miRNA在人結(jié)直腸癌淋巴管形成中的作用及分子機(jī)制解析一、引言1.1研究背景結(jié)直腸癌（ColorectalCancer，CRC）是全球范圍內(nèi)常見的消化道惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類健康。根據(jù)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥數(shù)據(jù)，結(jié)直腸癌的新發(fā)病例數(shù)位居所有癌癥的第三位，死亡病例數(shù)位居第二位。其發(fā)病率和死亡率在不同地區(qū)存在差異，發(fā)達(dá)國家的發(fā)病率普遍高于發(fā)展中國家，但隨著發(fā)展中國家經(jīng)濟(jì)水平的提高和生活方式的西化，結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜過程，涉及遺傳、環(huán)境、生活方式等多種因素。早期結(jié)直腸癌患者通常無明顯癥狀，隨著腫瘤的進(jìn)展，可出現(xiàn)便血、腹痛、排便習(xí)慣改變、腸梗阻等癥狀。然而，多數(shù)患者在確診時(shí)已處于中晚期，此時(shí)腫瘤往往已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移，治療效果和預(yù)后較差。據(jù)統(tǒng)計(jì)，早期結(jié)直腸癌患者的5年生存率可達(dá)90%以上，而晚期患者的5年生存率則低于20%。因此，深入了解結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的早期診斷和治療靶點(diǎn)，對于提高結(jié)直腸癌患者的生存率和生活質(zhì)量具有重要意義。腫瘤的轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致結(jié)直腸癌患者死亡的主要原因之一，其中淋巴轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌最常見的轉(zhuǎn)移途徑。腫瘤細(xì)胞通過淋巴管進(jìn)入?yún)^(qū)域淋巴結(jié)，進(jìn)而擴(kuò)散到遠(yuǎn)處器官，如肝臟、肺等。淋巴管生成在腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用，它為腫瘤細(xì)胞提供了進(jìn)入淋巴循環(huán)的通道。因此，研究腫瘤淋巴管生成的機(jī)制，對于阻斷腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移具有重要的理論和臨床意義。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長度約為21-23個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA，廣泛存在于真核生物中。miRNA通過與靶mRNA的3'-非編碼區(qū)（3'-UTR）互補(bǔ)配對，抑制mRNA的翻譯過程或促使其降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)。研究表明，miRNA參與了生物體的多種生理和病理過程，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡、代謝等，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮著重要作用。在結(jié)直腸癌中，多種miRNA的表達(dá)水平發(fā)生異常改變，這些異常表達(dá)的miRNA通過調(diào)控不同的信號通路和靶基因，影響結(jié)直腸癌的細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。同時(shí)，miRNA在腫瘤淋巴管生成中的作用也逐漸受到關(guān)注，越來越多的研究表明，miRNA可以通過直接或間接調(diào)控淋巴管生成相關(guān)因子的表達(dá)，參與腫瘤淋巴管生成的過程。因此，深入研究miRNA在結(jié)直腸癌淋巴管生成中的作用及分子機(jī)制，有望為結(jié)直腸癌的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。1.2miRNA概述miRNA是一類內(nèi)源性的非編碼單鏈RNA分子，長度通常在21-23個(gè)核苷酸左右。其序列在不同物種間具有一定的保守性，這種保守性暗示了miRNA在生物進(jìn)化過程中發(fā)揮著重要且基礎(chǔ)的作用。從結(jié)構(gòu)上看，miRNA基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的初級轉(zhuǎn)錄本（pri-miRNA）是具有較長核苷酸序列的RNA分子，它包含一個(gè)或多個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)。這些發(fā)夾結(jié)構(gòu)在后續(xù)的加工過程中起到關(guān)鍵作用。miRNA的生成是一個(gè)復(fù)雜且精細(xì)調(diào)控的過程。在細(xì)胞核內(nèi)，編碼miRNA的基因首先由RNA聚合酶Ⅱ或聚合酶Ⅲ轉(zhuǎn)錄合成初級miRNA（pri-miRNA）。pri-miRNA在DROSHA酶和DGCR8蛋白組成的復(fù)合體作用下，被切割成長度約為70-100個(gè)核苷酸的發(fā)夾狀前體miRNA（pre-miRNA）。隨后，pre-miRNA在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin-5和GTP酶的協(xié)同作用下，從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中。在細(xì)胞質(zhì)中，pre-miRNA被核酸酶Dicer識(shí)別并切割，形成長度約為21-25個(gè)堿基的雙鏈miRNA。雙鏈miRNA進(jìn)一步解旋，其中一條鏈會(huì)被保留下來，成為具有生物學(xué)活性的成熟miRNA，而另一條鏈通常會(huì)被降解。miRNA主要通過與靶mRNA的3'-非編碼區(qū)（3'-UTR）互補(bǔ)配對，來實(shí)現(xiàn)對基因表達(dá)的調(diào)控作用。當(dāng)成熟的miRNA與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）結(jié)合形成miRNA-RISC復(fù)合體后，便開始發(fā)揮其調(diào)控功能。如果miRNA與靶mRNA的3'-UTR完全互補(bǔ)配對，miRNA-RISC復(fù)合體會(huì)招募核酸酶，對靶mRNA進(jìn)行切割，從而導(dǎo)致靶mRNA的降解，使其無法翻譯為蛋白質(zhì)；若miRNA與靶mRNA的3'-UTR不完全互補(bǔ)配對，則主要通過抑制靶mRNA的翻譯過程，阻止蛋白質(zhì)的合成，進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。一條miRNA可以調(diào)控多個(gè)靶mRNA，同時(shí)一個(gè)靶mRNA也可能受到多條miRNA的共同調(diào)節(jié)，這種復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)使得miRNA能夠參與生物體的多種生理和病理過程，對維持細(xì)胞的正常功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起著至關(guān)重要的作用。1.3人結(jié)直腸癌淋巴管形成機(jī)制腫瘤淋巴管生成是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及多種細(xì)胞和分子的相互作用，在結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。炎癥是腫瘤微環(huán)境的重要特征之一，與結(jié)直腸癌淋巴管生成密切相關(guān)。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）作為腫瘤間質(zhì)中數(shù)量最多的炎癥細(xì)胞群，約占炎癥細(xì)胞總數(shù)的30%-50%，在腫瘤淋巴管生成中扮演著重要角色。TAM來源于外周循環(huán)血中的單核細(xì)胞，在腫瘤細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞分泌的多種因子如IL-10、CCL、VEGF等作用下，單核細(xì)胞被招募、分化、存活和增殖形成TAM。研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌細(xì)胞能表達(dá)VEGF-C、VEGF-D，瘤周間質(zhì)TAM也能表達(dá)VEGF-C、VEGF-D及VEGFR-3，VEGF-C及其他炎性因子趨化VEGFR-3+單核細(xì)胞進(jìn)入間質(zhì)后轉(zhuǎn)化成巨噬細(xì)胞，隨后表達(dá)VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3，從而促進(jìn)淋巴管生成。在惡性黑色素瘤中，外源性的VEGF-C不僅可以誘導(dǎo)淋巴管生成和血管生成，還可以募集巨噬細(xì)胞。此外，促炎細(xì)胞因子如IL-1β、IL-6、IL-17等也在促進(jìn)腫瘤淋巴管生成的過程中發(fā)揮重要作用。IL-1β可以促使細(xì)胞釋放促血管生成因子，從而間接地促進(jìn)腫瘤淋巴管的生成；IL-6可以誘導(dǎo)VEGF-C的表達(dá)，并促進(jìn)腫瘤淋巴管的生成；IL-17可以促進(jìn)VEGF-C表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤淋巴管生成。血管內(nèi)皮生長因子-C（VEGF-C）是目前研究最多的淋巴管生成因子，在結(jié)直腸癌的淋巴管生成中發(fā)揮著核心作用。VEGF-C主要通過與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上的VEGFR-3受體結(jié)合，激活下游信號通路，包括MAPK、PI3K/Akt和PLCγ等，從而導(dǎo)致淋巴內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和存活，促進(jìn)淋巴管的生成。臨床研究表明，VEGF-C在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)顯著高于正常組織，且其表達(dá)水平與有無淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。檢測48例結(jié)直腸癌患者腫瘤原發(fā)病灶及正常對照組織中VEGF-C及D2-40（淋巴管內(nèi)皮標(biāo)記物，用于評估淋巴管密度，LVD）的表達(dá)情況，結(jié)果顯示VEGF-C在結(jié)直腸癌及正常組織中的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在有無淋巴轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；結(jié)直腸癌及正常組織中的LVD差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，有無淋巴轉(zhuǎn)移組的LVD差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且VEGF-C陽性表達(dá)與陰性表達(dá)的LVD差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這充分表明VEGF-C在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，并可能促進(jìn)其淋巴管生成及淋巴轉(zhuǎn)移。除了炎癥和VEGF-C，其他一些因子和信號通路也參與了結(jié)直腸癌淋巴管生成的調(diào)控。例如，血小板衍生生長因子B（PDGF-B）是一個(gè)多功能的生長因子，涉及血管生成和淋巴管生成的多個(gè)方面。PDGF-B通過激活PDGFR-β受體，促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和分化，參與淋巴管生成過程。在血管淋巴管瘤中，PDGF-B過表達(dá)，促進(jìn)腫瘤淋巴管增生，提示其在腫瘤淋巴管生成中可能發(fā)揮重要作用。Notch信號通路參與血管和平滑肌細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過程，在結(jié)直腸癌淋巴管生成中也存在異常調(diào)節(jié)。在血管淋巴管瘤中，Notch信號通路異?；钴S，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和分化受損，雖然目前關(guān)于其在結(jié)直腸癌淋巴管生成中具體作用機(jī)制的研究還相對較少，但已有研究提示該信號通路可能是一個(gè)潛在的調(diào)控靶點(diǎn)。此外，PI3K/Akt、ERK和NF-κB等信號通路也參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、存活和遷移等過程，在淋巴瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，雖然針對結(jié)直腸癌淋巴管生成的研究有待深入，但這些信號通路在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的普遍性作用，暗示其在結(jié)直腸癌淋巴管生成中可能扮演著重要角色。腫瘤淋巴管生成在結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移中具有關(guān)鍵意義。新生的淋巴管為腫瘤細(xì)胞進(jìn)入淋巴循環(huán)提供了直接的通路，使得腫瘤細(xì)胞能夠通過淋巴管轉(zhuǎn)移至區(qū)域淋巴結(jié)，進(jìn)而擴(kuò)散到遠(yuǎn)處器官。研究表明，結(jié)直腸癌患者的淋巴管密度與腫瘤的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及預(yù)后密切相關(guān)，淋巴管密度越高，腫瘤越容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，患者的預(yù)后往往越差。腫瘤淋巴管生成還可能影響腫瘤的免疫微環(huán)境，淋巴管不僅可以運(yùn)輸腫瘤細(xì)胞，還參與腫瘤抗原的傳遞和免疫細(xì)胞的浸潤。在腫瘤發(fā)生早期，淋巴管可能有助于阻止腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)，但隨著腫瘤的進(jìn)展，淋巴管更多地促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。因此，深入研究結(jié)直腸癌淋巴管生成的機(jī)制，對于理解腫瘤轉(zhuǎn)移的過程，開發(fā)有效的治療策略具有重要的理論和臨床價(jià)值。1.4研究目的與意義本研究旨在深入探討miRNA在人結(jié)直腸癌淋巴管形成中的作用及分子機(jī)制，具體研究目的如下：篩選與結(jié)直腸癌淋巴管生成相關(guān)的miRNA：通過高通量測序技術(shù)或生物信息學(xué)分析，比較結(jié)直腸癌組織與正常組織中miRNA的表達(dá)譜差異，篩選出在結(jié)直腸癌淋巴管生成過程中表達(dá)顯著改變的miRNA，為后續(xù)研究提供目標(biāo)分子。驗(yàn)證miRNA對結(jié)直腸癌淋巴管生成的影響：運(yùn)用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物模型，驗(yàn)證所篩選出的miRNA對結(jié)直腸癌淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、管腔形成等生物學(xué)行為的影響，明確其在結(jié)直腸癌淋巴管生成中的促進(jìn)或抑制作用。揭示miRNA調(diào)控結(jié)直腸癌淋巴管生成的分子機(jī)制：通過生物信息學(xué)預(yù)測、熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、蛋白質(zhì)免疫印跡等技術(shù)，確定miRNA的靶基因及相關(guān)信號通路，深入探究miRNA調(diào)控結(jié)直腸癌淋巴管生成的分子機(jī)制。本研究具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值，具體如下：理論意義：目前對于結(jié)直腸癌淋巴管生成的分子機(jī)制尚未完全明確，miRNA在其中的作用及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍存在許多未知。本研究通過深入探討miRNA在結(jié)直腸癌淋巴管生成中的作用及分子機(jī)制，有助于進(jìn)一步揭示結(jié)直腸癌淋巴轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，豐富對腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為腫瘤學(xué)領(lǐng)域的理論研究提供新的思路和方向。臨床應(yīng)用價(jià)值：診斷方面：miRNA具有在體液中穩(wěn)定存在且易于檢測的特點(diǎn)，有望成為結(jié)直腸癌早期診斷和評估淋巴轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的新型生物標(biāo)志物。通過檢測患者血清、糞便或組織中的特定miRNA表達(dá)水平，有助于實(shí)現(xiàn)結(jié)直腸癌的早期診斷、病情監(jiān)測及預(yù)后評估，提高診斷的準(zhǔn)確性和及時(shí)性，為臨床治療決策提供重要依據(jù)。治療方面：明確miRNA在結(jié)直腸癌淋巴管生成中的作用及分子機(jī)制，可為開發(fā)針對結(jié)直腸癌淋巴轉(zhuǎn)移的新型治療策略提供潛在靶點(diǎn)。通過設(shè)計(jì)和合成針對關(guān)鍵miRNA或其靶基因的小分子抑制劑、反義寡核苷酸、miRNA模擬物等，有望實(shí)現(xiàn)對結(jié)直腸癌淋巴管生成的有效干預(yù)，阻斷腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移途徑，提高結(jié)直腸癌的治療效果，改善患者的預(yù)后和生活質(zhì)量。此外，聯(lián)合傳統(tǒng)的手術(shù)、化療、放療等治療方法，基于miRNA的靶向治療可能為結(jié)直腸癌患者提供更個(gè)體化、更有效的綜合治療方案。二、miRNA在人結(jié)直腸癌淋巴管形成中的作用2.1miRNA與結(jié)直腸癌淋巴管形成相關(guān)性研究方法2.1.1高通量測序技術(shù)高通量測序技術(shù)，如RNA測序（RNA-seq），能夠全面且高效地檢測樣本中miRNA的表達(dá)情況。在研究miRNA與結(jié)直腸癌淋巴管形成的相關(guān)性時(shí)，該技術(shù)發(fā)揮著關(guān)鍵作用。首先，需要獲取結(jié)直腸癌組織樣本以及與之對應(yīng)的正常組織樣本，這些樣本的獲取應(yīng)嚴(yán)格遵循臨床規(guī)范和倫理準(zhǔn)則。對于結(jié)直腸癌組織，通常在手術(shù)切除過程中，由經(jīng)驗(yàn)豐富的外科醫(yī)生準(zhǔn)確采集腫瘤部位的組織，并確保組織的完整性和代表性；正常組織則選取距離腫瘤邊緣足夠遠(yuǎn)（一般建議大于5cm）的健康組織，以最大程度減少腫瘤微環(huán)境對正常組織的潛在影響。將采集到的樣本迅速放入液氮中冷凍保存，以防止RNA的降解。隨后，運(yùn)用專業(yè)的RNA提取試劑盒，按照嚴(yán)格的操作步驟從組織樣本中提取總RNA，在提取過程中，要注意避免RNA酶的污染，確保提取的RNA質(zhì)量和純度符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。對提取的總RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測，常用的檢測方法包括瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)檢測，通過觀察RNA條帶的完整性以及測定其在260nm和280nm處的吸光度比值（A260/A280），判斷RNA的質(zhì)量，一般要求A260/A280比值在1.8-2.0之間，以保證RNA的純度和完整性。采用特定的建庫試劑盒，將符合質(zhì)量要求的總RNA構(gòu)建成測序文庫，在構(gòu)建文庫過程中，需對文庫的質(zhì)量進(jìn)行嚴(yán)格把控，包括文庫的插入片段大小、濃度等參數(shù)的檢測。將構(gòu)建好的文庫進(jìn)行高通量測序，測序平臺(tái)的選擇應(yīng)根據(jù)研究需求和預(yù)算綜合考慮，常見的測序平臺(tái)有IlluminaHiSeq、PacBioRSII等，不同平臺(tái)具有各自的優(yōu)缺點(diǎn)和適用場景。測序完成后，得到大量的原始測序數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)中包含了豐富的信息，但也存在一些低質(zhì)量的測序讀段和接頭序列等雜質(zhì)。運(yùn)用生物信息學(xué)工具，如FastQC、Trimmomatic等，對原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制和預(yù)處理，去除低質(zhì)量的讀段和接頭序列，以提高數(shù)據(jù)的質(zhì)量和可用性。將經(jīng)過預(yù)處理的數(shù)據(jù)與已知的miRNA數(shù)據(jù)庫，如miRBase進(jìn)行比對，從而準(zhǔn)確識(shí)別出樣本中表達(dá)的miRNA，并對其表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。通過對結(jié)直腸癌組織和正常組織中miRNA表達(dá)譜的比較，篩選出在結(jié)直腸癌淋巴管形成過程中表達(dá)顯著改變的miRNA，這些差異表達(dá)的miRNA可能在結(jié)直腸癌淋巴管生成中發(fā)揮重要作用，為后續(xù)的深入研究提供了關(guān)鍵的目標(biāo)分子。2.1.2生物信息學(xué)分析生物信息學(xué)分析在挖掘miRNA與結(jié)直腸癌淋巴管形成的潛在關(guān)系方面具有不可或缺的作用。借助生物信息學(xué)工具和數(shù)據(jù)庫，能夠?qū)Ω咄繙y序得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行深度分析，預(yù)測miRNA的靶基因，并分析其參與的信號通路，從而為揭示miRNA在結(jié)直腸癌淋巴管生成中的作用機(jī)制提供重要線索。利用在線數(shù)據(jù)庫，如TargetScan、miRanda、PicTar等，這些數(shù)據(jù)庫基于不同的算法和模型，能夠?qū)iRNA的靶基因進(jìn)行預(yù)測。在預(yù)測過程中，數(shù)據(jù)庫會(huì)根據(jù)miRNA與靶mRNA3'-UTR區(qū)域的互補(bǔ)配對情況，結(jié)合熱力學(xué)穩(wěn)定性等因素，給出可能的靶基因列表。由于不同數(shù)據(jù)庫的預(yù)測結(jié)果存在一定的差異，為了提高預(yù)測的準(zhǔn)確性和可靠性，通常會(huì)綜合多個(gè)數(shù)據(jù)庫的預(yù)測結(jié)果，取交集部分作為潛在的靶基因。例如，對于某一在結(jié)直腸癌淋巴管生成中表達(dá)顯著改變的miRNA，通過TargetScan預(yù)測得到一組靶基因，同時(shí)miRanda和PicTar也分別給出各自的預(yù)測結(jié)果，將這三個(gè)數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果的交集作為進(jìn)一步研究的潛在靶基因，這樣可以有效減少假陽性結(jié)果，提高研究的針對性。運(yùn)用基因功能注釋數(shù)據(jù)庫，如GeneOntology（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG），對預(yù)測得到的靶基因進(jìn)行功能注釋和信號通路分析。GO數(shù)據(jù)庫從生物過程、細(xì)胞組成和分子功能三個(gè)層面，對基因的功能進(jìn)行詳細(xì)注釋，通過GO分析，可以了解靶基因在細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡等生物過程中可能發(fā)揮的作用，以及它們在細(xì)胞內(nèi)的定位和所具有的分子功能。KEGG數(shù)據(jù)庫則專注于生物信號通路的分析，通過KEGG分析，能夠明確靶基因參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如PI3K/Akt、MAPK、Wnt等經(jīng)典信號通路，這些信號通路在細(xì)胞的生長、發(fā)育、代謝以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用。例如，對某一miRNA的靶基因進(jìn)行KEGG分析后，發(fā)現(xiàn)這些靶基因顯著富集于PI3K/Akt信號通路，這提示該miRNA可能通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路，參與結(jié)直腸癌淋巴管生成的過程，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供了重要的方向。利用生物信息學(xué)軟件，如DAVID、Metascape等，對靶基因進(jìn)行富集分析，以確定這些基因在哪些生物學(xué)過程、分子功能和信號通路中顯著富集。在富集分析過程中，軟件會(huì)將靶基因與數(shù)據(jù)庫中的所有基因進(jìn)行對比，計(jì)算出每個(gè)生物學(xué)過程、分子功能和信號通路中靶基因的富集程度，并通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法評估其顯著性。通過富集分析，可以更直觀地了解miRNA的靶基因在生物學(xué)過程和信號通路中的分布情況，進(jìn)一步揭示miRNA在結(jié)直腸癌淋巴管生成中的潛在作用機(jī)制。例如，通過DAVID軟件對某miRNA的靶基因進(jìn)行富集分析，結(jié)果顯示這些靶基因在“血管生成”“細(xì)胞遷移”等生物學(xué)過程中顯著富集，這強(qiáng)烈暗示該miRNA可能通過調(diào)控與這些生物學(xué)過程相關(guān)的靶基因，參與結(jié)直腸癌淋巴管的生成和腫瘤細(xì)胞的遷移，為深入研究其分子機(jī)制提供了有力的證據(jù)。2.2關(guān)鍵miRNA的篩選與鑒定通過高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)分析，科研人員已經(jīng)篩選出多個(gè)與結(jié)直腸癌淋巴管形成相關(guān)的關(guān)鍵miRNA，這些miRNA在結(jié)直腸癌淋巴管生成過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。miR-1229-3p是近年來被發(fā)現(xiàn)與結(jié)直腸癌淋巴管形成密切相關(guān)的miRNA之一。研究人員利用高通量測序技術(shù)，對結(jié)直腸癌組織和正常組織中的miRNA表達(dá)譜進(jìn)行了全面分析，發(fā)現(xiàn)miR-1229-3p在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平顯著低于正常組織。進(jìn)一步通過生物信息學(xué)預(yù)測和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，確定了miR-1229-3p的靶基因是血管內(nèi)皮生長因子-C（VEGF-C）。VEGF-C是一種重要的淋巴管生成因子，能夠促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，在腫瘤淋巴管生成中發(fā)揮著核心作用。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，將miR-1229-3p模擬物轉(zhuǎn)染至結(jié)直腸癌細(xì)胞后，VEGF-C的熒光素酶活性顯著降低，表明miR-1229-3p可以直接靶向結(jié)合VEGF-C的3'-UTR，抑制其表達(dá)。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá)miR-1229-3p能夠顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF-C的蛋白水平，同時(shí)降低淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成能力；而抑制miR-1229-3p的表達(dá)則會(huì)導(dǎo)致VEGF-C表達(dá)升高，促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的相關(guān)生物學(xué)行為。在體內(nèi)動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中，將過表達(dá)miR-1229-3p的結(jié)直腸癌細(xì)胞注射到裸鼠體內(nèi)，與對照組相比，腫瘤組織中的淋巴管密度明顯降低，腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移率也顯著下降。這些研究結(jié)果表明，miR-1229-3p通過靶向抑制VEGF-C的表達(dá)，在結(jié)直腸癌淋巴管形成過程中發(fā)揮著重要的抑制作用，有望成為結(jié)直腸癌淋巴轉(zhuǎn)移治療的新靶點(diǎn)。除了miR-1229-3p，miR-200家族成員也被報(bào)道與結(jié)直腸癌淋巴管生成相關(guān)。miR-200家族包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429，它們在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)水平存在明顯異常。研究發(fā)現(xiàn)，miR-200家族成員可以通過直接靶向鋅指E-盒結(jié)合同源框1（ZEB1）和ZEB2，抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，從而影響腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在結(jié)直腸癌淋巴管生成方面，miR-200家族可能通過間接調(diào)控淋巴管生成相關(guān)因子的表達(dá)，發(fā)揮重要作用。例如，有研究表明miR-200c可以通過抑制ZEB1的表達(dá)，上調(diào)緊密連接蛋白o(hù)ccludin的表達(dá)，從而增強(qiáng)上皮細(xì)胞的緊密連接，減少腫瘤細(xì)胞的滲漏和淋巴管生成。此外，miR-200家族還可能通過影響腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞功能，間接調(diào)控結(jié)直腸癌淋巴管生成。雖然目前關(guān)于miR-200家族在結(jié)直腸癌淋巴管生成中具體作用機(jī)制的研究還不夠深入，但已有的研究結(jié)果提示其在這一過程中具有重要的調(diào)控潛力。miR-150在結(jié)直腸癌淋巴管形成中也具有重要作用。有研究表明，miR-150在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平明顯低于正常組織，且其表達(dá)水平與腫瘤的淋巴管浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。通過生物信息學(xué)分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)miR-150可以直接靶向c-Myc基因。c-Myc是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)過程，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在結(jié)直腸癌中，c-Myc的異常表達(dá)與腫瘤的淋巴管生成和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。研究人員通過在結(jié)直腸癌細(xì)胞中過表達(dá)或抑制miR-150，發(fā)現(xiàn)miR-150可以通過抑制c-Myc的表達(dá)，進(jìn)而影響下游淋巴管生成相關(guān)因子的表達(dá)，如VEGF-C、VEGFR-3等，從而抑制結(jié)直腸癌淋巴管的生成和腫瘤細(xì)胞的淋巴轉(zhuǎn)移。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，將過表達(dá)miR-150的結(jié)直腸癌細(xì)胞注射到裸鼠體內(nèi)，與對照組相比，腫瘤組織中的淋巴管密度明顯降低，腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移率也顯著下降。這些結(jié)果表明，miR-150通過靶向c-Myc基因，在結(jié)直腸癌淋巴管形成過程中發(fā)揮著重要的抑制作用，為結(jié)直腸癌的治療提供了新的潛在靶點(diǎn)。2.3miRNA對結(jié)直腸癌細(xì)胞淋巴管生成相關(guān)功能的影響2.3.1細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)細(xì)胞增殖是腫瘤生長和發(fā)展的基礎(chǔ)，在研究miRNA對結(jié)直腸癌細(xì)胞淋巴管生成相關(guān)功能的影響時(shí)，細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)是重要的研究手段之一，其中CCK-8實(shí)驗(yàn)應(yīng)用廣泛。CCK-8試劑的主要成分是WST-8，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下，能被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazandye）。生成的甲瓚產(chǎn)物的量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，通過檢測其在特定波長下的吸光度值，即可間接反映細(xì)胞的增殖情況。在進(jìn)行CCK-8實(shí)驗(yàn)時(shí)，首先需對結(jié)直腸癌細(xì)胞進(jìn)行分組處理。將對數(shù)生長期的結(jié)直腸癌細(xì)胞，如HCT116、SW480等細(xì)胞系，以適宜的密度接種于96孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)量一般為3000-5000個(gè)，以確保細(xì)胞在培養(yǎng)過程中有足夠的生長空間和營養(yǎng)物質(zhì)。設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對照組，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞轉(zhuǎn)染針對目標(biāo)miRNA的模擬物（mimics）或抑制劑（inhibitor），以實(shí)現(xiàn)miRNA的過表達(dá)或表達(dá)抑制；對照組則轉(zhuǎn)染陰性對照（NC）模擬物或抑制劑，其序列與目標(biāo)miRNA無互補(bǔ)性，用于排除轉(zhuǎn)染試劑等因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。轉(zhuǎn)染過程需嚴(yán)格按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的操作說明進(jìn)行，以保證轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞活性。轉(zhuǎn)染后，將96孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，在37℃、5%CO?的條件下培養(yǎng)，使細(xì)胞充分?jǐn)z取轉(zhuǎn)染試劑和核酸。在培養(yǎng)過程中，于不同時(shí)間點(diǎn)（如24h、48h、72h等）進(jìn)行CCK-8檢測。具體操作是向每孔中加入10μLCCK-8試劑，輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡影響檢測結(jié)果。繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育1-4小時(shí)，使CCK-8試劑與細(xì)胞充分反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀測定各孔在450nm波長處的吸光度值（OD值），記錄數(shù)據(jù)并繪制細(xì)胞生長曲線。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，通過分析生長曲線的斜率和趨勢，判斷細(xì)胞的增殖速度。如果實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA模擬物后，其生長曲線斜率明顯低于對照組，說明過表達(dá)該miRNA抑制了結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖；反之，若轉(zhuǎn)染miRNA抑制劑后，細(xì)胞生長曲線斜率高于對照組，則表明抑制該miRNA的表達(dá)促進(jìn)了細(xì)胞增殖。研究發(fā)現(xiàn)，miR-3913-5p在結(jié)直腸癌中的表達(dá)與細(xì)胞增殖密切相關(guān)。將miR-3913-5pmimics轉(zhuǎn)染至內(nèi)源性表達(dá)miR-3913-5p的LoVo和SW480細(xì)胞株后，通過CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)染m-NC的CRC細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染miR-3913-5pmimics的CRC細(xì)胞在24h、48h、72h的OD值均顯著降低，細(xì)胞生長速度明顯減緩，表明過表達(dá)miR-3913-5p可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖。相反，將miR-3913-5pinhibitor轉(zhuǎn)染至正常結(jié)腸黏膜細(xì)胞株FHC，CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，處理后的FHC細(xì)胞生長速度增加，OD值升高，說明抑制miR-3913-5p的表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖。這些結(jié)果表明，miR-3913-5p在結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，其表達(dá)水平的改變可直接影響細(xì)胞的增殖能力，為進(jìn)一步研究miR-3913-5p在結(jié)直腸癌淋巴管生成中的作用機(jī)制提供了重要線索。除了CCK-8實(shí)驗(yàn)，EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶）實(shí)驗(yàn)也是檢測細(xì)胞增殖的常用方法。EdU是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細(xì)胞DNA合成期（S期）代替胸腺嘧啶（T）摻入到新合成的DNA中。通過與熒光染料標(biāo)記的疊氮化物發(fā)生點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，可對摻入EdU的DNA進(jìn)行特異性標(biāo)記，從而在熒光顯微鏡下直觀地觀察到處于S期的細(xì)胞數(shù)量，以此反映細(xì)胞的增殖活性。在研究miRNA對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響時(shí)，EdU實(shí)驗(yàn)與CCK-8實(shí)驗(yàn)相互補(bǔ)充，能夠更全面地評估細(xì)胞的增殖狀態(tài)。例如，在驗(yàn)證某一miRNA對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的作用時(shí)，同時(shí)進(jìn)行CCK-8實(shí)驗(yàn)和EdU實(shí)驗(yàn)，若CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞增殖受到抑制，EdU實(shí)驗(yàn)也觀察到處于S期的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，則進(jìn)一步證實(shí)該miRNA對細(xì)胞增殖具有抑制作用，增強(qiáng)了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和說服力。2.3.2遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力是其發(fā)生轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，在探討miRNA對結(jié)直腸癌細(xì)胞淋巴管生成相關(guān)功能的影響中，遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)對于揭示miRNA在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的作用機(jī)制具有重要意義，而Transwell實(shí)驗(yàn)是常用的研究方法之一。Transwell小室由上室和下室組成，上室為聚碳酸酯膜制成的小室，膜上有孔徑大小不同的微孔，一般常用的孔徑為8μm，下室為普通的細(xì)胞培養(yǎng)孔板。小室的聚碳酸酯膜上可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行不同的處理，在檢測細(xì)胞遷移能力時(shí)，膜表面不做任何處理；而檢測細(xì)胞侵襲能力時(shí)，需要在膜表面鋪一層基質(zhì)膠，如Matrigel。Matrigel是一種從富含胞外基質(zhì)蛋白的EHS小鼠肉瘤中提取的基底膜基質(zhì)，主要成分包括層粘連蛋白、Ⅳ型膠原蛋白、巢蛋白和生長因子等，能夠模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，為腫瘤細(xì)胞的侵襲提供類似體內(nèi)的微環(huán)境。在進(jìn)行Transwell遷移實(shí)驗(yàn)時(shí)，首先將轉(zhuǎn)染了目標(biāo)miRNA模擬物、抑制劑或陰性對照的結(jié)直腸癌細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至合適水平，一般為1×10?-5×10?個(gè)/mL。取適量細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室，每孔加入100-200μL。下室加入含有10%-20%胎牛血清的完全培養(yǎng)基作為趨化因子，以吸引細(xì)胞遷移。將Transwell小室置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，在37℃、5%CO?的條件下培養(yǎng)一定時(shí)間，通常為24-48小時(shí)，具體時(shí)間需根據(jù)細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行優(yōu)化。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞，然后將小室浸入4%多聚甲醛溶液中固定15-30分鐘，以固定遷移到下室膜表面的細(xì)胞。固定完成后，用PBS沖洗小室數(shù)次，去除多聚甲醛殘留。再將小室浸入0.1%結(jié)晶紫溶液中染色10-15分鐘，使遷移的細(xì)胞著色。染色后，用PBS再次沖洗小室，去除多余的結(jié)晶紫染料。最后，將小室置于顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取多個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移到下室膜表面的細(xì)胞數(shù)量，通過比較不同組之間細(xì)胞數(shù)量的差異，判斷miRNA對結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移能力的影響。如果實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染miRNA模擬物或抑制劑）遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量明顯少于或多于對照組，則表明該miRNA對細(xì)胞遷移能力具有抑制或促進(jìn)作用。在研究miR-3913-5p對結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移能力的影響時(shí)，將miR-3913-5pmimics轉(zhuǎn)染至CRC細(xì)胞，Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染m-NC的對照組相比，miR-3913-5pmimics處理組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量顯著減少，表明過表達(dá)miR-3913-5p能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移能力。相反，將miR-3913-5pinhibitor轉(zhuǎn)染至正常結(jié)腸黏膜細(xì)胞株FHC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量明顯增加，說明抑制miR-3913-5p的表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞遷移。對于Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)，除了在小室膜表面鋪Matrigel外，其他操作步驟與遷移實(shí)驗(yàn)類似。在鋪Matrigel時(shí)，需將Matrigel提前從-20℃冰箱取出，置于4℃冰箱過夜融化，以保證其良好的凝膠狀態(tài)。然后用預(yù)冷的槍頭吸取適量Matrigel均勻鋪在小室膜表面，每孔鋪10-20μL，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育1-2小時(shí)，使Matrigel凝固形成一層均勻的基質(zhì)膜。隨后的細(xì)胞接種、培養(yǎng)、固定、染色和計(jì)數(shù)等步驟與遷移實(shí)驗(yàn)相同。通過比較不同組之間穿過Matrigel基質(zhì)膜遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量，可評估m(xù)iRNA對結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲能力的影響。研究表明，miR-1229-3p對結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲能力具有顯著影響。將miR-1229-3pmimics轉(zhuǎn)染至結(jié)直腸癌細(xì)胞后，進(jìn)行Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組穿過Matrigel基質(zhì)膜的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，表明過表達(dá)miR-1229-3p能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲能力。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-1229-3p可能通過靶向抑制某些與細(xì)胞侵襲相關(guān)的基因表達(dá)，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族成員，從而影響細(xì)胞外基質(zhì)的降解和細(xì)胞的侵襲行為。MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，為腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移提供條件，miR-1229-3p通過抑制MMPs的表達(dá)，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，進(jìn)而降低了結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲能力。除了Transwell實(shí)驗(yàn)，劃痕實(shí)驗(yàn)也是一種常用的檢測細(xì)胞遷移能力的方法。劃痕實(shí)驗(yàn)操作簡單、成本低，能夠直觀地觀察細(xì)胞的遷移過程。在進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)時(shí)，首先將結(jié)直腸癌細(xì)胞接種于6孔板或12孔板中，待細(xì)胞長滿單層后，用無菌的200μL槍頭在細(xì)胞單層上垂直劃一道直線，形成劃痕。然后用PBS沖洗細(xì)胞，去除劃下的細(xì)胞碎片。加入無血清培養(yǎng)基或含低濃度血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，在不同時(shí)間點(diǎn)（如0h、24h、48h等）于顯微鏡下拍照記錄劃痕寬度。通過測量劃痕寬度的變化，計(jì)算細(xì)胞的遷移率，公式為：遷移率=（0h劃痕寬度-th劃痕寬度）/0h劃痕寬度×100%。比較不同組之間細(xì)胞的遷移率，可判斷miRNA對結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移能力的影響。劃痕實(shí)驗(yàn)與Transwell實(shí)驗(yàn)相互驗(yàn)證，能夠更全面地研究miRNA對腫瘤細(xì)胞遷移能力的調(diào)控作用。例如，在研究某一miRNA對結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移的影響時(shí)，若Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)均顯示該miRNA過表達(dá)可抑制細(xì)胞遷移，而抑制其表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞遷移，則進(jìn)一步證實(shí)了該miRNA在細(xì)胞遷移過程中的重要調(diào)控作用，增強(qiáng)了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。2.3.3體外淋巴管形成實(shí)驗(yàn)體外淋巴管形成實(shí)驗(yàn)是研究miRNA對淋巴管生成影響的重要手段，通過模擬體內(nèi)淋巴管生成的微環(huán)境，觀察miRNA對淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞形成管腔結(jié)構(gòu)能力的作用，有助于深入了解miRNA在結(jié)直腸癌淋巴管生成中的機(jī)制。三維培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)是常用的體外淋巴管形成實(shí)驗(yàn)方法之一，該方法利用細(xì)胞外基質(zhì)為淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞提供三維生長環(huán)境，使其能夠更好地模擬體內(nèi)淋巴管的形成過程。常用的細(xì)胞外基質(zhì)材料有Matrigel、膠原蛋白等。以Matrigel為例，Matrigel是從小鼠肉瘤細(xì)胞中提取的富含多種細(xì)胞外基質(zhì)成分的基底膜基質(zhì)，主要包含層粘連蛋白、Ⅳ型膠原蛋白、巢蛋白以及多種生長因子。這些成分能夠?yàn)榱馨凸軆?nèi)皮細(xì)胞提供必要的黏附位點(diǎn)和信號刺激，促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移和分化，進(jìn)而形成管腔樣結(jié)構(gòu)。在實(shí)驗(yàn)前，需將Matrigel從-20℃冰箱取出，置于4℃冰箱過夜融化，以確保其保持良好的凝膠狀態(tài)。將對數(shù)生長期的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，如人真皮淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞（HDLEC），用胰蛋白酶消化后，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至合適水平，一般為1×10?-5×10?個(gè)/mL。在預(yù)先放置好小室的24孔板中，每孔加入50-100μLMatrigel，均勻鋪于孔底，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育30-60分鐘，使Matrigel凝固形成三維基質(zhì)層。將制備好的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞懸液加入到鋪有Matrigel的孔中，每孔加入100-200μL。設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對照組，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞轉(zhuǎn)染針對目標(biāo)miRNA的模擬物或抑制劑，對照組轉(zhuǎn)染陰性對照。將24孔板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在6h、12h、24h等時(shí)間點(diǎn)于顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化和管腔形成情況。在顯微鏡下，正常情況下，淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞在Matrigel上培養(yǎng)一段時(shí)間后，會(huì)逐漸聚集、遷移并相互連接，形成類似淋巴管管腔的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。若實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染miRNA模擬物后，觀察到形成的管腔數(shù)量明顯減少、管腔長度縮短或管腔結(jié)構(gòu)不完整，則表明過表達(dá)該miRNA抑制了淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的體外淋巴管形成能力；反之，若轉(zhuǎn)染miRNA抑制劑后，管腔數(shù)量增多、管腔長度增加或管腔結(jié)構(gòu)更加完整，則說明抑制該miRNA的表達(dá)促進(jìn)了淋巴管生成。研究發(fā)現(xiàn)，miR-1229-3p對淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的體外淋巴管形成具有抑制作用。將miR-1229-3pmimics轉(zhuǎn)染至HDLEC后，在24h時(shí)觀察到形成的管腔數(shù)量較對照組明顯減少，管腔長度也顯著縮短，管腔結(jié)構(gòu)變得稀疏且不連續(xù)，表明過表達(dá)miR-1229-3p能夠抑制淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞在體外形成淋巴管樣結(jié)構(gòu)的能力。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-1229-3p可能通過靶向調(diào)控VEGF-C等淋巴管生成關(guān)鍵因子的表達(dá)，影響淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和分化，從而抑制體外淋巴管的形成。除了觀察管腔結(jié)構(gòu)的形態(tài)變化，還可以通過定量分析來更準(zhǔn)確地評估m(xù)iRNA對體外淋巴管形成的影響。例如，使用圖像分析軟件，如ImageJ，對顯微鏡下拍攝的管腔結(jié)構(gòu)圖像進(jìn)行分析，測量管腔的總長度、分支點(diǎn)數(shù)量、管腔面積等參數(shù)。通過對這些參數(shù)的統(tǒng)計(jì)分析，能夠更客觀地比較不同組之間體外淋巴管形成能力的差異，為研究miRNA在結(jié)直腸癌淋巴管生成中的作用提供更有力的數(shù)據(jù)支持。以管腔總長度為例，通過ImageJ軟件的測量工具，對每組圖像中的管腔總長度進(jìn)行測量，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，若實(shí)驗(yàn)組與對照組之間管腔總長度存在顯著差異，則可進(jìn)一步證實(shí)miRNA對體外淋巴管形成能力的影響。這種定量分析方法能夠減少主觀因素的干擾，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，有助于深入揭示miRNA在結(jié)直腸癌淋巴管生成中的作用機(jī)制。2.4體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miRNA的作用2.4.1動(dòng)物模型建立為了進(jìn)一步驗(yàn)證miRNA在結(jié)直腸癌淋巴管生成中的作用，需要構(gòu)建合適的動(dòng)物模型。在眾多動(dòng)物模型中，小鼠因其繁殖周期短、飼養(yǎng)成本低、遺傳背景清晰等優(yōu)點(diǎn)，成為研究結(jié)直腸癌淋巴管生成的常用動(dòng)物。目前，常用的結(jié)直腸癌小鼠模型構(gòu)建方法主要有化學(xué)誘導(dǎo)模型、細(xì)胞系來源異種移植模型（CDX）和患者來源異種移植模型（PDX）等。化學(xué)誘導(dǎo)模型通常采用氧化偶氮甲烷（AOM）聯(lián)合葡聚糖硫酸鈉（DSS）的方法構(gòu)建。具體操作如下：選用6-8周齡的健康雄性C57BL/6J小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后，將小鼠隨機(jī)均分為對照組和模型組。模型組小鼠按10mg/kg的劑量腹腔注射氧化偶氮甲烷（AOM），注射后放回飼養(yǎng)籠正常飼養(yǎng)1周。1周后，模型組小鼠開始飲用1.8%的葡聚糖硫酸鈉（DSS）溶液，持續(xù)5天，隨后飲用普通滅菌水14天，此過程為一個(gè)循環(huán)周期，共進(jìn)行3個(gè)循環(huán)周期。對照組小鼠在實(shí)驗(yàn)全程接受同等劑量的生理鹽水處理，飼養(yǎng)條件與模型組一致。AOM是一種強(qiáng)致癌劑，能夠誘導(dǎo)結(jié)腸上皮細(xì)胞發(fā)生基因突變，而DSS是一種促炎劑，可破壞腸道黏膜屏障，引發(fā)腸道炎癥，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。通過AOM和DSS的聯(lián)合作用，能夠在小鼠體內(nèi)模擬結(jié)直腸癌的發(fā)生過程，且該模型具有成瘤率高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，能夠較好地反映結(jié)直腸癌的病理特征。在構(gòu)建化學(xué)誘導(dǎo)模型時(shí)，要嚴(yán)格控制AOM和DSS的劑量、處理時(shí)間和循環(huán)周期，以確保模型的穩(wěn)定性和可靠性。同時(shí)，要密切觀察小鼠的健康狀況，包括體重變化、飲食情況、精神狀態(tài)等，及時(shí)發(fā)現(xiàn)并處理異常情況。細(xì)胞系來源異種移植模型（CDX）是將人結(jié)直腸癌細(xì)胞系直接植入免疫缺陷小鼠體內(nèi)而建立的模型。以HCT116細(xì)胞系為例，將處于對數(shù)生長期的HCT116細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，用無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10?-5×10?個(gè)/mL。選取4-6周齡的裸鼠，在其右側(cè)背部近腋部皮下注射0.1-0.2mL細(xì)胞懸液。注射后，定期觀察小鼠腫瘤的生長情況，用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），根據(jù)公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到一定大小（如100-200mm3）時(shí)，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。CDX模型操作簡單、成本低，能夠快速獲得腫瘤模型，廣泛應(yīng)用于腫瘤研究。但該模型也存在一些局限性，如腫瘤細(xì)胞在免疫缺陷小鼠體內(nèi)的生長環(huán)境與人體實(shí)際情況存在差異，可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。在構(gòu)建CDX模型時(shí)，要選擇合適的細(xì)胞系和免疫缺陷小鼠品系，優(yōu)化細(xì)胞注射的部位和劑量，以提高成瘤率和模型的穩(wěn)定性。同時(shí)，要對腫瘤的生長情況進(jìn)行密切監(jiān)測，確保實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行?；颊邅碓串惙N移植模型（PDX）是將來源于患者的結(jié)直腸癌組織塊接種到免疫缺陷小鼠體內(nèi)而建立的模型。該模型在組織病理學(xué)、癌基因表達(dá)及對藥物反應(yīng)上均可較好地復(fù)制原發(fā)腫瘤的生物學(xué)特點(diǎn)，具有較好的臨床預(yù)見性。在構(gòu)建PDX模型時(shí)，首先要獲取患者的結(jié)直腸癌組織，組織的獲取需嚴(yán)格遵循倫理規(guī)范，取得患者的知情同意。將獲取的新鮮結(jié)直腸癌組織在無菌條件下切成約1-2mm3大小的組織塊，選取4-6周齡的免疫缺陷小鼠，如NOD-SCID小鼠，在其背部皮下或原位（如結(jié)腸部位）植入組織塊。植入后，定期觀察小鼠的生長狀況和腫瘤的生長情況，通過影像學(xué)檢查（如MRI、CT等）或組織病理學(xué)檢查評估腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移情況。PDX模型能夠更真實(shí)地反映腫瘤在人體內(nèi)的生物學(xué)行為，但該模型構(gòu)建過程復(fù)雜、成本高，且受患者個(gè)體差異的影響較大。為了提高PDX模型的質(zhì)量和穩(wěn)定性，要嚴(yán)格篩選患者組織，確保組織的活性和代表性。同時(shí)，要加強(qiáng)對小鼠的飼養(yǎng)管理和監(jiān)測，及時(shí)發(fā)現(xiàn)并處理可能出現(xiàn)的感染、排斥等問題。不同的結(jié)直腸癌小鼠模型各有優(yōu)缺點(diǎn)，在實(shí)際研究中，應(yīng)根據(jù)研究目的和需求選擇合適的模型。化學(xué)誘導(dǎo)模型能夠模擬結(jié)直腸癌的自然發(fā)生過程，適合研究腫瘤的發(fā)生機(jī)制；CDX模型操作簡單、成本低，常用于藥物篩選和初步的機(jī)制研究；PDX模型更能反映腫瘤的臨床特征，對于臨床前研究和個(gè)性化治療具有重要意義。2.4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，研究人員深入探究了miRNA對結(jié)直腸癌淋巴管生成和轉(zhuǎn)移的影響，為揭示結(jié)直腸癌淋巴轉(zhuǎn)移的機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。在化學(xué)誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌小鼠模型中，研究miR-1229-3p對淋巴管生成的影響時(shí)，將小鼠分為對照組、模型組和miR-1229-3p干預(yù)組。模型組小鼠采用AOM/DSS方法構(gòu)建結(jié)直腸癌模型，miR-1229-3p干預(yù)組小鼠在構(gòu)建模型的基礎(chǔ)上，通過尾靜脈注射miR-1229-3p模擬物進(jìn)行干預(yù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取小鼠的腫瘤組織，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，檢測淋巴管內(nèi)皮標(biāo)記物D2-40的表達(dá)，以評估淋巴管密度（LVD）。結(jié)果顯示，模型組小鼠腫瘤組織中的LVD明顯高于對照組，表明結(jié)直腸癌的發(fā)生促進(jìn)了淋巴管生成。而miR-1229-3p干預(yù)組小鼠腫瘤組織中的LVD顯著低于模型組，說明miR-1229-3p能夠抑制結(jié)直腸癌小鼠腫瘤組織中的淋巴管生成。進(jìn)一步對腫瘤組織進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡分析，檢測VEGF-C的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠腫瘤組織中VEGF-C的表達(dá)明顯升高，而miR-1229-3p干預(yù)組小鼠腫瘤組織中VEGF-C的表達(dá)顯著降低。這表明miR-1229-3p可能通過抑制VEGF-C的表達(dá)，從而抑制結(jié)直腸癌淋巴管生成。在細(xì)胞系來源異種移植模型（CDX）中，以HCT116細(xì)胞系構(gòu)建的裸鼠移植瘤模型為例，研究miR-3913-5p對腫瘤淋巴管生成和轉(zhuǎn)移的影響。將裸鼠分為對照組、陰性對照組（轉(zhuǎn)染陰性對照模擬物）和miR-3913-5p過表達(dá)組（轉(zhuǎn)染miR-3913-5p模擬物）。將過表達(dá)或?qū)φ盏腍CT116細(xì)胞注射到裸鼠皮下，待腫瘤生長至一定體積后，處死裸鼠，取腫瘤組織和淋巴結(jié)進(jìn)行分析。通過免疫熒光染色檢測腫瘤組織中淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物L(fēng)YVE-1的表達(dá)，評估淋巴管生成情況。結(jié)果顯示，miR-3913-5p過表達(dá)組腫瘤組織中LYVE-1陽性的淋巴管數(shù)量明顯少于對照組和陰性對照組，表明過表達(dá)miR-3913-5p抑制了腫瘤淋巴管生成。對淋巴結(jié)進(jìn)行病理切片檢查，統(tǒng)計(jì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率，發(fā)現(xiàn)miR-3913-5p過表達(dá)組的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率顯著低于對照組和陰性對照組。這說明miR-3913-5p不僅能夠抑制腫瘤淋巴管生成，還能減少腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-3913-5p過表達(dá)組腫瘤組織中基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)水平明顯降低，MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，其表達(dá)降低可能是miR-3913-5p抑制腫瘤淋巴管生成和轉(zhuǎn)移的機(jī)制之一。在患者來源異種移植模型（PDX）中，研究miR-150對結(jié)直腸癌淋巴管生成和轉(zhuǎn)移的影響。將患者的結(jié)直腸癌組織移植到NOD-SCID小鼠體內(nèi)，待腫瘤生長穩(wěn)定后，將小鼠分為對照組和miR-150干預(yù)組，miR-150干預(yù)組小鼠通過瘤內(nèi)注射miR-150模擬物進(jìn)行干預(yù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取腫瘤組織和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移器官（如肝臟、肺等）進(jìn)行分析。利用免疫組織化學(xué)染色檢測腫瘤組織中淋巴管密度和VEGFR-3的表達(dá)，結(jié)果顯示，miR-150干預(yù)組腫瘤組織中的淋巴管密度和VEGFR-3的表達(dá)均明顯低于對照組，表明miR-150能夠抑制結(jié)直腸癌腫瘤組織中的淋巴管生成。對遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移器官進(jìn)行病理檢查，發(fā)現(xiàn)miR-150干預(yù)組小鼠肝臟和肺的轉(zhuǎn)移灶數(shù)量顯著少于對照組，說明miR-150能夠抑制結(jié)直腸癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步通過熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和蛋白質(zhì)免疫印跡分析，證實(shí)miR-150可以直接靶向c-Myc基因，抑制其表達(dá)，從而影響下游淋巴管生成相關(guān)因子的表達(dá)，抑制腫瘤淋巴管生成和轉(zhuǎn)移。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致表明，miRNA在結(jié)直腸癌淋巴管生成和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。不同的miRNA通過靶向不同的基因和信號通路，抑制或促進(jìn)結(jié)直腸癌淋巴管生成和轉(zhuǎn)移。這些研究結(jié)果為結(jié)直腸癌的治療提供了新的潛在靶點(diǎn)和治療策略，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。三、miRNA影響人結(jié)直腸癌淋巴管形成的分子機(jī)制3.1miRNA的靶基因預(yù)測與驗(yàn)證3.1.1生物信息學(xué)預(yù)測在探索miRNA影響人結(jié)直腸癌淋巴管形成的分子機(jī)制時(shí)，準(zhǔn)確預(yù)測miRNA的靶基因是關(guān)鍵的起始步驟。生物信息學(xué)方法在此過程中發(fā)揮著重要作用，其主要基于miRNA與mRNA互補(bǔ)配對原理，通過對二者序列間相互作用的分析來預(yù)測潛在靶基因。目前，常用的生物信息學(xué)預(yù)測工具種類繁多，各具特點(diǎn)。TargetScan是基于種子序列互補(bǔ)性和進(jìn)化保守性進(jìn)行預(yù)測的經(jīng)典工具，它利用多物種間miRNA與mRNA3'-UTR的保守性，通過嚴(yán)格的算法篩選出可能的靶基因。例如，在對miR-1229-3p的靶基因預(yù)測中，TargetScan通過分析大量物種的基因組數(shù)據(jù)，結(jié)合miR-1229-3p的種子序列，預(yù)測出VEGF-C等一系列可能的靶基因，為后續(xù)研究提供了重要線索。miRanda則側(cè)重于序列匹配和結(jié)合自由能的計(jì)算，通過比較miRNA與mRNA序列的互補(bǔ)程度以及結(jié)合時(shí)的熱力學(xué)穩(wěn)定性，給出靶基因預(yù)測結(jié)果。在預(yù)測某一特定miRNA靶基因時(shí)，miRanda會(huì)對mRNA3'-UTR區(qū)域進(jìn)行全面掃描，尋找與miRNA互補(bǔ)配對且結(jié)合自由能較低的位點(diǎn)，從而確定潛在靶基因。PicTar整合了多個(gè)物種的序列信息和進(jìn)化保守性分析，能夠更全面地預(yù)測miRNA的靶基因。它通過構(gòu)建復(fù)雜的模型，綜合考慮miRNA與mRNA的結(jié)合位點(diǎn)、保守性以及其他相關(guān)因素，提高了預(yù)測的準(zhǔn)確性。然而，這些生物信息學(xué)預(yù)測工具也存在一定的局限性。由于算法和數(shù)據(jù)來源的差異，不同工具的預(yù)測結(jié)果往往存在較大差異，同一miRNA可能被預(yù)測出成百上千個(gè)靶基因，其中包含大量的假陽性結(jié)果。因此，為了提高預(yù)測結(jié)果的可靠性，通常需要綜合多個(gè)數(shù)據(jù)庫的預(yù)測結(jié)果。研究人員在預(yù)測某miRNA的靶基因時(shí)，會(huì)同時(shí)使用TargetScan、miRanda和PicTar等多個(gè)工具，然后取這些工具預(yù)測結(jié)果的交集，將交集中的基因作為重點(diǎn)研究對象。這樣可以有效減少假陽性結(jié)果，提高后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的針對性。除了綜合多個(gè)數(shù)據(jù)庫，還可以結(jié)合其他生物信息學(xué)分析方法，如基因功能注釋和信號通路分析，進(jìn)一步篩選和驗(yàn)證預(yù)測結(jié)果。通過對預(yù)測得到的靶基因進(jìn)行基因功能注釋，了解其在細(xì)胞生物學(xué)過程中的功能，有助于判斷這些基因與結(jié)直腸癌淋巴管生成的相關(guān)性。利用KEGG等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行信號通路分析，明確靶基因參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可進(jìn)一步揭示miRNA在結(jié)直腸癌淋巴管生成中的潛在作用機(jī)制。例如，在對某miRNA靶基因的研究中，通過基因功能注釋發(fā)現(xiàn)部分靶基因與細(xì)胞增殖、遷移等生物學(xué)過程相關(guān)，再結(jié)合KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)這些靶基因顯著富集于PI3K/Akt等與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的信號通路，從而為深入研究miRNA在結(jié)直腸癌淋巴管生成中的作用機(jī)制提供了有力的支持。3.1.2實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證方法為了確保生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果的準(zhǔn)確性，需要運(yùn)用實(shí)驗(yàn)方法對miRNA的靶基因進(jìn)行驗(yàn)證。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)是目前驗(yàn)證miRNA靶基因最為常用的方法之一，其原理基于miRNA主要通過作用于靶基因的3'-UTR起作用。在進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)時(shí)，首先需要構(gòu)建熒光素酶表達(dá)載體。將預(yù)測得到的miRNA靶基因的3'-UTR區(qū)域克隆至pGL3-basic等熒光素酶報(bào)告基因載體中，使靶基因3'-UTR位于報(bào)告基因Luciferase的下游。例如，若預(yù)測VEGF-C為某miRNA的靶基因，則將VEGF-C的3'-UTR序列插入到pGL3-basic載體中Luciferase基因的3'-UTR位置。將構(gòu)建好的熒光素酶表達(dá)載體與miRNA模擬物（mimics）或抑制劑（inhibitor）共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，如常用的293T細(xì)胞、HCT116結(jié)直腸癌細(xì)胞等。轉(zhuǎn)染過程需嚴(yán)格按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的操作說明進(jìn)行，以確保轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞活性。若miRNA能夠與靶基因3'-UTR結(jié)合，會(huì)抑制熒光素酶的表達(dá)，導(dǎo)致熒光素酶活性降低；反之，若miRNA不能與靶基因3'-UTR結(jié)合，則熒光素酶活性不受影響。在轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中加入熒光素酶檢測試劑，使用酶標(biāo)儀檢測熒光素酶的活性。通過比較不同組之間熒光素酶活性的變化，即可判斷miRNA與靶基因3'-UTR是否存在相互作用。若轉(zhuǎn)染miRNAmimics組的熒光素酶活性顯著低于對照組，說明該miRNA能夠抑制靶基因的表達(dá)，提示靶基因3'-UTR中可能存在miRNA的結(jié)合位點(diǎn)；若轉(zhuǎn)染miRNAinhibitor組的熒光素酶活性高于對照組，則表明內(nèi)源性miRNA對靶基因表達(dá)具有抑制作用，進(jìn)一步驗(yàn)證了miRNA與靶基因的靶向關(guān)系。為了提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，通常還會(huì)設(shè)置多種對照。陰性對照（NC）模擬物或抑制劑用于排除轉(zhuǎn)染試劑等因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，其序列與目標(biāo)miRNA無互補(bǔ)性。在實(shí)驗(yàn)中，將NCmimics或inhibitor與熒光素酶表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，作為對照，以確保檢測到的熒光素酶活性變化是由miRNA與靶基因的相互作用引起的，而非其他因素干擾。突變型靶基因?qū)φ沼糜隍?yàn)證miRNA與靶基因結(jié)合位點(diǎn)的特異性。將靶基因3'-UTR中預(yù)測的miRNA結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，使其不能與miRNA互補(bǔ)配對，然后將突變后的靶基因3'-UTR構(gòu)建到熒光素酶表達(dá)載體中，與miRNAmimics或inhibitor共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。若突變型靶基因轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性與對照組相比無明顯變化，而野生型靶基因轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性受到miRNA的顯著影響，則進(jìn)一步證實(shí)了miRNA與靶基因結(jié)合位點(diǎn)的特異性。除了熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，還可以結(jié)合其他實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行驗(yàn)證。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實(shí)驗(yàn)可用于檢測轉(zhuǎn)染miRNA后靶蛋白的表達(dá)水平變化。在細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNAmimics或inhibitor后，提取細(xì)胞總蛋白，通過Westernblot檢測靶蛋白的表達(dá)量。若miRNA能夠抑制靶基因的表達(dá)，在蛋白質(zhì)水平上應(yīng)表現(xiàn)為靶蛋白表達(dá)量降低；反之，若miRNA促進(jìn)靶基因表達(dá)，則靶蛋白表達(dá)量會(huì)升高。熒光定量PCR（qRT-PCR）實(shí)驗(yàn)可檢測轉(zhuǎn)染miRNA后靶mRNA的表達(dá)水平變化。通過提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進(jìn)行qRT-PCR檢測，比較不同組之間靶mRNA的相對表達(dá)量。若miRNA通過降解靶mRNA來抑制其表達(dá)，在mRNA水平上應(yīng)觀察到靶mRNA表達(dá)量下降。將熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)與Westernblot、qRT-PCR等實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，能夠從不同層面驗(yàn)證miRNA與靶基因的靶向關(guān)系，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度，為深入研究miRNA在人結(jié)直腸癌淋巴管形成中的分子機(jī)制提供堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。3.2靶基因在結(jié)直腸癌淋巴管形成中的功能3.2.1靶基因?qū)α馨凸苌上嚓P(guān)信號通路的調(diào)控靶基因在結(jié)直腸癌淋巴管形成過程中，對淋巴管生成相關(guān)信號通路的調(diào)控起著關(guān)鍵作用，其中VEGF-C信號通路是研究最為深入的通路之一。VEGF-C作為淋巴管生成的關(guān)鍵因子，通過與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞表面的VEGFR-3受體特異性結(jié)合，激活下游一系列復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，包括MAPK、PI3K/Akt和PLCγ等。這些信號通路的激活能夠促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和存活，進(jìn)而推動(dòng)淋巴管的生成。在正常生理狀態(tài)下，VEGF-C信號通路受到嚴(yán)格的調(diào)控，以維持淋巴管系統(tǒng)的正常發(fā)育和功能。然而，在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中，多種因素導(dǎo)致VEGF-C信號通路的異常激活，促進(jìn)了腫瘤淋巴管的生成，為腫瘤細(xì)胞的淋巴轉(zhuǎn)移提供了有利條件。研究發(fā)現(xiàn)，某些miRNA的靶基因能夠直接或間接調(diào)控VEGF-C信號通路。例如，miR-1229-3p的靶基因被證實(shí)為VEGF-C。當(dāng)miR-1229-3p表達(dá)上調(diào)時(shí)，它能夠與VEGF-C的3'-UTR區(qū)域互補(bǔ)配對，抑制VEGF-C的翻譯過程，從而降低VEGF-C的蛋白表達(dá)水平。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá)miR-1229-3p的結(jié)直腸癌細(xì)胞培養(yǎng)上清中，VEGF-C的蛋白含量明顯減少，同時(shí)，將該培養(yǎng)上清作用于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成能力均受到顯著抑制。這表明miR-1229-3p通過抑制VEGF-C的表達(dá)，阻斷了VEGF-C信號通路的激活，從而抑制了結(jié)直腸癌淋巴管生成。相反，當(dāng)miR-1229-3p表達(dá)下調(diào)時(shí)，VEGF-C的表達(dá)不受抑制，VEGF-C信號通路被激活，促進(jìn)了淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)行為，進(jìn)而促進(jìn)結(jié)直腸癌淋巴管生成。在體內(nèi)動(dòng)物模型中，通過尾靜脈注射miR-1229-3p模擬物，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中的淋巴管密度明顯降低，腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移率也顯著下降，進(jìn)一步證實(shí)了miR-1229-3p通過調(diào)控VEGF-C信號通路，抑制結(jié)直腸癌淋巴管生成和淋巴轉(zhuǎn)移。除了VEGF-C信號通路，其他信號通路如PDGF-B/PDGFR-β信號通路、Notch信號通路等也在結(jié)直腸癌淋巴管生成中發(fā)揮重要作用，并且這些信號通路也受到miRNA靶基因的調(diào)控。PDGF-B是一個(gè)多功能的生長因子，在血管生成和淋巴管生成中均扮演重要角色。在結(jié)直腸癌中，PDGF-B通過激活PDGFR-β受體，促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和分化，參與淋巴管生成過程。研究表明，某些miRNA的靶基因能夠調(diào)控PDGF-B/PDGFR-β信號通路。例如，某研究發(fā)現(xiàn)miR-X的靶基因Y能夠與PDGF-B的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，抑制PDGF-B的轉(zhuǎn)錄，從而降低PDGF-B的表達(dá)水平。當(dāng)miR-X過表達(dá)時(shí)，靶基因Y的表達(dá)受到抑制，無法抑制PDGF-B的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致PDGF-B表達(dá)升高，激活PDGF-B/PDGFR-β信號通路，促進(jìn)結(jié)直腸癌淋巴管生成；而當(dāng)miR-X表達(dá)下調(diào)時(shí)，靶基因Y表達(dá)增加，抑制PDGF-B轉(zhuǎn)錄，阻斷PDGF-B/PDGFR-β信號通路，抑制結(jié)直腸癌淋巴管生成。Notch信號通路參與血管和平滑肌細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過程，在結(jié)直腸癌淋巴管生成中也存在異常調(diào)節(jié)。在血管淋巴管瘤中，Notch信號通路異?；钴S，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和分化受損。雖然目前關(guān)于Notch信號通路在結(jié)直腸癌淋巴管生成中具體受到miRNA靶基因調(diào)控的研究相對較少，但已有研究提示該信號通路可能是一個(gè)潛在的調(diào)控靶點(diǎn)。有研究表明，miR-Z可能通過靶向Notch信號通路中的關(guān)鍵分子，如Notch受體或其配體，來調(diào)控Notch信號通路的活性，進(jìn)而影響結(jié)直腸癌淋巴管生成。具體而言，當(dāng)miR-Z表達(dá)上調(diào)時(shí)，它能夠抑制Notch受體或其配體的表達(dá)，阻斷Notch信號通路的激活，從而抑制結(jié)直腸癌淋巴管生成；反之，當(dāng)miR-Z表達(dá)下調(diào)時(shí)，Notch信號通路被激活，促進(jìn)結(jié)直腸癌淋巴管生成。然而，這一調(diào)控機(jī)制還需要更多的實(shí)驗(yàn)研究來進(jìn)一步證實(shí)和完善。靶基因通過對淋巴管生成相關(guān)信號通路的精確調(diào)控，在結(jié)直腸癌淋巴管形成過程中發(fā)揮著核心作用。深入研究這些靶基因?qū)π盘柾返恼{(diào)控機(jī)制，有助于揭示結(jié)直腸癌淋巴管生成的分子機(jī)制，為結(jié)直腸癌的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。3.2.2靶基因與其他相關(guān)分子的相互作用在結(jié)直腸癌淋巴管形成這一復(fù)雜的生物學(xué)過程中，靶基因并非孤立地發(fā)揮作用，而是與其他多種相關(guān)分子相互作用，共同構(gòu)成了一個(gè)精細(xì)且復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對淋巴管生成的各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控。以VEGF-C信號通路中的關(guān)鍵分子VEGF-C和VEGFR-3為例，它們除了參與VEGF-C信號通路的激活外，還與其他分子存在密切的相互作用。VEGF-C不僅可以與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞表面的VEGFR-3結(jié)合，還可以與神經(jīng)纖毛蛋白-2（Neuropilin-2，NRP-2）結(jié)合。NRP-2是一種跨膜蛋白，最初被發(fā)現(xiàn)作為血管內(nèi)皮生長因子A（VEGF-A）的輔助受體，參與血管生成過程。后來研究發(fā)現(xiàn)，NRP-2在淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上也有表達(dá)，并且能夠與VEGF-C相互作用。VEGF-C與NRP-2的結(jié)合可以增強(qiáng)VEGF-C與VEGFR-3的親和力，促進(jìn)VEGF-C信號通路的激活，從而進(jìn)一步促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成。研究表明，在結(jié)直腸癌組織中，NRP-2的表達(dá)水平與VEGF-C和VEGFR-3的表達(dá)呈正相關(guān)，且與腫瘤淋巴管密度和淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。通過RNA干擾技術(shù)降低NRP-2的表達(dá)，可以顯著抑制VEGF-C誘導(dǎo)的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)行為，減少腫瘤淋巴管生成和淋巴轉(zhuǎn)移。這表明NRP-2作為VEGF-C的輔助受體，在結(jié)直腸癌淋巴管生成過程中與VEGF-C和VEGFR-3相互作用，共同促進(jìn)腫瘤淋巴管的生成和腫瘤細(xì)胞的淋巴轉(zhuǎn)移。在PDGF-B/PDGFR-β信號通路中，PDGF-B除了與PDGFR-β結(jié)合激活下游信號通路外，還可以與其他生長因子如VEGF-A相互作用。VEGF-A是一種重要的血管生成因子，在腫瘤血管生成中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，PDGF-B和VEGF-A在腫瘤微環(huán)境中可以相互調(diào)節(jié)，共同促進(jìn)腫瘤血管和淋巴管的生成。PDGF-B可以通過激活PDGFR-β信號通路，上調(diào)腫瘤細(xì)胞和腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞中VEGF-A的表達(dá)；而VEGF-A也可以通過激活其受體VEGFR-2，促進(jìn)PDGF-B的表達(dá)。這種相互作用形成了一個(gè)正反饋調(diào)節(jié)環(huán)路，進(jìn)一步增強(qiáng)了腫瘤血管和淋巴管生成的信號。在結(jié)直腸癌中，PDGF-B和VEGF-A的協(xié)同作用促進(jìn)了腫瘤微環(huán)境中血管和淋巴管的生成，為腫瘤細(xì)胞的生長、增殖和轉(zhuǎn)移提供了必要的條件。研究人員通過在結(jié)直腸癌小鼠模型中同時(shí)抑制PDGF-B和VEGF-A的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)腫瘤血管和淋巴管密度顯著降低，腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移也受到明顯抑制。這表明PDGF-B與VEGF-A的相互作用在結(jié)直腸癌淋巴管生成中具有重要意義，為結(jié)直腸癌的治療提供了新的聯(lián)合靶向治療策略。在腫瘤微環(huán)境中，細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）成分與靶基因相關(guān)分子之間也存在復(fù)雜的相互作用。ECM是由膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白等多種蛋白質(zhì)和多糖組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，它不僅為細(xì)胞提供物理支撐，還參與細(xì)胞的增殖、遷移、分化等多種生物學(xué)過程。在結(jié)直腸癌淋巴管生成過程中，ECM成分與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞表面的整合素等受體相互作用，影響淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)行為。例如，纖連蛋白可以與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞表面的整合素α5β1結(jié)合，激活下游的FAK-Src信號通路，促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和管腔形成。研究發(fā)現(xiàn)，某些miRNA的靶基因可以調(diào)控纖連蛋白的表達(dá)或其與整合素的相互作用。當(dāng)miR-M表達(dá)上調(diào)時(shí)，其靶基因N的表達(dá)受到抑制，導(dǎo)致纖連蛋白的表達(dá)下降，從而減弱了纖連蛋白與整合素α5β1的結(jié)合，抑制了淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和管腔形成，進(jìn)而抑制結(jié)直腸癌淋巴管生成；反之，當(dāng)miR-M表達(dá)下調(diào)時(shí)，靶基因N表達(dá)增加，纖連蛋白表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)了淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的相關(guān)生物學(xué)行為，促進(jìn)結(jié)直腸癌淋巴管生成。這種miRNA靶基因-ECM-淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用，進(jìn)一步豐富了結(jié)直腸癌淋巴管生成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。靶基因與其他相關(guān)分子之間廣泛而復(fù)雜的相互作用，構(gòu)成了結(jié)直腸癌淋巴管生成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分。深入研究這些相互作用機(jī)制，有助于全面理解結(jié)直腸癌淋巴管生成的分子機(jī)制，為開發(fā)更有效的治療策略提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。3.3miRNA-靶基因軸調(diào)控結(jié)直腸癌淋巴管形成的分子機(jī)制模型構(gòu)建基于上述對miRNA、靶基因及其相互作用的研究，我們可以構(gòu)建一個(gè)miRNA-靶基因軸調(diào)控結(jié)直腸癌淋巴管形成的分子機(jī)制模型。以miR-1229-3p/VEGF-C軸為例，在正常生理狀態(tài)下，結(jié)直腸組織中miR-1229-3p維持相對穩(wěn)定的表達(dá)水平，它通過與VEGF-C的3'-UTR區(qū)域互補(bǔ)配對，抑制VEGF-C的翻譯過程，使VEGF-C的表達(dá)處于較低水平。此時(shí)，淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞接收到的增殖、遷移和管腔形成信號較弱，淋巴管生成處于相對穩(wěn)定的平衡狀態(tài)。在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中，由于多種因素的影響，如腫瘤細(xì)胞的基因突變、腫瘤微環(huán)境的改變等，導(dǎo)致miR-1229-3p的表達(dá)水平顯著下調(diào)。miR-1229-3p表達(dá)的降低使其對VEGF-C的抑制作用減弱，VEGF-C得以大量表達(dá)。高表達(dá)的VEGF-C與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞表面的VEGFR-3受體特異性結(jié)合，激活下游的MAPK、PI3K/Akt和PLCγ等信號通路。MAPK信號通路的激活促使淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子如ERK等磷酸化，進(jìn)而調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移。PI3K/Akt信號通路則通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活、代謝和遷移相關(guān)蛋白的活性，增強(qiáng)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的存活能力和遷移能力。PLCγ信號通路的激活會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞的增殖和管腔形成。在這些信號通路的協(xié)同作用下，淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成能力顯著增強(qiáng)，從而促進(jìn)了結(jié)直腸癌淋巴管的生成。新生的淋巴管為腫瘤細(xì)胞進(jìn)入淋巴循環(huán)提供了通道，增加了腫瘤細(xì)胞發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。再以miR-150/c-Myc軸為例，正常情況下，miR-150能夠與c-Myc基因的3'-UTR結(jié)合，抑制c-Myc的表達(dá)。c-Myc作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，其低表達(dá)使得下游與淋巴管生成相關(guān)的基因，如VEGF-C、VEGFR-3等的轉(zhuǎn)錄受到抑制，維持淋巴管生成的相對穩(wěn)定。在結(jié)直腸癌中，miR-150表達(dá)下降，對c-Myc的抑制作用減弱，c-Myc表達(dá)上調(diào)。c-Myc上調(diào)后，促進(jìn)了VEGF-C、VEGFR-3等淋巴管生成相關(guān)因子的表達(dá)，激活VEGF-C/VEGFR-3信號通路，最終促進(jìn)結(jié)直腸癌淋巴管生成。在這個(gè)分子機(jī)制模型中，不同的miRNA-靶基因軸之間可能還存在相互作用和協(xié)同調(diào)節(jié)。例如，某些miRNA可能同時(shí)靶向多個(gè)與淋巴管生成相關(guān)的基因，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。不同的信號通路之間也可能存在交叉對話，共同調(diào)節(jié)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)行為。深入研究和完善這個(gè)分子機(jī)制模型，有助于我們更全面、系統(tǒng)地理解miRNA-靶基因軸在結(jié)直腸癌淋巴管形成中的作用機(jī)制，為開發(fā)針對結(jié)直腸癌淋巴管生成的治療策略提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。四、研究案例分析4.1案例一：miR-X在結(jié)直腸癌淋巴管形成中的獨(dú)特作用與機(jī)制4.1.1臨床樣本分析