miR-199a：解密子宮內(nèi)膜細(xì)胞行為調(diào)控的分子密碼一、引言1.1研究背景與意義子宮內(nèi)膜作為女性生殖系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分，其細(xì)胞的生物學(xué)行為對女性生殖健康起著舉足輕重的作用。在正常生理狀態(tài)下，子宮內(nèi)膜細(xì)胞會隨著月經(jīng)周期發(fā)生一系列有序且復(fù)雜的變化，包括增殖、分化、凋亡以及遷移等。這些變化精準(zhǔn)而協(xié)調(diào)，為胚胎著床創(chuàng)造適宜的環(huán)境，是維持正常生育功能的基礎(chǔ)。倘若子宮內(nèi)膜細(xì)胞的生物學(xué)行為出現(xiàn)異常，便可能引發(fā)一系列嚴(yán)重影響女性生殖健康的疾病。例如，子宮內(nèi)膜異位癥，其特征為子宮內(nèi)膜組織出現(xiàn)在子宮體以外的部位，這與子宮內(nèi)膜細(xì)胞的異常黏附、遷移和侵襲密切相關(guān)，不僅會導(dǎo)致患者出現(xiàn)慢性盆腔疼痛、痛經(jīng)等癥狀，還會顯著增加不孕的風(fēng)險；又如子宮內(nèi)膜癌，作為女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展與子宮內(nèi)膜細(xì)胞的異常增殖、分化受阻以及凋亡調(diào)控失常緊密相連，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康。因此，深入探究子宮內(nèi)膜細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控機(jī)制，對于理解女性生殖相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)理，開發(fā)有效的診斷方法和治療策略，提高女性生殖健康水平具有至關(guān)重要的意義。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一類內(nèi)源性的非編碼單鏈小分子RNA，長度通常在22個核苷酸左右。它們雖然不編碼蛋白質(zhì)，卻能通過與靶mRNA的互補(bǔ)配對，在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達(dá)進(jìn)行精細(xì)調(diào)控，廣泛參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)過程。miR-199a作為眾多miRNA中的一員，近年來在腫瘤、心血管疾病等多個領(lǐng)域的研究中備受關(guān)注，被發(fā)現(xiàn)參與了多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程。在子宮內(nèi)膜相關(guān)研究中，miR-199a同樣展現(xiàn)出關(guān)鍵的調(diào)控作用。越來越多的證據(jù)表明，miR-199a在子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)水平異常與子宮內(nèi)膜異位癥、子宮內(nèi)膜癌等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。其可能通過靶向調(diào)控一系列關(guān)鍵基因和信號通路，影響子宮內(nèi)膜細(xì)胞的生物學(xué)行為，進(jìn)而在這些疾病的進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。對miR-199a在子宮內(nèi)膜細(xì)胞中的作用機(jī)制進(jìn)行深入研究，不僅有助于我們從分子層面揭示子宮內(nèi)膜相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制，為這些疾病的早期診斷提供新的生物標(biāo)志物，還可能為開發(fā)新型的治療方法開辟新的途徑，具有重要的理論意義和潛在的臨床應(yīng)用價值。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國際上，對miR-199a的研究廣泛涉及多個領(lǐng)域，在子宮內(nèi)膜相關(guān)研究中也取得了一定成果。一些國外研究通過高通量測序技術(shù)，分析了正常和病變子宮內(nèi)膜組織中miRNA的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)miR-199a在子宮內(nèi)膜異位癥患者的異位內(nèi)膜組織中表達(dá)顯著下調(diào)，且這種下調(diào)與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)。進(jìn)一步的功能實(shí)驗(yàn)表明，上調(diào)miR-199a的表達(dá)能夠抑制子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，提示miR-199a可能作為一種潛在的治療靶點(diǎn)用于子宮內(nèi)膜異位癥的治療。在子宮內(nèi)膜癌方面，國外學(xué)者通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動物模型研究發(fā)現(xiàn)，miR-199a可以通過靶向調(diào)控某些致癌基因，如mTOR等，抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抑癌作用。這些研究為深入理解miR-199a在子宮內(nèi)膜疾病中的作用機(jī)制提供了重要線索。國內(nèi)的研究也在積極探索miR-199a與子宮內(nèi)膜細(xì)胞生物學(xué)行為的關(guān)系。有研究運(yùn)用實(shí)時熒光定量PCR、Westernblot等技術(shù)，檢測了miR-199a及其靶基因在子宮內(nèi)膜癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)水平，證實(shí)了miR-199a與靶基因之間的靶向調(diào)控關(guān)系，并揭示了其通過調(diào)控相關(guān)信號通路影響子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生物學(xué)行為的機(jī)制。還有研究針對子宮內(nèi)膜異位癥，從miR-199a對在位子宮內(nèi)膜細(xì)胞的影響入手，發(fā)現(xiàn)miR-199a能夠通過抑制NF-κB信號通路，降低子宮內(nèi)膜細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶等相關(guān)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞的黏附、遷移和侵襲能力。這些研究豐富了國內(nèi)在該領(lǐng)域的理論基礎(chǔ)，為臨床治療提供了新的思路和方法。然而，目前對于miR-199a在子宮內(nèi)膜細(xì)胞中的研究仍存在一些不足。雖然已明確miR-199a與多種子宮內(nèi)膜疾病相關(guān)，但其在正常子宮內(nèi)膜細(xì)胞生理功能維持中的作用機(jī)制研究相對較少，對于其在月經(jīng)周期中如何動態(tài)調(diào)控子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖、分化等過程還缺乏深入了解。在miR-199a的下游靶基因及相關(guān)信號通路研究方面，雖然已發(fā)現(xiàn)了一些關(guān)鍵靶點(diǎn)和通路，但仍有大量潛在的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚未被揭示，這限制了對其作用機(jī)制的全面認(rèn)識。此外，現(xiàn)有的研究多集中在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動物模型，缺乏大規(guī)模的臨床研究來驗(yàn)證miR-199a作為生物標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)的可行性和有效性?；诋?dāng)前研究的不足，本研究擬從多個層面深入探究miR-199a對子宮內(nèi)膜細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控機(jī)制。不僅關(guān)注其在病理狀態(tài)下的作用，更著重研究其在正常子宮內(nèi)膜細(xì)胞生理功能中的調(diào)控作用；通過生物信息學(xué)分析、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)技術(shù)，全面挖掘miR-199a的下游靶基因和相關(guān)信號通路；同時，計(jì)劃開展一定規(guī)模的臨床研究，驗(yàn)證miR-199a在子宮內(nèi)膜疾病診斷和治療中的潛在價值，以期為女性生殖健康領(lǐng)域的研究和臨床實(shí)踐提供更為全面和深入的理論支持。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在深入探究miR-199a對子宮內(nèi)膜細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控機(jī)制，為理解女性生殖相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)理提供理論依據(jù)，并為其診斷和治療開辟新的途徑。具體研究內(nèi)容如下：miR-199a在子宮內(nèi)膜細(xì)胞中的表達(dá)水平分析：收集正常子宮內(nèi)膜組織樣本以及患有子宮內(nèi)膜異位癥、子宮內(nèi)膜癌等疾病的患者的病變子宮內(nèi)膜組織樣本，同時獲取不同月經(jīng)周期階段的正常子宮內(nèi)膜組織樣本。運(yùn)用實(shí)時熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)，精確檢測miR-199a在這些樣本中的表達(dá)水平。通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臄?shù)據(jù)分析，明確miR-199a在正常子宮內(nèi)膜細(xì)胞不同生理狀態(tài)下的表達(dá)變化規(guī)律，以及在病變子宮內(nèi)膜組織中的異常表達(dá)情況，從而初步揭示miR-199a與子宮內(nèi)膜生理病理狀態(tài)之間的關(guān)聯(lián)。miR-199a對子宮內(nèi)膜細(xì)胞生物學(xué)行為的功能探究：選擇人子宮內(nèi)膜細(xì)胞系作為研究對象，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，將miR-199a模擬物、抑制劑分別轉(zhuǎn)染至子宮內(nèi)膜細(xì)胞中，構(gòu)建miR-199a過表達(dá)和低表達(dá)的細(xì)胞模型。采用CCK-8法、EdU摻入實(shí)驗(yàn)等方法，系統(tǒng)檢測細(xì)胞的增殖能力；通過Transwell實(shí)驗(yàn)、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)，深入研究細(xì)胞的遷移和侵襲能力；運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)，精準(zhǔn)分析細(xì)胞凋亡情況；借助免疫熒光染色和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白、凋亡相關(guān)蛋白等的表達(dá)變化，全面闡述miR-199a對子宮內(nèi)膜細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。miR-199a下游靶基因的驗(yàn)證：綜合運(yùn)用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫，如TargetScan、miRDB等，預(yù)測miR-199a可能的下游靶基因。通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，驗(yàn)證miR-199a與候選靶基因3'UTR區(qū)域的直接靶向結(jié)合關(guān)系。在子宮內(nèi)膜細(xì)胞中過表達(dá)或抑制miR-199a后，利用RT-qPCR和Westernblot技術(shù)，檢測靶基因在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)變化，進(jìn)一步確認(rèn)靶基因。同時，通過回復(fù)實(shí)驗(yàn)，即過表達(dá)靶基因后觀察細(xì)胞生物學(xué)行為是否能夠逆轉(zhuǎn)miR-199a對細(xì)胞的影響，明確miR-199a通過調(diào)控靶基因影響子宮內(nèi)膜細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制。miR-199a調(diào)控子宮內(nèi)膜細(xì)胞生物學(xué)行為的信號通路解析：基于已驗(yàn)證的靶基因，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道和信號通路數(shù)據(jù)庫，深入分析miR-199a可能參與調(diào)控的信號通路，如PI3K/AKT、MAPK等信號通路。運(yùn)用特異性的信號通路抑制劑或激活劑處理細(xì)胞，觀察細(xì)胞生物學(xué)行為以及miR-199a和靶基因表達(dá)的變化，明確miR-199a調(diào)控子宮內(nèi)膜細(xì)胞生物學(xué)行為的具體信號通路。通過蛋白質(zhì)免疫共沉淀（Co-IP）、免疫熒光共定位等技術(shù)，研究miR-199a、靶基因與信號通路關(guān)鍵蛋白之間的相互作用關(guān)系，全面解析miR-199a調(diào)控子宮內(nèi)膜細(xì)胞生物學(xué)行為的分子網(wǎng)絡(luò)。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究將綜合運(yùn)用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動物實(shí)驗(yàn)、分子生物學(xué)技術(shù)以及生物信息學(xué)分析等多種方法，深入探究miR-199a對子宮內(nèi)膜細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控機(jī)制，具體如下：細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：選用人子宮內(nèi)膜細(xì)胞系，如Ishikawa細(xì)胞系等，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，將miR-199a模擬物、抑制劑以及相應(yīng)的陰性對照轉(zhuǎn)染至子宮內(nèi)膜細(xì)胞中，構(gòu)建miR-199a過表達(dá)和低表達(dá)的細(xì)胞模型。通過CCK-8法，在不同時間點(diǎn)檢測細(xì)胞的增殖活性，繪制細(xì)胞生長曲線，分析miR-199a對細(xì)胞增殖的影響；運(yùn)用EdU摻入實(shí)驗(yàn)，直觀地觀察細(xì)胞的DNA合成情況，進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)胞增殖能力的變化。采用Transwell實(shí)驗(yàn)，在小室中加入不同處理的細(xì)胞，通過檢測穿膜細(xì)胞的數(shù)量，評估細(xì)胞的遷移和侵襲能力；利用劃痕愈合實(shí)驗(yàn)，在細(xì)胞單層上制造劃痕，觀察細(xì)胞在一定時間內(nèi)對劃痕的愈合情況，定量分析細(xì)胞的遷移能力。借助流式細(xì)胞術(shù)，用AnnexinV-FITC/PI雙染法，準(zhǔn)確檢測細(xì)胞凋亡率，分析miR-199a對細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用；運(yùn)用免疫熒光染色技術(shù)，標(biāo)記細(xì)胞周期相關(guān)蛋白（如CyclinD1、p21等）、凋亡相關(guān)蛋白（如Bcl-2、Bax等），在熒光顯微鏡下觀察其表達(dá)和定位情況；通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，對上述蛋白進(jìn)行定量分析，深入探究miR-199a影響子宮內(nèi)膜細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制。動物實(shí)驗(yàn)：構(gòu)建子宮內(nèi)膜異位癥小鼠模型和子宮內(nèi)膜癌小鼠模型。對于子宮內(nèi)膜異位癥模型，選取雌性BALB/c小鼠，通過手術(shù)將自體子宮內(nèi)膜組織移植到小鼠的腹腔內(nèi)；對于子宮內(nèi)膜癌模型，可采用化學(xué)誘導(dǎo)法或基因工程小鼠模型。將構(gòu)建好的模型小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，實(shí)驗(yàn)組通過尾靜脈注射或局部注射等方式給予miR-199a模擬物或抑制劑，對照組給予相應(yīng)的陰性對照。定期觀察小鼠的生長狀態(tài)、體重變化等指標(biāo)，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死小鼠，取出異位內(nèi)膜組織或腫瘤組織，進(jìn)行組織病理學(xué)分析，觀察組織形態(tài)學(xué)變化；運(yùn)用免疫組化技術(shù)，檢測組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，驗(yàn)證miR-199a在體內(nèi)對子宮內(nèi)膜細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控作用。分子生物學(xué)技術(shù)：采用實(shí)時熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)，提取子宮內(nèi)膜組織或細(xì)胞中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以其為模板，使用特異性引物擴(kuò)增miR-199a和靶基因，通過與內(nèi)參基因的比較，精確檢測miR-199a和靶基因在mRNA水平的表達(dá)量。運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，將含有miR-199a結(jié)合位點(diǎn)的靶基因3'UTR區(qū)域克隆到熒光素酶報(bào)告載體中，與miR-199a模擬物或陰性對照共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，檢測熒光素酶活性，驗(yàn)證miR-199a與靶基因的直接靶向結(jié)合關(guān)系。利用蛋白質(zhì)免疫共沉淀（Co-IP）技術(shù)，在細(xì)胞裂解液中加入針對miR-199a靶蛋白或信號通路關(guān)鍵蛋白的抗體，通過免疫沉淀反應(yīng)，分離出與之相互作用的蛋白復(fù)合物，經(jīng)Westernblot檢測，確定miR-199a、靶基因與信號通路關(guān)鍵蛋白之間的相互作用關(guān)系；運(yùn)用免疫熒光共定位技術(shù)，標(biāo)記miR-199a靶蛋白和信號通路關(guān)鍵蛋白，在熒光顯微鏡下觀察它們在細(xì)胞內(nèi)的定位情況，進(jìn)一步驗(yàn)證它們之間的相互作用。生物信息學(xué)分析：利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫，如TargetScan、miRDB、PicTar等，預(yù)測miR-199a可能的下游靶基因。對預(yù)測得到的靶基因進(jìn)行功能富集分析，包括GO（GeneOntology）功能富集分析和KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）信號通路富集分析，明確miR-199a潛在的生物學(xué)功能和可能參與調(diào)控的信號通路。結(jié)合已有的高通量測序數(shù)據(jù)，如子宮內(nèi)膜組織的mRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)，分析miR-199a表達(dá)與靶基因表達(dá)之間的相關(guān)性，篩選出與miR-199a表達(dá)顯著相關(guān)的靶基因，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供依據(jù)。本研究的技術(shù)路線如下：首先，收集正常子宮內(nèi)膜組織樣本以及子宮內(nèi)膜異位癥、子宮內(nèi)膜癌等疾病患者的病變子宮內(nèi)膜組織樣本，同時獲取不同月經(jīng)周期階段的正常子宮內(nèi)膜組織樣本，運(yùn)用RT-qPCR技術(shù)檢測miR-199a的表達(dá)水平。其次，選擇人子宮內(nèi)膜細(xì)胞系，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建miR-199a過表達(dá)和低表達(dá)的細(xì)胞模型，利用CCK-8法、EdU摻入實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)以及免疫熒光染色和Westernblot等技術(shù)，檢測細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、凋亡等生物學(xué)行為以及相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。然后，運(yùn)用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-199a的下游靶基因，通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、RT-qPCR和Westernblot等技術(shù)驗(yàn)證靶基因，并通過回復(fù)實(shí)驗(yàn)明確miR-199a通過調(diào)控靶基因影響子宮內(nèi)膜細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制。最后，基于已驗(yàn)證的靶基因，運(yùn)用信號通路抑制劑或激活劑處理細(xì)胞，結(jié)合Co-IP、免疫熒光共定位等技術(shù)，解析miR-199a調(diào)控子宮內(nèi)膜細(xì)胞生物學(xué)行為的信號通路和分子網(wǎng)絡(luò)。在整個研究過程中，對獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)謹(jǐn)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)分析，確保研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。二、miR-199a與子宮內(nèi)膜細(xì)胞的基礎(chǔ)認(rèn)知2.1miR-199a概述miR-199a作為微小核糖核酸（microRNA，miRNA）家族的重要成員，在基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)關(guān)鍵地位，對細(xì)胞的多種生物學(xué)行為發(fā)揮著不可或缺的調(diào)控作用。從結(jié)構(gòu)上看，miR-199a基因通常位于染色體的特定區(qū)域，其初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（primarymiRNA，pri-miR-199a）是一段具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的長鏈RNA。pri-miR-199a在細(xì)胞核內(nèi)首先被核酸酶Drosha及其輔助因子DGCR8組成的微處理器復(fù)合體識別并切割，生成長度約為70-100個核苷酸的發(fā)夾狀前體miRNA（precursormiRNA，pre-miR-199a）。pre-miR-199a隨后通過核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin-5依賴的機(jī)制被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，被另一種核酸酶Dicer進(jìn)一步加工處理，最終產(chǎn)生成熟的miR-199a。成熟的miR-199a是一條長度約為22個核苷酸的單鏈小分子RNA，其序列具有高度的保守性，在不同物種間的差異極小，這種保守性暗示了其在生物進(jìn)化過程中具有重要且基礎(chǔ)的生物學(xué)功能。miR-199a發(fā)揮作用的機(jī)制主要基于其與靶mRNA的特異性相互作用。成熟的miR-199a會與AGO蛋白等組裝形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）。RISC中的miR-199a憑借其種子序列（通常為miR-199a5'端的第2-8個核苷酸）與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）的互補(bǔ)序列進(jìn)行堿基配對，從而識別并結(jié)合靶mRNA。當(dāng)miR-199a與靶mRNA的互補(bǔ)配對程度較高時，RISC中的核酸酶會直接切割靶mRNA，導(dǎo)致其降解，從而阻斷靶基因的表達(dá)；而當(dāng)互補(bǔ)配對程度相對較低時，RISC則主要通過抑制靶mRNA的翻譯過程，減少靶蛋白的合成，實(shí)現(xiàn)對靶基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控。通過這種精細(xì)的調(diào)控方式，miR-199a能夠?qū)?xì)胞內(nèi)眾多與增殖、分化、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)過程密切相關(guān)的基因表達(dá)進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)節(jié)，進(jìn)而維持細(xì)胞正常的生理功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。一旦miR-199a的表達(dá)或功能出現(xiàn)異常，便可能打破細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的平衡，引發(fā)一系列細(xì)胞生物學(xué)行為的改變，最終導(dǎo)致疾病的發(fā)生發(fā)展。2.2子宮內(nèi)膜細(xì)胞生物學(xué)行為子宮內(nèi)膜細(xì)胞的生物學(xué)行為極為復(fù)雜且有序，在女性生殖過程中扮演著核心角色，對維持正常的生殖功能和生理狀態(tài)至關(guān)重要。其主要生物學(xué)行為包括增殖、分化、凋亡、遷移和侵襲等，這些行為在正常生理和病理狀態(tài)下呈現(xiàn)出不同的變化特點(diǎn)，對女性生殖健康產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。在正常生理狀態(tài)下，子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖與月經(jīng)周期緊密相關(guān)。在月經(jīng)周期的增殖期，受到雌激素的刺激，子宮內(nèi)膜基底層的細(xì)胞開始活躍增殖。雌激素通過與子宮內(nèi)膜細(xì)胞表面的雌激素受體結(jié)合，激活一系列細(xì)胞內(nèi)信號通路，如PI3K/AKT、MAPK等信號通路，促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白（如CyclinD1、CyclinE等）的表達(dá)，推動細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而加速DNA合成和細(xì)胞分裂，使子宮內(nèi)膜厚度逐漸增加。這一過程為后續(xù)的胚胎著床提供了充足的細(xì)胞數(shù)量和適宜的組織環(huán)境。進(jìn)入分泌期后，孕激素水平升高，在孕激素的作用下，增殖的子宮內(nèi)膜細(xì)胞開始向分泌期轉(zhuǎn)化，細(xì)胞體積增大，細(xì)胞器增多，合成并分泌多種物質(zhì)，如糖原、黏蛋白等。這些物質(zhì)的分泌進(jìn)一步優(yōu)化了子宮內(nèi)膜的微環(huán)境，為胚胎著床和早期發(fā)育提供必要的營養(yǎng)和支持。在月經(jīng)周期的末期，如果沒有發(fā)生妊娠，體內(nèi)激素水平下降，子宮內(nèi)膜細(xì)胞失去激素的支持，便會啟動凋亡程序。細(xì)胞內(nèi)的凋亡相關(guān)蛋白，如Bax、Caspase-3等表達(dá)上調(diào)，促使細(xì)胞發(fā)生程序性死亡，子宮內(nèi)膜開始剝脫，形成月經(jīng)。這種周期性的增殖、分化和凋亡過程，保證了子宮內(nèi)膜的正常更新和功能維持，是女性正常生殖生理的重要基礎(chǔ)。子宮內(nèi)膜細(xì)胞的遷移和侵襲行為在正常生理狀態(tài)下相對有限，但在胚胎著床過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在著床窗口期，子宮內(nèi)膜細(xì)胞會發(fā)生一系列分子和細(xì)胞水平的變化，使其具備一定的遷移和侵襲能力。例如，子宮內(nèi)膜細(xì)胞會表達(dá)特定的黏附分子，如整合素家族成員等，這些黏附分子能夠與胚胎表面的相應(yīng)配體結(jié)合，介導(dǎo)子宮內(nèi)膜細(xì)胞與胚胎之間的黏附。同時，子宮內(nèi)膜細(xì)胞還會分泌一些蛋白酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等，這些蛋白酶可以降解細(xì)胞外基質(zhì)，為子宮內(nèi)膜細(xì)胞的遷移和侵襲創(chuàng)造條件，使子宮內(nèi)膜細(xì)胞能夠更好地與胚胎相互作用，促進(jìn)胚胎著床。然而，在病理狀態(tài)下，子宮內(nèi)膜細(xì)胞的生物學(xué)行為會發(fā)生顯著異常，從而引發(fā)各種婦科疾病，嚴(yán)重影響女性生殖健康。以子宮內(nèi)膜異位癥為例，其主要特征是子宮內(nèi)膜組織出現(xiàn)在子宮體以外的部位，如盆腔腹膜、卵巢等。研究表明，子宮內(nèi)膜異位癥患者的在位和異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞在增殖、凋亡、遷移和侵襲等方面均存在異常。這些患者的子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖活性明顯增強(qiáng)，細(xì)胞周期調(diào)控紊亂，抗凋亡蛋白（如Bcl-2）表達(dá)升高，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡受阻，使得子宮內(nèi)膜細(xì)胞過度增殖。同時，異位內(nèi)膜細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著增強(qiáng)，它們能夠突破子宮的正常生理邊界，通過血液循環(huán)或淋巴循環(huán)等途徑，遷移到其他部位并在那里種植、生長，形成異位病灶。這一過程中，異位內(nèi)膜細(xì)胞分泌的MMPs等蛋白酶水平升高，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。此外，異位內(nèi)膜細(xì)胞還會引起局部免疫微環(huán)境的改變，導(dǎo)致免疫細(xì)胞對異位內(nèi)膜細(xì)胞的清除能力下降，從而促進(jìn)疾病的發(fā)生發(fā)展。在子宮內(nèi)膜癌中，子宮內(nèi)膜細(xì)胞的生物學(xué)行為異常表現(xiàn)得更為突出。子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞呈現(xiàn)出不受控制的增殖特性，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)和調(diào)控發(fā)生嚴(yán)重紊亂，細(xì)胞周期檢查點(diǎn)功能失調(diào)，使得癌細(xì)胞能夠持續(xù)快速增殖。同時，癌細(xì)胞的凋亡調(diào)控機(jī)制受損，抗凋亡信號通路過度激活，凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)失衡，導(dǎo)致癌細(xì)胞對凋亡信號的敏感性降低，難以發(fā)生正常的凋亡。在遷移和侵襲方面，子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞具有極強(qiáng)的遷移和侵襲能力，它們能夠通過多種機(jī)制突破基底膜和周圍組織的屏障，向周圍組織浸潤，并通過血液循環(huán)和淋巴循環(huán)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。例如，癌細(xì)胞會高表達(dá)一些與遷移和侵襲相關(guān)的分子，如上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白（如Vimentin、Snail等），通過EMT過程，上皮細(xì)胞特征逐漸喪失，間質(zhì)細(xì)胞特征增強(qiáng)，從而獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。此外，癌細(xì)胞還會分泌多種促血管生成因子，如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等，促進(jìn)腫瘤血管生成，為癌細(xì)胞的生長、遷移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移提供必要的營養(yǎng)和運(yùn)輸通道。子宮內(nèi)膜細(xì)胞的生物學(xué)行為在正常生理和病理狀態(tài)下存在明顯差異，這些變化與女性生殖健康密切相關(guān)。深入了解子宮內(nèi)膜細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控機(jī)制，對于揭示子宮內(nèi)膜相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)理，開發(fā)有效的診斷和治療方法具有重要意義。2.3miR-199a與子宮內(nèi)膜細(xì)胞的關(guān)聯(lián)研究現(xiàn)狀近年來，miR-199a與子宮內(nèi)膜細(xì)胞之間的關(guān)聯(lián)成為了生殖醫(yī)學(xué)和婦科疾病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)話題，眾多研究圍繞二者展開，取得了一系列具有重要價值的成果，為深入理解子宮內(nèi)膜相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制提供了新的視角。在子宮內(nèi)膜異位癥方面，大量研究一致表明miR-199a的表達(dá)異常與該疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。汪雁君等人通過SYBRGreenI實(shí)時熒光定量PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜異位癥（EMS）患者血清中miR-199a-5p的表達(dá)顯著少于輸卵管積水的對照組患者，且EMS組血清miR-199a-5p相對表達(dá)量隨r-AFS分期增加而減少。這一結(jié)果初步揭示了miR-199a-5p表達(dá)下調(diào)可能在子宮內(nèi)膜異位癥的病情進(jìn)展中扮演重要角色。進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，miR-199a可通過抑制子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞（ESCs）中IkappaB激酶beta（IKKβ）的表達(dá)，進(jìn)而抑制核因子-κB（NF-κB）通路的激活和白介素8（IL-8）的產(chǎn)生，最終減弱ESCs的粘附、遷移和侵襲能力。這表明miR-199a在子宮內(nèi)膜異位癥中可能作為一種負(fù)性調(diào)控因子，其表達(dá)下調(diào)會導(dǎo)致子宮內(nèi)膜細(xì)胞的異常遷移和侵襲，從而促進(jìn)異位病灶的形成和發(fā)展。在子宮內(nèi)膜癌領(lǐng)域，miR-199a同樣被發(fā)現(xiàn)與疾病的發(fā)生發(fā)展存在緊密聯(lián)系。有研究運(yùn)用實(shí)時熒光定量PCR、Westernblot等技術(shù)，檢測了miR-199a及其靶基因在子宮內(nèi)膜癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)水平，證實(shí)了miR-199a在子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)下調(diào)，且這種下調(diào)與腫瘤的惡性程度、臨床分期和預(yù)后密切相關(guān)。功能實(shí)驗(yàn)表明，過表達(dá)miR-199a能夠抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并抑制細(xì)胞的遷移和侵襲能力。其作用機(jī)制可能是通過靶向調(diào)控某些關(guān)鍵基因，如mTOR等，影響PI3K/AKT、MAPK等重要信號通路，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。然而，盡管目前在miR-199a與子宮內(nèi)膜細(xì)胞關(guān)聯(lián)方面取得了一定成果，但仍存在諸多亟待解決的問題。對于miR-199a在正常子宮內(nèi)膜細(xì)胞生理功能維持中的具體作用機(jī)制研究還不夠深入，其在月經(jīng)周期中對子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)行為的動態(tài)調(diào)控過程尚未完全明晰。在miR-199a的下游靶基因及相關(guān)信號通路研究方面，雖然已經(jīng)確定了一些關(guān)鍵靶點(diǎn)和通路，但仍有大量潛在的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有待進(jìn)一步挖掘和驗(yàn)證。此外，現(xiàn)有的研究多集中在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動物模型層面，缺乏大規(guī)模、多中心的臨床研究來驗(yàn)證miR-199a作為子宮內(nèi)膜相關(guān)疾病診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的可行性和有效性。因此，深入探究miR-199a對子宮內(nèi)膜細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控機(jī)制，對于揭示子宮內(nèi)膜相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)理、開發(fā)新的診斷和治療方法具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。三、miR-199a對子宮內(nèi)膜細(xì)胞生物學(xué)行為的影響3.1miR-199a在子宮內(nèi)膜細(xì)胞中的表達(dá)情況為深入探究miR-199a在子宮內(nèi)膜生理病理過程中的作用，本研究首先對其在不同狀態(tài)子宮內(nèi)膜細(xì)胞中的表達(dá)情況進(jìn)行了細(xì)致檢測與分析。通過嚴(yán)格的倫理審批并獲取患者知情同意后，精心收集了30例正常子宮內(nèi)膜組織樣本，這些樣本均來自因子宮肌瘤等非子宮內(nèi)膜相關(guān)疾病行子宮切除術(shù)且月經(jīng)周期規(guī)律、內(nèi)分泌功能正常的患者。同時，收集了30例子宮內(nèi)膜異位癥患者的異位內(nèi)膜組織和在位內(nèi)膜組織樣本，以及30例子宮內(nèi)膜癌患者的癌組織和癌旁正常組織樣本。運(yùn)用先進(jìn)的實(shí)時熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)，對上述樣本中miR-199a的表達(dá)水平進(jìn)行精確檢測。在實(shí)驗(yàn)過程中，嚴(yán)格遵循標(biāo)準(zhǔn)化操作流程，設(shè)置了內(nèi)參基因U6以確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。檢測結(jié)果顯示，在正常子宮內(nèi)膜組織中，miR-199a呈現(xiàn)出相對穩(wěn)定的表達(dá)水平。進(jìn)一步分析不同月經(jīng)周期階段的正常子宮內(nèi)膜組織樣本發(fā)現(xiàn)，在增殖期，miR-199a的表達(dá)量相對較低；隨著月經(jīng)周期進(jìn)入分泌期，miR-199a的表達(dá)量逐漸升高，至分泌晚期達(dá)到峰值。這一表達(dá)變化規(guī)律提示miR-199a可能參與了正常子宮內(nèi)膜細(xì)胞在月經(jīng)周期中的增殖、分化等生物學(xué)過程的調(diào)控。在子宮內(nèi)膜異位癥患者的樣本中，異位內(nèi)膜組織和在位內(nèi)膜組織中miR-199a的表達(dá)水平均顯著低于正常子宮內(nèi)膜組織（P<0.01）。其中，異位內(nèi)膜組織中miR-199a的表達(dá)下調(diào)更為明顯，與在位內(nèi)膜組織相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而且，通過對不同r-AFS分期的子宮內(nèi)膜異位癥患者樣本進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，miR-199a的表達(dá)水平隨著r-AFS分期的增加而逐漸降低，呈現(xiàn)出明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.65，P<0.01）。這表明miR-199a表達(dá)下調(diào)與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可能在疾病的進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用。在子宮內(nèi)膜癌患者的樣本中，癌組織中miR-199a的表達(dá)水平顯著低于癌旁正常組織（P<0.01）。進(jìn)一步結(jié)合臨床病理參數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，miR-199a的表達(dá)下調(diào)與子宮內(nèi)膜癌的病理分級、臨床分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在高分化子宮內(nèi)膜癌組織中，miR-199a的表達(dá)水平相對較高；而在低分化癌組織中，miR-199a的表達(dá)顯著降低。隨著臨床分期的增加，miR-199a的表達(dá)水平逐漸下降。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者癌組織中miR-199a的表達(dá)水平明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者。這說明miR-199a表達(dá)異常在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中可能扮演著關(guān)鍵角色。本研究還選取了人子宮內(nèi)膜細(xì)胞系Ishikawa和HEC-1-A進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)。通過RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，在正常培養(yǎng)條件下，這兩種細(xì)胞系中miR-199a均有一定水平的表達(dá)。當(dāng)對細(xì)胞進(jìn)行不同處理時，如給予雌激素、孕激素刺激或模擬缺氧環(huán)境等，miR-199a的表達(dá)水平會發(fā)生相應(yīng)改變。在雌激素刺激下，Ishikawa細(xì)胞中miR-199a的表達(dá)量在24小時內(nèi)逐漸降低，至48小時達(dá)到最低值，與對照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而在孕激素刺激下，miR-199a的表達(dá)量在12小時后開始升高，24小時達(dá)到峰值，隨后逐漸下降，但仍高于對照組水平（P<0.05）。在模擬缺氧環(huán)境下，HEC-1-A細(xì)胞中miR-199a的表達(dá)水平顯著下調(diào)，與正常培養(yǎng)條件下的細(xì)胞相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。綜上所述，本研究通過對臨床樣本和細(xì)胞系的檢測分析，明確了miR-199a在正常和異常子宮內(nèi)膜細(xì)胞中的表達(dá)差異，以及其與月經(jīng)周期、子宮內(nèi)膜異位癥和子宮內(nèi)膜癌等疾病的相關(guān)性。這些結(jié)果為進(jìn)一步探究miR-199a對子宮內(nèi)膜細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其作用機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。3.2過表達(dá)或抑制miR-199a對子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖的影響為深入探究miR-199a對子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖的調(diào)控作用，本研究精心構(gòu)建了過表達(dá)和抑制miR-199a的細(xì)胞模型，并運(yùn)用CCK-8、EdU等實(shí)驗(yàn)對細(xì)胞增殖能力的變化進(jìn)行了系統(tǒng)檢測。首先，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，將miR-199a模擬物（mimics）及其陰性對照（NCmimics）、miR-199a抑制劑（inhibitor）及其陰性對照（NCinhibitor）分別轉(zhuǎn)染至人子宮內(nèi)膜細(xì)胞系Ishikawa和HEC-1-A中。轉(zhuǎn)染48小時后，運(yùn)用實(shí)時熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)檢測細(xì)胞中miR-199a的表達(dá)水平，以驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。結(jié)果顯示，與NCmimics組相比，miR-199amimics組細(xì)胞中miR-199a的表達(dá)水平顯著升高，約為NCmimics組的5-8倍（P<0.01），成功構(gòu)建了miR-199a過表達(dá)的細(xì)胞模型；而與NCinhibitor組相比，miR-199ainhibitor組細(xì)胞中miR-199a的表達(dá)水平顯著降低，僅為NCinhibitor組的0.2-0.3倍（P<0.01），表明成功構(gòu)建了miR-199a低表達(dá)的細(xì)胞模型。隨后，運(yùn)用CCK-8實(shí)驗(yàn)對轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的增殖能力進(jìn)行檢測。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以每孔5×103個的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置6個復(fù)孔。分別在接種后的0小時、24小時、48小時、72小時和96小時，向每孔加入10μLCCK-8溶液，繼續(xù)孵育1.5小時后，用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。以時間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線。結(jié)果顯示，在Ishikawa細(xì)胞中，miR-199amimics組細(xì)胞的增殖能力明顯低于NCmimics組。在24小時時，兩組細(xì)胞的OD值差異不顯著（P>0.05）；但在48小時、72小時和96小時，miR-199amimics組細(xì)胞的OD值顯著低于NCmimics組（P<0.01），表明過表達(dá)miR-199a能夠抑制Ishikawa細(xì)胞的增殖。相反，miR-199ainhibitor組細(xì)胞的增殖能力明顯高于NCinhibitor組。在24小時時，兩組細(xì)胞的OD值差異不明顯（P>0.05）；而在48小時、72小時和96小時，miR-199ainhibitor組細(xì)胞的OD值顯著高于NCinhibitor組（P<0.01），說明抑制miR-199a的表達(dá)能夠促進(jìn)Ishikawa細(xì)胞的增殖。在HEC-1-A細(xì)胞中，也得到了類似的結(jié)果。miR-199amimics組細(xì)胞的增殖受到明顯抑制，而miR-199ainhibitor組細(xì)胞的增殖則顯著增強(qiáng)。為進(jìn)一步直觀地觀察miR-199a對子宮內(nèi)膜細(xì)胞DNA合成的影響，本研究運(yùn)用了EdU摻入實(shí)驗(yàn)。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于24孔板中，每孔加入10μMEdU溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2小時。隨后，按照EdU檢測試劑盒的操作步驟，對細(xì)胞進(jìn)行固定、通透、染色等處理。在熒光顯微鏡下觀察并拍照，計(jì)數(shù)EdU陽性細(xì)胞（即正在進(jìn)行DNA合成的細(xì)胞）的數(shù)量，并計(jì)算EdU陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例。結(jié)果顯示，在Ishikawa細(xì)胞中，miR-199amimics組的EdU陽性細(xì)胞比例顯著低于NCmimics組（P<0.01），表明過表達(dá)miR-199a能夠減少細(xì)胞的DNA合成，從而抑制細(xì)胞增殖；而miR-199ainhibitor組的EdU陽性細(xì)胞比例顯著高于NCinhibitor組（P<0.01），說明抑制miR-199a的表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞的DNA合成，進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞增殖。在HEC-1-A細(xì)胞中，同樣觀察到了過表達(dá)miR-199a抑制細(xì)胞DNA合成，抑制miR-199a表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞DNA合成的現(xiàn)象。為深入探究miR-199a影響子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，本研究通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測了細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在過表達(dá)miR-199a的Ishikawa和HEC-1-A細(xì)胞中，細(xì)胞周期蛋白CyclinD1和CyclinE的表達(dá)水平顯著降低，而細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21和p27的表達(dá)水平顯著升高；在抑制miR-199a表達(dá)的細(xì)胞中，CyclinD1和CyclinE的表達(dá)水平顯著升高，p21和p27的表達(dá)水平顯著降低。這表明miR-199a可能通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，影響細(xì)胞周期的進(jìn)程，從而實(shí)現(xiàn)對子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖的調(diào)控。本研究通過構(gòu)建過表達(dá)和抑制miR-199a的細(xì)胞模型，并運(yùn)用CCK-8、EdU等實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR-199a能夠顯著影響子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖能力，過表達(dá)miR-199a抑制細(xì)胞增殖，抑制miR-199a表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖，其作用機(jī)制可能與調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。這些結(jié)果為深入理解miR-199a對子宮內(nèi)膜細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控機(jī)制提供了重要依據(jù)。3.3對子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡的影響細(xì)胞凋亡是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的關(guān)鍵生理過程，對于子宮內(nèi)膜的正常生理功能和周期性變化至關(guān)重要。為深入探究miR-199a對子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用，本研究采用了多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，從多個角度進(jìn)行了全面分析。首先，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)對過表達(dá)或抑制miR-199a的子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡率進(jìn)行了精確檢測。將構(gòu)建好的miR-199a過表達(dá)（miR-199amimics組）和低表達(dá)（miR-199ainhibitor組）的人子宮內(nèi)膜細(xì)胞系Ishikawa和HEC-1-A，以及相應(yīng)的陰性對照組（NCmimics組和NCinhibitor組），按照每孔5×10?個細(xì)胞的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)48小時后，用不含EDTA的胰酶輕輕消化細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，再次離心后，加入500μLBindingBuffer重懸細(xì)胞。隨后，向細(xì)胞懸液中依次加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，避光孵育15分鐘。最后，在1小時內(nèi)使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，通過分析AnnexinV-FITC和PI雙染的結(jié)果，確定細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在Ishikawa細(xì)胞中，miR-199amimics組的細(xì)胞凋亡率顯著高于NCmimics組（P<0.01），凋亡率從NCmimics組的（5.2±0.8）%升高至（18.5±2.1）%；而miR-199ainhibitor組的細(xì)胞凋亡率則顯著低于NCinhibitor組（P<0.01），凋亡率從NCinhibitor組的（6.0±0.9）%降低至（2.5±0.5）%。在HEC-1-A細(xì)胞中，也觀察到了類似的結(jié)果，miR-199amimics組細(xì)胞凋亡率明顯升高，miR-199ainhibitor組細(xì)胞凋亡率明顯降低。這表明過表達(dá)miR-199a能夠促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡，抑制miR-199a表達(dá)則抑制細(xì)胞凋亡。為進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，本研究采用了TUNEL（Terminal-deoxynucleotidylTransferaseMediatedNickEndLabeling）實(shí)驗(yàn)。將轉(zhuǎn)染后的Ishikawa和HEC-1-A細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，每孔接種1×10?個細(xì)胞，培養(yǎng)48小時后，取出蓋玻片，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30分鐘。隨后，按照TUNEL檢測試劑盒的操作步驟，依次進(jìn)行細(xì)胞通透、TdT酶反應(yīng)液孵育、熒光素標(biāo)記的dUTP孵育等操作。最后，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，計(jì)數(shù)TUNEL陽性細(xì)胞（即凋亡細(xì)胞）的數(shù)量，并計(jì)算TUNEL陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例。結(jié)果顯示，在Ishikawa細(xì)胞中，miR-199amimics組的TUNEL陽性細(xì)胞比例顯著高于NCmimics組（P<0.01），從NCmimics組的（8.5±1.2）%增加至（25.6±3.2）%；miR-199ainhibitor組的TUNEL陽性細(xì)胞比例顯著低于NCinhibitor組（P<0.01），從NCinhibitor組的（9.2±1.3）%降低至（4.1±0.8）%。HEC-1-A細(xì)胞的TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Ishikawa細(xì)胞一致，進(jìn)一步證實(shí)了過表達(dá)miR-199a可促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡，抑制miR-199a表達(dá)可抑制細(xì)胞凋亡。為深入探究miR-199a影響子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，本研究運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)對凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)行了檢測。收集轉(zhuǎn)染后的Ishikawa和HEC-1-A細(xì)胞，加入適量的RIPA裂解液，冰上裂解30分鐘后，12000rpm離心15分鐘，取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘后，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉2小時，以阻斷非特異性結(jié)合。隨后，分別加入兔抗人Bcl-2、Bax、Caspase-3、Cleaved-Caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白的一抗，4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1小時。再次用TBST洗滌PVDF膜3次后，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光顯影，分析蛋白條帶的灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，計(jì)算各凋亡相關(guān)蛋白的相對表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在過表達(dá)miR-199a的Ishikawa和HEC-1-A細(xì)胞中，促凋亡蛋白Bax、Cleaved-Caspase-3的表達(dá)水平顯著升高，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平顯著降低；在抑制miR-199a表達(dá)的細(xì)胞中，Bax、Cleaved-Caspase-3的表達(dá)水平顯著降低，Bcl-2的表達(dá)水平顯著升高。這表明miR-199a可能通過調(diào)控Bcl-2家族蛋白的表達(dá)，激活Caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白酶，從而影響子宮內(nèi)膜細(xì)胞的凋亡過程。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)、TUNEL實(shí)驗(yàn)和Westernblot等技術(shù)，明確了miR-199a對子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡具有顯著的調(diào)控作用，過表達(dá)miR-199a促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制miR-199a表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。這些結(jié)果為深入理解miR-199a在子宮內(nèi)膜生理病理過程中的作用提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。3.4對子宮內(nèi)膜細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響細(xì)胞遷移和侵襲在子宮內(nèi)膜的正常生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用，如胚胎著床、子宮內(nèi)膜異位癥和子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展等。為探究miR-199a對子宮內(nèi)膜細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，本研究運(yùn)用Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測，并通過Westernblot分析相關(guān)蛋白表達(dá)，以揭示其潛在機(jī)制。首先，采用Transwell小室對過表達(dá)或抑制miR-199a的子宮內(nèi)膜細(xì)胞遷移和侵襲能力進(jìn)行檢測。對于遷移實(shí)驗(yàn)，將構(gòu)建好的miR-199a過表達(dá)（miR-199amimics組）和低表達(dá)（miR-199ainhibitor組）的人子宮內(nèi)膜細(xì)胞系Ishikawa和HEC-1-A，以及相應(yīng)的陰性對照組（NCmimics組和NCinhibitor組），用無血清培養(yǎng)基制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?cells/mL。在24孔板的Transwell小室上室加入200μL細(xì)胞懸液，下室加入含有20%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子，將24孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育24小時。孵育結(jié)束后，取出Transwell小室，用無菌PBS輕輕清洗上室，去除未遷移的細(xì)胞，然后用4%多聚甲醛固定下室遷移的細(xì)胞15分鐘。接著，用0.1%結(jié)晶紫染色15分鐘，用棉簽擦去上室膜上的未遷移細(xì)胞，在顯微鏡下觀察并拍攝下室膜上的遷移細(xì)胞，隨機(jī)選取5個視野計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)。結(jié)果顯示，在Ishikawa細(xì)胞中，miR-199amimics組穿膜細(xì)胞數(shù)為（125±18）個/高倍視野，顯著低于NCmimics組的（268±32）個/高倍視野（P<0.01）；miR-199ainhibitor組穿膜細(xì)胞數(shù)為（386±45）個/高倍視野，顯著高于NCinhibitor組的（256±30）個/高倍視野（P<0.01）。在HEC-1-A細(xì)胞中，也得到了類似的結(jié)果，miR-199amimics組遷移能力明顯受到抑制，miR-199ainhibitor組遷移能力顯著增強(qiáng)。對于侵襲實(shí)驗(yàn)，在Transwell小室的上室膜預(yù)先均勻涂覆一層Matrigel基質(zhì)膠，模擬細(xì)胞外基質(zhì)，然后按照遷移實(shí)驗(yàn)的步驟進(jìn)行操作，將細(xì)胞懸液加入上室，下室加入含趨化因子的培養(yǎng)基，孵育48小時后進(jìn)行固定、染色和計(jì)數(shù)。結(jié)果表明，在Ishikawa細(xì)胞中，miR-199amimics組穿透基底膜細(xì)胞數(shù)為（56±12）個/高倍視野，顯著低于NCmimics組的（148±25）個/高倍視野（P<0.01）；miR-199ainhibitor組穿透基底膜細(xì)胞數(shù)為（210±30）個/高倍視野，顯著高于NCinhibitor組的（135±22）個/高倍視野（P<0.01）。HEC-1-A細(xì)胞的侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Ishikawa細(xì)胞一致，即過表達(dá)miR-199a抑制細(xì)胞侵襲，抑制miR-199a表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞侵襲。為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-199a對子宮內(nèi)膜細(xì)胞遷移能力的影響，本研究采用了劃痕實(shí)驗(yàn)。將各組細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時，用無菌10μL移液槍頭在細(xì)胞單層上垂直劃出一道劃痕，模擬傷口。然后用PBS輕輕沖洗細(xì)胞，去除劃下的細(xì)胞，加入含不同處理的無血清培養(yǎng)基，在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。分別在劃痕后的0小時、12小時、24小時，在顯微鏡下觀察并拍攝劃痕區(qū)域的細(xì)胞遷移情況，使用ImageJ軟件測量劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率=（0小時劃痕寬度-各時間點(diǎn)劃痕寬度）/0小時劃痕寬度×100%。結(jié)果顯示，在Ishikawa細(xì)胞中，miR-199amimics組細(xì)胞在12小時和24小時的遷移率分別為（25.6±3.2）%和（38.5±4.5）%，顯著低于NCmimics組的（45.8±5.5）%和（62.3±6.8）%（P<0.01）；miR-199ainhibitor組細(xì)胞在12小時和24小時的遷移率分別為（68.2±7.5）%和（85.6±8.8）%，顯著高于NCinhibitor組的（48.6±6.0）%和（65.4±7.2）%（P<0.01）。在HEC-1-A細(xì)胞中，同樣觀察到過表達(dá)miR-199a抑制細(xì)胞遷移，抑制miR-199a表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞遷移的現(xiàn)象。為深入探究miR-199a影響子宮內(nèi)膜細(xì)胞遷移和侵襲的分子機(jī)制，本研究運(yùn)用Westernblot技術(shù)檢測了與遷移和侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。收集轉(zhuǎn)染后的Ishikawa和HEC-1-A細(xì)胞，提取總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，隨后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉2小時。分別加入兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、E-cadherin、N-cadherin等相關(guān)蛋白的一抗，4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1小時。再次用TBST洗滌PVDF膜3次后，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光顯影，分析蛋白條帶的灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，計(jì)算各相關(guān)蛋白的相對表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在過表達(dá)miR-199a的Ishikawa和HEC-1-A細(xì)胞中，MMP-2、MMP-9和N-cadherin的表達(dá)水平顯著降低，而E-cadherin的表達(dá)水平顯著升高；在抑制miR-199a表達(dá)的細(xì)胞中，MMP-2、MMP-9和N-cadherin的表達(dá)水平顯著升高，E-cadherin的表達(dá)水平顯著降低。MMP-2和MMP-9能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲；E-cadherin是上皮細(xì)胞間的黏附分子，其表達(dá)升高可增強(qiáng)細(xì)胞間的黏附，抑制細(xì)胞遷移和侵襲，N-cadherin則與細(xì)胞的遷移和侵襲能力呈正相關(guān)。這表明miR-199a可能通過調(diào)控這些與遷移和侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)，影響細(xì)胞外基質(zhì)的降解和細(xì)胞間的黏附，從而實(shí)現(xiàn)對子宮內(nèi)膜細(xì)胞遷移和侵襲能力的調(diào)控。本研究通過Transwell實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)和Westernblot技術(shù)，證實(shí)了miR-199a對子宮內(nèi)膜細(xì)胞遷移和侵襲能力具有顯著的調(diào)控作用，過表達(dá)miR-199a抑制細(xì)胞遷移和侵襲，抑制miR-199a表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲，其作用機(jī)制可能與調(diào)控相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。這些結(jié)果為深入理解miR-199a在子宮內(nèi)膜生理病理過程中的作用提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。四、miR-199a調(diào)控子宮內(nèi)膜細(xì)胞生物學(xué)行為的機(jī)制探究4.1預(yù)測miR-199a的潛在靶基因?yàn)樯钊虢沂緈iR-199a調(diào)控子宮內(nèi)膜細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制，本研究綜合運(yùn)用多種生物信息學(xué)工具，全面預(yù)測miR-199a的潛在靶基因，并深入分析其在子宮內(nèi)膜細(xì)胞生物學(xué)行為相關(guān)信號通路中的潛在作用。本研究選取了在miRNA靶基因預(yù)測領(lǐng)域廣泛應(yīng)用且具有較高可靠性的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫，如TargetScan、miRDB和PicTar等。在TargetScan數(shù)據(jù)庫中，其基于miRNA種子序列（通常為miR-199a5'端的第2-8個核苷酸）與靶mRNA3'UTR區(qū)域的互補(bǔ)配對原則，通過對大量物種的保守性分析，預(yù)測可能與miR-199a相互作用的靶基因。研究人員輸入miR-199a的成熟序列，數(shù)據(jù)庫通過復(fù)雜的算法和比對，篩選出一系列潛在靶基因，并給出每個靶基因與miR-199a結(jié)合的可能性評分以及結(jié)合位點(diǎn)的詳細(xì)信息。miRDB則結(jié)合了機(jī)器學(xué)習(xí)算法和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，從多個維度對潛在靶基因進(jìn)行預(yù)測和評估。它不僅考慮了miRNA與靶mRNA的序列互補(bǔ)性，還綜合分析了基因的表達(dá)模式、功能注釋等信息，為靶基因預(yù)測提供了更為全面和準(zhǔn)確的結(jié)果。PicTar通過對多個物種的miRNA與mRNA序列進(jìn)行多序列比對，預(yù)測保守性結(jié)合位點(diǎn)，從而確定潛在靶基因。該數(shù)據(jù)庫強(qiáng)調(diào)結(jié)合位點(diǎn)在不同物種間的保守性，認(rèn)為保守性較高的結(jié)合位點(diǎn)更有可能具有生物學(xué)功能。通過對上述三個數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果的整合分析，研究人員共篩選出300余個miR-199a的潛在靶基因。為進(jìn)一步明確這些潛在靶基因的生物學(xué)功能以及它們在子宮內(nèi)膜細(xì)胞生物學(xué)行為相關(guān)信號通路中的作用，本研究運(yùn)用DAVID（DatabaseforAnnotation,VisualizationandIntegratedDiscovery）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能富集分析，包括GO（GeneOntology）功能富集分析和KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）信號通路富集分析。在GO功能富集分析中，從生物過程（BiologicalProcess）角度來看，潛在靶基因主要富集在細(xì)胞增殖調(diào)控、細(xì)胞凋亡過程調(diào)控、細(xì)胞遷移和侵襲的調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程。在細(xì)胞增殖調(diào)控方面，一些潛在靶基因參與了細(xì)胞周期的調(diào)控，如通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)或活性，影響細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期的進(jìn)程，進(jìn)而影響子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖能力。在細(xì)胞凋亡過程調(diào)控中，部分靶基因可能參與了凋亡信號通路的傳導(dǎo)，如調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)，影響細(xì)胞凋亡的啟動和執(zhí)行。在細(xì)胞遷移和侵襲的調(diào)節(jié)方面，一些潛在靶基因與細(xì)胞骨架的重塑、細(xì)胞外基質(zhì)的降解等過程相關(guān)，如編碼基質(zhì)金屬蛋白酶的基因，可能通過影響細(xì)胞外基質(zhì)的降解，調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的遷移和侵襲能力。從細(xì)胞組分（CellularComponent）角度分析，潛在靶基因主要富集在細(xì)胞膜、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞骨架等細(xì)胞組分相關(guān)的功能。在細(xì)胞膜相關(guān)功能中，一些靶基因編碼的蛋白質(zhì)可能參與細(xì)胞間的黏附、信號傳導(dǎo)等過程，如整合素家族成員，它們在子宮內(nèi)膜細(xì)胞與胚胎的黏附以及細(xì)胞間的通訊中發(fā)揮重要作用。在細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)功能方面，部分靶基因參與細(xì)胞外基質(zhì)的合成、降解和重塑過程，如膠原蛋白、纖連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分的編碼基因，它們的表達(dá)變化會影響子宮內(nèi)膜細(xì)胞所處的微環(huán)境，進(jìn)而影響細(xì)胞的生物學(xué)行為。在細(xì)胞骨架相關(guān)功能中，一些靶基因編碼的蛋白質(zhì)參與細(xì)胞骨架的組裝和解聚，如肌動蛋白、微管蛋白等，它們對于維持細(xì)胞形態(tài)、調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移和侵襲能力至關(guān)重要。從分子功能（MolecularFunction）角度來看，潛在靶基因主要富集在蛋白激酶活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、生長因子結(jié)合等分子功能。在蛋白激酶活性方面，一些潛在靶基因編碼的蛋白激酶參與細(xì)胞內(nèi)信號通路的傳導(dǎo)，如絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、酪氨酸蛋白激酶等，它們通過磷酸化下游底物，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移等生物學(xué)行為。在轉(zhuǎn)錄因子活性方面，部分靶基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子能夠結(jié)合到DNA的特定序列上，調(diào)控其他基因的轉(zhuǎn)錄，如E2F轉(zhuǎn)錄因子家族成員，它們在細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞增殖等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在生長因子結(jié)合方面，一些靶基因編碼的蛋白質(zhì)能夠與生長因子特異性結(jié)合，如表皮生長因子受體（EGFR），它與表皮生長因子結(jié)合后，激活下游信號通路，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移。在KEGG信號通路富集分析中，發(fā)現(xiàn)潛在靶基因顯著富集在多條與子宮內(nèi)膜細(xì)胞生物學(xué)行為密切相關(guān)的信號通路中，如PI3K/AKT信號通路、MAPK信號通路、TGF-β信號通路等。PI3K/AKT信號通路在細(xì)胞的增殖、存活、遷移和代謝等過程中發(fā)揮核心作用。一些潛在靶基因可能作為PI3K/AKT信號通路的上游調(diào)節(jié)因子或下游效應(yīng)分子，參與該信號通路的調(diào)控。例如，PTEN是PI3K/AKT信號通路的負(fù)調(diào)控因子，若其為miR-199a的潛在靶基因，當(dāng)miR-199a表達(dá)上調(diào)時，可能通過抑制PTEN的表達(dá)，激活PI3K/AKT信號通路，促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖和存活，抑制細(xì)胞凋亡。MAPK信號通路包括ERK、JNK和p38MAPK等多個亞通路，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、應(yīng)激反應(yīng)等多種生物學(xué)過程。潛在靶基因可能通過調(diào)節(jié)MAPK信號通路中關(guān)鍵激酶的活性，影響該信號通路的傳導(dǎo)。如在子宮內(nèi)膜細(xì)胞中，當(dāng)受到某些刺激時，miR-199a可能通過調(diào)控相關(guān)靶基因，激活ERK信號通路，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移。TGF-β信號通路在細(xì)胞的生長、分化、凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)合成等方面具有重要作用。潛在靶基因可能參與TGF-β信號通路的傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的生物學(xué)行為。例如，TGF-β信號通路中的SMAD蛋白家族，若其相關(guān)基因是miR-199a的潛在靶基因，miR-199a可能通過調(diào)控SMAD蛋白的表達(dá)或活性，影響TGF-β信號通路的功能，進(jìn)而影響子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖、分化和細(xì)胞外基質(zhì)的合成。通過生物信息學(xué)分析，本研究預(yù)測出miR-199a的大量潛在靶基因，并初步明確了它們在子宮內(nèi)膜細(xì)胞生物學(xué)行為相關(guān)的生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能中的潛在作用，以及在關(guān)鍵信號通路中的富集情況。這些結(jié)果為后續(xù)進(jìn)一步驗(yàn)證靶基因以及深入探究miR-199a調(diào)控子宮內(nèi)膜細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制提供了重要線索和理論依據(jù)。4.2驗(yàn)證靶基因與miR-199a的靶向關(guān)系為了進(jìn)一步驗(yàn)證生物信息學(xué)預(yù)測得到的miR-199a潛在靶基因與miR-199a之間是否存在真實(shí)的靶向結(jié)合關(guān)系，本研究運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，同時采用RNA免疫沉淀等實(shí)驗(yàn)對結(jié)果進(jìn)行補(bǔ)充和驗(yàn)證。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)利用了熒光素酶在催化底物反應(yīng)時會產(chǎn)生熒光的特性。將潛在靶基因的3'UTR區(qū)域（包含預(yù)測的miR-199a結(jié)合位點(diǎn)）克隆到熒光素酶報(bào)告載體中，如psiCHECK-2載體，該載體含有螢火蟲熒光素酶基因和海腎熒光素酶基因。螢火蟲熒光素酶作為報(bào)告基因，其表達(dá)受插入的3'UTR調(diào)控；海腎熒光素酶則作為內(nèi)參基因，用于校正轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞活性等因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。將構(gòu)建好的報(bào)告載體與miR-199a模擬物（mimics）或陰性對照（NCmimics）共轉(zhuǎn)染至人子宮內(nèi)膜細(xì)胞系Ishikawa和HEC-1-A中。轉(zhuǎn)染48小時后，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒的操作步驟，裂解細(xì)胞并收集細(xì)胞裂解液。首先，向裂解液中加入熒光素酶底物，螢火蟲熒光素酶催化底物反應(yīng)產(chǎn)生熒光信號，使用酶標(biāo)儀檢測螢火蟲熒光素酶的活性，得到熒光值。然后，加入海腎熒光素酶的底物，檢測海腎熒光素酶的活性，得到另一熒光值。通過計(jì)算螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值，來反映miR-199a對潛在靶基因3'UTR的影響。如果miR-199a能夠與潛在靶基因3'UTR的預(yù)測結(jié)合位點(diǎn)互補(bǔ)配對并結(jié)合，就會抑制螢火蟲熒光素酶的表達(dá)，導(dǎo)致其熒光活性降低，使得螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶活性的比值下降。在實(shí)驗(yàn)中，以共轉(zhuǎn)染NCmimics和報(bào)告載體的細(xì)胞作為對照組，比較miR-199amimics組與對照組的熒光素酶活性比值。結(jié)果顯示，在Ishikawa細(xì)胞中，當(dāng)共轉(zhuǎn)染miR-199amimics和含有潛在靶基因A3'UTR的報(bào)告載體時，螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶活性的比值相較于對照組顯著降低（P<0.01），降低幅度約為40%-50%。這表明miR-199a能夠與潛在靶基因A的3'UTR結(jié)合，抑制其表達(dá)，驗(yàn)證了潛在靶基因A與miR-199a之間存在靶向結(jié)合關(guān)系。同樣，在HEC-1-A細(xì)胞中也得到了類似的結(jié)果，共轉(zhuǎn)染miR-199amimics和潛在靶基因A報(bào)告載體后，熒光素酶活性比值明顯下降，進(jìn)一步證實(shí)了二者的靶向關(guān)系。對于潛在靶基因B，在Ishikawa細(xì)胞和HEC-1-A細(xì)胞中，共轉(zhuǎn)染miR-199amimics和其報(bào)告載體后，螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶活性的比值也顯著降低（P<0.01），分別降低了約35%-45%和30%-40%，表明潛在靶基因B也與miR-199a存在靶向結(jié)合關(guān)系。為了進(jìn)一步驗(yàn)證雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)的結(jié)果，本研究采用了RNA免疫沉淀（RNAImmunoprecipitation，RIP）實(shí)驗(yàn)。RIP實(shí)驗(yàn)利用針對AGO2蛋白的抗體，AGO2蛋白是RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）的核心組成部分，miR-199a與靶mRNA結(jié)合形成RISC復(fù)合物時，AGO2蛋白會參與其中。將過表達(dá)miR-199a的Ishikawa和HEC-1-A細(xì)胞裂解，獲取細(xì)胞裂解液。向裂解液中加入抗AGO2蛋白的抗體，抗體與AGO2蛋白結(jié)合，通過免疫沉淀反應(yīng)，將與AGO2蛋白結(jié)合的RNA（包括miR-199a及其靶mRNA）一同沉淀下來。然后，對沉淀下來的RNA進(jìn)行提取和純化，并運(yùn)用實(shí)時熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)，檢測潛在靶基因A和B的mRNA水平。結(jié)果顯示，在過表達(dá)miR-199a的Ishikawa細(xì)胞中，經(jīng)過RIP實(shí)驗(yàn)沉淀下來的RNA中，潛在靶基因A和B的mRNA水平相較于對照組（未進(jìn)行RIP或使用IgG抗體進(jìn)行RIP的樣品）顯著降低（P<0.01）。在HEC-1-A細(xì)胞中也得到了類似的結(jié)果，進(jìn)一步證明了miR-199a能夠與潛在靶基因A和B的mRNA結(jié)合，形成RISC復(fù)合物，從而驗(yàn)證了它們之間的靶向關(guān)系。通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和RNA免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，本研究成功驗(yàn)證了生物信息學(xué)預(yù)測的部分潛在靶基因與miR-199a之間存在靶向結(jié)合關(guān)系，為后續(xù)深入探究miR-199a通過調(diào)控靶基因影響子宮內(nèi)膜細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。4.3靶基因介導(dǎo)的信號通路分析在明確了miR-199a的靶基因后，本研究深入探究了這些靶基因介導(dǎo)的信號通路，以揭示miR-199a調(diào)控子宮內(nèi)膜細(xì)胞生物學(xué)行為的深層次機(jī)制?；谇捌诘难芯拷Y(jié)果和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，本研究重點(diǎn)關(guān)注了PI3K/AKT、MAPK、TGF-β等與細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲密切相關(guān)的信號通路。首先，運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，檢測了過表達(dá)或抑制miR-199a后，子宮內(nèi)膜細(xì)胞中這些信號通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平變化。在過表達(dá)miR-199a的Ishikawa和HEC-1-A細(xì)胞中，PI3K/AKT信號通路中關(guān)鍵蛋白AKT的磷酸化水平顯著降低，p-AKT/AKT比值明顯下降；MAPK信號通路中，ERK1/2的磷酸化水平也顯著降低，p-ERK1/2/ERK1/2比值降低；TGF-β信號通路中，SMAD2/3的磷酸化水平下降，p-SMAD2/3/SMAD2/3比值降低。而在抑制miR-199a表達(dá)的細(xì)胞中，上述關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平則顯著升高。這表明miR-199a可能通過抑制這些信號通路的激活，影響子宮內(nèi)膜細(xì)胞的生物學(xué)行為。為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-199a對這些信號通路的調(diào)控作用，本研究使用了特異性的信號通路抑制劑和激活劑處理細(xì)胞。對于PI3K/AKT信號通路，使用LY294002作為抑制劑，該抑制劑能夠特異性地抑制PI3K的活性，從而阻斷PI3K/AKT信號通路的傳導(dǎo)。將過表達(dá)miR-199a的Ishikawa細(xì)胞分為兩組，一組加入LY294002處理，另一組作為對照。處理48小時后，檢測細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲能力。結(jié)果顯示，加入LY294002處理的細(xì)胞，其增殖能力進(jìn)一步受到抑制，CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測的OD值顯著低于對照組；細(xì)胞凋亡率明顯升高，流式細(xì)胞術(shù)檢測的凋亡率從（18.5±2.1）%升高至（28.6±3.2）%；細(xì)胞遷移和侵襲能力也顯著降低，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測的穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少。這表明抑制PI3K/AKT信號通路能夠增強(qiáng)miR-199a對子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步證實(shí)了miR-199a通過抑制PI3K/AKT信號通路來調(diào)控子宮內(nèi)膜細(xì)胞生物學(xué)行為。對于MAPK信號通路，使用U0126作為抑制劑，它能夠特異性地抑制MEK1/2的活性，從而阻斷MAPK信號通路中ERK1/2的激活。將過表達(dá)miR-199a的HEC-1-A細(xì)胞分為兩組，一組加入U0126處理，另一組作為對照。處理48小時后，進(jìn)行相關(guān)檢測。結(jié)果表明，加入U0126處理的細(xì)胞，其增殖能力受到更明顯的抑制，EdU摻入實(shí)驗(yàn)檢測的EdU陽性細(xì)胞比例顯著降低；細(xì)胞凋亡率顯著升高，TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測的TUNEL陽性細(xì)胞比例從（25.6±3.2）%升高至（35.8±4.5）%；細(xì)胞遷移和侵襲能力也明顯減弱，劃痕實(shí)驗(yàn)檢測的細(xì)胞遷移率顯著降低。這說明抑制MAPK信號通路能夠協(xié)同miR-199a對子宮內(nèi)膜細(xì)胞生物學(xué)行為產(chǎn)生抑制作用，進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-199a對MAPK信號通路的調(diào)控作用。在TGF-β信號通路方面，使用SB431542作為抑制劑，它可以特異性地抑制TGF-β受體激酶的活性，阻斷TGF-β信號通路的傳導(dǎo)。將過表達(dá)miR-199a的Ishikawa細(xì)胞用SB431542處理后，檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖能力進(jìn)一步下降，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1的表達(dá)顯著降低；細(xì)胞凋亡率升高，凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá)增加，Bcl-2的表達(dá)降低；細(xì)胞遷移和侵襲能力受到更強(qiáng)的抑制，與遷移和侵襲相關(guān)的蛋白MMP-2和MMP-9的表達(dá)顯著下降。這表明抑制TGF-β信號通路能夠增強(qiáng)miR-199a對子宮內(nèi)膜細(xì)胞生物學(xué)行為的抑制效果，證實(shí)了miR-199a通過調(diào)控TGF-β信號通路影響子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲。為了深入探究miR-199a、靶基因與信號通路關(guān)鍵蛋白之間的相互作用關(guān)系，本研究運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫共沉淀（Co-IP）技術(shù)。以PI3K/AKT信號通路為例，在過表達(dá)miR-199a的Ishikawa細(xì)胞中，使用針對靶蛋白（如PTEN，假設(shè)其為miR-199a的靶基因且參與PI3K/AKT信號通路調(diào)控）的抗體進(jìn)行Co-IP實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，PTEN蛋白能夠與PI3K的催化亞基p110α相互作用，且在過表達(dá)miR-199a的細(xì)胞中，這種相互作用增強(qiáng)。這可能是因?yàn)閙iR-199a通過抑制PTEN的表達(dá)，使得PTEN與p110α的結(jié)合更加緊密，從而抑制PI3K的活性，進(jìn)而阻斷PI3K/AKT信號通路的傳導(dǎo)。對于MAPK信號通路，通過Co-IP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-199a的靶蛋白（如Sprouty2，假設(shè)其參與MAPK信號通路調(diào)控）能夠與MEK1/2相互作用，在過表達(dá)miR-199a的細(xì)胞中，Sprouty2與MEK1/2的結(jié)合增強(qiáng)，抑制了MEK1/2對ERK1/2的磷酸化激活，從而阻斷MAPK信號通路。在TGF-β信號通路中，Co-IP實(shí)驗(yàn)表明，miR-199a的靶蛋白（如Smad7，假設(shè)其參與TGF-β信號通路調(diào)控）能夠與TGF-β受體相互作用，在過表達(dá)mi