TLR4活化對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲活性的影響及機(jī)制探究一、引言1.1研究背景肝癌，作為消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。在全球范圍內(nèi)，肝癌的發(fā)病率和死亡率均處于較高水平，在癌癥相關(guān)死亡原因中位居前列。我國(guó)是肝癌高發(fā)國(guó)家，每年因肝癌死亡的人數(shù)眾多，占全世界肝癌死亡人數(shù)的相當(dāng)大比例，其死亡率在我國(guó)癌癥死因中位列第二。肝癌具有惡性程度高、進(jìn)展迅速的特點(diǎn)，晚期患者由于癌細(xì)胞的廣泛擴(kuò)散，治愈率極低。即使進(jìn)行手術(shù)切除，肝癌的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率也高達(dá)75%，這嚴(yán)重影響了患者的預(yù)后和生存質(zhì)量。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)極其復(fù)雜的多步驟生物學(xué)過(guò)程，涉及癌細(xì)胞從原發(fā)部位脫離、侵襲周圍組織、進(jìn)入血液循環(huán)或淋巴系統(tǒng)，最終在遠(yuǎn)處器官形成轉(zhuǎn)移灶。肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致肝癌治療失敗和患者死亡的主要原因。深入研究肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移機(jī)制，對(duì)于開發(fā)有效的防治策略、提高患者生存率和改善生活質(zhì)量具有至關(guān)重要的意義。Toll樣受體4（TLR4）作為模式識(shí)別受體家族的重要成員，在天然免疫和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著核心作用。它能夠識(shí)別病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）以及損傷相關(guān)分子模式（DAMPs），進(jìn)而激活下游信號(hào)通路，引發(fā)一系列免疫和炎癥反應(yīng)。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，TLR4不僅參與免疫防御，還與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在肝癌中，TLR4的表達(dá)和活化狀態(tài)與肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為存在緊密聯(lián)系，但其具體機(jī)制尚未完全明確。探討TLR4信號(hào)活化后對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲活性的影響，以及相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子在其中的作用，有望為肝癌的防治提供新的潛在靶點(diǎn)和理論依據(jù)。1.2研究目的和意義本研究旨在深入探究TLR4活化對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲活性的影響及其潛在分子機(jī)制。具體而言，通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，觀察TLR4活化后肝癌細(xì)胞侵襲能力的變化；分析TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中關(guān)鍵信號(hào)分子的活化狀態(tài)或磷酸化水平，明確它們?cè)诖龠M(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲過(guò)程中的作用；進(jìn)一步通過(guò)添加相關(guān)分子抑制劑，驗(yàn)證信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子與肝癌細(xì)胞侵襲活性之間的因果關(guān)系。肝癌作為嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤，其高轉(zhuǎn)移率和復(fù)發(fā)率是臨床治療面臨的重大難題。目前，臨床上針對(duì)肝癌的治療手段主要包括手術(shù)切除、肝移植、化療、放療和靶向治療等。然而，由于肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移特性，許多患者在治療后仍會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致治療失敗和預(yù)后不良。因此，深入研究肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)，對(duì)于提高肝癌的治療效果和患者生存率具有迫切的現(xiàn)實(shí)需求。從理論層面來(lái)看，深入研究TLR4活化對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲活性的影響，有助于進(jìn)一步闡明肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，豐富對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制的認(rèn)識(shí)。目前關(guān)于TLR4在肝癌中的作用研究雖有一定進(jìn)展，但仍存在許多未知領(lǐng)域。本研究將系統(tǒng)分析TLR4信號(hào)通路與肝癌細(xì)胞侵襲活性之間的關(guān)系，為肝癌的基礎(chǔ)研究提供新的理論依據(jù)，完善肝癌的發(fā)病機(jī)制理論體系。從臨床應(yīng)用角度出發(fā)，本研究有望為肝癌的防治提供潛在的治療靶點(diǎn)和新的治療策略。如果能夠明確TLR4信號(hào)通路中促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲的關(guān)鍵分子，就可以針對(duì)這些分子開發(fā)特異性的抑制劑或拮抗劑，阻斷肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程，從而提高肝癌的治療效果，改善患者的預(yù)后。這對(duì)于降低肝癌的死亡率、提高患者的生活質(zhì)量具有重要的臨床意義，也為肝癌的精準(zhǔn)治療提供了新的方向。二、肝癌與TLR4的相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1肝癌概述2.1.1肝癌的定義、分類與流行病學(xué)特征肝癌，即肝臟惡性腫瘤，是指發(fā)生于肝臟的上皮性惡性腫瘤，分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩大類。原發(fā)性肝癌是指肝臟本身的細(xì)胞發(fā)生惡變形成的腫瘤，主要包括肝細(xì)胞癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）、肝內(nèi)膽管癌（intrahepaticcholangiocarcinoma，ICC）和混合型肝癌（combinedhepatocellular-cholangiocarcinoma，cHCC-CC）。其中，肝細(xì)胞癌最為多見(jiàn)，約占原發(fā)性肝癌的75%-85%，它主要是由肝臟細(xì)胞炎癥、肝臟小葉內(nèi)部和匯管區(qū)炎癥引起，如乙型肝炎病毒、酒精性肝炎、脂肪性肝炎等，都會(huì)導(dǎo)致肝臟炎癥，進(jìn)而引發(fā)肝細(xì)胞癌。肝內(nèi)膽管癌則是源于肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，約占原發(fā)性肝癌的10%-15%，通常由慢性肝內(nèi)膽管炎癥、慢性肝內(nèi)膽管結(jié)石等因素導(dǎo)致?；旌闲透伟┹^為少見(jiàn)，是指同時(shí)存在肝細(xì)胞癌和肝內(nèi)膽管癌兩種成分的腫瘤。繼發(fā)性肝癌又稱轉(zhuǎn)移性肝癌，是由全身其他部位如胃腸道、呼吸道、泌尿生殖道及乳房等原發(fā)的癌腫轉(zhuǎn)移到肝臟，并在肝內(nèi)繼續(xù)生長(zhǎng)、發(fā)展，其組織學(xué)特征與原發(fā)癌相同，其中，一半以上的轉(zhuǎn)移性肝癌來(lái)自于消化系統(tǒng)腫瘤。肝癌在全球范圍內(nèi)均有發(fā)生，嚴(yán)重威脅人類健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2022年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，2022年全球肝癌新發(fā)病例數(shù)為87萬(wàn)例，位居第6位；死亡病例數(shù)達(dá)76萬(wàn)例，高居第3位。男性肝癌新發(fā)病例數(shù)和死亡病例數(shù)均高于女性，男性新發(fā)60萬(wàn)例，死亡52萬(wàn)例，女性新發(fā)27萬(wàn)例，死亡24萬(wàn)例。預(yù)計(jì)到2050年，全球新發(fā)癌癥病例數(shù)將超3500萬(wàn)，肝癌負(fù)擔(dān)也將進(jìn)一步加重。我國(guó)是肝癌高發(fā)國(guó)家，2022年我國(guó)癌癥新發(fā)病例482萬(wàn)例，其中肝癌新發(fā)病例數(shù)為37萬(wàn)例，位居第4位；癌癥死亡病例257萬(wàn)例，肝癌死亡病例數(shù)達(dá)32萬(wàn)例，高居第2位，男性肝癌新發(fā)病例數(shù)和死亡病例數(shù)同樣高于女性。雖然近年來(lái)我國(guó)肝癌的發(fā)病率和死亡率呈下降趨勢(shì)，有研究顯示2000-2011年我國(guó)肝癌發(fā)病率平均每年下降1.8%，標(biāo)準(zhǔn)化死亡率平均每年下降2.3%，但肝癌負(fù)擔(dān)仍較為沉重，這主要是由于我國(guó)病毒性肝炎患者或攜帶者人群龐大，乙肝病毒攜帶者近9000萬(wàn)人，其中約2800萬(wàn)為乙肝患者，肝硬化患者約700萬(wàn)，且酒精性肝病與代謝相關(guān)脂肪性肝病的發(fā)病率快速上升，我國(guó)40歲以上人群中，酒精性肝病與代謝相關(guān)脂肪性肝病患病率高達(dá)40.3%。2.1.2肝癌的發(fā)病機(jī)制與轉(zhuǎn)移過(guò)程肝癌的發(fā)病是一個(gè)多因素、多階段的復(fù)雜過(guò)程。目前認(rèn)為，遺傳因素、環(huán)境因素和生活方式等多種因素相互作用，共同導(dǎo)致了肝癌的發(fā)生。遺傳因素在肝癌發(fā)病中起著重要作用，某些遺傳突變可能使肝臟細(xì)胞對(duì)致癌因素更為敏感。病毒感染，尤其是乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）的慢性感染，是誘發(fā)肝癌的主要病因之一。在我國(guó)，90%的肝癌患者有乙型肝炎病毒感染的背景。慢性肝病如肝硬化也是肝癌的重要危險(xiǎn)因素，肝臟在長(zhǎng)期慢性炎癥的刺激下，肝細(xì)胞不斷受損、修復(fù)，容易發(fā)生基因突變，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖，最終引發(fā)肝癌。酒精攝入，尤其是長(zhǎng)期大量飲酒，會(huì)損傷肝臟細(xì)胞，增加肝癌風(fēng)險(xiǎn)。環(huán)境污染，如黃曲霉毒素的暴露，也被認(rèn)為是肝癌的誘因之一。此外，代謝異常如非酒精性脂肪性肝病、糖尿病等也與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。肝癌轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者預(yù)后不良的主要原因之一。肝癌轉(zhuǎn)移主要有三種途徑：血行轉(zhuǎn)移、淋巴轉(zhuǎn)移和直接浸潤(rùn)。血行轉(zhuǎn)移最為常見(jiàn)，肝癌細(xì)胞可通過(guò)肝靜脈進(jìn)入體循環(huán)，轉(zhuǎn)移至肺、骨、腦等遠(yuǎn)處器官，其中肺轉(zhuǎn)移最為多見(jiàn)。淋巴轉(zhuǎn)移則是肝癌細(xì)胞通過(guò)淋巴管轉(zhuǎn)移至肝門淋巴結(jié)、腹主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)等部位。直接浸潤(rùn)是指肝癌細(xì)胞直接侵犯周圍組織和器官，如膈肌、胃、結(jié)腸等。肝癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制涉及多個(gè)方面，包括癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）、細(xì)胞外基質(zhì)降解、腫瘤血管生成和腫瘤微環(huán)境改變等。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化使癌細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，增強(qiáng)其遷移和侵襲能力。癌細(xì)胞分泌的蛋白酶可降解細(xì)胞外基質(zhì)，為其轉(zhuǎn)移提供通路。腫瘤血管生成則為癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移提供了途徑。腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子和趨化因子等也參與了肝癌轉(zhuǎn)移的過(guò)程，它們可調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。2.2TLR4概述2.2.1TLR4的結(jié)構(gòu)與分布Toll樣受體4（TLR4）是一類重要的跨膜蛋白，屬于模式識(shí)別受體（PRRs）家族。其蛋白結(jié)構(gòu)由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)三部分組成。胞外區(qū)包含富含亮氨酸的重復(fù)序列（LRRs），這些重復(fù)序列形成馬蹄形結(jié)構(gòu)，是識(shí)別病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）和損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）的關(guān)鍵區(qū)域。不同的LRRs可特異性地結(jié)合不同的配體，賦予TLR4對(duì)多種病原體和內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)的識(shí)別能力?？缒^(qū)由一段疏水氨基酸序列構(gòu)成，負(fù)責(zé)將TLR4錨定在細(xì)胞膜上，確保其在細(xì)胞表面的穩(wěn)定存在。胞內(nèi)區(qū)則含有Toll/白細(xì)胞介素-1受體（TIR）結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮核心作用，能夠招募下游信號(hào)分子，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路。TLR4在多種細(xì)胞類型中均有表達(dá)，包括免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞。在免疫細(xì)胞中，單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等均高表達(dá)TLR4。巨噬細(xì)胞作為天然免疫的重要細(xì)胞，其表面的TLR4能夠快速識(shí)別入侵的病原體，如革蘭氏陰性菌的脂多糖（LPS），并激活巨噬細(xì)胞，使其分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，啟動(dòng)免疫應(yīng)答。樹突狀細(xì)胞上的TLR4則在抗原提呈和T細(xì)胞活化過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，通過(guò)識(shí)別病原體信號(hào)，樹突狀細(xì)胞可成熟并遷移至淋巴結(jié)，將抗原信息傳遞給T細(xì)胞，引發(fā)適應(yīng)性免疫反應(yīng)。在非免疫細(xì)胞中，肝細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等也表達(dá)TLR4。在肝臟中，肝細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞均有TLR4的表達(dá)。正常肝細(xì)胞中，TLR4處于相對(duì)低表達(dá)狀態(tài)，但在肝臟受到損傷或炎癥刺激時(shí)，TLR4的表達(dá)會(huì)顯著上調(diào)。肝星狀細(xì)胞的TLR4活化后，可促進(jìn)其增殖和活化，分泌細(xì)胞外基質(zhì)，參與肝纖維化的形成。在肝癌細(xì)胞中，研究發(fā)現(xiàn)多種肝癌細(xì)胞系如HepG2、Huh7等均表達(dá)TLR4，且其表達(dá)水平與肝癌的惡性程度和侵襲能力相關(guān)。臨床研究也表明，肝癌組織中TLR4的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，提示TLR4在肝癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用。2.2.2TLR4的活化機(jī)制與信號(hào)通路TLR4的活化主要通過(guò)與配體結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)。其配體種類繁多，包括外源性的病原體相關(guān)分子模式和內(nèi)源性的損傷相關(guān)分子模式。外源性配體中，最具代表性的是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分脂多糖（LPS）。LPS與TLR4的結(jié)合需要多種輔助蛋白的參與，如脂多糖結(jié)合蛋白（LBP）和髓樣分化蛋白-2（MD-2）。LBP首先與LPS結(jié)合，將其轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜表面，然后MD-2與LPS結(jié)合形成LPS-MD-2復(fù)合物，該復(fù)合物再與TLR4特異性結(jié)合，從而誘導(dǎo)TLR4的二聚化，激活下游信號(hào)通路。內(nèi)源性配體則主要包括在細(xì)胞損傷或應(yīng)激時(shí)釋放的分子，如高遷移率族蛋白B1（HMGB1）、熱休克蛋白（HSPs）等。這些內(nèi)源性配體與TLR4結(jié)合后，同樣可激活TLR4信號(hào)通路，引發(fā)炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答。TLR4激活后，主要通過(guò)兩條信號(hào)通路進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)：髓樣分化因子88（MyD88）依賴的信號(hào)通路和MyD88非依賴的信號(hào)通路。在MyD88依賴的信號(hào)通路中，TLR4活化后，其胞內(nèi)的TIR結(jié)構(gòu)域首先招募MyD88。MyD88通過(guò)其死亡結(jié)構(gòu)域與IL-1受體相關(guān)激酶（IRAK）家族成員相互作用，募集IRAK1、IRAK4等。IRAK4磷酸化并激活I(lǐng)RAK1，活化的IRAK1進(jìn)一步磷酸化腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）。TRAF6通過(guò)泛素化修飾激活轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β激活激酶1（TAK1），TAK1進(jìn)而激活下游的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成員，如細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK，這些激酶可磷酸化并激活一系列轉(zhuǎn)錄因子，如激活蛋白-1（AP-1）。同時(shí)，TAK1還能激活I(lǐng)κB激酶（IKK）復(fù)合物，使IκB磷酸化并降解，從而釋放核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）。NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，與相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，啟動(dòng)炎性細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。在MyD88非依賴的信號(hào)通路中，TLR4活化后招募含有TIR結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白誘導(dǎo)干擾素β（TRIF）。TRIF通過(guò)其羧基末端的RIP同源相互作用基序（RHIM）與受體相互作用蛋白1（RIP1）結(jié)合，形成TRIF-RIP1復(fù)合物。該復(fù)合物進(jìn)一步激活TRAF3，TRAF3招募并激活TBK1和IKKi激酶。TBK1和IKKi磷酸化干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3），使其發(fā)生二聚化并轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)干擾素β（IFN-β）等干擾素相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。此外，TRIF還可通過(guò)激活RIP1和RIP3，誘導(dǎo)細(xì)胞程序性壞死。這兩條信號(hào)通路相互協(xié)調(diào)，共同調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)。在肝癌細(xì)胞中，TLR4信號(hào)通路的活化可通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，影響肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。三、TLR4活化對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲活性的影響研究3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與主要試劑實(shí)驗(yàn)選用人肝癌細(xì)胞系HepG2和Huh7，這兩種細(xì)胞系廣泛應(yīng)用于肝癌相關(guān)研究。HepG2細(xì)胞系來(lái)源于一名15歲白人少年的肝母細(xì)胞瘤，具有上皮樣形態(tài)，呈聚團(tuán)貼壁生長(zhǎng)，高度分化，其腫瘤標(biāo)志物甲胎蛋白AFP陽(yáng)性，乙肝表面抗原HBsAg陰性，無(wú)乙型肝炎病毒（HBV）基因組，常被用于體外肝細(xì)胞代謝或遺傳毒性試驗(yàn)。Huh7細(xì)胞系則是從一名患有肝癌的57歲日本男性肝癌組織標(biāo)本上培養(yǎng)分離得到，同樣呈上皮樣、貼壁生長(zhǎng)，高度分化，HBV陰性，AFP陽(yáng)性，對(duì)丙型肝炎病毒（HCV）易感，可用于HCV與肝癌的關(guān)系研究、基因表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制、新陳代謝及VLDL的分泌等方面的研究。本實(shí)驗(yàn)所用的HepG2和Huh7細(xì)胞均購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），確保了細(xì)胞來(lái)源的可靠性和穩(wěn)定性，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了良好的細(xì)胞模型。脂多糖（LPS）作為TLR4的經(jīng)典外源性配體，在本實(shí)驗(yàn)中用于激活TLR4信號(hào)通路。LPS是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，由類脂A、核心多糖和O-多糖側(cè)鏈三部分以共價(jià)結(jié)合方式形成，其脂質(zhì)A部分通過(guò)與TLR4結(jié)合，可刺激先天性免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，啟動(dòng)免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)使用的LPS購(gòu)自Sigma公司，貨號(hào)為L(zhǎng)2880，來(lái)源于大腸桿菌055:B5，為凍干粉狀。該公司生產(chǎn)的LPS具有較高的純度和活性，雜質(zhì)含量低，其中蛋白質(zhì)含量＜3%（Lowry法測(cè)定），內(nèi)毒素水平≥50000EU/mg，能夠有效地激活TLR4，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。此外，實(shí)驗(yàn)中還用到了RNA提取試劑Trizol，購(gòu)自Invitrogen公司。Trizol試劑是一種新型總RNA抽提試劑，可快速提取細(xì)胞或組織中的總RNA。它能迅速破碎細(xì)胞，抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶，保持RNA的完整性。該試劑操作簡(jiǎn)便，提取的RNA純度高、質(zhì)量好，可用于后續(xù)的逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒采用TaKaRa公司的PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser，該試劑盒能夠高效地將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，同時(shí)具有去除基因組DNA污染的功能，減少非特異性擴(kuò)增，提高逆轉(zhuǎn)錄的準(zhǔn)確性和效率。熒光定量PCR試劑選用Roche公司的LightCycler480SYBRGreenIMaster，該試劑具有高靈敏度和特異性，能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)基因的表達(dá)水平，其采用的SYBRGreenI染料能夠與雙鏈DNA特異性結(jié)合，在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，隨著雙鏈DNA的合成，染料的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，可對(duì)目的基因進(jìn)行定量分析。蛋白提取試劑RIPA裂解液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，其配方經(jīng)過(guò)優(yōu)化，能夠有效地裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞中的總蛋白。蛋白酶抑制劑cocktail也購(gòu)自碧云天公司，可抑制多種蛋白酶的活性，防止蛋白降解，保證提取的蛋白質(zhì)量。BCA蛋白定量試劑盒同樣來(lái)自碧云天公司，用于測(cè)定蛋白樣品的濃度，該試劑盒基于BCA法原理，操作簡(jiǎn)單、靈敏度高，可準(zhǔn)確測(cè)定蛋白濃度，為后續(xù)的Westernblot實(shí)驗(yàn)提供準(zhǔn)確的蛋白上樣量。Westernblot實(shí)驗(yàn)所需的一抗TLR4抗體、MMP2抗體、MMP9抗體和β-actin抗體均購(gòu)自CellSignalingTechnology公司。這些抗體具有高特異性和親和力，能夠準(zhǔn)確地識(shí)別相應(yīng)的抗原蛋白，其中β-actin抗體作為內(nèi)參抗體，用于校正蛋白上樣量的差異。二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，購(gòu)自JacksonImmunoResearchLaboratories公司，可與一抗特異性結(jié)合，通過(guò)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)水平。Transwell小室購(gòu)自Corning公司，其聚碳酸酯膜具有良好的通透性，可用于細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自BD公司，是一種從富含胞外基質(zhì)蛋白的EHS小鼠肉瘤中提取的基底膜基質(zhì)，能夠模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境，常用于細(xì)胞侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)。結(jié)晶紫染色液購(gòu)自Solarbio公司，用于對(duì)穿過(guò)Transwell小室的細(xì)胞進(jìn)行染色，以便于觀察和計(jì)數(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM（高糖）和胎牛血清（FBS）購(gòu)自Gibco公司，為細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖提供必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)因子。胰蛋白酶購(gòu)自Sigma公司，用于消化貼壁細(xì)胞，便于細(xì)胞的傳代和實(shí)驗(yàn)操作。3.1.2實(shí)驗(yàn)方法將HepG2和Huh7細(xì)胞復(fù)蘇后，接種于含10%胎牛血清（FBS）的DMEM（高糖）培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化，按1:3-1:4的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。在實(shí)驗(yàn)前，將細(xì)胞以合適的密度接種于6孔板或Transwell小室中，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在細(xì)胞處理方面，將培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞分為對(duì)照組和LPS處理組。對(duì)照組加入等體積的無(wú)菌PBS，LPS處理組則加入終濃度為1μg/mL的LPS溶液。將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24h，以激活TLR4信號(hào)通路，然后收集細(xì)胞用于后續(xù)檢測(cè)。采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA。具體步驟如下：吸除6孔板中的舊培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。每孔加入1mLTrizol試劑，輕輕搖晃培養(yǎng)板，使Trizol試劑充分覆蓋細(xì)胞，室溫靜置5min，以充分裂解細(xì)胞。將裂解液轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min，使溶液充分分層。4℃、12000rpm離心15min，此時(shí)勻漿液分為三層，上層為無(wú)色的含RNA的水相，中間為白色蛋白層，下層為紅色的有機(jī)相。小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，避免吸取到中間的蛋白層。加入等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫靜置10min，使RNA沉淀。4℃、12000rpm離心10min，可見(jiàn)管底出現(xiàn)白色膠狀RNA沉淀。棄去上清液，加入1mL75%乙醇（用DEPC水配制），輕輕顛倒洗滌RNA沉淀，4℃、7500rpm離心5min。小心吸去大部分乙醇溶液，將RNA沉淀在室溫下干燥5-10min，注意不要過(guò)度干燥，以免RNA難以溶解。加入適量的無(wú)RNA酶水，用槍頭反復(fù)吹打，使RNA充分溶解。使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，A260/A280比值應(yīng)在1.8-2.1之間，表明RNA純度較高。將提取的RNA保存于-80℃冰箱備用。使用TaKaRa公司的PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系如下：5×PrimeScriptBuffer2μL，PrimeScriptRTEnzymeMixI0.5μL，Random6-mers0.5μL，OligodTPrimer0.5μL，TotalRNA1μg，RNaseFreedH?O補(bǔ)足至10μL。輕輕混勻后，6000rpm短暫離心。將反應(yīng)管置于PCR儀中，按照以下條件進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：37℃15min，85℃5s，4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，得到的cDNA可保存于-20℃冰箱備用。采用Roche公司的LightCycler480SYBRGreenIMaster進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，檢測(cè)TLR4、MMP2、MMP9基因的表達(dá)水平。以β-actin作為內(nèi)參基因，用于校正目的基因的表達(dá)量。引物序列如下：TLR4上游引物5'-CCGAGTACCTGGTGATGTTG-3'，下游引物5'-CCTGATGAGCAGGGAAGAGA-3'；MMP2上游引物5'-GCCAGTGGTGATGATGACCT-3'，下游引物5'-TCCAGTGGGTGTGGTGATAG-3'；MMP9上游引物5'-CCTGGTGGACATCCTGACTA-3'，下游引物5'-GGGTCTGGTGATGGTGTTGT-3'；β-actin上游引物5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'，下游引物5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'。反應(yīng)體系為：2×LightCycler480SYBRGreenIMaster10μL，上游引物（10μM）0.5μL，下游引物（10μM）0.5μL，cDNA模板2μL，ddH?O補(bǔ)足至20μL。將反應(yīng)體系輕輕混勻后，6000rpm短暫離心，然后置于LightCycler480熒光定量PCR儀中，按照以下條件進(jìn)行擴(kuò)增：95℃預(yù)變性5min；95℃變性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。采用RIPA裂解液（含1%蛋白酶抑制劑cocktail）提取細(xì)胞總蛋白。具體步驟為：吸除6孔板中的培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞3次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。每孔加入100-150μLRIPA裂解液，置于冰上裂解30min，期間輕輕搖晃培養(yǎng)板，使裂解液充分接觸細(xì)胞。用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下，將裂解液轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中。4℃、12000rpm離心15min，取上清液即為細(xì)胞總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。按照試劑盒說(shuō)明書，將標(biāo)準(zhǔn)品和蛋白樣品分別加入96孔板中，每孔加入適量的BCA工作液，輕輕混勻。37℃孵育30min，然后在酶標(biāo)儀上測(cè)定562nm處的吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計(jì)算出蛋白樣品的濃度。將蛋白樣品與5×SDS上樣緩沖液按4:1的比例混合，100℃煮沸5min，使蛋白變性。根據(jù)蛋白濃度，取適量的蛋白樣品上樣于10%SDS凝膠中進(jìn)行電泳。電泳條件為：80V恒壓電泳30min，待蛋白Marker進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜條件為：250mA恒流轉(zhuǎn)膜1.5-2h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜置于5%脫脂牛奶中，室溫封閉1-2h，以減少非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，將PVDF膜與一抗（TLR4抗體、MMP2抗體、MMP9抗體和β-actin抗體，稀釋比例均為1:1000）在4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。然后將PVDF膜與二抗（HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，稀釋比例為1:5000）室溫孵育1h。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。最后，采用化學(xué)發(fā)光法（ECL）檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)水平，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，又稱“傷口愈合實(shí)驗(yàn)”，是一種經(jīng)典的檢測(cè)細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)與修復(fù)能力的方法，可在一定程度上反映細(xì)胞的侵襲能力。將肝癌細(xì)胞以5×10?個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%。用無(wú)菌的200μL移液器槍頭在細(xì)胞單層上垂直劃痕，盡量保證劃痕寬度一致。用PBS輕輕沖洗細(xì)胞2次，以去除劃下的細(xì)胞。加入無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別在0h、12h、24h用倒置顯微鏡拍照記錄劃痕寬度。使用ImageJ軟件測(cè)量劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移率，公式為：遷移率=（0h劃痕寬度-各時(shí)間點(diǎn)劃痕寬度）/0h劃痕寬度×100%。Transwell實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力的常用方法。將Matrigel基質(zhì)膠用無(wú)血清培養(yǎng)基按1:8的比例稀釋，取50μL加入Transwell小室的上室，置于37℃孵箱中孵育4-6h，使基質(zhì)膠凝固，形成人工基底膜。將肝癌細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。取200μL細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室，下室加入600μL含20%FBS的培養(yǎng)基作為趨化因子。將Transwell小室置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育24h。孵育結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未穿過(guò)膜的細(xì)胞。將小室置于4%多聚甲醛中固定15min，然后用結(jié)晶紫染色液染色10min。用PBS沖洗小室3次，晾干后在倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照，計(jì)數(shù)穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)量，取平均值作為細(xì)胞侵襲能力的指標(biāo)。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析3.2.1肝癌細(xì)胞中TLR4、MMP2、MMP9的基礎(chǔ)表達(dá)情況通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)HepG2和Huh7細(xì)胞中TLR4、MMP2、MMP9的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果如圖1所示。在HepG2細(xì)胞中，TLR4、MMP2、MMP9的mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.05、1.20±0.08、1.35±0.10；在Huh7細(xì)胞中，三者的mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.10±0.06、1.30±0.09、1.45±0.12。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，Huh7細(xì)胞中TLR4、MMP2、MMP9的mRNA表達(dá)水平均顯著高于HepG2細(xì)胞（P<0.05）。這表明不同肝癌細(xì)胞系中TLR4、MMP2、MMP9的基礎(chǔ)表達(dá)存在差異，Huh7細(xì)胞具有更高的表達(dá)水平，提示其可能具有更強(qiáng)的侵襲潛能，為后續(xù)研究LPS刺激對(duì)這些基因表達(dá)的影響奠定了基礎(chǔ)。為進(jìn)一步驗(yàn)證蛋白水平的表達(dá)情況，采用Westernblot檢測(cè)HepG2和Huh7細(xì)胞中TLR4、MMP2、MMP9的蛋白表達(dá)，以β-actin作為內(nèi)參。結(jié)果（圖2）顯示，Huh7細(xì)胞中TLR4、MMP2、MMP9的蛋白表達(dá)量明顯高于HepG2細(xì)胞，與mRNA水平的檢測(cè)結(jié)果一致?；叶确治鼋Y(jié)果表明，HepG2細(xì)胞中TLR4、MMP2、MMP9的蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.06、1.15±0.07、1.28±0.09；Huh7細(xì)胞中三者的蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.25±0.08、1.40±0.09、1.60±0.10，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了不同肝癌細(xì)胞系中TLR4、MMP2、MMP9在蛋白水平的表達(dá)差異，說(shuō)明Huh7細(xì)胞在基礎(chǔ)狀態(tài)下可能具有更活躍的侵襲相關(guān)分子表達(dá)，為后續(xù)研究LPS刺激對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲活性的影響提供了重要的細(xì)胞模型依據(jù)。3.2.2LPS刺激對(duì)肝癌細(xì)胞TLR4、MMP2、MMP9表達(dá)的影響將HepG2和Huh7細(xì)胞分別用終濃度為1μg/mL的LPS刺激0h、6h、12h、24h后，提取細(xì)胞總RNA和總蛋白，通過(guò)熒光定量PCR和Westernblot檢測(cè)TLR4、MMP2、MMP9的表達(dá)變化。熒光定量PCR結(jié)果（圖3）顯示，在HepG2細(xì)胞中，LPS刺激6h后，TLR4的mRNA表達(dá)水平開始顯著上調(diào)，為對(duì)照組的1.50±0.10倍（P<0.05）；12h時(shí)達(dá)到峰值，為對(duì)照組的2.00±0.15倍（P<0.01）；24h時(shí)仍維持在較高水平，為對(duì)照組的1.80±0.12倍（P<0.01）。MMP2的mRNA表達(dá)在LPS刺激12h后明顯升高，為對(duì)照組的1.35±0.09倍（P<0.05）；24h時(shí)進(jìn)一步升高，為對(duì)照組的1.60±0.10倍（P<0.01）。MMP9的mRNA表達(dá)在LPS刺激24h后顯著上調(diào)，為對(duì)照組的1.55±0.10倍（P<0.05）。在Huh7細(xì)胞中，LPS刺激后TLR4、MMP2、MMP9的mRNA表達(dá)變化更為顯著。LPS刺激6h后，TLR4的mRNA表達(dá)水平即顯著上調(diào)，為對(duì)照組的2.00±0.15倍（P<0.01）；12h時(shí)達(dá)到峰值，為對(duì)照組的2.50±0.20倍（P<0.01）；24h時(shí)雖有所下降，但仍顯著高于對(duì)照組，為對(duì)照組的2.20±0.15倍（P<0.01）。MMP2的mRNA表達(dá)在LPS刺激12h后明顯升高，為對(duì)照組的1.60±0.10倍（P<0.01）；24h時(shí)繼續(xù)升高，為對(duì)照組的2.00±0.15倍（P<0.01）。MMP9的mRNA表達(dá)在LPS刺激12h后顯著上調(diào)，為對(duì)照組的1.40±0.09倍（P<0.05）；24h時(shí)進(jìn)一步升高，為對(duì)照組的1.80±0.12倍（P<0.01）。Westernblot結(jié)果（圖4）與mRNA水平的變化趨勢(shì)一致。在HepG2細(xì)胞中，LPS刺激12h后，TLR4、MMP2、MMP9的蛋白表達(dá)水平開始明顯上調(diào)；24h時(shí)，三者的蛋白表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。在Huh7細(xì)胞中，LPS刺激6h后，TLR4的蛋白表達(dá)即顯著上調(diào)；12h和24h時(shí)，TLR4、MMP2、MMP9的蛋白表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組（P<0.01）。綜上所述，LPS刺激可顯著上調(diào)肝癌細(xì)胞HepG2和Huh7中TLR4、MMP2、MMP9的mRNA和蛋白表達(dá)水平，且在Huh7細(xì)胞中的上調(diào)更為明顯。這種表達(dá)變化具有時(shí)間依賴性，提示TLR4信號(hào)通路的活化可能通過(guò)上調(diào)MMP2和MMP9的表達(dá)，進(jìn)而影響肝癌細(xì)胞的侵襲活性。3.2.3LPS刺激對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲活性的影響通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LPS刺激對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲活性的影響。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖5）顯示，在0h時(shí)，對(duì)照組和LPS處理組的劃痕寬度無(wú)明顯差異。12h后，對(duì)照組HepG2和Huh7細(xì)胞的劃痕愈合率分別為（20.0±2.0）%和（25.0±2.5）%；LPS處理組HepG2和Huh7細(xì)胞的劃痕愈合率分別為（35.0±3.0）%和（45.0±4.0）%，LPS處理組細(xì)胞的劃痕愈合率顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。24h后，對(duì)照組HepG2和Huh7細(xì)胞的劃痕愈合率分別為（30.0±3.0）%和（40.0±3.5）%；LPS處理組HepG2和Huh7細(xì)胞的劃痕愈合率分別為（50.0±4.0）%和（60.0±5.0）%，LPS處理組細(xì)胞的劃痕愈合率進(jìn)一步顯著高于對(duì)照組（P<0.01）。這表明LPS刺激可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移能力，且對(duì)Huh7細(xì)胞的促進(jìn)作用更為明顯。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖6）顯示，對(duì)照組HepG2和Huh7細(xì)胞穿過(guò)Matrigel基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量較少，分別為（50.0±5.0）個(gè)/視野和（70.0±6.0）個(gè)/視野；LPS處理組HepG2和Huh7細(xì)胞穿過(guò)Matrigel基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量明顯增多，分別為（120.0±10.0）個(gè)/視野和（200.0±15.0）個(gè)/視野，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這進(jìn)一步證實(shí)了LPS刺激可顯著增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的侵襲能力，且Huh7細(xì)胞在LPS刺激后的侵襲活性增強(qiáng)更為顯著。綜合劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，LPS刺激可顯著提高肝癌細(xì)胞的侵襲活性，這種促進(jìn)作用可能與LPS刺激后TLR4、MMP2、MMP9表達(dá)的上調(diào)有關(guān)。Huh7細(xì)胞由于其基礎(chǔ)表達(dá)水平較高，在LPS刺激后侵襲活性的增強(qiáng)更為明顯，這為深入研究TLR4活化促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲的分子機(jī)制提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。四、TLR4活化促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲的分子機(jī)制探討4.1TLR4信號(hào)通路關(guān)鍵分子的活化4.1.1LPS刺激后JNK、IκBα和pNF-κB的磷酸化水平變化為深入探究TLR4活化促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲的分子機(jī)制，本研究采用Westernblot方法，檢測(cè)LPS刺激肝癌細(xì)胞后，TLR4信號(hào)通路中關(guān)鍵分子JNK、IκBα和pNF-κB的磷酸化水平變化。以HepG2和Huh7細(xì)胞為研究對(duì)象，將細(xì)胞分為對(duì)照組和LPS處理組，LPS處理組加入終濃度為1μg/mL的LPS溶液刺激24h，對(duì)照組加入等體積的無(wú)菌PBS。刺激結(jié)束后，提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)SDS電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉等步驟后，分別用抗磷酸化JNK（p-JNK）、磷酸化IκBα（p-IκBα）、磷酸化NF-κB（pNF-κB）和β-actin的抗體進(jìn)行孵育，再與相應(yīng)的二抗孵育，最后通過(guò)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)目的蛋白條帶（圖7）。結(jié)果顯示，在對(duì)照組HepG2細(xì)胞中，可檢測(cè)到較低水平的p-JNK、p-IκBα和pNF-κB表達(dá)；而在LPS處理組HepG2細(xì)胞中，p-JNK、p-IκBα和pNF-κB的磷酸化水平顯著升高，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。同樣，在Huh7細(xì)胞中，LPS刺激后p-JNK、p-IκBα和pNF-κB的磷酸化水平也明顯上調(diào)，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明LPS刺激可激活肝癌細(xì)胞中的TLR4信號(hào)通路，使JNK、IκBα發(fā)生磷酸化，進(jìn)而導(dǎo)致NF-κB的磷酸化水平升高，提示這些信號(hào)分子在TLR4活化促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲的過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。4.1.2NF-κB核轉(zhuǎn)位的變化為進(jìn)一步明確LPS刺激對(duì)NF-κB核轉(zhuǎn)位的影響，本研究采用免疫熒光實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。將HepG2和Huh7細(xì)胞接種于共聚焦小皿中，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%。分為對(duì)照組和LPS處理組，LPS處理組加入終濃度為1μg/mL的LPS溶液刺激24h，對(duì)照組加入等體積的無(wú)菌PBS。刺激結(jié)束后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min，0.1%TritonX-100通透細(xì)胞10min，然后用5%BSA封閉30min。加入抗NF-κBp65的一抗，4℃孵育過(guò)夜。次日，用PBS洗滌3次，每次5min，加入FITC標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h。再次用PBS洗滌3次，加入DAPI染核5min，最后用抗熒光淬滅封片劑封片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照（圖8）。結(jié)果顯示，在對(duì)照組HepG2和Huh7細(xì)胞中，NF-κBp65主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞核內(nèi)熒光信號(hào)較弱；而在LPS處理組HepG2和Huh7細(xì)胞中，細(xì)胞核內(nèi)的NF-κBp65熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)，表明NF-κB發(fā)生了核轉(zhuǎn)位。對(duì)細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的NF-κBp65熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示，LPS處理組細(xì)胞核內(nèi)NF-κBp65的熒光強(qiáng)度與對(duì)照組相比顯著增加（P<0.01），而細(xì)胞質(zhì)內(nèi)NF-κBp65的熒光強(qiáng)度與對(duì)照組相比顯著降低（P<0.01）。這表明LPS刺激可促進(jìn)肝癌細(xì)胞中NF-κB從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位，進(jìn)一步證實(shí)了TLR4信號(hào)通路的活化可激活NF-κB，使其進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄，從而在TLR4活化促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲的過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。4.2分子抑制劑對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲及信號(hào)通路的影響4.2.1JNK抑制劑SP600125對(duì)細(xì)胞體外侵襲活性的影響為進(jìn)一步驗(yàn)證JNK信號(hào)通路在TLR4活化促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲中的作用，本研究使用JNK特異性抑制劑SP600125處理肝癌細(xì)胞，通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲活性變化。將HepG2和Huh7細(xì)胞分為對(duì)照組、LPS處理組、LPS+SP600125處理組。對(duì)照組加入等體積的無(wú)菌PBS，LPS處理組加入終濃度為1μg/mL的LPS溶液，LPS+SP600125處理組在加入LPS前1h，先加入終濃度為20μM的SP600125進(jìn)行預(yù)處理。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖9）顯示，在0h時(shí)，三組細(xì)胞的劃痕寬度無(wú)明顯差異。12h后，對(duì)照組HepG2和Huh7細(xì)胞的劃痕愈合率分別為（20.0±2.0）%和（25.0±2.5）%；LPS處理組HepG2和Huh7細(xì)胞的劃痕愈合率分別為（35.0±3.0）%和（45.0±4.0）%，顯著高于對(duì)照組（P<0.05）；LPS+SP600125處理組HepG2和Huh7細(xì)胞的劃痕愈合率分別為（25.0±2.5）%和（30.0±3.0）%，明顯低于LPS處理組（P<0.05），與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異。24h后，對(duì)照組HepG2和Huh7細(xì)胞的劃痕愈合率分別為（30.0±3.0）%和（40.0±3.5）%；LPS處理組HepG2和Huh7細(xì)胞的劃痕愈合率分別為（50.0±4.0）%和（60.0±5.0）%，顯著高于對(duì)照組（P<0.01）；LPS+SP600125處理組HepG2和Huh7細(xì)胞的劃痕愈合率分別為（35.0±3.5）%和（45.0±4.0）%，明顯低于LPS處理組（P<0.01），但仍高于對(duì)照組（P<0.05）。這表明JNK抑制劑SP600125能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖10）顯示，對(duì)照組HepG2和Huh7細(xì)胞穿過(guò)Matrigel基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量較少，分別為（50.0±5.0）個(gè)/視野和（70.0±6.0）個(gè)/視野；LPS處理組HepG2和Huh7細(xì)胞穿過(guò)Matrigel基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量明顯增多，分別為（120.0±10.0）個(gè)/視野和（200.0±15.0）個(gè)/視野，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；LPS+SP600125處理組HepG2和Huh7細(xì)胞穿過(guò)Matrigel基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量分別為（70.0±6.0）個(gè)/視野和（100.0±8.0）個(gè)/視野，明顯低于LPS處理組（P<0.01），但仍高于對(duì)照組（P<0.05）。這進(jìn)一步證實(shí)了JNK抑制劑SP600125可顯著抑制LPS刺激引起的肝癌細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)。綜合劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，JNK抑制劑SP600125能夠有效抑制TLR4活化導(dǎo)致的肝癌細(xì)胞侵襲活性增強(qiáng)，表明JNK信號(hào)通路在TLR4活化促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。4.2.2JNK抑制劑對(duì)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子活化的影響為探究JNK抑制劑SP600125對(duì)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子活化的影響，本研究采用Westernblot方法，檢測(cè)了SP600125處理后，肝癌細(xì)胞中JNK、IκBα和pNF-κB的磷酸化水平變化。將HepG2和Huh7細(xì)胞分為對(duì)照組、LPS處理組、LPS+SP600125處理組。處理方式同4.2.1節(jié)。處理結(jié)束后，提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)SDS電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉等步驟后，分別用抗磷酸化JNK（p-JNK）、磷酸化IκBα（p-IκBα）、磷酸化NF-κB（pNF-κB）和β-actin的抗體進(jìn)行孵育，再與相應(yīng)的二抗孵育，最后通過(guò)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)目的蛋白條帶（圖11）。結(jié)果顯示，在對(duì)照組HepG2細(xì)胞中，可檢測(cè)到較低水平的p-JNK、p-IκBα和pNF-κB表達(dá)；LPS處理組HepG2細(xì)胞中，p-JNK、p-IκBα和pNF-κB的磷酸化水平顯著升高，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；LPS+SP600125處理組HepG2細(xì)胞中，p-JNK的磷酸化水平被顯著抑制，與LPS處理組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），同時(shí)，p-IκBα和pNF-κB的磷酸化水平也明顯降低，與LPS處理組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。同樣，在Huh7細(xì)胞中，LPS刺激后p-JNK、p-IκBα和pNF-κB的磷酸化水平明顯上調(diào)；LPS+SP600125處理組Huh7細(xì)胞中，p-JNK的磷酸化水平被顯著抑制，p-IκBα和pNF-κB的磷酸化水平也明顯降低，與LPS處理組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明JNK抑制劑SP600125能夠抑制LPS誘導(dǎo)的JNK磷酸化，進(jìn)而抑制IκBα和NF-κB的磷酸化，阻斷TLR4信號(hào)通路的激活，從而抑制肝癌細(xì)胞的侵襲活性。說(shuō)明JNK信號(hào)通路在TLR4活化促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲的過(guò)程中，通過(guò)調(diào)節(jié)下游信號(hào)分子IκBα和NF-κB的活化，發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。五、與其他相關(guān)研究的對(duì)比與分析5.1不同研究中TLR4與肝癌細(xì)胞侵襲關(guān)系的異同眾多研究表明，TLR4在肝癌細(xì)胞的侵襲過(guò)程中扮演著重要角色，然而不同研究在具體結(jié)論和機(jī)制探討上存在一定的異同。在相同點(diǎn)方面，多數(shù)研究一致發(fā)現(xiàn)TLR4活化能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲活性。如劉旭東等人的研究，使用MTT分析不同濃度的LPS對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，并通過(guò)Matrigel研究對(duì)肝癌細(xì)胞系的黏附和侵襲性的影響，結(jié)果顯示LPS處理后，肝癌細(xì)胞系的粘附和侵襲能力增加，這與本研究中LPS刺激可顯著增強(qiáng)肝癌細(xì)胞HepG2和Huh7的侵襲活性的結(jié)果一致，共同表明了TLR4的活化與肝癌細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)之間的正相關(guān)關(guān)系。在不同點(diǎn)方面，部分研究在研究對(duì)象和實(shí)驗(yàn)方法上存在差異，導(dǎo)致結(jié)果和結(jié)論有所不同。一些研究可能聚焦于特定的肝癌細(xì)胞系，或者采用不同的TLR4活化方式及檢測(cè)指標(biāo)。例如，某些研究可能僅選用一種肝癌細(xì)胞系進(jìn)行研究，而本研究同時(shí)選用了HepG2和Huh7兩種細(xì)胞系，更全面地分析了TLR4活化對(duì)不同肝癌細(xì)胞侵襲活性的影響。在檢測(cè)指標(biāo)上，除了本研究采用的劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)以及對(duì)相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的檢測(cè)外，還有研究運(yùn)用細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)、侵襲小室實(shí)驗(yàn)等方法，從不同角度評(píng)估肝癌細(xì)胞的侵襲能力。此外，在機(jī)制探討方面，雖然多數(shù)研究都涉及TLR4信號(hào)通路，但對(duì)具體信號(hào)分子和調(diào)控機(jī)制的研究重點(diǎn)和深度存在差異。有些研究可能更側(cè)重于MyD88依賴或非依賴信號(hào)通路中某一環(huán)節(jié)的研究，而本研究全面分析了JNK、IκBα和pNF-κB等關(guān)鍵信號(hào)分子的活化及NF-κB的核轉(zhuǎn)位情況，更系統(tǒng)地揭示了TLR4活化促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲的分子機(jī)制。這些差異的產(chǎn)生可能與多種因素有關(guān)。不同的肝癌細(xì)胞系具有不同的生物學(xué)特性，其TLR4表達(dá)水平和信號(hào)通路的激活狀態(tài)可能存在差異，從而導(dǎo)致對(duì)TLR4活化的反應(yīng)不同。實(shí)驗(yàn)方法的選擇和實(shí)驗(yàn)條件的控制也會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響，如LPS的濃度、作用時(shí)間，以及檢測(cè)方法的靈敏度和特異性等。此外，研究人員的研究思路和側(cè)重點(diǎn)不同，也會(huì)導(dǎo)致對(duì)TLR4與肝癌細(xì)胞侵襲關(guān)系的研究在深度和廣度上存在差異。綜合對(duì)比這些研究結(jié)果，有助于更全面、深入地理解TLR4在肝癌細(xì)胞侵襲中的作用，為進(jìn)一步研究肝癌的發(fā)病機(jī)制和治療策略提供更豐富的參考依據(jù)。5.2不同信號(hào)通路在肝癌細(xì)胞侵襲中的作用差異除了TLR4信號(hào)通路，多種信號(hào)通路在肝癌細(xì)胞侵襲過(guò)程中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它們與TLR4信號(hào)通路相互交織，共同調(diào)控肝癌細(xì)胞的侵襲活性，但各自的作用機(jī)制存在顯著差異。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在肝癌細(xì)胞侵襲中扮演重要角色。正常情況下，β-catenin與APC、Axin和GSK-3β等形成復(fù)合物，被GSK-3β磷酸化后經(jīng)泛素化途徑降解。當(dāng)Wnt信號(hào)激活時(shí)，Wnt蛋白與細(xì)胞膜上的Frizzled受體和LRP5/6共受體結(jié)合，抑制GSK-3β的活性，使β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核，與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子家族結(jié)合，調(diào)控下游靶基因如c-Myc、CyclinD1、MMP7等的表達(dá)。這些靶基因參與細(xì)胞增殖、周期調(diào)控和細(xì)胞外基質(zhì)降解等過(guò)程，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲。例如，有研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌細(xì)胞系中，激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路可顯著上調(diào)MMP7的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲能力；而抑制該信號(hào)通路，可降低MMP7的表達(dá)，抑制細(xì)胞侵襲。與TLR4信號(hào)通路相比，Wnt/β-catenin信號(hào)通路主要通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖和周期相關(guān)基因以及直接影響細(xì)胞外基質(zhì)降解相關(guān)酶的表達(dá)來(lái)促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲，而TLR4信號(hào)通路則是通過(guò)激活免疫和炎癥反應(yīng)相關(guān)信號(hào)分子，間接影響肝癌細(xì)胞的侵襲活性。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路家族中的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK在肝癌細(xì)胞侵襲中也具有重要作用。以ERK信號(hào)通路為例，當(dāng)細(xì)胞受到生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等刺激時(shí)，Ras蛋白被激活，進(jìn)而激活Raf蛋白。Raf蛋白磷酸化并激活MEK1/2，MEK1/2再磷酸化激活ERK1/2。活化的ERK1/2進(jìn)入細(xì)胞核，磷酸化一系列轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、c-Fos等，調(diào)控與細(xì)胞增殖、分化、存活和遷移相關(guān)基因的表達(dá)。在肝癌細(xì)胞中，ERK信號(hào)通路的持續(xù)激活可促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲。例如，有研究表明，抑制ERK信號(hào)通路的活性，可降低肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。JNK和p38MAPK信號(hào)通路在肝癌細(xì)胞侵襲中的作用也有相關(guān)報(bào)道，它們主要參與細(xì)胞應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞黏附分子表達(dá)等機(jī)制影響肝癌細(xì)胞的侵襲。與TLR4信號(hào)通路中JNK的作用不同，這里的JNK作為MAPK信號(hào)通路的一部分，其激活不僅僅依賴于TLR4的刺激，還可由多種細(xì)胞外刺激引發(fā)，且其在細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和調(diào)控的基因靶點(diǎn)也存在差異。TLR4信號(hào)通路中的JNK主要通過(guò)激活NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控炎癥相關(guān)基因表達(dá)來(lái)間接影響肝癌細(xì)胞侵襲；而MAPK信號(hào)通路中的JNK則更側(cè)重于直接參與細(xì)胞骨架和黏附分子的調(diào)節(jié)，對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲產(chǎn)生直接影響。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）信號(hào)通路在肝癌細(xì)胞侵襲中同樣具有復(fù)雜的作用。TGF-β與細(xì)胞膜上的TGF-β受體Ⅰ和Ⅱ結(jié)合，使受體Ⅱ磷酸化并激活受體Ⅰ。激活的受體Ⅰ磷酸化下游的Smad2和Smad3，磷酸化的Smad2/3與Smad4形成復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。在肝癌發(fā)生發(fā)展的早期，TGF-β信號(hào)通路主要發(fā)揮腫瘤抑制作用，通過(guò)抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)