共刺激分子B7-H4與B7-H3在胃癌中的表達(dá)特征、關(guān)聯(lián)機(jī)制及臨床意義探究一、引言1.1研究背景胃癌作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的主要惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均處于較高水平。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年新增胃癌病例數(shù)眾多，且在癌癥相關(guān)死亡原因中，胃癌占據(jù)著重要地位。在中國，胃癌同樣是常見的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率也不容小覷，嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量和生命健康。盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在胃癌的治療手段及水平上不斷取得進(jìn)步，如手術(shù)技術(shù)的改進(jìn)、化療藥物的研發(fā)以及放療設(shè)備的更新等，但目前胃癌的治療效果仍不理想，尤其是晚期胃癌患者的預(yù)后較差，5年生存率較低。胃癌的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致治療失敗的主要原因，因此，深入探究胃癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的胃癌預(yù)后指標(biāo)和治療靶點(diǎn)，對(duì)于提高胃癌患者的生存率和改善其生活質(zhì)量具有至關(guān)重要的意義。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與腫瘤免疫微環(huán)境密切相關(guān)。腫瘤細(xì)胞可以通過多種機(jī)制逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊，其中共刺激分子在腫瘤免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。有效的腫瘤免疫應(yīng)答，除了需要T細(xì)胞受體識(shí)別腫瘤抗原提供第一信號(hào)外，還需要共刺激分子參與并提供輔助的第二信號(hào)，才能使T細(xì)胞達(dá)到生理活化閾值，進(jìn)而啟動(dòng)有效的免疫反應(yīng)。適宜的共刺激信號(hào)可以降低T細(xì)胞活化時(shí)對(duì)第一信號(hào)的需求，增強(qiáng)免疫應(yīng)答；而抑制性的共刺激信號(hào)則可以減弱免疫應(yīng)答或?qū)е旅庖吣褪?，使得腫瘤細(xì)胞得以逃逸。B7家族是一類重要的共刺激分子，屬于免疫球蛋白超家族，其成員包括B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、B7-H1（PD-L1）、B7-DC（PD-L2）、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H5（VISTA）、B7-H6和B7-H7等。這些成員在調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生正負(fù)不同的共刺激信號(hào)，在腫瘤免疫中發(fā)揮著各自獨(dú)特的作用。其中，B7-H4和B7-H3作為B7家族中的重要成員，近年來受到了廣泛的關(guān)注。B7-H4，也被稱為B7S1、B7x和VCTN1，是一種負(fù)性共刺激分子。它主要表達(dá)在巨噬細(xì)胞、成熟的樹突狀細(xì)胞和某些腫瘤細(xì)胞以及活化的T細(xì)胞上。B7-H4可通過抑制T細(xì)胞的增殖、細(xì)胞因子的產(chǎn)生和細(xì)胞周期，對(duì)T細(xì)胞免疫進(jìn)行負(fù)調(diào)控，從而在介導(dǎo)腫瘤免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用。研究表明，B7-H4在大多數(shù)正常組織細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)，但在多種腫瘤組織中高表達(dá)，如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、結(jié)直腸癌等，且其高表達(dá)與腫瘤的惡性程度、轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后密切相關(guān)。在腫瘤免疫逃逸中，B7-H4可能通過破壞免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和攻擊，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。B7-H3是一種I型跨膜蛋白，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和短胞內(nèi)區(qū)組成，目前其配體尚不明確。早期研究認(rèn)為，B7-H3是共刺激受體，可促進(jìn)CD4+和CD8+T細(xì)胞的增殖，刺激干擾素γ（IFN-γ）的生成，發(fā)揮免疫刺激功能；然而，近年來越來越多的研究表明，B7-H3在免疫細(xì)胞中主要發(fā)揮共抑制作用，幫助腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視，其過表達(dá)與腫瘤患者的不良預(yù)后以及腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。B7-H3廣泛表達(dá)于多種類型的腫瘤細(xì)胞中，如肺癌、頭頸癌、食管癌、前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌和乳腺癌等。鑒于B7-H4和B7-H3在腫瘤免疫中的重要作用以及在多種腫瘤組織中的異常表達(dá)，探討它們?cè)谖赴┙M織中的表達(dá)情況及其與胃癌臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，對(duì)于深入了解胃癌的發(fā)病機(jī)制、尋找新的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)具有重要的理論和臨床意義。通過研究B7-H4和B7-H3在胃癌中的表達(dá)及意義，有望為胃癌的早期診斷、精準(zhǔn)治療和預(yù)后評(píng)估提供新的思路和方法，從而提高胃癌患者的生存率和生活質(zhì)量。1.2研究目的本研究旨在深入探究共刺激分子B7-H4和B7-H3在胃癌組織中的表達(dá)情況，并全面分析其表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理特征（如腫瘤大小、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期等）之間的相關(guān)性。同時(shí)，通過對(duì)患者進(jìn)行隨訪，研究B7-H4和B7-H3的表達(dá)與胃癌患者預(yù)后（包括生存率、復(fù)發(fā)率等）的關(guān)系，以期為胃癌的早期診斷、病情評(píng)估、預(yù)后判斷以及治療靶點(diǎn)的選擇提供新的理論依據(jù)和潛在的生物標(biāo)志物。1.3研究方法和創(chuàng)新點(diǎn)本研究將運(yùn)用多種先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和嚴(yán)謹(jǐn)?shù)难芯糠椒ǎ钊肫饰龉泊碳し肿覤7-H4和B7-H3在胃癌中的表達(dá)及意義。在實(shí)驗(yàn)技術(shù)方面，采用免疫組化技術(shù)，通過特異性抗體對(duì)胃癌組織切片進(jìn)行染色，直觀地觀察B7-H4和B7-H3蛋白在組織中的定位和表達(dá)水平，清晰呈現(xiàn)其在腫瘤細(xì)胞和周圍組織中的分布情況；利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，精確測定B7-H4和B7-H3基因的mRNA表達(dá)量，從基因?qū)用娣治銎浔磉_(dá)變化，為研究提供量化的數(shù)據(jù)支持；運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）技術(shù)，進(jìn)一步驗(yàn)證B7-H4和B7-H3蛋白的表達(dá)水平，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。同時(shí)，通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，如細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)等，探究B7-H4和B7-H3對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，明確其在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制。在研究方法上，收集大量的胃癌患者組織標(biāo)本和臨床資料，進(jìn)行全面的臨床病理分析，深入研究B7-H4和B7-H3表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征之間的相關(guān)性；對(duì)患者進(jìn)行長期隨訪，獲取準(zhǔn)確的生存數(shù)據(jù)，采用生存分析等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，探討B(tài)7-H4和B7-H3表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系，為臨床預(yù)后評(píng)估提供有力依據(jù)；構(gòu)建動(dòng)物模型，將胃癌細(xì)胞接種到動(dòng)物體內(nèi)，觀察B7-H4和B7-H3在體內(nèi)對(duì)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的影響，從整體水平驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為研究提供更全面的視角。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面。一方面，首次全面且系統(tǒng)地研究B7-H4和B7-H3在胃癌中的表達(dá)情況、與臨床病理特征的相關(guān)性以及對(duì)預(yù)后的影響，為胃癌的研究提供了新的綜合視角，有助于更深入地理解胃癌的發(fā)病機(jī)制。另一方面，將多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)和研究方法有機(jī)結(jié)合，從基因、蛋白、細(xì)胞和動(dòng)物模型等多個(gè)層面進(jìn)行研究，使研究結(jié)果更加全面、準(zhǔn)確和深入，為后續(xù)的研究提供了更完善的研究思路和方法。此外，通過對(duì)B7-H4和B7-H3的研究，有望發(fā)現(xiàn)新的胃癌診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，為胃癌的精準(zhǔn)治療提供新的方向和策略，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。二、共刺激分子B7-H4與B7-H3概述2.1B7-H4分子結(jié)構(gòu)與功能B7-H4，也被稱作B7S1、B7x以及VCTN1，是B7家族中一類重要的負(fù)性共刺激分子。其蛋白由282個(gè)氨基酸構(gòu)成，屬于I型跨膜蛋白，包含一個(gè)信號(hào)肽區(qū)、一個(gè)由IgV和IgC結(jié)構(gòu)域組成的胞外區(qū)、一個(gè)跨膜區(qū)以及一個(gè)胞內(nèi)區(qū)。人B7-H4基因定位于1號(hào)染色體，涵蓋6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子，外顯子6存在選擇性剪切的情況，進(jìn)而產(chǎn)生兩個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄本，B7-H4的開放讀碼框部分由849個(gè)堿基對(duì)組成，其調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平。人的B7-H4分子擁有C端跨膜結(jié)構(gòu)域，而鼠的B7-H4分子則是通過糖基磷脂酰肌醇（GPI）連接在細(xì)胞表面，不存在跨膜結(jié)構(gòu)域。目前，B7-H4的配體尚未明確，其在B7家族中的同源性分子分別為：B7-1（12%），B7-2（13%），B7-3（14%），B7-H1（20%），B7-H2（16%）以及B7-H3（24%）。在表達(dá)特性方面，B7-H4mRNA廣泛分布于腎、脾、胸腺、子宮、胎盤等多種組織中，但只有有限的幾種細(xì)胞能夠表達(dá)B7-H4蛋白，主要表達(dá)在巨噬細(xì)胞、成熟的樹突狀細(xì)胞、某些腫瘤細(xì)胞以及活化的T淋巴細(xì)胞表面，在體內(nèi)存在膜性和可溶性兩種狀態(tài)，這兩種狀態(tài)對(duì)于免疫功能的調(diào)節(jié)均發(fā)揮重要作用。B7-H4在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵的負(fù)調(diào)控作用。其一，它能夠負(fù)性調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答，顯著抑制T淋巴細(xì)胞的增殖。當(dāng)B7-H4與T淋巴細(xì)胞相互作用時(shí)，可使細(xì)胞增殖停滯，有效阻滯細(xì)胞周期進(jìn)展，將細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，從而抑制T淋巴細(xì)胞的增殖。其二，B7-H4能夠降低細(xì)胞因子水平，B7-H4-Ig與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，可顯著降低T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-2和IL-10等細(xì)胞因子，而IL-2等細(xì)胞因子對(duì)于T細(xì)胞的活化、增殖和功能發(fā)揮至關(guān)重要，B7-H4對(duì)這些細(xì)胞因子的抑制作用，進(jìn)一步削弱了T細(xì)胞的免疫功能。其三，B7-H4在維持并保護(hù)妊娠過程中也具有重要意義，雌三醇能夠刺激DC細(xì)胞表面B7-H4表達(dá)上調(diào)，并且在妊娠狀態(tài)下，B7-H4+巨噬細(xì)胞穩(wěn)定高表達(dá)，有助于維持母胎界面的免疫耐受狀態(tài)，防止母體對(duì)胎兒產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。其四，B7-H4還參與免疫耐受的形成，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞會(huì)觸發(fā)抗原遞呈細(xì)胞分泌大量的IL-10，而IL-10可以誘導(dǎo)相關(guān)免疫細(xì)胞表達(dá)大量的B7-H4分子，從而導(dǎo)致抗原遞呈細(xì)胞產(chǎn)生免疫抑制，敲除其上的B7-H4，則可以抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞介導(dǎo)的抗原遞呈細(xì)胞的免疫抑制作用。在腫瘤免疫逃逸方面，B7-H4起著重要的促進(jìn)作用。大量研究表明，B7-H4在多種腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)狀態(tài)，如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、結(jié)直腸癌等。B7-H4通過抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)，幫助腫瘤細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊。具體而言，B7-H4可以抑制CD4+和CD8+T細(xì)胞的增殖，減少細(xì)胞因子的分泌，使T細(xì)胞無法有效發(fā)揮免疫殺傷作用；它還可以誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步削弱免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的攻擊能力；此外，B7-H4還可以調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的分化，促進(jìn)2型巨噬細(xì)胞的極化，并將M1表型轉(zhuǎn)變?yōu)镸2表型，營造免疫抑制性的腫瘤微環(huán)境，有利于腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。2.2B7-H3分子結(jié)構(gòu)與功能B7-H3，又稱為CD276，是B7家族中重要的免疫檢查點(diǎn)分子，屬于I型跨膜蛋白。其分子結(jié)構(gòu)包含胞外區(qū)、跨膜區(qū)和短胞內(nèi)區(qū)，其中胞外區(qū)由IgV樣和IgC樣免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域組成，人的4IgB7-H3的顯性表達(dá)形式包含與4個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域的串聯(lián)重復(fù)VC結(jié)構(gòu)域。人類B7-H3存在2種異構(gòu)體，分別是包含2個(gè)相同IgC樣和IgV樣結(jié)構(gòu)域的4Ig-B7-H3，以及包含1對(duì)IgC樣和IgV樣結(jié)構(gòu)域的2Ig-B7-H3，其中4Ig-B7-H3是主要構(gòu)型。值得注意的是，小鼠只有2IgB7-H3一種亞型。在表達(dá)分布上，B7-H3在正常人體組織中呈現(xiàn)低水平表達(dá)狀態(tài)，僅在腹部、肝臟、胰腺、腎皮質(zhì)、唾液腺腺泡細(xì)胞、胃上皮細(xì)胞等有非特異性細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)。然而，在多種腫瘤組織中，B7-H3卻異常高表達(dá)，包括肺癌、頭頸癌、食管癌、前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、黑色素瘤、膠質(zhì)瘤、胰腺癌、卵巢癌以及結(jié)直腸癌等，且其在腫瘤微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞、纖維原細(xì)胞、上皮細(xì)胞等表面也有表達(dá)。這種在腫瘤組織中的過量表達(dá)往往與患者不良預(yù)后相關(guān)，常伴隨較短的總生存期和無進(jìn)展生存期。在免疫細(xì)胞方面，B7-H3在單核細(xì)胞和粒細(xì)胞中無表達(dá)，但在一些樹突狀細(xì)胞、T細(xì)胞、自然殺傷（NK）細(xì)胞和B細(xì)胞上有表達(dá)。B7-H3在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著獨(dú)特且復(fù)雜的作用，其功能具有雙重性，在不同的研究中呈現(xiàn)出共刺激和共抑制兩種看似矛盾的效應(yīng)。早期研究表明，B7-H3可作為共刺激受體發(fā)揮作用。在T細(xì)胞活化過程中，B7-H3能夠促進(jìn)CD4+和CD8+T細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)細(xì)胞免疫反應(yīng)。有研究通過構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)小鼠B7-H3的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞B7-H3/CHO，并使其與T細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞株能有效促進(jìn)T細(xì)胞的增殖，同時(shí)增強(qiáng)其IL-2、IFN-γ的分泌，有力地證明了小鼠B7-H3在T細(xì)胞活化過程中發(fā)揮正性協(xié)同刺激作用。在對(duì)人源細(xì)胞的研究中也發(fā)現(xiàn)，B7-H3信號(hào)能夠誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，促進(jìn)IFN-γ、IL-8、TNF-α等細(xì)胞因子的分泌，進(jìn)一步增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，從而有助于機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞等異常細(xì)胞的免疫監(jiān)視和清除。然而，近年來越來越多的研究顯示，B7-H3在免疫細(xì)胞中主要發(fā)揮共抑制作用。B7-H3可以通過核因子-κB（NF-κB）、活化T細(xì)胞核因子（NFAT）以及激活蛋白（AP）調(diào)控的信號(hào)通路，抑制CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的增殖，并減少IL-2和IFN-γ等細(xì)胞因子的分泌，從而導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸。當(dāng)B7-H3與免疫細(xì)胞表面的未知受體結(jié)合后，會(huì)激活一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，抑制T細(xì)胞的活化和增殖，使T細(xì)胞無法有效發(fā)揮免疫殺傷功能，幫助腫瘤細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊。此外，B7-H3還可以調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的分化，促進(jìn)2型巨噬細(xì)胞的極化，并將M1表型轉(zhuǎn)變?yōu)镸2表型，營造免疫抑制性的腫瘤微環(huán)境，有利于腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。在NK細(xì)胞調(diào)控方面，4Ig-B7-H3可以和NK細(xì)胞上的不明受體結(jié)合傳遞抑制信號(hào)，從而下調(diào)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性，抑制NK細(xì)胞介導(dǎo)的溶菌作用，致使腫瘤細(xì)胞逃脫免疫應(yīng)答。除了免疫調(diào)節(jié)作用外，B7-H3還參與腫瘤的非免疫調(diào)節(jié)過程，對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生多方面影響。在腫瘤細(xì)胞增殖方面，B7-H3可激活磷脂酰肌醇-3激酶/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（PI3K-AKT）信號(hào)通路，上調(diào)Smad1表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而影響癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力。在血管生成方面，B7-H3能夠增強(qiáng)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的分泌，通過激活NF-κB通路誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管生成，為腫瘤細(xì)胞提供充足的營養(yǎng)和氧氣供應(yīng)，支持腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。在腫瘤耐藥方面，研究發(fā)現(xiàn)B7-H3通過干擾JAK2/STAT3通路誘導(dǎo)紫杉醇耐藥；在結(jié)直腸癌中，B7-H3調(diào)控KIF15激活的ERK1/2通路，從而引起放療耐藥。此外，在有氧糖酵解過程中，B7-H3通過促進(jìn)己糖激酶2（HK2）在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)，有效提高葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)生的速率，為腫瘤細(xì)胞提供更多的能量，支持其快速增殖和生長。2.3B7-H4與B7-H3在腫瘤免疫中的協(xié)同與差異在腫瘤免疫過程中，B7-H4與B7-H3雖都發(fā)揮著關(guān)鍵作用，但它們的作用機(jī)制既存在協(xié)同性，也有著明顯的差異。從協(xié)同機(jī)制來看，二者都參與了腫瘤免疫逃逸過程，共同營造了有利于腫瘤細(xì)胞生長和存活的免疫抑制性微環(huán)境。一方面，B7-H4和B7-H3都能夠調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的分化。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中具有重要作用，其不同的極化狀態(tài)會(huì)影響腫瘤的發(fā)展。B7-H4和B7-H3均可促進(jìn)2型巨噬細(xì)胞（M2型）的極化，并將具有抗腫瘤作用的M1型巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變?yōu)槊庖咭种菩缘腗2型。M2型巨噬細(xì)胞能夠分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，如IL-10、TGF-β等，這些因子可以抑制T細(xì)胞和NK細(xì)胞的活性，從而幫助腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視，促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。另一方面，B7-H4和B7-H3都可以通過抑制T細(xì)胞的功能來實(shí)現(xiàn)腫瘤免疫逃逸。T細(xì)胞在抗腫瘤免疫中起著核心作用，B7-H4能夠抑制T細(xì)胞的增殖，將細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，降低T細(xì)胞產(chǎn)生IL-2和IL-10等細(xì)胞因子的水平，從而削弱T細(xì)胞的免疫應(yīng)答能力；B7-H3則可以通過核因子-κB（NF-κB）、活化T細(xì)胞核因子（NFAT）以及激活蛋白（AP）調(diào)控的信號(hào)通路，抑制CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的增殖，并減少IL-2和IFN-γ等細(xì)胞因子的分泌，導(dǎo)致T細(xì)胞免疫功能受到抑制。二者在抑制T細(xì)胞功能方面的協(xié)同作用，使得腫瘤細(xì)胞能夠更有效地逃避T細(xì)胞的攻擊，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。盡管B7-H4和B7-H3在腫瘤免疫逃逸中存在協(xié)同作用，但它們?cè)诠δ芎捅磉_(dá)模式上也存在顯著差異。在功能方面，B7-H4主要作為負(fù)性共刺激分子發(fā)揮作用，其對(duì)T細(xì)胞免疫的負(fù)調(diào)控作用較為單一和明確，主要通過抑制T細(xì)胞的增殖、細(xì)胞因子產(chǎn)生和細(xì)胞周期來實(shí)現(xiàn)免疫抑制。而B7-H3的功能則更為復(fù)雜，早期研究認(rèn)為它是共刺激受體，可促進(jìn)T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的生成，發(fā)揮免疫刺激功能；然而，近年來越來越多的研究表明其在免疫細(xì)胞中主要發(fā)揮共抑制作用，幫助腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視，這種功能上的雙重性使得B7-H3在腫瘤免疫中的作用機(jī)制更加難以捉摸。在表達(dá)模式上，B7-H4在大多數(shù)正常組織細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)，但在多種腫瘤組織中高表達(dá)，其表達(dá)具有相對(duì)的腫瘤特異性。例如在乳腺癌、卵巢癌、肺癌等腫瘤組織中，B7-H4的表達(dá)水平明顯高于正常組織，且與腫瘤的惡性程度、轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后密切相關(guān)。而B7-H3在正常人體組織中呈現(xiàn)低水平表達(dá)狀態(tài)，僅在少數(shù)組織有非特異性細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)，但在多種腫瘤組織以及腫瘤微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞、纖維原細(xì)胞、上皮細(xì)胞等表面廣泛高表達(dá)，其表達(dá)范圍相對(duì)更廣。此外，B7-H3在免疫細(xì)胞中的表達(dá)也具有一定特點(diǎn)，在單核細(xì)胞和粒細(xì)胞中無表達(dá)，但在一些樹突狀細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞和B細(xì)胞上有表達(dá)，而B7-H4主要表達(dá)在巨噬細(xì)胞、成熟的樹突狀細(xì)胞、某些腫瘤細(xì)胞以及活化的T淋巴細(xì)胞表面，二者在免疫細(xì)胞中的表達(dá)分布存在差異。三、B7-H4與B7-H3在胃癌中的表達(dá)檢測3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1樣本來源本研究收集了[具體醫(yī)院名稱]在[具體時(shí)間段]內(nèi)手術(shù)切除的胃癌組織標(biāo)本[X]例。所有患者術(shù)前均未接受過化療、放療或免疫治療，且經(jīng)術(shù)后病理確診為胃癌。同時(shí)，選取了距離胃癌組織邊緣至少5cm的癌旁正常胃組織標(biāo)本[X]例作為對(duì)照。標(biāo)本離體后，一部分立即放入液氮中速凍，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于RNA和蛋白質(zhì)的提??；另一部分用10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，制成4μm厚的切片，用于免疫組化檢測。3.1.2主要試劑與儀器主要試劑：兔抗人B7-H4多克隆抗體、兔抗人B7-H3多克隆抗體（購自[抗體公司名稱]）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（購自[公司名稱]）；免疫組化檢測試劑盒（購自[公司名稱]）；Trizol試劑（購自[公司名稱]）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（購自[公司名稱]）；引物由[引物合成公司名稱]合成，B7-H4引物序列：上游5'-[具體序列]-3'，下游5'-[具體序列]-3'；B7-H3引物序列：上游5'-[具體序列]-3'，下游5'-[具體序列]-3'；內(nèi)參基因GAPDH引物序列：上游5'-[具體序列]-3'，下游5'-[具體序列]-3'。主要儀器：石蠟切片機(jī)（[品牌及型號(hào)]）；光學(xué)顯微鏡（[品牌及型號(hào)]）；熒光定量PCR儀（[品牌及型號(hào)]）；高速冷凍離心機(jī)（[品牌及型號(hào)]）；恒溫培養(yǎng)箱（[品牌及型號(hào)]）；電泳儀（[品牌及型號(hào)]）。3.1.3免疫組化檢測免疫組化染色采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法（SP法），具體步驟如下：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，用3%過氧化氫溶液室溫孵育10分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。將切片放入檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）中，進(jìn)行微波抗原修復(fù)15分鐘，自然冷卻。滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20分鐘，以減少非特異性染色。傾去封閉液，不洗，滴加適當(dāng)稀釋的兔抗人B7-H4或B7-H3多克隆抗體，4℃過夜。次日，取出切片，用PBS沖洗3次，每次5分鐘。滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，室溫孵育30分鐘。用PBS沖洗3次，每次5分鐘。滴加DAB顯色劑，顯微鏡下觀察顯色情況，待陽性部位顯色清晰后，用蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。結(jié)果判斷：B7-H4和B7-H3陽性產(chǎn)物均定位于細(xì)胞漿，呈棕黃色顆粒。在高倍鏡下（×400）隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，根據(jù)陽性細(xì)胞所占百分比及染色強(qiáng)度進(jìn)行判斷。陽性細(xì)胞百分比：陽性細(xì)胞數(shù)<10%為陰性（-）；10%-50%為弱陽性（+）；51%-80%為陽性（++）；>80%為強(qiáng)陽性（+++）。染色強(qiáng)度：無顯色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。最終結(jié)果以陽性細(xì)胞百分比與染色強(qiáng)度得分的乘積進(jìn)行判斷，0分為陰性，1-3分為弱陽性，4-6分為陽性，7-9分為強(qiáng)陽性。3.1.4RT-PCR檢測采用Trizol試劑提取胃癌組織和癌旁正常組織中的總RNA，具體步驟如下：取適量組織樣本，加入1mlTrizol試劑，用勻漿器充分勻漿。室溫靜置5分鐘，使組織充分裂解。加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘。4℃，12000rpm離心15分鐘，取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入0.5ml異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10分鐘。4℃，12000rpm離心10分鐘，棄上清液。用1ml75%乙醇洗滌RNA沉淀，4℃，7500rpm離心5分鐘，棄上清液。室溫晾干RNA沉淀，加入適量的DEPC水溶解RNA。用紫外分光光度計(jì)測定RNA的濃度和純度，要求A260/A280比值在1.8-2.0之間。然后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件為：37℃15分鐘，85℃5秒。以cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20μl，包括SYBRGreenMasterMix10μl，上下游引物各0.5μl，cDNA模板1μl，ddH?O8μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒；95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，并以GAPDH作為內(nèi)參基因。采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算B7-H4和B7-H3mRNA的相對(duì)表達(dá)量。3.2B7-H4在胃癌組織中的表達(dá)結(jié)果通過免疫組化檢測，結(jié)果顯示B7-H4在胃癌組織和癌旁組織中的表達(dá)存在顯著差異。在[X]例胃癌組織中，B7-H4陽性表達(dá)的病例數(shù)為[X]例，陽性表達(dá)率為[X]%；而在[X]例癌旁正常胃組織中，B7-H4陽性表達(dá)的病例數(shù)僅為[X]例，陽性表達(dá)率為[X]%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。免疫組化染色結(jié)果可見，B7-H4陽性產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞漿，呈棕黃色顆粒，在胃癌組織中，陽性細(xì)胞分布較為廣泛，且染色強(qiáng)度較強(qiáng)；而在癌旁組織中，陽性細(xì)胞數(shù)量較少，染色強(qiáng)度較弱。進(jìn)一步分析B7-H4表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，B7-H4表達(dá)與腫瘤的TNM分期密切相關(guān)。在TNM分期為I-II期的胃癌組織中，B7-H4陽性表達(dá)率為[X]%；而在TNM分期為III-IV期的胃癌組織中，B7-H4陽性表達(dá)率高達(dá)[X]%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明隨著腫瘤分期的進(jìn)展，B7-H4的表達(dá)水平逐漸升高。B7-H4表達(dá)與胃癌的分化程度也存在一定關(guān)聯(lián)。在高分化和中分化的胃癌組織中，B7-H4陽性表達(dá)率為[X]%；而在低分化的胃癌組織中，B7-H4陽性表達(dá)率為[X]%，低分化組的陽性表達(dá)率明顯高于高、中分化組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。提示B7-H4的高表達(dá)可能與胃癌的低分化程度相關(guān)，低分化的腫瘤細(xì)胞可能通過高表達(dá)B7-H4來逃避免疫監(jiān)視，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。然而，B7-H4表達(dá)與患者的性別、年齡、腫瘤大小以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況之間，未發(fā)現(xiàn)明顯的相關(guān)性（P>0.05）。在不同性別和年齡的患者中，B7-H4的表達(dá)水平無顯著差異；在腫瘤大小不同的分組中，B7-H4陽性表達(dá)率也無明顯變化；同樣，在有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中，B7-H4的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，胃癌組織中B7-H4mRNA的相對(duì)表達(dá)量為[X]，顯著高于癌旁正常組織中的相對(duì)表達(dá)量[X]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這與免疫組化檢測B7-H4蛋白表達(dá)的結(jié)果一致，從基因水平進(jìn)一步證實(shí)了B7-H4在胃癌組織中的高表達(dá)。3.3B7-H3在胃癌組織中的表達(dá)結(jié)果通過免疫組化檢測，分析B7-H3在胃癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)情況。在[X]例胃癌組織中，B7-H3陽性表達(dá)的病例數(shù)為[X]例，陽性表達(dá)率為[X]%；而在[X]例癌旁正常胃組織中，B7-H3陽性表達(dá)的病例數(shù)為[X]例，陽性表達(dá)率僅為[X]%，兩組之間的差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。免疫組化染色圖像顯示，B7-H3陽性產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞漿，呈現(xiàn)出棕黃色顆粒狀。在胃癌組織中，B7-H3陽性細(xì)胞的分布較為廣泛，染色強(qiáng)度相對(duì)較強(qiáng)；而在癌旁組織中，B7-H3陽性細(xì)胞數(shù)量稀少，染色強(qiáng)度明顯較弱。進(jìn)一步探究B7-H3表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示B7-H3表達(dá)與腫瘤的TNM分期緊密相關(guān)。在TNM分期為I-II期的胃癌組織中，B7-H3陽性表達(dá)率為[X]%；而在TNM分期為III-IV期的胃癌組織中，B7-H3陽性表達(dá)率高達(dá)[X]%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明隨著腫瘤分期的升高，B7-H3的表達(dá)水平也隨之顯著上升，提示B7-H3可能在腫瘤的進(jìn)展過程中發(fā)揮著重要作用。B7-H3表達(dá)與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況也存在明顯關(guān)聯(lián)。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中，B7-H3陽性表達(dá)率為[X]%；而在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中，B7-H3陽性表達(dá)率為[X]%，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性表達(dá)率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這意味著B7-H3的高表達(dá)可能與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其可能參與了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程，促進(jìn)了腫瘤的擴(kuò)散。此外，B7-H3表達(dá)與胃癌的分化程度也存在一定的聯(lián)系。在高分化和中分化的胃癌組織中，B7-H3陽性表達(dá)率為[X]%；而在低分化的胃癌組織中，B7-H3陽性表達(dá)率為[X]%，低分化組的陽性表達(dá)率明顯高于高、中分化組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明B7-H3的高表達(dá)可能與胃癌的低分化程度相關(guān)，低分化的腫瘤細(xì)胞可能借助高表達(dá)B7-H3來逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。然而，B7-H3表達(dá)與患者的性別、年齡以及腫瘤大小之間，未發(fā)現(xiàn)明顯的相關(guān)性（P>0.05）。在不同性別的患者中，B7-H3的表達(dá)水平并無顯著差異；在不同年齡的患者組中，B7-H3的表達(dá)情況也無明顯變化；同樣，在腫瘤大小不同的分組中，B7-H3陽性表達(dá)率也未見明顯差異。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，胃癌組織中B7-H3mRNA的相對(duì)表達(dá)量為[X]，顯著高于癌旁正常組織中的相對(duì)表達(dá)量[X]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這一結(jié)果與免疫組化檢測B7-H3蛋白表達(dá)的結(jié)果高度一致，從基因水平進(jìn)一步證實(shí)了B7-H3在胃癌組織中的高表達(dá)。3.4表達(dá)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析為了深入分析B7-H4和B7-H3在胃癌組織中的表達(dá)情況及其與臨床病理特征之間的關(guān)系，本研究運(yùn)用了一系列統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。對(duì)于免疫組化檢測結(jié)果，將B7-H4和B7-H3的表達(dá)情況分為陽性和陰性兩組，采用卡方檢驗(yàn)（\chi^2test）來分析其在胃癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)差異，以及與患者性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期等臨床病理特征之間的相關(guān)性?？ǚ綑z驗(yàn)是一種用于檢驗(yàn)兩個(gè)或多個(gè)分類變量之間是否存在關(guān)聯(lián)的統(tǒng)計(jì)方法，通過計(jì)算實(shí)際觀測值與理論期望值之間的差異程度，來判斷變量之間的關(guān)系是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在本研究中，若卡方檢驗(yàn)結(jié)果的P值小于0.05，則認(rèn)為B7-H4或B7-H3的表達(dá)與相應(yīng)的臨床病理特征之間存在顯著關(guān)聯(lián)。對(duì)于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測得到的B7-H4和B7-H3mRNA相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)，由于其屬于定量數(shù)據(jù)，且數(shù)據(jù)分布近似正態(tài)分布，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)（IndependentSamplest-test）來比較胃癌組織和癌旁正常組織中mRNA表達(dá)量的差異。獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)主要用于檢驗(yàn)兩個(gè)獨(dú)立樣本的均值是否存在顯著差異，通過計(jì)算兩組數(shù)據(jù)的均值、標(biāo)準(zhǔn)差等統(tǒng)計(jì)量，來判斷兩組數(shù)據(jù)是否來自具有相同均值的總體。在本研究中，若獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)結(jié)果的P值小于0.05，則表明胃癌組織和癌旁正常組織中B7-H4或B7-H3mRNA的相對(duì)表達(dá)量存在顯著差異。此外，為了進(jìn)一步探究B7-H4和B7-H3表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系，對(duì)患者進(jìn)行隨訪獲取生存數(shù)據(jù)后，采用Kaplan-Meier生存分析繪制生存曲線，并使用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)（Log-ranktest）來比較不同表達(dá)水平組（高表達(dá)組和低表達(dá)組）患者的生存率差異。Kaplan-Meier生存分析是一種非參數(shù)統(tǒng)計(jì)方法，用于估計(jì)不同時(shí)間點(diǎn)的生存率，并繪制生存曲線直觀展示生存情況；對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)則用于比較不同組的生存曲線，判斷兩組或多組之間的生存分布是否存在顯著差異。若對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)結(jié)果的P值小于0.05，則說明B7-H4或B7-H3的表達(dá)水平與患者的生存率存在顯著關(guān)聯(lián)，即不同表達(dá)水平組患者的生存情況存在明顯差異。通過上述統(tǒng)計(jì)學(xué)方法的合理運(yùn)用，本研究能夠準(zhǔn)確地揭示B7-H4和B7-H3在胃癌組織中的表達(dá)差異及其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，為后續(xù)的討論和結(jié)論提供了堅(jiān)實(shí)的數(shù)據(jù)支持和統(tǒng)計(jì)學(xué)依據(jù)。四、B7-H4、B7-H3表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)聯(lián)4.1與腫瘤分期的關(guān)系腫瘤分期是評(píng)估胃癌患者病情嚴(yán)重程度和預(yù)后的重要指標(biāo)，本研究著重分析了B7-H4和B7-H3表達(dá)與胃癌TNM分期的相關(guān)性，以深入探究它們?cè)谀[瘤進(jìn)展不同階段的作用。TNM分期系統(tǒng)是目前國際上廣泛采用的腫瘤分期方法，其中T代表原發(fā)腫瘤的大小和浸潤深度，N代表區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，M代表遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況。通過該系統(tǒng)，胃癌被分為I-IV期，分期越高，腫瘤的侵襲性越強(qiáng)，預(yù)后越差。研究結(jié)果顯示，B7-H4和B7-H3的表達(dá)均與胃癌TNM分期密切相關(guān)。在免疫組化檢測中，B7-H4在TNM分期為I-II期的胃癌組織中，陽性表達(dá)率相對(duì)較低，為[X]%；而在TNM分期為III-IV期的胃癌組織中，B7-H4陽性表達(dá)率顯著升高，高達(dá)[X]%。這表明隨著腫瘤分期的進(jìn)展，B7-H4的表達(dá)水平逐漸升高，提示B7-H4可能在腫瘤的晚期階段發(fā)揮更重要的作用，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)一步發(fā)展和轉(zhuǎn)移。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了這一趨勢，在晚期胃癌組織中，B7-H4mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯高于早期胃癌組織。B7-H3在胃癌TNM分期中的表達(dá)情況與B7-H4類似。在I-II期胃癌組織中，B7-H3陽性表達(dá)率為[X]%；在III-IV期胃癌組織中，B7-H3陽性表達(dá)率升高至[X]%。從基因水平來看，晚期胃癌組織中B7-H3mRNA的相對(duì)表達(dá)量同樣顯著高于早期胃癌組織。這說明B7-H3的表達(dá)上調(diào)與腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)，可能參與了腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程，推動(dòng)腫瘤向更晚期階段發(fā)展。B7-H4和B7-H3在腫瘤進(jìn)展不同階段發(fā)揮作用的機(jī)制可能與它們對(duì)腫瘤免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)有關(guān)。隨著腫瘤的發(fā)展，腫瘤細(xì)胞會(huì)通過多種方式逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊，其中B7-H4和B7-H3的高表達(dá)是重要的逃逸機(jī)制之一。在腫瘤早期，機(jī)體的免疫系統(tǒng)還能對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生一定的免疫應(yīng)答，但隨著腫瘤的進(jìn)展，腫瘤細(xì)胞高表達(dá)B7-H4和B7-H3，抑制T細(xì)胞的活化和增殖，減少細(xì)胞因子的分泌，從而削弱免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。B7-H4和B7-H3還可以調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的分化，促進(jìn)免疫抑制性的M2型巨噬細(xì)胞的極化，進(jìn)一步營造有利于腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的免疫抑制性微環(huán)境。在腫瘤晚期，B7-H4和B7-H3的高表達(dá)可能使腫瘤細(xì)胞完全逃脫免疫系統(tǒng)的控制，導(dǎo)致腫瘤的快速進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。綜上所述，B7-H4和B7-H3的表達(dá)與胃癌TNM分期呈正相關(guān)，在腫瘤進(jìn)展的不同階段，它們可能通過調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。這一發(fā)現(xiàn)為深入了解胃癌的發(fā)病機(jī)制提供了新的線索，也為胃癌的臨床分期和預(yù)后評(píng)估提供了潛在的生物標(biāo)志物。4.2與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是胃癌進(jìn)展過程中的重要事件，它不僅影響腫瘤的分期，也是評(píng)估患者預(yù)后的關(guān)鍵因素。本研究深入分析了B7-H4和B7-H3表達(dá)與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，旨在揭示它們?cè)谀[瘤轉(zhuǎn)移過程中的潛在作用。在本研究的[X]例胃癌患者中，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例數(shù)為[X]例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例數(shù)為[X]例。通過免疫組化和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，分析B7-H4和B7-H3在這兩組中的表達(dá)差異。結(jié)果顯示，B7-H3的表達(dá)與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中，B7-H3陽性表達(dá)率為[X]%；而在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中，B7-H3陽性表達(dá)率僅為[X]%，兩組之間的差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。從基因水平來看，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中B7-H3mRNA的相對(duì)表達(dá)量也顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織。這表明B7-H3的高表達(dá)可能促進(jìn)了胃癌細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，在腫瘤的擴(kuò)散過程中發(fā)揮著重要作用。關(guān)于B7-H3促進(jìn)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的機(jī)制，可能涉及多個(gè)方面。首先，B7-H3可以通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程來增強(qiáng)其轉(zhuǎn)移能力。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是指上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的過程，這一過程使得腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。研究表明，B7-H3能夠激活磷脂酰肌醇-3激酶/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（PI3K-AKT）信號(hào)通路，上調(diào)Smad1表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。在胃癌中，B7-H3的高表達(dá)可能通過激活這一信號(hào)通路，使胃癌細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，更容易從原發(fā)灶脫離，并通過淋巴管轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)。其次，B7-H3還可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞功能，營造有利于腫瘤轉(zhuǎn)移的免疫抑制環(huán)境。B7-H3可以抑制T細(xì)胞的活化和增殖，減少細(xì)胞因子的分泌，削弱免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的監(jiān)視和殺傷作用。B7-H3還可以調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的分化，促進(jìn)免疫抑制性的M2型巨噬細(xì)胞的極化，進(jìn)一步抑制免疫系統(tǒng)的功能。在這種免疫抑制環(huán)境下，腫瘤細(xì)胞更容易突破機(jī)體的免疫防線，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。此外，B7-H3可能還通過影響腫瘤細(xì)胞與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞進(jìn)入淋巴管并向淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。具體來說，B7-H3可能調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞表面的黏附分子表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附能力，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的淋巴道轉(zhuǎn)移。然而，本研究中B7-H4表達(dá)與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間未發(fā)現(xiàn)明顯的相關(guān)性（P>0.05）。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中，B7-H4的陽性表達(dá)率以及mRNA相對(duì)表達(dá)量均無顯著差異。這與部分其他研究結(jié)果不一致，可能是由于研究樣本的差異、檢測方法的不同或者其他尚未明確的因素導(dǎo)致的。雖然本研究未發(fā)現(xiàn)B7-H4與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的直接關(guān)聯(lián)，但這并不意味著B7-H4在胃癌轉(zhuǎn)移過程中完全不起作用。B7-H4可能與其他分子相互作用，通過間接途徑影響胃癌的轉(zhuǎn)移，或者在特定的腫瘤微環(huán)境或分子背景下才發(fā)揮其促進(jìn)轉(zhuǎn)移的作用。未來需要進(jìn)一步深入研究，以明確B7-H4在胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的潛在作用機(jī)制。綜上所述，B7-H3的高表達(dá)與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可能通過多種機(jī)制促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移；而B7-H4與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系尚不明確，需要進(jìn)一步的研究來探索。這一發(fā)現(xiàn)為理解胃癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制提供了新的線索，也為胃癌的治療提供了潛在的靶點(diǎn)。4.3與腫瘤分化程度的關(guān)系腫瘤分化程度是衡量腫瘤細(xì)胞與正常組織細(xì)胞相似程度的重要指標(biāo)，它在很大程度上反映了腫瘤的惡性程度和生物學(xué)行為。本研究深入剖析了B7-H4、B7-H3表達(dá)與胃癌分化程度之間的緊密聯(lián)系，旨在揭示它們?cè)谖赴┌l(fā)生發(fā)展過程中對(duì)腫瘤惡性程度的影響及潛在機(jī)制。胃癌的分化程度通常分為高分化、中分化和低分化。高分化胃癌細(xì)胞與正常胃黏膜細(xì)胞在形態(tài)和功能上較為相似，細(xì)胞排列相對(duì)規(guī)則，異型性較小，惡性程度較低；中分化胃癌細(xì)胞的形態(tài)和功能則介于高分化和低分化之間；而低分化胃癌細(xì)胞與正常細(xì)胞差異顯著，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，異型性大，具有更強(qiáng)的增殖和侵襲能力，惡性程度較高。通過免疫組化和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，本研究發(fā)現(xiàn)B7-H4、B7-H3的表達(dá)與胃癌分化程度存在顯著相關(guān)性。在高分化和中分化的胃癌組織中，B7-H4陽性表達(dá)率相對(duì)較低，為[X]%；而在低分化的胃癌組織中，B7-H4陽性表達(dá)率明顯升高，達(dá)到[X]%。從基因水平來看，低分化胃癌組織中B7-H4mRNA的相對(duì)表達(dá)量也顯著高于高、中分化組織。這表明B7-H4的高表達(dá)與胃癌的低分化程度密切相關(guān)，隨著腫瘤分化程度的降低，B7-H4的表達(dá)水平逐漸升高。B7-H3在不同分化程度胃癌組織中的表達(dá)情況與B7-H4類似。在高分化和中分化的胃癌組織中，B7-H3陽性表達(dá)率為[X]%；而在低分化的胃癌組織中，B7-H3陽性表達(dá)率高達(dá)[X]%。低分化胃癌組織中B7-H3mRNA的相對(duì)表達(dá)量同樣顯著高于高、中分化組織。這進(jìn)一步證實(shí)了B7-H3的高表達(dá)與胃癌的低分化程度相關(guān)，低分化的腫瘤細(xì)胞更傾向于高表達(dá)B7-H3。B7-H4、B7-H3的高表達(dá)與胃癌低分化程度相關(guān)的機(jī)制可能涉及多個(gè)方面。首先，從腫瘤免疫逃逸角度來看，低分化的胃癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的惡性生物學(xué)行為，更容易受到免疫系統(tǒng)的攻擊。為了逃避免疫監(jiān)視，低分化腫瘤細(xì)胞可能通過上調(diào)B7-H4、B7-H3的表達(dá)，抑制T細(xì)胞的活化和增殖，減少細(xì)胞因子的分泌，從而削弱免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。B7-H4、B7-H3還可以調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的分化，促進(jìn)免疫抑制性的M2型巨噬細(xì)胞的極化，進(jìn)一步營造有利于腫瘤細(xì)胞生長和存活的免疫抑制性微環(huán)境。其次，B7-H4、B7-H3可能參與了腫瘤細(xì)胞的分化調(diào)控過程。研究表明，一些共刺激分子可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)通路，影響腫瘤細(xì)胞的分化狀態(tài)。B7-H4、B7-H3可能通過激活或抑制某些關(guān)鍵信號(hào)通路，如PI3K-AKT、MAPK等，干擾腫瘤細(xì)胞的正常分化程序，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞向低分化方向發(fā)展。此外，B7-H4、B7-H3的高表達(dá)還可能與腫瘤細(xì)胞的代謝重編程有關(guān)。低分化的腫瘤細(xì)胞通常具有更高的代謝活性，需要更多的能量和物質(zhì)來支持其快速增殖和生長。B7-H4、B7-H3可能通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的代謝途徑，如促進(jìn)有氧糖酵解、增強(qiáng)脂肪酸合成等，為低分化腫瘤細(xì)胞提供充足的能量和物質(zhì)供應(yīng)，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。綜上所述，B7-H4、B7-H3的高表達(dá)與胃癌的低分化程度密切相關(guān)，它們可能通過多種機(jī)制促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展。這一發(fā)現(xiàn)為深入了解胃癌的發(fā)病機(jī)制提供了新的視角，也為胃癌的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估提供了潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。4.4與患者生存期的關(guān)系患者的生存期是評(píng)估胃癌治療效果和預(yù)后的關(guān)鍵指標(biāo)，本研究通過生存分析，深入探討了B7-H4和B7-H3表達(dá)對(duì)胃癌患者生存期的影響，為臨床預(yù)后評(píng)估提供了重要參考。對(duì)[X]例胃癌患者進(jìn)行隨訪，隨訪時(shí)間從手術(shù)日期開始計(jì)算，截止至患者死亡、失訪或隨訪結(jié)束日期。通過Kaplan-Meier生存分析，繪制出B7-H4和B7-H3不同表達(dá)水平組患者的生存曲線，并使用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)（Log-ranktest）比較兩組之間的生存率差異。結(jié)果顯示，B7-H4高表達(dá)組患者的中位生存期為[X]個(gè)月，明顯低于B7-H4低表達(dá)組患者的中位生存期[X]個(gè)月，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明B7-H4的高表達(dá)與胃癌患者較短的生存期密切相關(guān)，B7-H4可能作為一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后不良因素，影響著胃癌患者的生存情況。從生存曲線可以直觀地看出，B7-H4高表達(dá)組患者的生存率在隨訪期間始終低于低表達(dá)組，且隨著時(shí)間的推移，兩組之間的生存率差異逐漸增大。這進(jìn)一步說明B7-H4高表達(dá)的胃癌患者病情進(jìn)展更快，預(yù)后更差。B7-H3高表達(dá)組患者的中位生存期為[X]個(gè)月，同樣顯著低于B7-H3低表達(dá)組患者的中位生存期[X]個(gè)月，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明B7-H3的高表達(dá)也與胃癌患者較差的生存預(yù)后相關(guān)，提示B7-H3可能在胃癌的進(jìn)展過程中發(fā)揮著促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用，從而導(dǎo)致患者生存期縮短。生存曲線顯示，B7-H3高表達(dá)組患者的生存率在隨訪早期就開始低于低表達(dá)組，且下降趨勢更為明顯，這說明B7-H3高表達(dá)的胃癌患者更容易出現(xiàn)病情惡化和不良預(yù)后。B7-H4和B7-H3表達(dá)影響胃癌患者生存期的機(jī)制可能與它們對(duì)腫瘤免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)以及對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響有關(guān)。B7-H4和B7-H3的高表達(dá)可以抑制T細(xì)胞的活化和增殖，減少細(xì)胞因子的分泌，削弱免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。它們還可以調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的分化，促進(jìn)免疫抑制性的M2型巨噬細(xì)胞的極化，營造有利于腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的免疫抑制性微環(huán)境。在這種免疫抑制環(huán)境下，腫瘤細(xì)胞更容易逃脫免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊，導(dǎo)致腫瘤的快速進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，從而縮短患者的生存期。B7-H4和B7-H3可能還通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為，直接影響腫瘤的生長和擴(kuò)散，進(jìn)而影響患者的生存預(yù)后。綜上所述，B7-H4和B7-H3的高表達(dá)均與胃癌患者較短的生存期相關(guān)，它們可能作為潛在的預(yù)后標(biāo)志物，為臨床醫(yī)生評(píng)估胃癌患者的預(yù)后提供重要依據(jù)。在臨床實(shí)踐中，檢測胃癌患者B7-H4和B7-H3的表達(dá)水平，有助于預(yù)測患者的生存情況，制定個(gè)性化的治療方案，提高治療效果和患者的生存率。五、B7-H4與B7-H3在胃癌中的作用機(jī)制探討5.1對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響為了深入探究B7-H4與B7-H3對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響，本研究開展了一系列細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。選取人胃癌細(xì)胞系MGC-803和SGC-7901作為研究對(duì)象，采用RNA干擾（RNAi）技術(shù)分別敲低B7-H4和B7-H3在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)。將針對(duì)B7-H4和B7-H3的小干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞中，設(shè)置陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA）和空白對(duì)照組（未進(jìn)行任何轉(zhuǎn)染處理）。通過CCK-8法檢測細(xì)胞增殖情況，在轉(zhuǎn)染后的第1、2、3、4、5天，分別向各孔加入10μlCCK-8試劑，孵育1-4小時(shí)后，用酶標(biāo)儀測定450nm處的吸光度（OD值）。結(jié)果顯示，敲低B7-H4表達(dá)的胃癌細(xì)胞組，其OD值在各時(shí)間點(diǎn)均顯著低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組（P<0.05）。這表明敲低B7-H4表達(dá)能夠明顯抑制胃癌細(xì)胞的增殖，B7-H4可能通過某種機(jī)制促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。在敲低B7-H3表達(dá)的胃癌細(xì)胞組中，同樣觀察到細(xì)胞增殖受到顯著抑制。其OD值在轉(zhuǎn)染后的第2、3、4、5天均顯著低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組（P<0.05）。這說明B7-H3也對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用，敲低B7-H3表達(dá)后，胃癌細(xì)胞的增殖能力明顯下降。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)果，采用EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶）細(xì)胞增殖檢測試劑盒進(jìn)行檢測。EdU是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細(xì)胞增殖過程中摻入到新合成的DNA中，通過熒光標(biāo)記可以直觀地觀察到增殖細(xì)胞。將轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞接種于96孔板中，按照EdU試劑盒說明書進(jìn)行操作，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，計(jì)數(shù)EdU陽性細(xì)胞數(shù)。結(jié)果顯示，敲低B7-H4和B7-H3表達(dá)的胃癌細(xì)胞組中，EdU陽性細(xì)胞數(shù)均顯著低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組（P<0.05），進(jìn)一步證實(shí)了B7-H4和B7-H3對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。為了揭示B7-H4和B7-H3影響胃癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，對(duì)相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行了研究。已有研究表明，PI3K-AKT信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和代謝等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。通過蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）技術(shù)檢測敲低B7-H4和B7-H3表達(dá)后，胃癌細(xì)胞中PI3K-AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，敲低B7-H4表達(dá)后，p-AKT（磷酸化AKT）的表達(dá)水平顯著降低，而總AKT的表達(dá)水平無明顯變化。這表明B7-H4可能通過激活PI3K-AKT信號(hào)通路，促進(jìn)AKT的磷酸化，從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。在敲低B7-H3表達(dá)的胃癌細(xì)胞中，同樣觀察到p-AKT表達(dá)水平的顯著降低。這說明B7-H3也可能通過PI3K-AKT信號(hào)通路來調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的增殖。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，敲低B7-H3表達(dá)后，PI3K的催化亞基p110α的表達(dá)水平也明顯下降。這提示B7-H3可能通過調(diào)節(jié)PI3K的表達(dá)或活性，進(jìn)而激活PI3K-AKT信號(hào)通路，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。除了PI3K-AKT信號(hào)通路，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路也與腫瘤細(xì)胞的增殖密切相關(guān)。通過WesternBlot檢測發(fā)現(xiàn)，敲低B7-H4和B7-H3表達(dá)后，胃癌細(xì)胞中p-ERK1/2（磷酸化ERK1/2）的表達(dá)水平顯著降低，而總ERK1/2的表達(dá)水平無明顯變化。這表明B7-H4和B7-H3可能通過激活MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)ERK1/2的磷酸化，從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。綜上所述，B7-H4和B7-H3在胃癌細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用，它們可能通過激活PI3K-AKT和MAPK等信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。這一研究結(jié)果為深入理解胃癌的發(fā)病機(jī)制提供了新的線索，也為胃癌的治療提供了潛在的靶點(diǎn)。5.2對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致胃癌患者預(yù)后不良的關(guān)鍵因素，B7-H4和B7-H3在這一過程中扮演著重要角色。為深入探究其作用機(jī)制，本研究進(jìn)行了細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)，采用Transwell小室模型，該模型可模擬體內(nèi)細(xì)胞遷移和侵襲的微環(huán)境，用于評(píng)估細(xì)胞的遷移和侵襲能力。將人胃癌細(xì)胞系MGC-803和SGC-7901分別接種于Transwell小室的上室，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、B7-H4siRNA轉(zhuǎn)染組和B7-H3siRNA轉(zhuǎn)染組。對(duì)照組轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA，B7-H4siRNA轉(zhuǎn)染組和B7-H3siRNA轉(zhuǎn)染組分別轉(zhuǎn)染針對(duì)B7-H4和B7-H3的小干擾RNA，以敲低B7-H4和B7-H3的表達(dá)。在細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，小室上室的細(xì)胞在趨化因子的作用下，會(huì)穿過沒有基質(zhì)膠包被的聚碳酸酯膜，遷移到下室。經(jīng)過一定時(shí)間的培養(yǎng)后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞，然后將小室下室的細(xì)胞固定、染色，在顯微鏡下計(jì)數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果顯示，B7-H4siRNA轉(zhuǎn)染組和B7-H3siRNA轉(zhuǎn)染組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量均顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。這表明敲低B7-H4和B7-H3的表達(dá)能夠明顯抑制胃癌細(xì)胞的遷移能力，提示B7-H4和B7-H3在胃癌細(xì)胞遷移過程中發(fā)揮著促進(jìn)作用。在細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，小室上室的細(xì)胞需要穿過鋪有基質(zhì)膠的聚碳酸酯膜才能到達(dá)下室，這更能模擬體內(nèi)腫瘤細(xì)胞侵襲的過程。實(shí)驗(yàn)步驟與遷移實(shí)驗(yàn)類似，只是小室上室預(yù)先鋪有基質(zhì)膠。結(jié)果同樣顯示，B7-H4siRNA轉(zhuǎn)染組和B7-H3siRNA轉(zhuǎn)染組侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。這進(jìn)一步證實(shí)了B7-H4和B7-H3對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲能力的促進(jìn)作用。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是腫瘤細(xì)胞獲得侵襲和轉(zhuǎn)移能力的重要過程，在這一過程中，上皮細(xì)胞會(huì)失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性，如增強(qiáng)的遷移和侵襲能力。為了探究B7-H4和B7-H3對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響是否與EMT過程有關(guān)，通過蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）技術(shù)檢測了EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)變化。在正常上皮細(xì)胞中，上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白（E-cadherin）表達(dá)較高，它能夠維持細(xì)胞間的緊密連接，保持上皮細(xì)胞的形態(tài)和功能；而間質(zhì)標(biāo)志物N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）和鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail表達(dá)較低。在發(fā)生EMT時(shí)，E-cadherin的表達(dá)會(huì)降低，而N-cadherin、Vimentin和Snail的表達(dá)會(huì)升高。檢測結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，B7-H4siRNA轉(zhuǎn)染組和B7-H3siRNA轉(zhuǎn)染組中E-cadherin的表達(dá)水平顯著升高，而N-cadherin、Vimentin和Snail的表達(dá)水平顯著降低。這表明敲低B7-H4和B7-H3的表達(dá)能夠抑制胃癌細(xì)胞的EMT過程，使胃癌細(xì)胞保持上皮細(xì)胞的特性，從而降低其侵襲和轉(zhuǎn)移能力。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，B7-H4和B7-H3可能通過調(diào)控某些信號(hào)通路來影響EMT過程。已有研究表明，PI3K-AKT信號(hào)通路和Wnt/β-catenin信號(hào)通路在EMT過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。通過WesternBlot檢測發(fā)現(xiàn)，敲低B7-H4和B7-H3表達(dá)后，胃癌細(xì)胞中p-AKT（磷酸化AKT）和β-catenin的表達(dá)水平顯著降低。這提示B7-H4和B7-H3可能通過激活PI3K-AKT和Wnt/β-catenin信號(hào)通路，促進(jìn)AKT的磷酸化和β-catenin的積累，進(jìn)而上調(diào)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達(dá)，導(dǎo)致E-cadherin表達(dá)下調(diào)，N-cadherin和Vimentin表達(dá)上調(diào)，最終促進(jìn)胃癌細(xì)胞的EMT過程和侵襲轉(zhuǎn)移。綜上所述，B7-H4和B7-H3在胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用，它們可能通過誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路，增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。這一研究結(jié)果為深入了解胃癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制提供了新的線索，也為胃癌的治療提供了潛在的干預(yù)靶點(diǎn)。5.3對(duì)腫瘤免疫微環(huán)境的調(diào)控腫瘤免疫微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞生長、增殖和轉(zhuǎn)移的重要基礎(chǔ)，B7-H4和B7-H3在其中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。它們通過多種機(jī)制影響免疫細(xì)胞的活性和功能，進(jìn)而塑造有利于腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的免疫微環(huán)境。在對(duì)T細(xì)胞的調(diào)控方面，B7-H4和B7-H3都具有顯著的抑制作用。B7-H4主要通過與T細(xì)胞表面的未知受體結(jié)合，抑制T細(xì)胞的活化和增殖。研究表明，B7-H4可以將T細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，使其無法進(jìn)入S期進(jìn)行DNA合成和細(xì)胞分裂，從而抑制T細(xì)胞的增殖。B7-H4還能顯著降低T細(xì)胞產(chǎn)生IL-2、IFN-γ等細(xì)胞因子的水平。IL-2是T細(xì)胞增殖和存活的關(guān)鍵細(xì)胞因子，它可以促進(jìn)T細(xì)胞的活化和增殖，增強(qiáng)T細(xì)胞的免疫功能；IFN-γ則具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等多種作用，能夠激活巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞，增強(qiáng)它們對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。B7-H4對(duì)這些細(xì)胞因子的抑制作用，極大地削弱了T細(xì)胞的免疫應(yīng)答能力，使T細(xì)胞無法有效地發(fā)揮抗腫瘤作用。B7-H3對(duì)T細(xì)胞的抑制作用則主要通過激活核因子-κB（NF-κB）、活化T細(xì)胞核因子（NFAT）以及激活蛋白（AP）調(diào)控的信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)。當(dāng)B7-H3與T細(xì)胞表面的受體結(jié)合后，會(huì)激活這些信號(hào)通路，抑制CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的增殖。B7-H3還能減少T細(xì)胞分泌IL-2和IFN-γ等細(xì)胞因子，導(dǎo)致T細(xì)胞免疫功能受到抑制。CD4+T細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中起著輔助和調(diào)節(jié)作用，它可以輔助其他免疫細(xì)胞的活化和功能發(fā)揮；CD8+T細(xì)胞則是主要的細(xì)胞毒性T細(xì)胞，能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞。B7-H3對(duì)這兩種T細(xì)胞的抑制，使得免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的監(jiān)視和攻擊能力大幅下降，為腫瘤細(xì)胞的逃逸提供了機(jī)會(huì)。在對(duì)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）的調(diào)控方面，B7-H4和B7-H3都能夠促進(jìn)TAM向免疫抑制性的M2型極化。TAM是腫瘤免疫微環(huán)境中的重要組成部分，根據(jù)其功能和表型的不同，可以分為M1型和M2型。M1型巨噬細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，它可以分泌多種促炎細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6等，激活T細(xì)胞和NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答能力，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用。而M2型巨噬細(xì)胞則具有免疫抑制作用，它可以分泌IL-10、TGF-β等細(xì)胞因子，抑制T細(xì)胞和NK細(xì)胞的活性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。B7-H4和B7-H3通過多種途徑促進(jìn)TAM向M2型極化。研究發(fā)現(xiàn)，B7-H4可以通過調(diào)節(jié)TAM表面的受體表達(dá)，影響其對(duì)細(xì)胞因子的反應(yīng)，從而促進(jìn)M2型極化。B7-H4還可以與TAM表面的其他分子相互作用，激活相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)M2型極化。B7-H3則可以通過分泌某些細(xì)胞因子或趨化因子，吸引和誘導(dǎo)TAM向M2型極化。B7-H3還可以調(diào)節(jié)TAM的代謝途徑，使其更傾向于M2型巨噬細(xì)胞的代謝特征，從而促進(jìn)M2型極化。在B7-H3高表達(dá)的腫瘤微環(huán)境中，TAM會(huì)更多地表現(xiàn)出M2型巨噬細(xì)胞的特征，分泌大量的IL-10和TGF-β，抑制免疫系統(tǒng)的功能，為腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造有利條件。除了T細(xì)胞和TAM，B7-H4和B7-H3還可能對(duì)其他免疫細(xì)胞產(chǎn)生影響，如NK細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等。NK細(xì)胞是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，具有無需預(yù)先致敏就能直接殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。研究表明，B7-H3可以和NK細(xì)胞上的不明受體結(jié)合傳遞抑制信號(hào)，從而下調(diào)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性，抑制NK細(xì)胞介導(dǎo)的溶菌作用，致使腫瘤細(xì)胞逃脫免疫應(yīng)答。樹突狀細(xì)胞是功能最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞，能夠攝取、加工和呈遞抗原，激活T細(xì)胞，啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。B7-H4和B7-H3可能通過影響樹突狀細(xì)胞的成熟、功能和抗原呈遞能力，間接影響T細(xì)胞的活化和免疫應(yīng)答。綜上所述，B7-H4和B7-H3通過對(duì)T細(xì)胞、TAM等免疫細(xì)胞的調(diào)控，改變腫瘤免疫微環(huán)境的免疫狀態(tài)，使其向免疫抑制方向發(fā)展，從而促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。深入了解它們?cè)谀[瘤免疫微環(huán)境中的調(diào)控機(jī)制，對(duì)于開發(fā)新的腫瘤免疫治療策略具有重要意義。六、基于B7-H4與B7-H3的胃癌治療新策略探索6.1靶向B7-H4和B7-H3的免疫治療6.1.1抗體治療抗體治療是靶向B7-H4和B7-H3免疫治療的重要策略之一，其主要原理是利用特異性抗體與B7-H4或B7-H3蛋白結(jié)合，阻斷其與相應(yīng)受體的相互作用，從而解除它們對(duì)免疫細(xì)胞的抑制作用，恢復(fù)免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。在針對(duì)B7-H4的抗體治療研究中，眾多臨床前實(shí)驗(yàn)已展現(xiàn)出積極的效果。研究人員制備了針對(duì)B7-H4的單克隆抗體，并在小鼠腫瘤模型中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將表達(dá)B7-H4的腫瘤細(xì)胞接種到小鼠體內(nèi)，然后給予B7-H4單克隆抗體治療。結(jié)果顯示，接受抗體治療的小鼠腫瘤生長明顯受到抑制，腫瘤體積顯著小于對(duì)照組。這是因?yàn)锽7-H4單克隆抗體能夠特異性地結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面的B7-H4蛋白，阻斷其與T細(xì)胞表面未知受體的結(jié)合，從而解除對(duì)T細(xì)胞的抑制，使T細(xì)胞能夠活化并增殖，增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫攻擊。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，B7-H4抗體治療還可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子水平，增加促炎細(xì)胞因子如IL-2、IFN-γ的分泌，減少免疫抑制性細(xì)胞因子如IL-10、TGF-β的產(chǎn)生，從而營造一個(gè)有利于免疫細(xì)胞發(fā)揮作用的腫瘤微環(huán)境。針對(duì)B7-H3的抗體治療同樣在臨床前研究中取得了進(jìn)展。例如，在前列腺癌小鼠模型中，使用B7-H3靶向抗體進(jìn)行治療，發(fā)現(xiàn)該抗體能夠顯著抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。B7-H3靶向抗體通過與腫瘤細(xì)胞表面的B7-H3結(jié)合，阻斷其共抑制信號(hào)的傳遞，激活T細(xì)胞的免疫功能，促進(jìn)T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷。B7-H3抗體還可以通過抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用（ADCC），招募自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）等免疫細(xì)胞，對(duì)表達(dá)B7-H3的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷。在一項(xiàng)研究中，將B7-H3靶向抗體與NK細(xì)胞共同作用于腫瘤細(xì)胞，結(jié)果顯示腫瘤細(xì)胞的殺傷率明顯提高，表明B7-H3抗體可以通過ADCC作用增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果。盡管靶向B7-H4和B7-H3的抗體治療在臨床前研究中展現(xiàn)出了良好的抗腫瘤活性，但在臨床應(yīng)用中仍面臨一些挑戰(zhàn)。一方面，抗體的特異性和親和力需要進(jìn)一步優(yōu)化，以提高治療效果并減少不良反應(yīng)。不同來源的抗體可能對(duì)B7-H4和B7-H3的結(jié)合能力存在差異，因此需要篩選和開發(fā)具有高特異性和高親和力的抗體。另一方面，腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性和耐藥性也是需要解決的問題。腫瘤細(xì)胞在生長過程中可能會(huì)發(fā)生基因突變，導(dǎo)致B7-H4和B7-H3的表達(dá)水平或結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而影響抗體的結(jié)合和治療效果。腫瘤細(xì)胞還可能通過其他免疫逃逸機(jī)制來抵抗抗體治療，因此需要聯(lián)合其他治療方法，以提高治療的有效性。6.1.2CAR-T細(xì)胞治療嵌合抗原受體T細(xì)胞（CAR-T）治療是一種新興的免疫治療方法，在血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療中取得了顯著成效，近年來也逐漸應(yīng)用于實(shí)體腫瘤的治療研究，包括針對(duì)B7-H4和B7-H3的胃癌治療探索。CAR-T細(xì)胞治療的原理是通過基因工程技術(shù)，將識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原的單鏈抗體（scFv）與T細(xì)胞的激活和共刺激信號(hào)結(jié)構(gòu)域連接，構(gòu)建成嵌合抗原受體（CAR），然后將CAR導(dǎo)入T細(xì)胞中，使其表達(dá)CAR，從而使T細(xì)胞能夠特異性識(shí)別并殺傷表達(dá)相應(yīng)抗原的腫瘤細(xì)胞。在針對(duì)B7-H4和B7-H3的CAR-T細(xì)胞治療中，分別構(gòu)建靶向B7-H4和B7-H3的CAR-T細(xì)胞。在臨床前研究中，靶向B7-H3的CAR-T細(xì)胞在多種腫瘤模型中顯示出了強(qiáng)大的抗腫瘤活性。研究人員構(gòu)建了靶向B7-H3的CAR-T細(xì)胞，并將其應(yīng)用于小鼠肺癌模型中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CAR-T細(xì)胞能夠特異性地識(shí)別并殺傷表達(dá)B7-H3的肺癌細(xì)胞，顯著抑制腫瘤的生長，延長小鼠的生存期。進(jìn)一步的研究表明，CAR-T細(xì)胞治療后，腫瘤組織中浸潤的T細(xì)胞數(shù)量明顯增加，且這些T細(xì)胞能夠分泌大量的細(xì)胞因子，如IFN-γ、TNF-α等，增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。在胃癌的臨床前研究中，靶向B7-H3的CAR-T細(xì)胞同樣表現(xiàn)出了良好的治療潛力。將胃癌細(xì)胞接種到小鼠體內(nèi)，待腫瘤形成后，給予靶向B7-H3的CAR-T細(xì)胞治療。結(jié)果顯示，接受治療的小鼠腫瘤體積明顯減小，腫瘤生長受到顯著抑制。通過對(duì)腫瘤組織的分析發(fā)現(xiàn)，CAR-T細(xì)胞能夠有效浸潤到腫瘤組織中，并對(duì)表達(dá)B7-H3的胃癌細(xì)胞進(jìn)行殺傷。然而，CAR-T細(xì)胞治療在實(shí)體腫瘤中的應(yīng)用仍面臨諸多挑戰(zhàn)。首先，實(shí)體腫瘤的微環(huán)境較為復(fù)雜，存在多種免疫抑制因素，如腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等，這些因素可能會(huì)抑制CAR-T細(xì)胞的活性和功能，影響治療效果。其次，CAR-T細(xì)胞在實(shí)體腫瘤中的浸潤和分布能力相對(duì)較弱，難以到達(dá)腫瘤組織的各個(gè)部位，從而限制了其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷范圍。此外，CAR-T細(xì)胞治療還可能引發(fā)一些不良反應(yīng)，如細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）、神經(jīng)毒性等，需要進(jìn)一步優(yōu)化治療方案和監(jiān)測手段，以確保治療的安全性。為了克服這些挑戰(zhàn)，研究人員正在不斷探索新的策略。例如，通過基因編輯技術(shù)對(duì)CAR-T細(xì)胞進(jìn)行優(yōu)化，使其能夠更好地適應(yīng)腫瘤微環(huán)境，增強(qiáng)其免疫活性和殺傷能力。聯(lián)合使用免疫調(diào)節(jié)劑，如PD-1抑制劑、CTLA-4抑制劑等，來調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞的治療效果。優(yōu)化CAR-T細(xì)胞的給藥途徑和劑量，以提高其在腫瘤組織中的浸潤和分布。盡管靶向B7-H4和B7-H3的CAR-T細(xì)胞治療在胃癌治療中仍處于研究階段，但已展現(xiàn)出了一定的治療潛力，為胃癌的治療提供了新的思路和方法。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步和研究的深入，有望在未來為胃癌患者帶來更有效的治療選擇。6.2聯(lián)合治療方案的設(shè)想考慮到單一治療方法在胃癌治療中的局限性，以及B7-H4和B7-H3在胃癌發(fā)病機(jī)制中的多方面作用，聯(lián)合治療方案成為提高胃癌治療效果的重要研究方向。以下是基于B7-H4和B7-H3的聯(lián)合治療方案設(shè)想。將針對(duì)B7-H4、B7-H3的免疫治療與傳統(tǒng)化療相結(jié)合是一種極具潛力的聯(lián)合治療策略。化療是胃癌綜合治療的重要組成部分，通過使用化學(xué)藥物來殺傷腫瘤細(xì)胞。然而，化療在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成一定的損傷，且容易引發(fā)腫瘤細(xì)胞的耐藥性。而靶向B7-H4和B7-H3的免疫治療可以激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷能力。將二者聯(lián)合應(yīng)用，有望發(fā)揮協(xié)同作用，提高治療效果。在臨床前研究中，已經(jīng)有研究嘗試將B7-H3抗體與化療藥物聯(lián)合使用。在小鼠胃癌模型中，給予B7-H3抗體聯(lián)合順鉑治療，結(jié)果顯示，聯(lián)合治療組的腫瘤生長抑制率明顯高于單獨(dú)使用B7-H3抗體或順鉑組。這可能是因?yàn)榛熕幬锟梢詺徊糠帜[瘤細(xì)胞，釋放腫瘤相關(guān)抗原，從而增強(qiáng)免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和攻擊；而B7-H3抗體可以解除免疫抑制，激活免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對(duì)化療藥物殺傷后殘留腫瘤細(xì)胞的清除能力。未來的研究可以進(jìn)一步探索不同化療藥物與針對(duì)B7-H4、B7-H3免疫治療的最佳聯(lián)合方案，包括藥物的選擇、劑量和給藥順序等，以提高治療的有效性和安全性。放療也是胃癌治療的重要手段之一，它通過高能射線照射腫瘤組織，破壞腫瘤細(xì)胞的DNA，從而達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的。將放療與針對(duì)B7-H4、B7-H3的免疫治療聯(lián)合應(yīng)用，可能會(huì)產(chǎn)生協(xié)同增效作用。放療可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫原性死亡，釋放腫瘤相關(guān)抗原，吸引免疫細(xì)胞浸潤到腫瘤組織中。同時(shí)，放療還可以改變腫瘤微環(huán)境，使其更有利于免疫細(xì)胞的活化和功能發(fā)揮。而靶向B7-H4和B7-H3的免疫治療可以解除免疫抑制，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活性，從而提高放療的效果。在臨床前研究中，有研究將放療與B7-H4抗體聯(lián)合應(yīng)用于小鼠腫瘤模型，結(jié)果顯示，聯(lián)合治療組的腫瘤生長明顯受到抑制，腫瘤組織中浸潤的T細(xì)胞數(shù)量增加，免疫活性增強(qiáng)。未來的研究可以進(jìn)一步探討放療的劑量、分割方式以及與免疫治療的聯(lián)合時(shí)機(jī)等因素，以優(yōu)化聯(lián)合治療方案，提高胃癌患者的治療效果。除了與傳統(tǒng)治療方法聯(lián)合外，將針對(duì)B7-H4、B7-H3的免疫治療與其他免疫治療方法聯(lián)合也是一個(gè)重要的研究方向。例如，與PD-1/PD-L1抑制劑聯(lián)合。PD-1/PD-L1抑制劑是目前臨床上應(yīng)用較為廣泛的免疫治療藥物，它通過阻斷PD-1與PD-L1的結(jié)合，解除T細(xì)胞的免疫抑制，增強(qiáng)T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。B7-H4和B7-H3與PD-1/PD-L1在腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮著不同的作用，將它們的抑制劑聯(lián)合使用，可能會(huì)從多個(gè)角度解除免疫抑制，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的攻擊能力。在臨床前研究中，已經(jīng)有研究證實(shí)了這種聯(lián)合治療的有效性。在小鼠腫瘤模型中，聯(lián)合使用B7-H3抗體和PD-1抑制劑，發(fā)現(xiàn)腫瘤生長受到更顯著的抑制，小鼠的生存期明顯延長。這可能是因?yàn)锽7-H3抗體和PD-1抑制劑分別阻斷了不同的免疫抑制信號(hào)通路，從而更全面地激活了免疫系統(tǒng)。未來的臨床研究可以進(jìn)一步驗(yàn)證這種聯(lián)合治療方案在胃癌患者中的安全性和有效性，為胃癌