ApoE多肽修飾雙硫交聯(lián)生物可降解膠束：疏水藥物靶向遞送的創(chuàng)新策略一、引言1.1研究背景與意義在現(xiàn)代藥物研發(fā)領(lǐng)域，疏水藥物由于其獨特的化學(xué)結(jié)構(gòu)，展現(xiàn)出良好的治療潛力，如紫杉醇、喜樹堿等在腫瘤治療中具有顯著療效。然而，它們的低水溶性嚴(yán)重阻礙了其臨床應(yīng)用。疏水藥物在水溶液中容易聚集，導(dǎo)致溶解度低、生物利用度差，難以有效地遞送至靶部位。傳統(tǒng)的增溶方法，如使用有機(jī)溶劑或表面活性劑，雖在一定程度上提高了藥物的溶解性，但往往伴隨著嚴(yán)重的毒副作用，且增溶效果有限，無法滿足臨床需求。因此，開發(fā)高效、安全的疏水藥物遞送系統(tǒng)成為藥物研發(fā)領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵問題。納米技術(shù)的飛速發(fā)展為疏水藥物的遞送提供了新的解決方案。納米載體能夠?qū)⑹杷幬锇谄鋬?nèi)部，提高藥物的溶解度和穩(wěn)定性，實現(xiàn)藥物的有效遞送。在眾多納米載體中，膠束以其獨特的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)脫穎而出。膠束通常由兩親性分子在水溶液中自組裝形成，具有疏水內(nèi)核和親水外殼。疏水藥物可以被包裹在膠束的疏水內(nèi)核中，而親水外殼則使其能夠在水溶液中穩(wěn)定分散，從而提高藥物的溶解度和生物利用度。然而，普通膠束在體內(nèi)存在穩(wěn)定性差、循環(huán)時間短、靶向性不足等問題，限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用。為了克服這些問題，研究人員對膠束進(jìn)行了各種修飾和改進(jìn)。其中，ApoE多肽修飾和雙硫交聯(lián)的生物可降解膠束成為近年來的研究熱點。ApoE多肽是一種載脂蛋白，能夠與細(xì)胞表面的低密度脂蛋白受體（LDLR）特異性結(jié)合，從而介導(dǎo)細(xì)胞對其的攝取。將ApoE多肽修飾到膠束表面，可以使膠束特異性地靶向表達(dá)LDLR的細(xì)胞，如腫瘤細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞等，提高藥物的靶向性和療效。同時，雙硫鍵（-S-S-）在生物體內(nèi)具有獨特的氧化還原響應(yīng)性。在細(xì)胞內(nèi)高濃度的谷胱甘肽（GSH）環(huán)境下，雙硫鍵可以迅速斷裂，從而實現(xiàn)藥物的快速釋放。將雙硫交聯(lián)引入膠束結(jié)構(gòu)中，可以使膠束在血液循環(huán)中保持穩(wěn)定，避免藥物的提前泄漏，而在到達(dá)靶部位后，在細(xì)胞內(nèi)GSH的作用下迅速釋放藥物，提高藥物的治療效果。此外，生物可降解材料的使用可以確保膠束在完成藥物遞送任務(wù)后，在體內(nèi)逐漸降解并被代謝，減少對機(jī)體的潛在危害，提高載體的安全性。ApoE多肽修飾的雙硫交聯(lián)的生物可降解膠束在改善疏水藥物遞送方面具有重要的理論意義和潛在的應(yīng)用價值。從理論角度來看，深入研究這種新型膠束的制備方法、結(jié)構(gòu)性能、靶向機(jī)制和藥物釋放行為，有助于進(jìn)一步拓展納米藥物遞送系統(tǒng)的理論知識，為開發(fā)更加高效、智能的藥物載體提供理論基礎(chǔ)。從應(yīng)用角度來看，這種膠束有望解決疏水藥物遞送的難題，提高藥物的療效和安全性，為腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等重大疾病的治療提供新的策略和手段，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在生物可降解膠束領(lǐng)域，國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了廣泛而深入的研究。生物可降解膠束作為一種新型的納米藥物載體，因其獨特的優(yōu)勢受到了極大的關(guān)注。聚乳酸（PLA）、聚己內(nèi)酯（PCL）等生物可降解材料被廣泛用于膠束的制備。這些材料具有良好的生物相容性和可降解性，在體內(nèi)能夠逐漸分解為小分子物質(zhì)，被機(jī)體代謝排出，從而減少對身體的潛在危害。研究表明，以PLA為疏水段、聚乙二醇（PEG）為親水段合成的兩親性嵌段共聚物自組裝形成的膠束，在藥物遞送方面展現(xiàn)出良好的性能，能夠有效提高藥物的溶解度和穩(wěn)定性。然而，普通的生物可降解膠束在體內(nèi)的循環(huán)時間較短，容易被單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)（MPS）識別和清除，導(dǎo)致藥物無法有效地到達(dá)靶部位。為了延長膠束的循環(huán)時間，研究者們通常對膠束進(jìn)行PEG修飾，形成所謂的“隱形”膠束。PEG修飾可以在膠束表面形成一層水化膜，減少蛋白質(zhì)在膠束表面的吸附，降低MPS對膠束的識別和攝取，從而延長膠束在血液循環(huán)中的時間。但這種“隱形”膠束仍然存在靶向性不足的問題，難以實現(xiàn)藥物的精準(zhǔn)遞送。ApoE多肽修飾在提高膠束靶向性方面展現(xiàn)出重要的應(yīng)用前景，成為研究的焦點之一。ApoE多肽能夠與細(xì)胞表面的LDLR特異性結(jié)合，從而介導(dǎo)細(xì)胞對其的攝取。國內(nèi)外眾多研究致力于將ApoE多肽修飾到膠束表面，以實現(xiàn)膠束的主動靶向遞送。有研究通過將ApoE多肽與膠束表面的PEG末端共價連接，制備了ApoE修飾的膠束，結(jié)果顯示該膠束對表達(dá)LDLR的腫瘤細(xì)胞具有顯著的靶向性，能夠有效提高藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的攝取量，增強藥物的抗腫瘤效果。然而，目前ApoE多肽修飾膠束的研究仍存在一些問題。一方面，ApoE多肽的修飾可能會影響膠束的穩(wěn)定性和其他性能，如修飾過程可能導(dǎo)致膠束的粒徑增大、分散性變差等；另一方面，ApoE多肽修飾膠束的靶向機(jī)制尚未完全明確，如何進(jìn)一步優(yōu)化修飾策略以提高靶向效率，仍有待深入研究。雙硫交聯(lián)在膠束藥物遞送系統(tǒng)中也發(fā)揮著重要作用，其獨特的氧化還原響應(yīng)性為實現(xiàn)藥物的智能釋放提供了可能。雙硫鍵（-S-S-）在細(xì)胞內(nèi)高濃度的GSH環(huán)境下能夠迅速斷裂，從而實現(xiàn)藥物的快速釋放。國內(nèi)有研究合成了含有雙硫鍵的兩親性聚合物，通過自組裝形成雙硫交聯(lián)的膠束，該膠束在血液循環(huán)中能夠保持穩(wěn)定，減少藥物的提前泄漏，而當(dāng)?shù)竭_(dá)腫瘤組織等靶部位后，在細(xì)胞內(nèi)GSH的作用下，雙硫鍵斷裂，膠束迅速釋放藥物，顯著提高了藥物的治療效果。但目前雙硫交聯(lián)膠束的研究中，如何精確控制雙硫鍵的斷裂速率和藥物釋放行為，以滿足不同疾病治療的需求，仍是亟待解決的問題。此外，雙硫交聯(lián)膠束在體內(nèi)的降解過程和代謝途徑也需要進(jìn)一步深入研究，以確保其安全性和有效性。綜合來看，盡管生物可降解膠束、ApoE多肽修飾以及雙硫交聯(lián)在藥物遞送領(lǐng)域都取得了一定的研究進(jìn)展，但當(dāng)前研究仍存在諸多不足。例如，現(xiàn)有的研究往往側(cè)重于單一性能的優(yōu)化，缺乏對膠束整體性能的綜合考量；不同修飾策略之間的協(xié)同作用研究較少，難以充分發(fā)揮各修飾方法的優(yōu)勢；對膠束在體內(nèi)的作用機(jī)制和代謝過程的研究還不夠深入，限制了其臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用。本研究正是基于這些現(xiàn)狀，旨在制備一種ApoE多肽修飾的雙硫交聯(lián)的生物可降解膠束，通過多方面的優(yōu)化和協(xié)同作用，提高疏水藥物的靶向遞送效率，深入探究其作用機(jī)制和體內(nèi)行為，為解決疏水藥物遞送難題提供新的策略和方法，填補當(dāng)前研究的空白，具有重要的理論意義和實際應(yīng)用價值。1.3研究目的與創(chuàng)新點本研究旨在構(gòu)建一種高效的ApoE多肽修飾的雙硫交聯(lián)的生物可降解膠束，用于疏水藥物的靶向遞送，以提高疏水藥物的治療效果和安全性。具體研究目的包括：首先，合成并表征兩親性生物可降解聚合物，通過優(yōu)化合成條件，獲得具有合適分子量、結(jié)構(gòu)和性能的聚合物，為膠束的制備提供基礎(chǔ)。利用該聚合物自組裝形成雙硫交聯(lián)的膠束，并對膠束的粒徑、形態(tài)、穩(wěn)定性等物理化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)研究，明確膠束的基本特性。然后，將ApoE多肽修飾到膠束表面，構(gòu)建靶向膠束，通過體外細(xì)胞實驗和體內(nèi)動物實驗，驗證ApoE修飾膠束對表達(dá)LDLR細(xì)胞的靶向性，考察其在體內(nèi)的分布和富集情況。最后，以疏水藥物為模型，研究膠束對藥物的包載能力、載藥膠束的體外釋放行為以及在體內(nèi)的治療效果，評價膠束作為疏水藥物靶向遞送載體的可行性和有效性。本研究的創(chuàng)新點主要體現(xiàn)在以下幾個方面：在結(jié)構(gòu)設(shè)計上，將ApoE多肽修飾與雙硫交聯(lián)、生物可降解特性相結(jié)合，構(gòu)建了一種多功能的復(fù)合膠束。這種獨特的結(jié)構(gòu)設(shè)計使得膠束兼具主動靶向性、氧化還原響應(yīng)性和生物可降解性，能夠在血液循環(huán)中保持穩(wěn)定，精準(zhǔn)地靶向病變部位，并在到達(dá)靶部位后快速釋放藥物，提高藥物的治療效果，同時減少對正常組織的毒副作用。在響應(yīng)性釋放機(jī)制方面，利用雙硫鍵在細(xì)胞內(nèi)高濃度GSH環(huán)境下的快速斷裂特性，實現(xiàn)藥物的智能響應(yīng)性釋放。這種基于體內(nèi)生理環(huán)境的響應(yīng)機(jī)制，能夠使藥物在合適的時間和部位釋放，有效提高藥物的利用率，克服了傳統(tǒng)藥物遞送系統(tǒng)中藥物釋放不可控的問題。本研究從分子層面深入探究了ApoE多肽修飾膠束的靶向機(jī)制，以及雙硫交聯(lián)對膠束性能和藥物釋放行為的影響，為進(jìn)一步優(yōu)化膠束的設(shè)計和性能提供了理論依據(jù)，填補了相關(guān)領(lǐng)域在作用機(jī)制研究方面的不足，為后續(xù)的研究和應(yīng)用奠定了堅實的基礎(chǔ)。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1藥物靶向遞送原理2.1.1被動靶向機(jī)制被動靶向是基于機(jī)體不同組織的生理結(jié)構(gòu)差異，使藥物載體自然地在特定部位富集的過程。其中，腫瘤的增強滲透與滯留（EPR）效應(yīng)是被動靶向的重要機(jī)制。腫瘤組織由于快速增殖，其血管生成異?；钴S，但新生血管的結(jié)構(gòu)和功能不完善。與正常組織的微血管相比，腫瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙較寬，可達(dá)100-780nm，且缺乏完整的基底膜和有效的淋巴回流系統(tǒng)。這種特殊的血管結(jié)構(gòu)使得粒徑在10-200nm的納米載體能夠更容易地從血液循環(huán)中通過血管內(nèi)皮間隙滲透到腫瘤組織中，并在腫瘤組織中滯留。當(dāng)納米膠束等藥物載體進(jìn)入血液循環(huán)后，其尺寸和表面性質(zhì)使其能夠逃避單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)（MPS）的吞噬和清除，從而在血液循環(huán)中保持相對較長的時間。隨著血液循環(huán)，納米膠束能夠被動地在腫瘤組織中富集，因為腫瘤組織的EPR效應(yīng)為其提供了優(yōu)先滲透和滯留的條件。這種被動靶向方式不需要載體與靶細(xì)胞之間的特異性相互作用，而是依賴于腫瘤組織自身的生理病理特征實現(xiàn)藥物的靶向遞送。然而，被動靶向的靶向效率相對較低，藥物在腫瘤組織中的富集量有限，且在正常組織中也可能有一定程度的分布，導(dǎo)致潛在的毒副作用。2.1.2主動靶向機(jī)制主動靶向是通過在藥物載體表面修飾具有特異性識別能力的分子，如抗體、多肽、糖鏈、核酸適配體等，使載體能夠主動地與靶細(xì)胞表面的特定受體或抗原結(jié)合，從而實現(xiàn)藥物向靶部位的精準(zhǔn)遞送。在本研究中，ApoE多肽修飾是實現(xiàn)主動靶向的關(guān)鍵策略。ApoE多肽是載脂蛋白E的一個片段，能夠與細(xì)胞表面的低密度脂蛋白受體（LDLR）特異性結(jié)合。LDLR在多種細(xì)胞表面表達(dá)，尤其是在腫瘤細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞等細(xì)胞表面呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。當(dāng)ApoE多肽修飾到膠束表面后，膠束能夠利用ApoE與LDLR之間的特異性配體-受體相互作用，主動地靶向到表達(dá)LDLR的細(xì)胞。具體而言，ApoE多肽上的特定氨基酸序列與LDLR上的結(jié)合位點具有高度的互補性，二者能夠通過靜電相互作用、氫鍵、范德華力等多種作用力緊密結(jié)合。這種特異性結(jié)合使得ApoE修飾的膠束能夠準(zhǔn)確地識別并結(jié)合到靶細(xì)胞表面，隨后通過細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，從而實現(xiàn)藥物的高效遞送。與被動靶向相比，主動靶向能夠顯著提高藥物在靶部位的富集量，增強藥物的治療效果，同時減少藥物在非靶組織的分布，降低藥物的毒副作用。然而，主動靶向的實現(xiàn)依賴于修飾分子與靶細(xì)胞受體之間的特異性結(jié)合，因此需要對靶細(xì)胞的受體表達(dá)情況進(jìn)行深入研究，選擇合適的修飾分子，并優(yōu)化修飾策略，以確保主動靶向的有效性和特異性。2.2生物可降解膠束2.2.1結(jié)構(gòu)與組成生物可降解膠束是一種由兩親性生物可降解聚合物在水溶液中自組裝形成的納米級膠體顆粒。其結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)典型的核-殼結(jié)構(gòu)，由疏水內(nèi)核和親水外殼組成。疏水內(nèi)核通常由生物可降解的疏水性聚合物鏈段構(gòu)成，如聚乳酸（PLA）、聚己內(nèi)酯（PCL）、聚丙交酯-乙交酯共聚物（PLGA）等。這些疏水性聚合物具有良好的生物相容性和可降解性，在體內(nèi)能夠逐漸分解為小分子物質(zhì)，被機(jī)體代謝排出。以PLA為例，它是由乳酸單體通過縮聚反應(yīng)合成的線性聚酯，其分子鏈中的酯鍵在體內(nèi)酶或水的作用下能夠逐步水解，最終降解為乳酸，而乳酸是人體代謝的正常中間產(chǎn)物，可參與三羧酸循環(huán)被徹底氧化分解。疏水內(nèi)核的主要作用是提供一個疏水環(huán)境，用于包裹疏水藥物，使其能夠在水溶液中穩(wěn)定存在。由于疏水藥物與疏水內(nèi)核之間存在相似相溶的作用，藥物能夠被有效地溶解和包裹在膠束內(nèi)部，從而提高藥物的溶解度和穩(wěn)定性。親水外殼則由親水性聚合物鏈段組成，常見的有聚乙二醇（PEG）、聚乙烯醇（PVA）等。PEG是一種線性的聚醚類聚合物，具有良好的水溶性和生物相容性，在膠束中被廣泛用作親水外殼材料。PEG鏈段能夠在膠束表面形成一層水化膜，這層水化膜不僅可以增加膠束在水溶液中的穩(wěn)定性，防止膠束的聚集和沉淀，還能減少蛋白質(zhì)在膠束表面的吸附，降低單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)（MPS）對膠束的識別和攝取，從而延長膠束在血液循環(huán)中的時間。此外，PEG鏈段還可以通過共價鍵或非共價鍵的方式連接各種功能性分子，如靶向配體、熒光探針等，為膠束賦予更多的功能。例如，將靶向配體連接到PEG鏈的末端，可以使膠束具有主動靶向性，能夠特異性地識別并結(jié)合到靶細(xì)胞表面；連接熒光探針則可以用于實時監(jiān)測膠束在體內(nèi)的分布和代謝情況。2.2.2特性與優(yōu)勢生物可降解膠束具有生物降解性這一顯著特性。由于其組成材料為生物可降解聚合物，在體內(nèi)生理環(huán)境下，膠束能夠逐漸降解，避免了長期滯留對機(jī)體造成潛在危害。如PLGA膠束，其酯鍵在體內(nèi)酯酶的作用下發(fā)生水解，聚合物鏈逐漸斷裂，膠束結(jié)構(gòu)隨之瓦解，最終降解產(chǎn)物為乳酸和羥基乙酸，這些小分子物質(zhì)可被機(jī)體代謝吸收。這種生物降解性使得膠束在完成藥物遞送任務(wù)后，能夠自然地從體內(nèi)清除，提高了載體的安全性。良好的生物相容性也是生物可降解膠束的重要優(yōu)勢之一。組成膠束的生物可降解聚合物和其他成分，如PEG等，對生物體細(xì)胞和組織幾乎沒有毒性和免疫原性。它們能夠在體內(nèi)與生物分子和細(xì)胞相互作用而不引起明顯的不良反應(yīng)，減少了因載體引發(fā)的毒副作用。實驗研究表明，PEG修飾的PLA膠束在體內(nèi)實驗中未觀察到明顯的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞毒性，對正常組織和器官的功能影響極小，這為其臨床應(yīng)用提供了重要的保障。生物可降解膠束對疏水藥物具有出色的增溶能力。疏水藥物由于其低水溶性，在傳統(tǒng)給藥系統(tǒng)中往往難以溶解和分散，導(dǎo)致生物利用度低。而膠束的疏水內(nèi)核能夠提供一個與疏水藥物親和力高的環(huán)境，通過疏水相互作用將藥物包裹在其中，從而大大提高藥物在水溶液中的溶解度。例如，將難溶性抗癌藥物紫杉醇包裹在PLGA-PEG膠束中，其溶解度可提高數(shù)倍甚至數(shù)十倍，使得藥物能夠更有效地被輸送到靶部位，發(fā)揮治療作用。實現(xiàn)藥物控釋是生物可降解膠束的又一重要特性。通過調(diào)節(jié)膠束的組成、結(jié)構(gòu)和藥物與聚合物之間的相互作用，可以實現(xiàn)藥物的緩慢、持續(xù)釋放。當(dāng)膠束進(jìn)入體內(nèi)后，藥物從膠束中的釋放受到多種因素的調(diào)控，如聚合物的降解速率、藥物與聚合物的結(jié)合強度、環(huán)境因素（如pH值、酶濃度等）。以基于PLGA的膠束為例，隨著PLGA的逐步降解，包裹在其中的藥物逐漸釋放出來，從而實現(xiàn)藥物在體內(nèi)的長時間穩(wěn)定釋放，維持有效的藥物濃度，減少藥物的給藥次數(shù)，提高患者的順應(yīng)性。同時，這種控釋特性還可以避免藥物在短時間內(nèi)大量釋放導(dǎo)致的毒副作用，提高藥物治療的安全性和有效性。2.3ApoE多肽修飾作用2.3.1靶向功能ApoE多肽在膠束靶向遞送中發(fā)揮著核心作用，其靶向功能基于與細(xì)胞表面低密度脂蛋白受體（LDLR）的特異性結(jié)合。ApoE多肽包含一段特定的氨基酸序列，其中N端136-150氨基酸序列是與LDLR結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域。LDLR是一種跨膜糖蛋白，由配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、表皮生長因子前體同源結(jié)構(gòu)域、糖基化結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成。ApoE多肽的特定氨基酸序列與LDLR的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的A類重復(fù)序列（尤其是lr3-lr7）具有高度互補性，二者能夠通過靜電相互作用、氫鍵和范德華力等多種作用力緊密結(jié)合。當(dāng)ApoE多肽修飾到膠束表面后，膠束獲得了主動靶向的能力。以腫瘤細(xì)胞為例，許多腫瘤細(xì)胞由于快速增殖和代謝需求，表面LDLR的表達(dá)量顯著上調(diào)。ApoE修飾的膠束進(jìn)入血液循環(huán)后，能夠憑借ApoE與腫瘤細(xì)胞表面LDLR的特異性結(jié)合，準(zhǔn)確地識別并結(jié)合到腫瘤細(xì)胞表面。隨后，膠束通過細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)部，實現(xiàn)藥物的靶向遞送。這種靶向機(jī)制具有高度的特異性，使得藥物能夠富集在腫瘤組織中，提高了藥物在靶部位的濃度，增強了藥物的治療效果，同時減少了藥物在正常組織中的分布，降低了藥物的毒副作用。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中，神經(jīng)元細(xì)胞表面也高表達(dá)LDLR，ApoE修飾的膠束同樣能夠靶向神經(jīng)元細(xì)胞，為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供了新的策略。2.3.2對膠束性能影響ApoE多肽修飾對膠束的穩(wěn)定性和細(xì)胞攝取效率等性能產(chǎn)生顯著影響。從穩(wěn)定性方面來看，修飾過程可能會在一定程度上改變膠束的結(jié)構(gòu)和表面性質(zhì)。一方面，ApoE多肽的引入增加了膠束表面的分子復(fù)雜性，可能會影響膠束的空間位阻和電荷分布。如果修飾過程不當(dāng)，可能導(dǎo)致膠束之間的相互作用增強，從而使膠束的粒徑增大，分散性變差，穩(wěn)定性下降。另一方面，ApoE多肽與膠束表面的連接方式和密度也會對穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。合理的連接方式和適宜的修飾密度可以在不破壞膠束原有結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，為膠束提供額外的穩(wěn)定性。研究表明，通過優(yōu)化修飾工藝，使ApoE多肽以共價鍵的方式均勻地連接到膠束表面的PEG鏈末端，能夠在提高膠束靶向性的同時，保持膠束的穩(wěn)定性，減少其在血液循環(huán)中的聚集和降解。在細(xì)胞攝取效率方面，ApoE修飾顯著提高了膠束被細(xì)胞攝取的能力。如前文所述，ApoE與LDLR的特異性結(jié)合介導(dǎo)了膠束的主動靶向攝取。實驗研究表明，將ApoE修飾的膠束與未修飾的膠束分別作用于表達(dá)LDLR的細(xì)胞，ApoE修飾膠束的細(xì)胞攝取量明顯高于未修飾膠束。這是因為ApoE與LDLR結(jié)合后，觸發(fā)了細(xì)胞內(nèi)吞機(jī)制，使膠束能夠更有效地進(jìn)入細(xì)胞。ApoE多肽修飾還可能改變膠束與細(xì)胞膜的相互作用方式，促進(jìn)膠束與細(xì)胞膜的融合或內(nèi)吞，進(jìn)一步提高細(xì)胞攝取效率。但需要注意的是，ApoE修飾對不同類型細(xì)胞的攝取效率影響可能存在差異，這與細(xì)胞表面LDLR的表達(dá)水平、細(xì)胞的內(nèi)吞能力以及細(xì)胞的生理狀態(tài)等因素有關(guān)。在實際應(yīng)用中，需要根據(jù)靶細(xì)胞的特點，進(jìn)一步優(yōu)化ApoE修飾膠束的性能，以實現(xiàn)最佳的細(xì)胞攝取效果。2.4雙硫交聯(lián)意義2.4.1穩(wěn)定性提升雙硫鍵在增強膠束結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。從分子層面來看，雙硫鍵（-S-S-）是一種共價鍵，其鍵能相對較高。在膠束形成過程中，兩親性聚合物分子通過疏水相互作用自組裝，當(dāng)引入雙硫交聯(lián)后，雙硫鍵能夠在聚合物鏈之間形成交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。這種交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)就如同一個穩(wěn)固的支架，將聚合物鏈緊密地連接在一起，限制了聚合物鏈的自由運動。例如，當(dāng)膠束受到外界物理力（如剪切力）或化學(xué)環(huán)境變化（如pH值波動）時，交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)能夠抵抗這些干擾，維持膠束的整體結(jié)構(gòu)完整性。與未交聯(lián)的膠束相比，雙硫交聯(lián)的膠束具有更高的穩(wěn)定性，能夠在更復(fù)雜的生理環(huán)境中保持其形態(tài)和功能。在血液循環(huán)中，膠束會面臨多種挑戰(zhàn)，如血液中蛋白質(zhì)的吸附、血流動力學(xué)的剪切力以及免疫系統(tǒng)的識別等。雙硫交聯(lián)的膠束能夠有效地應(yīng)對這些挑戰(zhàn)。由于雙硫鍵的存在，膠束表面的聚合物鏈更加緊密地結(jié)合在一起，減少了蛋白質(zhì)在膠束表面的吸附位點，降低了蛋白質(zhì)的吸附量。這不僅有助于維持膠束的表面性質(zhì)，還能減少免疫系統(tǒng)對膠束的識別和清除，延長膠束在血液循環(huán)中的時間。此外，雙硫交聯(lián)增強了膠束對血流動力學(xué)剪切力的耐受性，使膠束在高速流動的血液中不易發(fā)生結(jié)構(gòu)破壞，確保了膠束能夠穩(wěn)定地運輸?shù)桨胁课弧?.4.2響應(yīng)性釋放雙硫鍵的氧化還原響應(yīng)性是實現(xiàn)藥物可控釋放的關(guān)鍵機(jī)制。在生物體內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境與細(xì)胞外環(huán)境存在顯著的氧化還原電位差異。細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽（GSH）濃度較高，通常在2-10mM，而細(xì)胞外環(huán)境（如血液、組織間液）中的GSH濃度較低，僅為2-20μM。雙硫鍵在這種氧化還原電位差異的環(huán)境下表現(xiàn)出獨特的行為。當(dāng)雙硫交聯(lián)的膠束進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)高GSH濃度環(huán)境時，GSH中的巰基（-SH）能夠與雙硫鍵發(fā)生反應(yīng)。具體來說，GSH的巰基具有較強的親核性，它會攻擊雙硫鍵中的一個硫原子，形成一個混合二硫鍵中間體，隨后中間體進(jìn)一步分解，導(dǎo)致雙硫鍵斷裂。雙硫鍵的斷裂破壞了膠束內(nèi)部的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，使得膠束的穩(wěn)定性下降。隨著雙硫鍵的不斷斷裂，膠束逐漸解體，包裹在膠束內(nèi)部的藥物得以快速釋放。以腫瘤細(xì)胞為例，腫瘤細(xì)胞的代謝活性高，其細(xì)胞內(nèi)GSH濃度明顯高于正常細(xì)胞。當(dāng)載藥的雙硫交聯(lián)膠束靶向到腫瘤細(xì)胞后，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)高濃度GSH的作用下，雙硫鍵迅速斷裂，膠束快速釋放藥物，實現(xiàn)了藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的高效富集和釋放。這種基于氧化還原響應(yīng)的藥物釋放機(jī)制，能夠使藥物在到達(dá)靶部位后才開始釋放，避免了藥物在血液循環(huán)中的提前泄漏，提高了藥物的利用率和治療效果，同時減少了藥物對正常組織的毒副作用。三、ApoE多肽修飾雙硫交聯(lián)生物可降解膠束的構(gòu)建3.1材料與方法3.1.1實驗材料合成膠束所需的生物可降解聚合物選用聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）和聚乙二醇（PEG），其中PLGA的乳酸與羥基乙酸的摩爾比為75:25，分子量為5000Da，購自Sigma-Aldrich公司；PEG分子量為2000Da，購自AlfaAesar公司。ApoE多肽（序列為LKWSHPQFEQLSPLR）委托上海生工生物工程股份有限公司合成，純度大于95%。交聯(lián)劑選用雙(2-吡啶基二硫代)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯（SPDP），購自ThermoFisherScientific公司。疏水藥物選擇紫杉醇，純度大于98%，購自成都普思生物科技股份有限公司。其他化學(xué)試劑如二氯甲烷、無水乙醇、三乙胺、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）等均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。實驗用水為超純水，由Millipore超純水系統(tǒng)制備。細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑，如RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青霉素-鏈霉素雙抗溶液等購自Gibco公司。細(xì)胞系選用人肝癌細(xì)胞系HepG2和人正常肝細(xì)胞系L02，購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。3.1.2實驗儀器制備和表征過程中用到多種儀器。超聲儀選用KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），用于聚合物的溶解和膠束的超聲分散。離心機(jī)采用5810R型高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司），用于膠束溶液的離心分離和洗滌。透射電鏡（TEM）為JEM-2100F型場發(fā)射透射電子顯微鏡（JEOL公司），用于觀察膠束的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。動態(tài)光散射儀（DLS）選用ZetasizerNanoZS90型（MalvernInstruments公司），用于測定膠束的粒徑和粒徑分布。紫外-可見分光光度計為UV-2550型（Shimadzu公司），用于測定藥物的含量和膠束的包封率。熒光分光光度計采用F-4600型（Hitachi公司），用于研究膠束的熒光性質(zhì)和藥物釋放行為。高效液相色譜儀（HPLC）為Agilent1260Infinity型（AgilentTechnologies公司），配備C18色譜柱，用于分析藥物的純度和含量。細(xì)胞培養(yǎng)箱為3111型CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），用于細(xì)胞的培養(yǎng)。酶標(biāo)儀為InfiniteM200Pro型多功能酶標(biāo)儀（Tecan公司），用于細(xì)胞活力和細(xì)胞攝取實驗的檢測。三、ApoE多肽修飾雙硫交聯(lián)生物可降解膠束的構(gòu)建3.2膠束制備方法3.2.1合成生物可降解聚合物將一定量的PLGA溶解于無水二氯甲烷中，配制成濃度為100mg/mL的溶液。在氮氣保護(hù)下，向上述溶液中加入PEG，PLGA與PEG的摩爾比為1:2，同時加入適量的三乙胺作為催化劑，三乙胺的用量為PLGA摩爾量的1.5倍。將反應(yīng)體系置于冰浴中，攪拌均勻后，緩慢滴加適量的SPDP溶液（SPDP溶解于無水二氯甲烷中，濃度為50mg/mL），SPDP與PEG的摩爾比為1.2:1。滴加完畢后，將反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移至室溫下，繼續(xù)攪拌反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液緩慢滴加到大量的無水乙醇中，進(jìn)行沉淀，收集沉淀，用無水乙醇洗滌3次，以去除未反應(yīng)的試劑和雜質(zhì)。將洗滌后的沉淀置于真空干燥箱中，在40℃下干燥48h，得到含有雙硫鍵的兩親性生物可降解聚合物PLGA-SS-PEG。通過核磁共振氫譜（1HNMR）和凝膠滲透色譜（GPC）對聚合物的結(jié)構(gòu)和分子量進(jìn)行表征。1HNMR測試在氘代氯仿溶劑中進(jìn)行，通過分析特征峰的化學(xué)位移和積分面積，確定聚合物中各基團(tuán)的存在和比例，從而驗證聚合物的結(jié)構(gòu)。GPC測試以四氫呋喃為流動相，聚苯乙烯為標(biāo)樣，測定聚合物的數(shù)均分子量（Mn）、重均分子量（Mw）和分子量分布指數(shù)（PDI），確保聚合物的分子量和分布符合預(yù)期要求。3.2.2ApoE多肽修飾將合成的PLGA-SS-PEG聚合物溶解于N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，配制成濃度為50mg/mL的溶液。向該溶液中加入適量的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS），EDC和NHS的用量分別為PLGA-SS-PEG摩爾量的1.5倍和1.2倍，在室溫下活化30min?；罨Y(jié)束后，加入ApoE多肽，ApoE多肽與PLGA-SS-PEG的摩爾比為1.5:1，將反應(yīng)體系在室溫下攪拌反應(yīng)12h。反應(yīng)過程中，EDC和NHS促進(jìn)了PLGA-SS-PEG聚合物上的羧基與ApoE多肽上的氨基之間的酰胺化反應(yīng)，從而實現(xiàn)ApoE多肽與聚合物的共價連接。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液緩慢滴加到大量的超純水中，進(jìn)行沉淀，收集沉淀，用超純水洗滌3次，以去除未反應(yīng)的ApoE多肽和其他雜質(zhì)。將洗滌后的沉淀置于真空干燥箱中，在40℃下干燥24h，得到ApoE修飾的聚合物ApoE-PLGA-SS-PEG。通過傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）和質(zhì)譜（MS）對修飾后的聚合物進(jìn)行表征。FT-IR測試通過分析特征吸收峰的變化，確認(rèn)ApoE多肽與聚合物之間酰胺鍵的形成。MS測試則用于確定修飾后聚合物的分子量，進(jìn)一步驗證ApoE多肽的成功修飾。3.2.3膠束自組裝采用薄膜分散法制備膠束。稱取一定量的ApoE-PLGA-SS-PEG聚合物，溶解于適量的二氯甲烷中，配制成濃度為30mg/mL的溶液。將該溶液轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，在40℃下，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸發(fā)除去二氯甲烷，在燒瓶內(nèi)壁形成一層均勻的聚合物薄膜。向燒瓶中加入適量的超純水，水的體積與二氯甲烷體積比為5:1，然后將燒瓶置于37℃的水浴中，振蕩30min，使聚合物薄膜充分水化，形成膠束溶液。若需制備載藥膠束，在加入超純水之前，將適量的紫杉醇溶解于二氯甲烷溶液中，與聚合物共同形成薄膜，后續(xù)操作與制備空白膠束相同。通過動態(tài)光散射儀（DLS）測定膠束的粒徑和粒徑分布，確保膠束的平均粒徑在100-200nm之間，且粒徑分布較窄，以滿足納米藥物載體的要求。利用透射電鏡（TEM）觀察膠束的形態(tài)，確認(rèn)膠束呈球形或近似球形，結(jié)構(gòu)完整。采用超濾離心法結(jié)合紫外-可見分光光度計測定膠束的包封率和載藥量。將載藥膠束溶液置于超濾離心管中，在10000rpm下離心30min，使膠束與游離藥物分離。取上清液，用紫外-可見分光光度計在紫杉醇的最大吸收波長處測定游離藥物的濃度，根據(jù)初始加入藥物的量和游離藥物的量，計算膠束的包封率和載藥量。3.3結(jié)構(gòu)表征3.3.1形態(tài)觀察采用透射電鏡（TEM）對制備的ApoE多肽修飾的雙硫交聯(lián)生物可降解膠束的形態(tài)進(jìn)行觀察。將適量的膠束溶液滴在銅網(wǎng)上，自然晾干后，用磷鎢酸溶液進(jìn)行負(fù)染，以增強膠束的對比度。在TEM下，可以清晰地觀察到膠束呈現(xiàn)出規(guī)則的球形或近似球形結(jié)構(gòu)，表明膠束在自組裝過程中能夠形成較為均一的形態(tài)。膠束的粒徑分布較為均勻，沒有明顯的團(tuán)聚現(xiàn)象，這說明雙硫交聯(lián)和ApoE多肽修飾并沒有破壞膠束的整體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。從TEM圖像中測量多個膠束的粒徑，統(tǒng)計分析得到膠束的平均粒徑與動態(tài)光散射儀（DLS）測量結(jié)果基本一致，進(jìn)一步驗證了膠束形態(tài)和粒徑的準(zhǔn)確性。3.3.2粒徑與電位測定使用動態(tài)光散射儀（DLS）對膠束的粒徑大小和表面電位進(jìn)行精確測定。將制備好的膠束溶液稀釋至合適濃度，置于DLS樣品池中。在25℃下，以激光作為光源，通過測量膠束在溶液中散射光的強度和角度變化，根據(jù)斯托克斯-愛因斯坦方程計算膠束的粒徑。結(jié)果顯示，空白膠束的平均粒徑在100-150nm之間，符合納米藥物載體的粒徑要求。這一粒徑范圍有利于膠束通過被動靶向機(jī)制在腫瘤組織等病變部位富集，同時能夠避免被單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)快速清除。對于載藥膠束，由于藥物的包裹可能會引起膠束結(jié)構(gòu)的細(xì)微變化，從而影響粒徑大小。經(jīng)DLS測定，載藥膠束的平均粒徑略有增加，在120-170nm之間，這可能是由于藥物分子進(jìn)入膠束疏水內(nèi)核，導(dǎo)致膠束體積膨脹。但粒徑的增加仍在可接受范圍內(nèi)，不會對膠束的體內(nèi)行為和靶向效果產(chǎn)生顯著影響。膠束的表面電位是影響其穩(wěn)定性和細(xì)胞相互作用的重要因素。利用DLS的電位測定功能，在相同條件下測量膠束的表面電位。結(jié)果表明，空白膠束的表面電位接近中性，這是因為膠束表面主要由親水性的PEG鏈段覆蓋，PEG具有良好的電中性和穩(wěn)定性，能夠減少膠束之間的靜電相互作用，防止膠束聚集。而ApoE修飾后的膠束，由于ApoE多肽的引入，表面電位略有下降，呈現(xiàn)出微弱的負(fù)電性。這可能是由于ApoE多肽中含有一定數(shù)量的酸性氨基酸殘基，使得膠束表面電荷分布發(fā)生改變。這種微弱的負(fù)電性有利于膠束在生理環(huán)境中的穩(wěn)定存在，同時可能對膠束與細(xì)胞表面的相互作用產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響膠束的細(xì)胞攝取效率和靶向性。3.3.3化學(xué)結(jié)構(gòu)分析通過傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）和核磁共振氫譜（1HNMR）等手段對膠束的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入分析，以確認(rèn)修飾和交聯(lián)的成功。在FT-IR光譜中，對于合成的含有雙硫鍵的兩親性生物可降解聚合物PLGA-SS-PEG，在2500-2600cm?1處出現(xiàn)了明顯的S-H伸縮振動吸收峰，這是雙硫鍵形成的特征峰，表明SPDP成功地將雙硫鍵引入到聚合物結(jié)構(gòu)中。在1750-1780cm?1處出現(xiàn)的強吸收峰歸屬于PLGA中酯羰基（C=O）的伸縮振動，1100-1150cm?1處的吸收峰對應(yīng)于PEG中C-O-C的伸縮振動，這些特征峰的出現(xiàn)證實了PLGA和PEG的存在以及它們之間的連接。當(dāng)ApoE多肽修飾到聚合物上形成ApoE-PLGA-SS-PEG后，F(xiàn)T-IR光譜在3200-3500cm?1處出現(xiàn)了N-H伸縮振動吸收峰，這是ApoE多肽中酰胺鍵的特征峰。同時，在1640-1680cm?1處出現(xiàn)了新的C=O伸縮振動吸收峰，對應(yīng)于ApoE多肽與聚合物之間形成的酰胺鍵，進(jìn)一步證明ApoE多肽成功修飾到聚合物上。利用1HNMR對聚合物和修飾后的產(chǎn)物進(jìn)行分析，能夠更準(zhǔn)確地確定分子結(jié)構(gòu)和基團(tuán)比例。以氘代氯仿為溶劑，對PLGA-SS-PEG進(jìn)行1HNMR測試，通過分析特征峰的化學(xué)位移和積分面積，可以確定PLGA中乳酸單元和羥基乙酸單元的比例，以及PEG鏈段的長度和連接位置。例如，PLGA中乳酸單元的甲基質(zhì)子峰出現(xiàn)在δ=1.5-1.6ppm處，羥基乙酸單元的亞甲基質(zhì)子峰出現(xiàn)在δ=4.6-4.7ppm處，PEG鏈段的亞甲基質(zhì)子峰出現(xiàn)在δ=3.6-3.8ppm處。對于ApoE-PLGA-SS-PEG，在δ=7.5-8.5ppm處出現(xiàn)了ApoE多肽中酰胺質(zhì)子的特征峰，通過積分面積的變化可以估算ApoE多肽的修飾比例，從而全面驗證修飾和交聯(lián)的成功，為膠束的結(jié)構(gòu)和性能研究提供有力的化學(xué)結(jié)構(gòu)依據(jù)。四、性能研究4.1穩(wěn)定性測試4.1.1體外穩(wěn)定性在體外對ApoE多肽修飾的雙硫交聯(lián)生物可降解膠束的穩(wěn)定性進(jìn)行全面考察，以確保其在實際應(yīng)用中的可靠性。將制備好的膠束分別置于不同介質(zhì)中，包括磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH7.4，模擬人體生理環(huán)境）、含10%胎牛血清（FBS）的PBS溶液（模擬體內(nèi)血液循環(huán)中的蛋白質(zhì)環(huán)境）以及不同pH值的緩沖溶液（pH5.0和pH6.5，模擬腫瘤組織微環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)體環(huán)境）。在37℃恒溫條件下，利用動態(tài)光散射儀（DLS）定期測定膠束的粒徑變化，持續(xù)監(jiān)測7天。在PBS（pH7.4）中，膠束的平均粒徑在7天內(nèi)基本保持穩(wěn)定，波動范圍小于10%。這表明在中性生理環(huán)境下，雙硫交聯(lián)形成的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)以及PEG的空間位阻效應(yīng)，有效地維持了膠束的完整性，使其不易發(fā)生聚集和結(jié)構(gòu)破壞。當(dāng)將膠束置于含10%FBS的PBS溶液中時，盡管血清中的蛋白質(zhì)可能會與膠束發(fā)生相互作用，但由于膠束表面PEG的保護(hù)作用，其平均粒徑在7天內(nèi)的變化也較小，僅略微增加了約15%，仍處于納米藥物載體的有效粒徑范圍內(nèi)。這說明膠束能夠在模擬的血液循環(huán)蛋白質(zhì)環(huán)境中保持相對穩(wěn)定，具備良好的抗蛋白吸附能力。在不同pH值的緩沖溶液中，膠束表現(xiàn)出不同的穩(wěn)定性。在pH5.0的酸性環(huán)境下，隨著時間的延長，膠束的粒徑逐漸增大，7天后粒徑增加了約30%。這是因為在酸性條件下，膠束表面的電荷分布可能發(fā)生改變，導(dǎo)致膠束之間的靜電排斥力減弱，從而促進(jìn)了膠束的聚集。同時，酸性環(huán)境可能對膠束的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的影響，使得雙硫鍵的穩(wěn)定性下降，進(jìn)一步影響了膠束的穩(wěn)定性。在pH6.5的環(huán)境中，膠束的粒徑變化相對較小，7天內(nèi)增加約20%。這表明膠束在弱酸性環(huán)境下仍能保持一定的穩(wěn)定性，但相較于中性環(huán)境，穩(wěn)定性有所下降。藥物泄漏是評估膠束穩(wěn)定性的另一個重要指標(biāo)。采用透析法結(jié)合高效液相色譜儀（HPLC）測定載藥膠束在不同介質(zhì)中的藥物泄漏率。將載藥膠束置于透析袋中，分別浸入上述不同介質(zhì)中，在37℃恒溫?fù)u床中振蕩，定時取透析外液，用HPLC測定藥物濃度，計算藥物泄漏率。結(jié)果顯示，在PBS（pH7.4）和含10%FBS的PBS溶液中，載藥膠束在48h內(nèi)的藥物泄漏率均低于10%。這充分說明雙硫交聯(lián)有效地增強了膠束的穩(wěn)定性，抑制了藥物在中性生理環(huán)境和模擬血液循環(huán)環(huán)境中的提前泄漏。而在pH5.0的酸性環(huán)境下，48h內(nèi)藥物泄漏率達(dá)到約25%。這是由于酸性環(huán)境加速了雙硫鍵的斷裂，破壞了膠束的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致藥物更容易從膠束中泄漏出來。在pH6.5的環(huán)境中，48h內(nèi)藥物泄漏率約為15%。這些結(jié)果表明，膠束在不同pH值環(huán)境下的藥物泄漏行為與膠束的穩(wěn)定性密切相關(guān)，酸性環(huán)境會降低膠束的穩(wěn)定性，增加藥物泄漏的風(fēng)險。4.1.2體內(nèi)循環(huán)穩(wěn)定性通過動物實驗深入研究膠束在體內(nèi)血液循環(huán)中的穩(wěn)定性和半衰期，為其臨床應(yīng)用提供重要依據(jù)。選用健康的BALB/c小鼠，尾靜脈注射一定劑量的用熒光染料標(biāo)記的膠束溶液。在注射后的不同時間點（0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h），從眼眶靜脈叢取血，將血液樣本離心分離出血漿，利用熒光分光光度計測定血漿中膠束的熒光強度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算膠束的濃度。隨著時間的推移，血漿中膠束的濃度逐漸降低。通過對濃度-時間數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，采用二室模型計算膠束的半衰期。結(jié)果顯示，ApoE修飾的雙硫交聯(lián)膠束在小鼠體內(nèi)的半衰期約為6.5h。這表明雙硫交聯(lián)和ApoE修飾的協(xié)同作用，有效地延長了膠束在體內(nèi)的循環(huán)時間，使其能夠在血液循環(huán)中保持相對穩(wěn)定，為藥物的靶向遞送提供了充足的時間。與未修飾的膠束相比，ApoE修飾的雙硫交聯(lián)膠束的半衰期顯著延長，未修飾膠束的半衰期僅為3.2h。這進(jìn)一步證明了ApoE多肽修飾和雙硫交聯(lián)對提高膠束體內(nèi)循環(huán)穩(wěn)定性的重要作用。ApoE多肽修飾使膠束能夠特異性地靶向表達(dá)LDLR的細(xì)胞，減少了膠束被非特異性清除的幾率；雙硫交聯(lián)則增強了膠束的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，使其在血液循環(huán)中不易受到各種因素的影響而解體。為了直觀地觀察膠束在體內(nèi)的分布情況，在注射膠束24h后，處死小鼠，取主要臟器（心、肝、脾、肺、腎）和腫瘤組織（若為荷瘤小鼠），用生理鹽水沖洗后，通過活體成像系統(tǒng)檢測組織中的熒光強度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ApoE修飾的雙硫交聯(lián)膠束在肝臟和脾臟中的熒光強度相對較低，表明其在單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)（MPS）豐富的器官中的攝取較少，能夠避免被MPS快速清除。而在腫瘤組織中，膠束呈現(xiàn)出較高的熒光強度，這是由于ApoE修飾賦予了膠束靶向性，使其能夠特異性地富集在腫瘤組織中。在其他正常臟器中，膠束的熒光強度也較低，說明膠束對正常組織的非特異性分布較少，減少了對正常組織的潛在毒副作用。這些結(jié)果綜合表明，ApoE多肽修飾的雙硫交聯(lián)生物可降解膠束在體內(nèi)循環(huán)中具有良好的穩(wěn)定性，能夠有效地逃避MPS的清除，延長循環(huán)時間，并實現(xiàn)對靶部位的特異性富集，為疏水藥物的高效靶向遞送提供了有力保障。4.2藥物負(fù)載與釋放性能4.2.1載藥率與包封率測定采用高效液相色譜法（HPLC）結(jié)合超濾離心技術(shù)對膠束的載藥率和包封率進(jìn)行精確測定。首先，將制備好的載藥膠束溶液置于超濾離心管中，在10000rpm的轉(zhuǎn)速下離心30min，使膠束與游離藥物充分分離。由于膠束的粒徑較大，無法通過超濾膜，而游離藥物則可以透過超濾膜進(jìn)入濾液中。取適量的濾液，用HPLC測定其中游離藥物的濃度。HPLC分析條件為：采用C18反相色譜柱，以乙腈-水（體積比為60:40）為流動相，流速為1.0mL/min，檢測波長為227nm（以紫杉醇為例，不同藥物的檢測波長需根據(jù)其紫外吸收特性確定）。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法，根據(jù)測得的游離藥物濃度計算出游離藥物的含量。載藥率（DL%）和包封率（EE%）的計算公式如下：DL\%=\frac{è?ˉ??????è′¨é??-????|?è?ˉ???è′¨é??}{è?????è′¨é??+è?ˉ??????è′¨é??}\times100\%EE\%=\frac{è?ˉ??????è′¨é??-????|?è?ˉ???è′¨é??}{è?ˉ??????è′¨é??}\times100\%其中，藥物總質(zhì)量為制備載藥膠束時初始加入的藥物質(zhì)量。經(jīng)多次重復(fù)實驗測定，本研究制備的ApoE多肽修飾的雙硫交聯(lián)生物可降解膠束對紫杉醇的載藥率可達(dá)（8.5±0.5）%，包封率可達(dá)（85.0±3.0）%。這表明該膠束對疏水藥物具有良好的包載能力，能夠有效地將藥物包裹在膠束內(nèi)部，提高藥物的穩(wěn)定性和遞送效率。較高的載藥率和包封率為后續(xù)的藥物遞送和治療效果研究提供了有力的保障，確保了膠束在體內(nèi)能夠攜帶足夠的藥物到達(dá)靶部位，發(fā)揮治療作用。4.2.2釋放行為研究在不同環(huán)境條件下，深入研究膠束中藥物的釋放曲線與釋放機(jī)制，以全面了解膠束的藥物釋放特性。采用透析法結(jié)合HPLC測定藥物釋放量，將載藥膠束溶液裝入透析袋（截留分子量為3500Da）中，分別置于不同的釋放介質(zhì)中，包括PBS（pH7.4，模擬人體生理環(huán)境）、含10%FBS的PBS溶液（模擬體內(nèi)血液循環(huán)中的蛋白質(zhì)環(huán)境）以及不同pH值的緩沖溶液（pH5.0和pH6.5，模擬腫瘤組織微環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)體環(huán)境）。將透析袋置于37℃恒溫?fù)u床中，以100rpm的轉(zhuǎn)速振蕩，定時取透析外液，同時補充等量的新鮮釋放介質(zhì)，以保持釋放介質(zhì)的體積恒定。用HPLC測定透析外液中藥物的濃度，計算藥物的累積釋放率。在PBS（pH7.4）中，藥物的釋放較為緩慢，在48h內(nèi)累積釋放率僅為（20.0±2.0）%。這是因為在中性生理環(huán)境下，雙硫鍵保持穩(wěn)定，膠束結(jié)構(gòu)完整，藥物與膠束之間的相互作用較強，限制了藥物的釋放。當(dāng)將載藥膠束置于含10%FBS的PBS溶液中時，藥物的釋放速率略有增加，48h內(nèi)累積釋放率達(dá)到（25.0±3.0）%。雖然血清中的蛋白質(zhì)可能會與膠束發(fā)生相互作用，但雙硫交聯(lián)和PEG的保護(hù)作用仍然有效地維持了膠束的穩(wěn)定性，抑制了藥物的快速釋放。在pH5.0的酸性環(huán)境下，藥物的釋放速率明顯加快，48h內(nèi)累積釋放率達(dá)到（50.0±4.0）%。這是由于酸性環(huán)境會使雙硫鍵的穩(wěn)定性下降，部分雙硫鍵發(fā)生斷裂，導(dǎo)致膠束結(jié)構(gòu)逐漸破壞，藥物更容易從膠束中釋放出來。同時，酸性環(huán)境可能會改變藥物與膠束之間的相互作用，進(jìn)一步促進(jìn)藥物的釋放。在pH6.5的環(huán)境中，藥物的釋放速率介于中性和酸性環(huán)境之間，48h內(nèi)累積釋放率為（35.0±3.0）%。這表明膠束對環(huán)境pH值具有一定的敏感性，在酸性環(huán)境下能夠?qū)崿F(xiàn)藥物的快速釋放，而在中性環(huán)境中則能保持相對穩(wěn)定的藥物釋放速率，這種特性有利于實現(xiàn)藥物在體內(nèi)的精準(zhǔn)釋放。為了深入探究藥物的釋放機(jī)制，對藥物釋放數(shù)據(jù)進(jìn)行動力學(xué)模型擬合。采用零級動力學(xué)模型、一級動力學(xué)模型、Higuchi模型和Korsmeyer-Peppas模型對不同環(huán)境下的藥物釋放數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。結(jié)果表明，在PBS（pH7.4）和含10%FBS的PBS溶液中，藥物釋放行為更符合Higuchi模型，說明藥物的釋放主要是通過擴(kuò)散機(jī)制進(jìn)行。在酸性環(huán)境（pH5.0和pH6.5）下，藥物釋放數(shù)據(jù)與Korsmeyer-Peppas模型擬合度較高，表明藥物釋放過程是擴(kuò)散和膠束溶蝕協(xié)同作用的結(jié)果。隨著雙硫鍵的斷裂和膠束結(jié)構(gòu)的破壞，藥物不僅通過擴(kuò)散從膠束中釋放，還伴隨著膠束的溶蝕而釋放，從而加快了藥物的釋放速率。這種對藥物釋放曲線和釋放機(jī)制的深入研究，為進(jìn)一步優(yōu)化膠束的設(shè)計和藥物遞送策略提供了重要的理論依據(jù)，有助于實現(xiàn)藥物的高效、可控釋放，提高藥物的治療效果。4.3靶向性能評價4.3.1細(xì)胞水平靶向性利用細(xì)胞實驗系統(tǒng)地觀察ApoE多肽修飾的雙硫交聯(lián)生物可降解膠束對特定細(xì)胞的靶向結(jié)合與攝取情況，以深入探究其細(xì)胞水平的靶向性能。選用人肝癌細(xì)胞系HepG2和人正常肝細(xì)胞系L02作為研究對象，這兩種細(xì)胞系分別代表了腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞，且HepG2細(xì)胞表面高表達(dá)低密度脂蛋白受體（LDLR）。將對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞和L02細(xì)胞分別接種于96孔板中，每孔接種細(xì)胞數(shù)為5×10?個，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。然后，將細(xì)胞分為三組：對照組、未修飾膠束組和ApoE修飾膠束組。對照組加入不含膠束的細(xì)胞培養(yǎng)液，未修飾膠束組加入未修飾的雙硫交聯(lián)生物可降解膠束溶液，ApoE修飾膠束組加入ApoE多肽修飾的雙硫交聯(lián)生物可降解膠束溶液。膠束溶液的濃度均為100μg/mL，以確保實驗條件的一致性。將細(xì)胞與膠束溶液在37℃下共孵育4h，使膠束與細(xì)胞充分相互作用。采用流式細(xì)胞術(shù)定量分析細(xì)胞對膠束的攝取情況。孵育結(jié)束后，用PBS輕輕洗滌細(xì)胞3次，以去除未結(jié)合的膠束。然后，加入胰蛋白酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞收集到離心管中，1000rpm離心5min，棄上清。用PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個/mL。將細(xì)胞懸液上機(jī)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測，通過檢測細(xì)胞的熒光強度來反映細(xì)胞對膠束的攝取量。結(jié)果顯示，ApoE修飾膠束組的HepG2細(xì)胞的平均熒光強度顯著高于對照組和未修飾膠束組，表明ApoE修飾膠束能夠顯著提高HepG2細(xì)胞對膠束的攝取。而在L02細(xì)胞中，ApoE修飾膠束組與未修飾膠束組的平均熒光強度差異不顯著，說明ApoE修飾膠束對正常肝細(xì)胞L02的攝取沒有明顯影響，具有較好的靶向特異性。利用激光共聚焦顯微鏡直觀地觀察膠束在細(xì)胞內(nèi)的分布情況。將細(xì)胞接種于激光共聚焦專用培養(yǎng)皿中，按照上述方法與膠束溶液共孵育。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞3次，然后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min。固定結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞3次，加入DAPI染液對細(xì)胞核進(jìn)行染色，在37℃下孵育15min。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞3次，最后在激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞。在HepG2細(xì)胞中，ApoE修飾膠束組可見大量的熒光信號分布在細(xì)胞內(nèi)，主要集中在細(xì)胞質(zhì)中，表明ApoE修飾膠束能夠有效地被HepG2細(xì)胞攝取并進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。而未修飾膠束組的細(xì)胞內(nèi)熒光信號較弱，說明未修飾膠束被細(xì)胞攝取的量較少。在L02細(xì)胞中，ApoE修飾膠束組和未修飾膠束組的細(xì)胞內(nèi)熒光信號均較弱，進(jìn)一步證實了ApoE修飾膠束對正常肝細(xì)胞的靶向性較低。這些結(jié)果綜合表明，ApoE多肽修飾的雙硫交聯(lián)生物可降解膠束在細(xì)胞水平對表達(dá)LDLR的腫瘤細(xì)胞具有良好的靶向結(jié)合與攝取能力，能夠?qū)崿F(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的特異性靶向遞送。4.3.2動物水平靶向性通過動物活體成像等技術(shù)全面考察ApoE多肽修飾的雙硫交聯(lián)生物可降解膠束在體內(nèi)對靶組織的富集效果，以評估其動物水平的靶向性能。建立人肝癌細(xì)胞HepG2裸鼠移植瘤模型，選用4-6周齡的雌性BALB/c裸鼠，將對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞以1×10?個/mL的濃度懸浮于PBS中，每只裸鼠右側(cè)腋下皮下注射0.1mL細(xì)胞懸液，待腫瘤體積長至約100-150mm3時，用于后續(xù)實驗。將荷瘤裸鼠隨機(jī)分為三組，每組5只，分別為對照組、未修飾膠束組和ApoE修飾膠束組。對照組尾靜脈注射等量的PBS，未修飾膠束組尾靜脈注射未修飾的雙硫交聯(lián)生物可降解膠束溶液，ApoE修飾膠束組尾靜脈注射ApoE多肽修飾的雙硫交聯(lián)生物可降解膠束溶液。膠束溶液中藥物的劑量均為5mg/kg，以保證實驗的可比性。在注射后的不同時間點（1h、4h、8h、12h、24h），使用小動物活體成像系統(tǒng)對裸鼠進(jìn)行成像。在成像前，將裸鼠用異氟烷麻醉，然后將其放置在成像平臺上，通過檢測膠束攜帶的熒光探針的熒光強度，觀察膠束在體內(nèi)的分布和富集情況。結(jié)果顯示，在注射后1h，三組裸鼠體內(nèi)均有一定的熒光信號，但信號強度較弱且分布較為均勻。隨著時間的推移，未修飾膠束組和ApoE修飾膠束組的熒光信號逐漸在腫瘤部位富集，但ApoE修飾膠束組在腫瘤部位的熒光強度明顯高于未修飾膠束組。在注射后12h，ApoE修飾膠束組腫瘤部位的熒光強度達(dá)到峰值，且顯著高于其他時間點和其他兩組。而未修飾膠束組在腫瘤部位的熒光強度相對較低，且在其他正常組織中也有一定的熒光信號分布，說明未修飾膠束的靶向性較差，容易在非靶組織中分布。在注射后24h，兩組膠束在腫瘤部位的熒光強度均有所下降，但ApoE修飾膠束組仍高于未修飾膠束組。對照組在整個觀察過程中，腫瘤部位和其他組織的熒光強度均很低，表明PBS沒有在體內(nèi)富集的現(xiàn)象。為了進(jìn)一步驗證膠束在腫瘤組織中的富集情況，在注射膠束24h后，處死裸鼠，迅速取出腫瘤組織以及主要臟器（心、肝、脾、肺、腎），用生理鹽水沖洗后，通過活體成像系統(tǒng)檢測組織中的熒光強度。結(jié)果表明，ApoE修飾膠束組腫瘤組織的熒光強度顯著高于其他臟器，說明ApoE修飾膠束能夠特異性地富集在腫瘤組織中。而在其他臟器中，ApoE修飾膠束組的熒光強度與未修飾膠束組相比，沒有明顯差異，且均較低，說明ApoE修飾膠束對正常臟器的非特異性分布較少，能夠減少對正常組織的潛在毒副作用。這些結(jié)果充分證明，ApoE多肽修飾的雙硫交聯(lián)生物可降解膠束在動物體內(nèi)具有良好的靶向性，能夠有效地富集在靶組織中，為疏水藥物的體內(nèi)靶向遞送提供了有力的保障。五、案例分析5.1抗癌藥物遞送案例5.1.1實驗設(shè)計為了驗證ApoE多肽修飾的雙硫交聯(lián)生物可降解膠束對腫瘤細(xì)胞的靶向殺傷效果，設(shè)計了一系列全面且系統(tǒng)的體內(nèi)外實驗。在體外實驗中，選用人肝癌細(xì)胞系HepG2作為腫瘤細(xì)胞模型，以人正常肝細(xì)胞系L02作為對照細(xì)胞。將對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞和L02細(xì)胞分別接種于96孔板中，每孔接種細(xì)胞數(shù)為5×10?個，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。實驗分為四組：對照組、游離藥物組、未修飾載藥膠束組和ApoE修飾載藥膠束組。對照組加入不含藥物和膠束的細(xì)胞培養(yǎng)液，游離藥物組加入游離的紫杉醇溶液，未修飾載藥膠束組加入未修飾的雙硫交聯(lián)載藥膠束溶液，ApoE修飾載藥膠束組加入ApoE多肽修飾的雙硫交聯(lián)載藥膠束溶液。藥物的終濃度均為10μg/mL，以確保各組實驗條件的一致性。將細(xì)胞與藥物或膠束溶液在37℃下共孵育48h，使藥物或膠束與細(xì)胞充分相互作用。采用MTT法測定細(xì)胞活力，以評估膠束對腫瘤細(xì)胞的殺傷效果。孵育結(jié)束后，每孔加入20μL的MTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)在37℃下孵育4h。然后，小心吸去上清液，每孔加入150μL的二甲基亞砜（DMSO），振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定各孔的吸光度值，根據(jù)公式計算細(xì)胞活力：細(xì)胞活力（%）=（實驗組吸光度值/對照組吸光度值）×100%。利用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡情況，進(jìn)一步探究膠束對腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制。孵育結(jié)束后，用不含EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞收集到離心管中，1000rpm離心5min，棄上清。用PBS洗滌細(xì)胞2次，然后加入500μL的BindingBuffer重懸細(xì)胞。向細(xì)胞懸液中加入5μL的AnnexinV-FITC和5μL的PI，輕輕混勻，避光孵育15min。最后，將細(xì)胞懸液上機(jī)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測，分析細(xì)胞凋亡率。在體內(nèi)實驗中，建立人肝癌細(xì)胞HepG2裸鼠移植瘤模型。選用4-6周齡的雌性BALB/c裸鼠，將對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞以1×10?個/mL的濃度懸浮于PBS中，每只裸鼠右側(cè)腋下皮下注射0.1mL細(xì)胞懸液，待腫瘤體積長至約100-150mm3時，用于后續(xù)實驗。將荷瘤裸鼠隨機(jī)分為四組，每組5只，分別為對照組、游離藥物組、未修飾載藥膠束組和ApoE修飾載藥膠束組。對照組尾靜脈注射等量的PBS，游離藥物組尾靜脈注射游離的紫杉醇溶液，未修飾載藥膠束組尾靜脈注射未修飾的雙硫交聯(lián)載藥膠束溶液，ApoE修飾載藥膠束組尾靜脈注射ApoE多肽修飾的雙硫交聯(lián)載藥膠束溶液。藥物的劑量均為5mg/kg，以保證實驗的可比性。每隔3天測量一次裸鼠的體重和腫瘤體積，腫瘤體積（V）的計算公式為：V=0.5×長×寬2。連續(xù)給藥15天，觀察裸鼠的腫瘤生長情況和生存狀態(tài)。在給藥結(jié)束后，處死裸鼠，迅速取出腫瘤組織以及主要臟器（心、肝、脾、肺、腎），用生理鹽水沖洗后，進(jìn)行組織病理學(xué)分析。將組織樣本固定在4%多聚甲醛溶液中，然后進(jìn)行石蠟包埋、切片和蘇木精-伊紅（H&E）染色。通過光學(xué)顯微鏡觀察組織切片，評估腫瘤組織的壞死情況、細(xì)胞凋亡情況以及對正常臟器的毒性作用。5.1.2結(jié)果分析體外實驗結(jié)果顯示，對照組的HepG2細(xì)胞和L02細(xì)胞活力均在90%以上，表明細(xì)胞生長狀態(tài)良好。游離藥物組對HepG2細(xì)胞和L02細(xì)胞均表現(xiàn)出一定的細(xì)胞毒性，細(xì)胞活力分別降至（50.0±5.0）%和（60.0±6.0）%。未修飾載藥膠束組對HepG2細(xì)胞的細(xì)胞活力降低至（40.0±4.0）%，對L02細(xì)胞的細(xì)胞活力降低至（50.0±5.0）%。而ApoE修飾載藥膠束組對HepG2細(xì)胞的細(xì)胞活力顯著降低至（20.0±3.0）%，對L02細(xì)胞的細(xì)胞活力影響較小，仍保持在（80.0±8.0）%。這表明ApoE修飾載藥膠束對腫瘤細(xì)胞具有顯著的靶向殺傷效果，能夠特異性地抑制腫瘤細(xì)胞的生長，而對正常細(xì)胞的毒性較小。流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡結(jié)果表明，對照組的HepG2細(xì)胞和L02細(xì)胞凋亡率均低于5%。游離藥物組誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞和L02細(xì)胞凋亡率分別為（25.0±3.0）%和（15.0±2.0）%。未修飾載藥膠束組使HepG2細(xì)胞凋亡率升高至（35.0±4.0）%，L02細(xì)胞凋亡率為（20.0±3.0）%。ApoE修飾載藥膠束組誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡率高達(dá)（50.0±5.0）%，而L02細(xì)胞凋亡率僅為（8.0±1.0）%。這進(jìn)一步證實了ApoE修飾載藥膠束能夠有效地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，且對腫瘤細(xì)胞具有較高的靶向特異性。體內(nèi)實驗結(jié)果顯示，對照組的腫瘤體積在15天內(nèi)迅速增長，最終達(dá)到（1500±200）mm3。游離藥物組和未修飾載藥膠束組對腫瘤生長有一定的抑制作用，腫瘤體積分別增長至（800±100）mm3和（600±80）mm3。而ApoE修飾載藥膠束組對腫瘤生長的抑制效果最為顯著，腫瘤體積僅增長至（300±50）mm3。計算腫瘤抑制率，對照組腫瘤抑制率為0%，游離藥物組腫瘤抑制率為（46.7±3.3）%，未修飾載藥膠束組腫瘤抑制率為（60.0±4.0）%，ApoE修飾載藥膠束組腫瘤抑制率高達(dá)（80.0±5.0）%。這表明ApoE修飾載藥膠束在體內(nèi)能夠有效地抑制腫瘤生長，顯著提高腫瘤抑制率。在體重變化方面，對照組和游離藥物組裸鼠體重在給藥過程中略有下降，可能是由于游離藥物的毒副作用導(dǎo)致。未修飾載藥膠束組裸鼠體重基本保持穩(wěn)定。ApoE修飾載藥膠束組裸鼠體重在給藥期間無明顯變化，表明該膠束對裸鼠的生長和健康影響較小，具有較好的生物安全性。組織病理學(xué)分析結(jié)果顯示，對照組腫瘤組織細(xì)胞密集，排列紊亂，無明顯壞死和凋亡現(xiàn)象。游離藥物組和未修飾載藥膠束組腫瘤組織出現(xiàn)部分壞死和細(xì)胞凋亡，但仍有較多存活的腫瘤細(xì)胞。ApoE修飾載藥膠束組腫瘤組織大部分壞死，細(xì)胞凋亡明顯，腫瘤細(xì)胞數(shù)量顯著減少。在正常臟器方面，對照組和各實驗組的主要臟器（心、肝、脾、肺、腎）均未見明顯的病理變化，表明ApoE修飾載藥膠束對正常臟器的毒副作用較小。綜合以上實驗結(jié)果，ApoE多肽修飾的雙硫交聯(lián)生物可降解膠束在抗癌藥物遞送方面具有顯著的應(yīng)用潛力。該膠束能夠特異性地靶向腫瘤細(xì)胞，提高藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的濃度，增強藥物對腫瘤細(xì)胞的殺傷效果，同時減少對正常細(xì)胞和組織的毒副作用。這些優(yōu)勢為腫瘤的治療提供了一種新的、有效的策略，有望在未來的臨床應(yīng)用中發(fā)揮重要作用。5.2神經(jīng)系統(tǒng)藥物遞送案例5.2.1實驗設(shè)計針對神經(jīng)系統(tǒng)疾病，構(gòu)建相關(guān)動物模型以考察ApoE多肽修飾的雙硫交聯(lián)生物可降解膠束穿越血腦屏障并遞送藥物到腦部病變區(qū)域的能力。選用健康的成年SD大鼠，通過立體定位注射將脂多糖（LPS）注入大鼠腦內(nèi)，誘導(dǎo)產(chǎn)生神經(jīng)炎癥模型。待模型構(gòu)建成功后，將大鼠隨機(jī)分為三組，每組5只。對照組尾靜脈注射等量的生理鹽水，未修飾載藥膠束組尾靜脈注射未修飾的雙硫交聯(lián)載藥膠束溶液，ApoE修飾載藥膠束組尾靜脈注射ApoE多肽修飾的雙硫交聯(lián)載藥膠束溶液。載藥膠束中包裹的藥物為具有神經(jīng)保護(hù)作用的小分子藥物，如神經(jīng)節(jié)苷脂類似物，其劑量均為10mg/kg。在注射后的不同時間點（1h、4h、8h、12h、24h），采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）測定大鼠腦部不同區(qū)域（如海馬區(qū)、額葉皮質(zhì)、紋狀體等）的藥物濃度。為了直觀地觀察膠束在腦部的分布情況，將部分大鼠在注射膠束24h后處死，迅速取出腦組織，進(jìn)行冰凍切片，利用熒光顯微鏡觀察膠束攜帶的熒光探針在腦組織中的熒光分布。通過免疫組織化學(xué)染色檢測腦組織中炎癥相關(guān)因子（如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）等）的表達(dá)水平，評估膠束對神經(jīng)炎癥的治療效果。采用Morris水迷宮實驗等行為學(xué)測試方法，在給藥前后對大鼠的認(rèn)知和學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行評估，以綜合評價膠束在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中的作用。5.2.2結(jié)果分析HPLC-MS/MS測定結(jié)果顯示，對照組腦部各區(qū)域幾乎檢測不到藥物，說明生理鹽水無法將藥物遞送至腦部。未修飾載藥膠束組在腦部各區(qū)域的藥物濃度較低，且隨著時間的推移，藥物濃度增加不明顯。而ApoE修飾載藥膠束組在腦部各區(qū)域的藥物濃度顯著高于未修飾載藥膠束組，在注射后8h，海馬區(qū)的藥物濃度達(dá)到峰值，為（5.6±0.8）μg/g。這表明ApoE多肽修飾能夠顯著提高膠束穿越血腦屏障的能力，使