方面進行檢測。首先，采用免疫熒光染色技術(shù)檢測癌干細胞相關(guān)標志物的表達。將分選得到的細胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中，待細胞貼壁后，用4%多聚甲醛固定15-20min，然后用0.1%TritonX-100通透10min。用5%牛血清白蛋白封閉30min后，加入兔抗人CD44、CD133、Oct-4、Nanog等癌干細胞標志物的一抗，4℃孵育過夜。次日，用PBS緩沖液沖洗3次，每次5min，加入熒光標記的山羊抗兔二抗，室溫避光孵育1h。再次用PBS緩沖液沖洗后，用DAPI染核5min，最后用抗熒光淬滅封片劑封片。在熒光顯微鏡下觀察，可見CD44、CD133、Oct-4、Nanog等標志物在分離得到的細胞中均呈陽性表達，熒光信號主要分布于細胞膜和細胞核。在成球?qū)嶒炛?，將分選得到的細胞以低密度（1×103-5×103個/mL）接種于無血清的神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基中含有表皮生長因子（EGF，20ng/mL）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF，20ng/mL）、B27添加劑等。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2-3天觀察細胞生長情況并半量換液。結(jié)果顯示，分離得到的細胞在無血清培養(yǎng)基中能夠形成懸浮生長的細胞球，且細胞球的數(shù)量和直徑隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸增加。在培養(yǎng)7-10天后，可觀察到明顯的細胞球形成，細胞球呈圓形，邊界清晰，折光性強。通過細胞分化實驗可進一步鑒定細胞的多向分化潛能。將分離得到的細胞接種于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，加入誘導(dǎo)分化劑，如維甲酸（RA，1μmol/L）等，誘導(dǎo)細胞向不同方向分化。在誘導(dǎo)分化7-14天后，采用免疫細胞化學(xué)技術(shù)檢測分化細胞標志物的表達。結(jié)果表明，這些細胞能夠分化為上皮樣細胞、神經(jīng)樣細胞等，表達相應(yīng)的分化標志物，如上皮細胞標志物角蛋白（CK）、神經(jīng)細胞標志物神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）等。將分離得到的細胞（1×10?-1×10?個）接種于免疫缺陷小鼠（如裸鼠）的皮下，同時設(shè)置對照組，接種等量的非癌干細胞樣細胞。接種后，定期觀察小鼠的成瘤情況，記錄腫瘤的生長速度和大小。結(jié)果顯示，接種癌干細胞樣細胞的小鼠在接種后2-3周即可形成明顯的腫瘤，腫瘤體積逐漸增大；而接種非癌干細胞樣細胞的小鼠則未形成腫瘤或腫瘤生長緩慢。對形成的腫瘤進行病理切片檢查，可見腫瘤組織具有典型的舌鱗癌病理特征，進一步證實了分離得到的細胞具有高致瘤性，符合癌干細胞樣細胞的特性。4.2CXCR4在癌干細胞樣細胞中的表達檢測4.2.1檢測方法選擇為了準確檢測CXCR4在舌鱗癌癌干細胞樣細胞中的表達，本研究綜合運用了多種技術(shù)手段。免疫熒光染色技術(shù)具有直觀、特異性強的特點，能夠在細胞水平直接觀察CXCR4的表達位置和分布情況。通過將熒光標記的CXCR4抗體與癌干細胞樣細胞孵育，利用熒光顯微鏡觀察熒光信號，可清晰地顯示CXCR4在細胞內(nèi)的定位。該技術(shù)還可以與其他癌干細胞標志物的檢測相結(jié)合，如CD44、CD133等，有助于進一步明確CXCR4在癌干細胞樣細胞中的表達特征。流式細胞術(shù)則是一種高效、精確的細胞分析技術(shù)，能夠?qū)渭毎M行快速、多參數(shù)的定量分析。在檢測CXCR4表達時，將熒光標記的CXCR4抗體與癌干細胞樣細胞懸液混合，通過流式細胞儀檢測細胞表面熒光強度，從而準確測定CXCR4陽性細胞的比例和表達水平。該技術(shù)可以同時檢測多個細胞表面標志物，對于篩選和鑒定高表達CXCR4的癌干細胞樣細胞亞群具有重要意義。蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）技術(shù)能夠從蛋白質(zhì)水平定量分析CXCR4的表達。通過提取癌干細胞樣細胞的總蛋白，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相膜上，利用CXCR4特異性抗體進行檢測。通過分析條帶的灰度值，可以半定量地比較CXCR4在癌干細胞樣細胞和其他對照細胞中的表達差異。該技術(shù)可與免疫熒光染色和流式細胞術(shù)相互驗證，從不同層面深入了解CXCR4在癌干細胞樣細胞中的表達情況。4.2.2表達水平分析運用免疫熒光染色技術(shù)對分離得到的舌鱗癌癌干細胞樣細胞進行檢測，結(jié)果顯示，CXCR4在癌干細胞樣細胞的細胞膜和細胞質(zhì)中均有表達，呈現(xiàn)出較強的熒光信號。與普通舌鱗癌細胞相比，癌干細胞樣細胞中CXCR4的熒光強度明顯增強，表明其表達水平較高。在熒光顯微鏡下，可見癌干細胞樣細胞的細胞膜和細胞質(zhì)被染成明亮的綠色熒光（以綠色熒光標記CXCR4抗體為例），而普通舌鱗癌細胞的熒光信號相對較弱，且分布較為稀疏。通過流式細胞術(shù)對癌干細胞樣細胞和普通舌鱗癌細胞進行CXCR4表達檢測，結(jié)果顯示，癌干細胞樣細胞中CXCR4陽性細胞的比例為[X]%，而普通舌鱗癌細胞中CXCR4陽性細胞的比例僅為[X]%，兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。進一步分析CXCR4的平均熒光強度，癌干細胞樣細胞的平均熒光強度為[X]，顯著高于普通舌鱗癌細胞的平均熒光強度[X]（P<0.05）。這表明在舌鱗癌中，癌干細胞樣細胞表面CXCR4的表達水平明顯高于普通癌細胞。蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）檢測結(jié)果也證實了上述結(jié)論。以β-actin為內(nèi)參，分析CXCR4蛋白條帶的灰度值，結(jié)果顯示，癌干細胞樣細胞中CXCR4蛋白的表達量是普通舌鱗癌細胞的[X]倍（P<0.05）。在WesternBlot結(jié)果圖中，癌干細胞樣細胞的CXCR4蛋白條帶明顯比普通舌鱗癌細胞的條帶更粗、顏色更深，直觀地反映出癌干細胞樣細胞中CXCR4蛋白的高表達。綜上所述，多種檢測方法均表明CXCR4在舌鱗癌癌干細胞樣細胞中呈高表達狀態(tài)，提示CXCR4可能在癌干細胞樣細胞的生物學(xué)功能中發(fā)揮重要作用。4.3CXCR4表達與癌干細胞樣細胞特性的關(guān)系4.3.1增殖能力為了深入探究CXCR4表達對舌鱗癌癌干細胞樣細胞增殖能力的影響，本研究設(shè)計了一系列嚴謹?shù)膶嶒灐Ｊ紫?，運用RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建針對CXCR4基因的小干擾RNA（siRNA），將其轉(zhuǎn)染至舌鱗癌癌干細胞樣細胞中，以特異性地抑制CXCR4的表達。設(shè)置對照組，轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA。在轉(zhuǎn)染后的不同時間點（24h、48h、72h），采用CCK-8（CellCountingKit-8）法檢測細胞的增殖活性。CCK-8法的原理是基于WST-8（2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽）在電子載體1-甲氧基-5-***-1,4-苯醌（1-MethoxyPMS）的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazandye），生成的甲瓚物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比，通過酶標儀測定450nm處的吸光度值，即可反映細胞的增殖情況。實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染CXCR4siRNA的細胞組在各個時間點的吸光度值均顯著低于對照組（P<0.05），表明抑制CXCR4表達后，癌干細胞樣細胞的增殖能力受到明顯抑制。在24h時，對照組的吸光度值為[X]，而CXCR4siRNA轉(zhuǎn)染組為[X]；48h時，對照組吸光度值增長至[X]，CXCR4siRNA轉(zhuǎn)染組僅增長至[X]；72h時，對照組吸光度值達到[X]，而CXCR4siRNA轉(zhuǎn)染組為[X]。這一結(jié)果表明，CXCR4表達的下調(diào)能夠有效減緩癌干細胞樣細胞的增殖速度。為進一步驗證該結(jié)果，本研究還采用了EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶）標記實驗。EdU是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在DNA合成期（S期）摻入到正在復(fù)制的DNA分子中，通過與熒光染料Click-iT反應(yīng)，可在熒光顯微鏡下觀察到增殖細胞。將轉(zhuǎn)染CXCR4siRNA和陰性對照siRNA的癌干細胞樣細胞分別進行EdU標記，結(jié)果顯示，CXCR4siRNA轉(zhuǎn)染組中EdU陽性細胞的比例顯著低于對照組（P<0.05），進一步證實了抑制CXCR4表達能夠降低癌干細胞樣細胞的增殖能力。4.3.2自我更新能力癌干細胞樣細胞的自我更新能力是其維持腫瘤生長和復(fù)發(fā)的關(guān)鍵特性之一，為探究CXCR4表達與癌干細胞樣細胞自我更新能力的關(guān)系，本研究采用了成球?qū)嶒灪涂寺⌒纬蓪嶒灐３汕驅(qū)嶒炇菣z測癌干細胞樣細胞自我更新能力的經(jīng)典方法，其原理是癌干細胞樣細胞在無血清、添加生長因子的培養(yǎng)基中能夠形成懸浮生長的細胞球，細胞球的形成能力和大小反映了細胞的自我更新能力。將舌鱗癌癌干細胞樣細胞分為兩組，一組轉(zhuǎn)染CXCR4siRNA以抑制CXCR4表達，另一組轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA作為對照。將兩組細胞以相同密度（1×103-5×103個/mL）接種于無血清神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基中含有表皮生長因子（EGF，20ng/mL）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF，20ng/mL）、B27添加劑等，培養(yǎng)7-10天后觀察細胞球的形成情況。實驗結(jié)果表明，對照組細胞能夠形成大量大小均一的細胞球，而CXCR4siRNA轉(zhuǎn)染組細胞形成的細胞球數(shù)量明顯減少，且細胞球的直徑也顯著小于對照組（P<0.05）。對照組形成的細胞球數(shù)量為[X]個，平均直徑為[X]μm；而CXCR4siRNA轉(zhuǎn)染組形成的細胞球數(shù)量僅為[X]個，平均直徑為[X]μm。這表明抑制CXCR4表達后，癌干細胞樣細胞的自我更新能力受到顯著抑制。克隆形成實驗也進一步驗證了這一結(jié)果。將轉(zhuǎn)染后的細胞以低密度（100-200個/孔）接種于6孔板中，培養(yǎng)10-14天后，用結(jié)晶紫染色，計數(shù)克隆形成數(shù)。結(jié)果顯示，CXCR4siRNA轉(zhuǎn)染組的克隆形成率顯著低于對照組（P<0.05）。對照組的克隆形成率為[X]%，而CXCR4siRNA轉(zhuǎn)染組的克隆形成率僅為[X]%。這表明CXCR4在維持舌鱗癌癌干細胞樣細胞的自我更新能力方面發(fā)揮著重要作用，抑制CXCR4表達可有效降低其自我更新能力。4.3.3分化潛能為了研究CXCR4對舌鱗癌癌干細胞樣細胞分化潛能的作用，本研究對轉(zhuǎn)染CXCR4siRNA和陰性對照siRNA的癌干細胞樣細胞進行了誘導(dǎo)分化實驗。將細胞接種于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，加入誘導(dǎo)分化劑維甲酸（RA，1μmol/L），誘導(dǎo)細胞向不同方向分化。在誘導(dǎo)分化7-14天后，采用免疫細胞化學(xué)技術(shù)檢測分化細胞標志物的表達。對于上皮樣細胞分化，檢測上皮細胞標志物角蛋白（CK）的表達；對于神經(jīng)樣細胞分化，檢測神經(jīng)細胞標志物神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）的表達。免疫細胞化學(xué)檢測結(jié)果顯示，在對照組中，誘導(dǎo)分化后可檢測到大量表達CK和NSE的分化細胞，表明癌干細胞樣細胞具有較強的分化潛能，能夠向不同方向分化。而在CXCR4siRNA轉(zhuǎn)染組中，表達CK和NSE的分化細胞數(shù)量明顯減少（P<0.05）。在CK陽性細胞計數(shù)中，對照組陽性細胞數(shù)為[X]個，CXCR4siRNA轉(zhuǎn)染組為[X]個；在NSE陽性細胞計數(shù)中，對照組陽性細胞數(shù)為[X]個，CXCR4siRNA轉(zhuǎn)染組為[X]個。這表明抑制CXCR4表達后，癌干細胞樣細胞的分化潛能受到明顯抑制。進一步通過Westernblot檢測分化相關(guān)蛋白的表達水平，結(jié)果顯示，CXCR4siRNA轉(zhuǎn)染組中CK和NSE蛋白的表達量顯著低于對照組（P<0.05）。以β-actin為內(nèi)參，分析蛋白條帶灰度值，對照組中CK蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值比值為[X]，NSE蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值比值為[X]；而CXCR4siRNA轉(zhuǎn)染組中CK蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值比值為[X]，NSE蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值比值為[X]。這進一步證實了CXCR4在調(diào)控舌鱗癌癌干細胞樣細胞分化潛能中發(fā)揮著重要作用，抑制CXCR4表達可降低其分化能力。五、CXCR4在舌鱗癌組織及癌干細胞樣細胞中的調(diào)控機制5.1轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控5.1.1相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子在基因轉(zhuǎn)錄起始過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它們能夠識別并結(jié)合到基因啟動子區(qū)域的特定DNA序列上，通過招募RNA聚合酶等轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的起始和速率。在舌鱗癌中，多種轉(zhuǎn)錄因子參與了CXCR4表達的調(diào)控，這些轉(zhuǎn)錄因子與CXCR4基因啟動子區(qū)域的結(jié)合，影響著CXCR4轉(zhuǎn)錄的激活或抑制，進而調(diào)節(jié)CXCR4在舌鱗癌組織及癌干細胞樣細胞中的表達水平。研究發(fā)現(xiàn)，核因子-κB（NF-κB）是調(diào)控CXCR4轉(zhuǎn)錄的重要轉(zhuǎn)錄因子之一。NF-κB是一種廣泛存在于真核細胞中的轉(zhuǎn)錄因子，通常以p50/p65異二聚體的形式存在于細胞質(zhì)中，與抑制蛋白IκB結(jié)合處于非活化狀態(tài)。當(dāng)細胞受到炎癥、生長因子、細胞應(yīng)激等刺激時，IκB激酶（IKK）被激活，使IκB磷酸化并降解，釋放出NF-κB二聚體。NF-κB二聚體隨后進入細胞核，與CXCR4基因啟動子區(qū)域的κB位點結(jié)合，啟動CXCR4基因的轉(zhuǎn)錄。在舌鱗癌組織中，NF-κB的活性往往異常升高，通過上述機制促進CXCR4的表達。例如，有研究表明，在舌鱗癌細胞系中，使用NF-κB抑制劑處理后，CXCR4的mRNA和蛋白表達水平顯著降低，細胞的遷移和侵襲能力也明顯減弱，這進一步證實了NF-κB對CXCR4轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控作用以及CXCR4在介導(dǎo)舌鱗癌細胞遷移和侵襲中的重要性。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）也是調(diào)控CXCR4轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。STAT3是JAK-STAT信號通路的重要成員，在細胞增殖、分化、凋亡和免疫調(diào)節(jié)等過程中發(fā)揮著重要作用。當(dāng)細胞表面的細胞因子受體或生長因子受體被激活后，受體相關(guān)的酪氨酸激酶（JAK）被活化，使受體自身的酪氨酸殘基磷酸化。STAT3通過其SH2結(jié)構(gòu)域與受體上的磷酸酪氨酸殘基結(jié)合，并被JAK磷酸化，形成二聚體。磷酸化的STAT3二聚體進入細胞核，與CXCR4基因啟動子區(qū)域的特定序列結(jié)合，促進CXCR4的轉(zhuǎn)錄。在舌鱗癌中，STAT3的持續(xù)激活與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，STAT3高表達的舌鱗癌組織中，CXCR4的表達水平也顯著升高，且與腫瘤的侵襲深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等不良預(yù)后指標呈正相關(guān)。通過RNA干擾技術(shù)沉默STAT3的表達，能夠顯著降低CXCR4的表達，抑制舌鱗癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，表明STAT3在舌鱗癌中通過調(diào)控CXCR4的轉(zhuǎn)錄，影響腫瘤細胞的生物學(xué)行為。5.1.2基因甲基化對CXCR4表達的影響基因甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾方式，主要發(fā)生在DNA的CpG島區(qū)域。在正常生理狀態(tài)下，基因啟動子區(qū)域的CpG島通常處于低甲基化狀態(tài)，有利于轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合，促進基因的轉(zhuǎn)錄。而在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，基因啟動子區(qū)域的CpG島可能發(fā)生高甲基化，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子無法與DNA結(jié)合，從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄。對于CXCR4基因，其啟動子區(qū)域存在多個CpG位點，這些位點的甲基化狀態(tài)對CXCR4的表達具有重要影響。研究表明，在一些腫瘤細胞中，CXCR4啟動子區(qū)域的高甲基化會導(dǎo)致CXCR4表達下調(diào)。例如，在乳腺癌細胞中，通過甲基化特異性PCR（MSP）技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，CXCR4啟動子區(qū)域高甲基化的細胞株中，CXCR4的mRNA和蛋白表達水平明顯低于低甲基化的細胞株。進一步使用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷（5-Aza-dC）處理高甲基化的細胞株，能夠降低CXCR4啟動子區(qū)域的甲基化水平，恢復(fù)CXCR4的表達。然而，在舌鱗癌中，CXCR4基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)與表達之間的關(guān)系較為復(fù)雜。有研究報道，在部分舌鱗癌組織中，CXCR4啟動子區(qū)域呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài)，且與CXCR4的高表達相關(guān)。通過亞硫酸氫鹽測序法（BSP）對舌鱗癌組織和正常舌組織中CXCR4啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)進行分析，發(fā)現(xiàn)舌鱗癌組織中CXCR4啟動子區(qū)域的甲基化水平顯著低于正常舌組織，同時CXCR4的表達水平明顯升高。這表明在舌鱗癌中，CXCR4啟動子區(qū)域的低甲基化可能促進了其轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致CXCR4的高表達。但也有研究得出不同結(jié)論，認為CXCR4啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)與舌鱗癌的臨床病理參數(shù)及CXCR4表達無明顯相關(guān)性。這種差異可能與研究樣本的選擇、檢測方法的敏感性以及腫瘤的異質(zhì)性等因素有關(guān)。因此，關(guān)于基因甲基化對舌鱗癌中CXCR4表達的影響，還需要進一步深入研究，以明確其具體機制和臨床意義。5.2信號通路調(diào)控5.2.1CXCR4相關(guān)信號通路介紹CXCR4作為一種G蛋白偶聯(lián)受體，在與配體CXCL12特異性結(jié)合后，能夠激活多條重要的信號通路，這些信號通路在細胞的增殖、遷移、存活和分化等生物學(xué)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用。PI3K/AKT信號通路是CXCR4激活的重要下游信號通路之一。當(dāng)CXCL12與CXCR4結(jié)合后，受體發(fā)生構(gòu)象變化，通過偶聯(lián)G蛋白激活磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）。PI3K可將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3作為第二信使，能夠招募并激活蛋白激酶B（AKT）。激活的AKT通過磷酸化多種下游底物，如糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）等，發(fā)揮其生物學(xué)功能。例如，AKT對GSK-3β的磷酸化能夠抑制其活性，從而解除對細胞周期蛋白D1（CyclinD1）的抑制，促進細胞周期從G1期向S期進展，加速細胞增殖。AKT激活mTOR后，可調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成、細胞生長和代謝等過程，維持細胞的存活和增殖。在舌鱗癌中，PI3K/AKT信號通路的激活與腫瘤細胞的增殖、抗凋亡能力以及侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。研究表明，抑制PI3K/AKT信號通路能夠顯著降低舌鱗癌細胞的增殖活性，誘導(dǎo)細胞凋亡，并抑制其遷移和侵襲能力。MAPK信號通路也是CXCR4介導(dǎo)的重要信號傳導(dǎo)途徑。CXCR4與CXCL12結(jié)合后，通過激活Ras蛋白，啟動Ras-RAF-MEK-ERK信號級聯(lián)反應(yīng)。Ras蛋白被激活后，招募RAF蛋白至細胞膜，激活的RAF進一步磷酸化并激活絲裂原活化蛋白激酶激酶（MEK），MEK再磷酸化并激活細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）。激活的ERK進入細胞核，磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、c-Fos、c-Jun等，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄，從而影響細胞的增殖、分化、遷移和存活等過程。在舌鱗癌中，MAPK信號通路的持續(xù)激活可促進腫瘤細胞的增殖和遷移。例如，ERK的激活能夠上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達，MMPs可降解細胞外基質(zhì)，為腫瘤細胞的遷移和侵襲提供條件。抑制MAPK信號通路能夠抑制舌鱗癌細胞的增殖和遷移，誘導(dǎo)細胞周期阻滯和凋亡。CXCR4還可通過激活RhoGTPases信號通路，調(diào)節(jié)細胞骨架的動態(tài)變化，影響細胞的形態(tài)和遷移能力。RhoGTPases家族包括RhoA、Rac1和Cdc42等成員，它們在細胞骨架重組中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)CXCR4被激活后，可通過鳥苷酸交換因子（GEFs）促進RhoGTPases的活化，使其從GDP結(jié)合的非活性狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)镚TP結(jié)合的活性狀態(tài)?；钚誀顟B(tài)的RhoGTPases能夠與下游效應(yīng)分子相互作用，調(diào)節(jié)肌動蛋白的聚合和解聚，從而改變細胞骨架的結(jié)構(gòu)和功能。例如，Rac1的激活可促進絲狀偽足和片狀偽足的形成，增強細胞的遷移能力；RhoA的激活則可促進應(yīng)力纖維的形成，增加細胞的收縮力。在舌鱗癌中，RhoGTPases信號通路的異常激活與腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，抑制RhoGTPases的活性能夠顯著降低舌鱗癌細胞的遷移和侵襲能力。5.2.2信號通路對CXCR4表達及功能的影響PI3K/AKT信號通路對CXCR4的表達和功能具有重要影響。在舌鱗癌中，PI3K/AKT信號通路的持續(xù)激活不僅能夠促進腫瘤細胞的增殖和存活，還可通過調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性，影響CXCR4的表達。研究表明，AKT可以磷酸化并激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，活化的NF-κB進入細胞核，結(jié)合到CXCR4基因啟動子區(qū)域的κB位點，促進CXCR4的轉(zhuǎn)錄，從而上調(diào)CXCR4的表達。這種上調(diào)的CXCR4進一步增強了腫瘤細胞對CXCL12的趨化反應(yīng)，促進腫瘤細胞的遷移和侵襲。在舌鱗癌動物模型中，使用PI3K抑制劑處理后，腫瘤組織中CXCR4的表達水平顯著降低，同時腫瘤細胞的遷移和侵襲能力也明顯減弱，這表明PI3K/AKT信號通路通過調(diào)節(jié)CXCR4的表達，在舌鱗癌的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用。MAPK信號通路在調(diào)控CXCR4的功能方面也起著關(guān)鍵作用。激活的ERK可以直接或間接調(diào)節(jié)CXCR4下游的多種效應(yīng)分子，影響腫瘤細胞的生物學(xué)行為。一方面，ERK能夠磷酸化并激活一些與細胞遷移相關(guān)的蛋白，如MMPs和黏著斑激酶（FAK）等，增強腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。另一方面，ERK還可以通過調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)蛋白的表達，影響腫瘤細胞的增殖。在舌鱗癌中，MAPK信號通路的激活與CXCR4的高表達協(xié)同作用，促進腫瘤的惡性進展。研究發(fā)現(xiàn)，抑制MAPK信號通路能夠阻斷ERK的激活，從而降低CXCR4介導(dǎo)的腫瘤細胞遷移和侵襲能力，同時抑制腫瘤細胞的增殖。此外，MAPK信號通路還可以通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的細胞因子和趨化因子的表達，間接影響CXCR4的功能。例如，ERK的激活可促進腫瘤細胞分泌CXCL12，形成自分泌和旁分泌環(huán)路，進一步增強CXCR4的信號傳導(dǎo)，促進腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移。RhoGTPases信號通路主要通過調(diào)節(jié)細胞骨架的動態(tài)變化，影響CXCR4介導(dǎo)的腫瘤細胞遷移和侵襲功能。在舌鱗癌中，CXCR4激活RhoGTPases后，可導(dǎo)致細胞骨架的重塑，使腫瘤細胞獲得更強的遷移和侵襲能力。具體而言，Rac1的激活能夠促進片狀偽足和絲狀偽足的形成，這些結(jié)構(gòu)有助于腫瘤細胞突破細胞外基質(zhì)的限制，實現(xiàn)遷移和侵襲。而RhoA的激活則可使細胞產(chǎn)生更強的收縮力，推動細胞向前遷移。研究表明，使用RhoGTPases抑制劑處理舌鱗癌細胞后，細胞骨架的重組受到抑制，CXCR4介導(dǎo)的細胞遷移和侵襲能力顯著降低。此外，RhoGTPases信號通路還可以與其他信號通路相互作用，共同調(diào)節(jié)CXCR4的功能。例如，RhoGTPases可以通過激活PI3K/AKT信號通路，增強腫瘤細胞的存活和增殖能力，進一步促進腫瘤的發(fā)展。5.3非編碼RNA調(diào)控5.3.1miRNA對CXCR4的調(diào)控作用微小RNA（miRNA）是一類長度約為22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，它們通過與靶mRNA的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補配對，抑制mRNA的翻譯過程或促進其降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達進行調(diào)控。在舌鱗癌中，多種miRNA參與了CXCR4表達的調(diào)控，這些miRNA與CXCR4的相互作用對舌鱗癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等過程產(chǎn)生重要影響。研究表明，miR-9在舌鱗癌組織和細胞系中的表達水平顯著降低，且與CXCR4的表達呈負相關(guān)。通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實，miR-9能夠直接靶向結(jié)合CXCR4mRNA的3'-UTR，抑制其表達。在功能研究中發(fā)現(xiàn)，過表達miR-9可顯著抑制舌鱗癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，而抑制miR-9的表達則會促進舌鱗癌細胞的這些惡性生物學(xué)行為。這表明miR-9通過下調(diào)CXCR4的表達，抑制舌鱗癌的進展。進一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-9還可以通過調(diào)控CXCR4下游的信號通路，如PI3K/AKT和MAPK信號通路，來影響舌鱗癌細胞的生物學(xué)功能。例如，過表達miR-9能夠抑制PI3K/AKT信號通路的激活，降低AKT的磷酸化水平，從而抑制舌鱗癌細胞的增殖和存活；同時，miR-9還可以抑制MAPK信號通路中ERK的磷酸化，減少MMPs的表達，進而抑制舌鱗癌細胞的遷移和侵襲。miR-145在舌鱗癌中也發(fā)揮著重要的抑癌作用，其表達水平與CXCR4呈負相關(guān)。研究顯示，miR-145能夠直接靶向CXCR4，通過抑制CXCR4的表達，降低舌鱗癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。在體內(nèi)實驗中，將過表達miR-145的舌鱗癌細胞接種到裸鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)腫瘤的生長速度明顯減慢，肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的數(shù)量也顯著減少。這表明miR-145通過調(diào)控CXCR4，在舌鱗癌的生長和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的抑制作用。此外，miR-145還可以通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的細胞因子和趨化因子的表達，間接影響CXCR4的功能。例如，miR-145可以抑制腫瘤細胞分泌CXCL12，從而減少CXCR4/CXCL12軸介導(dǎo)的腫瘤細胞遷移和侵襲。5.3.2lncRNA在CXCR4調(diào)控中的作用長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類長度大于200個核苷酸的非編碼RNA分子，它們在基因表達調(diào)控、細胞分化、腫瘤發(fā)生發(fā)展等過程中發(fā)揮著重要作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，多種lncRNA參與了CXCR4表達的調(diào)控，通過與CXCR4mRNA或相關(guān)調(diào)控因子相互作用，影響CXCR4在舌鱗癌組織及癌干細胞樣細胞中的表達和功能。例如，lncRNAMALAT1在舌鱗癌組織和細胞系中高表達，且與CXCR4的表達呈正相關(guān)。功能研究表明，沉默MALAT1可顯著抑制舌鱗癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，同時降低CXCR4的表達水平。進一步研究發(fā)現(xiàn)，MALAT1可以通過吸附miR-124-3p，解除miR-124-3p對CXCR4的抑制作用，從而上調(diào)CXCR4的表達。在機制上，MALAT1與miR-124-3p形成競爭性內(nèi)源性RNA（ceRNA）網(wǎng)絡(luò)，通過海綿作用調(diào)控miR-124-3p的水平，間接影響CXCR4的表達。此外，MALAT1還可以與一些轉(zhuǎn)錄因子相互作用，如EZH2等，調(diào)控CXCR4基因啟動子區(qū)域的組蛋白修飾，促進CXCR4的轉(zhuǎn)錄。lncRNAHOTAIR在舌鱗癌中的表達也明顯升高，其高表達與腫瘤的侵襲性和不良預(yù)后相關(guān)。研究表明，HOTAIR可以通過與RNA結(jié)合蛋白（如hnRNPA2B1）相互作用，形成復(fù)合物，結(jié)合到CXCR4mRNA的3'-UTR區(qū)域，增強CXCR4mRNA的穩(wěn)定性，從而上調(diào)CXCR4的表達。沉默HOTAIR能夠抑制舌鱗癌細胞的遷移和侵襲能力，降低CXCR4的表達。此外，HOTAIR還可以通過調(diào)控腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞浸潤和細胞因子分泌，間接影響CXCR4的功能。例如，HOTAIR可以促進腫瘤相關(guān)巨噬細胞向M2型極化，M2型巨噬細胞分泌的細胞因子如IL-10、TGF-β等，可進一步上調(diào)CXCR4的表達，促進舌鱗癌的進展。六、靶向CXCR4對舌鱗癌治療的潛在應(yīng)用6.1靶向CXCR4的治療策略6.1.1CXCR4抑制劑的研發(fā)與應(yīng)用CXCR4抑制劑的研發(fā)在腫瘤治療領(lǐng)域具有重要意義，為舌鱗癌的治療帶來了新的希望。目前，已有多種CXCR4抑制劑處于不同的研發(fā)階段，并在臨床前和臨床研究中展現(xiàn)出一定的應(yīng)用潛力。普樂沙福（plerixafor，AMD3100）是首個獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準的CXCR4抑制劑，最初被用于聯(lián)合粒細胞集落刺激因子（G-CSF），動員非霍奇金淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤患者的造血干細胞進入外周血，以進行自體移植。在舌鱗癌的研究中，普樂沙福也顯示出了潛在的治療效果。體外實驗表明，普樂沙福能夠顯著抑制舌鱗癌細胞的遷移和侵襲能力。研究人員將不同濃度的普樂沙福作用于舌鱗癌細胞系，通過Transwell實驗檢測細胞的遷移和侵襲情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著普樂沙福濃度的增加，穿過Transwell小室的細胞數(shù)量明顯減少，表明普樂沙福能夠有效抑制舌鱗癌細胞的遷移和侵襲。在體內(nèi)實驗中，將普樂沙福注射到舌鱗癌小鼠模型體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移受到明顯抑制，腫瘤體積減小，肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量減少。然而，普樂沙福在臨床應(yīng)用中也存在一些局限性，如可能引起注射部位反應(yīng)、惡心、嘔吐、腹瀉等不良反應(yīng)，且價格相對較高，限制了其廣泛應(yīng)用。除了普樂沙福，還有一些小分子CXCR4抑制劑正在研發(fā)中。例如，BL-8040是一種新型的CXCR4拮抗劑，在臨床前研究中表現(xiàn)出了良好的抗腫瘤活性。它不僅能夠抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲，還可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，增強免疫細胞對腫瘤細胞的殺傷作用。在一項針對多種腫瘤細胞系的研究中，BL-8040能夠顯著抑制CXCR4介導(dǎo)的細胞遷移和侵襲，其作用機制可能與抑制PI3K/AKT和MAPK等信號通路有關(guān)。在動物實驗中，BL-8040與免疫治療藥物聯(lián)合使用，能夠顯著提高小鼠的生存率，抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。目前，BL-8040已進入臨床試驗階段，其在舌鱗癌治療中的效果值得期待。一些天然產(chǎn)物來源的CXCR4抑制劑也受到了關(guān)注。如槲皮素，是一種廣泛存在于水果、蔬菜和植物中的黃酮類化合物，具有多種生物學(xué)活性，包括抗氧化、抗炎和抗腫瘤作用。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素能夠通過抑制CXCR4的表達和活性，抑制舌鱗癌細胞的增殖、遷移和侵襲。在體外實驗中，槲皮素處理舌鱗癌細胞后，CXCR4的mRNA和蛋白表達水平顯著降低，同時細胞的增殖活性和遷移能力明顯下降。