生物化學(xué)檢驗(yàn)常用技術(shù)演講人：日期:01光譜分析技術(shù)02電泳分離技術(shù)03色譜分析技術(shù)04免疫檢測技術(shù)05分子診斷技術(shù)06質(zhì)譜分析技術(shù)目錄CATALOGUE光譜分析技術(shù)01PART紫外-可見分光光度法原理與應(yīng)用方法優(yōu)勢與局限儀器構(gòu)成基于物質(zhì)對紫外-可見光區(qū)（200-800nm）的選擇性吸收特性，通過朗伯-比爾定律定量分析待測物濃度。廣泛應(yīng)用于核酸、蛋白質(zhì)定量及藥物純度檢測，如DNA/RNA的A260/A280比值測定。核心部件包括光源（氘燈/鎢燈）、單色器、樣品池、檢測器（光電倍增管）及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。需定期校準(zhǔn)波長準(zhǔn)確性和吸光度線性范圍以確保數(shù)據(jù)可靠性。操作簡便、成本低，但易受溶劑極性、pH值及共存雜質(zhì)干擾，需通過空白對照和標(biāo)準(zhǔn)曲線法減少誤差。熒光光譜分析法高靈敏度檢測利用物質(zhì)受激發(fā)后發(fā)射熒光的特性，檢測限可達(dá)納克甚至皮克級，適用于痕量物質(zhì)分析（如維生素、多環(huán)芳烴）。需優(yōu)化激發(fā)/發(fā)射波長以排除背景熒光干擾。動(dòng)態(tài)范圍與猝滅效應(yīng)熒光強(qiáng)度與濃度呈線性關(guān)系，但高濃度時(shí)可能因內(nèi)濾效應(yīng)或碰撞猝滅導(dǎo)致信號衰減，需稀釋樣本或使用同步熒光技術(shù)校正。聯(lián)用技術(shù)拓展與高效液相色譜（HPLC）聯(lián)用（HPLC-FLD），可分離復(fù)雜基質(zhì)中的熒光物質(zhì)，提升特異性，如食品安全中的黃曲霉毒素檢測。通過基態(tài)原子對特征譜線的吸收測定金屬元素（如鉛、汞、鈣）含量，火焰原子化法適用于ppm級，石墨爐原子化法可達(dá)ppb級。需選擇合適空心陰極燈及背景校正方式（如氘燈或塞曼效應(yīng)）。原子吸收光譜法元素定量分析化學(xué)干擾（如磷酸鹽對鈣的抑制）可通過加入釋放劑（鑭鹽）緩解；物理干擾（粘度差異）需匹配基體或采用標(biāo)準(zhǔn)加入法。干擾與消除被EPA、ISO等機(jī)構(gòu)列為環(huán)境水樣、生物組織重金屬檢測的權(quán)威方法，如血鉛監(jiān)測需嚴(yán)格遵循CLIA認(rèn)證的質(zhì)控流程。行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法電泳分離技術(shù)02PART聚丙烯酰胺凝膠電泳高分辨率分離聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）能夠根據(jù)蛋白質(zhì)或核酸的分子量、電荷及構(gòu)象差異實(shí)現(xiàn)高分辨率分離，尤其適用于小分子量蛋白質(zhì)（10-300kDa）和寡核苷酸的精細(xì)分析。01凝膠孔徑可調(diào)通過調(diào)整丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的濃度比例，可控制凝膠孔徑大小，從而適應(yīng)不同分子量范圍的分離需求（如變性電泳SDS或非變性電泳Native）。聚合方式多樣化學(xué)聚合（過硫酸銨-TEMED催化）和光聚合（核黃素激發(fā)）兩種方法可靈活選擇，前者適用于常規(guī)實(shí)驗(yàn)，后者適用于對氧敏感的樣品或低溫環(huán)境。應(yīng)用廣泛除蛋白質(zhì)分析外，還可用于DNA測序（尿素）、WesternBlot轉(zhuǎn)印前處理及蛋白質(zhì)復(fù)合物研究。020304瓊脂糖凝膠因其孔徑較大（0.5%-3%濃度），更適合分離1kb至50kb的DNA或RNA片段，是分子生物學(xué)中PCR產(chǎn)物鑒定和基因組分析的核心技術(shù)。大分子核酸分離相比聚丙烯酰胺，瓊脂糖毒性更低，且可通過熔點(diǎn)差異回收目標(biāo)DNA片段（如低熔點(diǎn)瓊脂糖用于DNA純化）。低毒性支持介質(zhì)無需聚合反應(yīng)，加熱溶解后冷卻即可成膠，且電泳時(shí)間短（通常30-60分鐘），兼容溴化乙錠（EB）或更安全的核酸染料進(jìn)行可視化檢測。操作簡便快速010302瓊脂糖凝膠電泳通過交替電場方向，可實(shí)現(xiàn)超大DNA分子（高達(dá)10Mb）的分離，用于染色體分析和病原體分型。脈沖場電泳擴(kuò)展應(yīng)用04毛細(xì)管電泳技術(shù)支持自由溶液電泳（CZE）、膠束電動(dòng)色譜（MEKC）和凝膠填充毛細(xì)管電泳（CGE），適用于蛋白質(zhì)、核酸、小分子代謝物甚至離子分析。多模式分離機(jī)制

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常與質(zhì)譜（CE-MS）或激光誘導(dǎo)熒光檢測器（CE-LIF）聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜生物樣品的高通量、高特異性分析。聯(lián)用技術(shù)優(yōu)勢利用內(nèi)徑50-100μm的毛細(xì)管作為分離通道，僅需納升級樣品即可完成分離，顯著減少試劑消耗并提高靈敏度（檢測限可達(dá)fmol級別）。高效微量化分析集成自動(dòng)進(jìn)樣器和多毛細(xì)管陣列，可并行處理數(shù)十個(gè)樣本，廣泛應(yīng)用于臨床診斷（如血紅蛋白變異檢測）和二代測序片段分析。自動(dòng)化與高通量色譜分析技術(shù)03PART高效液相色譜法（HPLC）采用高壓泵推動(dòng)流動(dòng)相通過高精度色譜柱，能夠?qū)崿F(xiàn)復(fù)雜混合物中各組分的有效分離和定量分析，尤其適用于熱不穩(wěn)定、高沸點(diǎn)或大分子化合物的檢測。高效液相色譜法高分離效能與精確分析HPLC在藥物分析、食品安全、環(huán)境監(jiān)測及生物醫(yī)學(xué)研究中具有重要地位，如藥物代謝產(chǎn)物檢測、食品添加劑含量測定及環(huán)境污染物的痕量分析等。廣泛應(yīng)用領(lǐng)域根據(jù)檢測需求可搭配紫外-可見光檢測器（UV-VIS）、熒光檢測器（FLD）或質(zhì)譜檢測器（MS），顯著提升方法的靈敏度和特異性。多樣化的檢測器選擇氣相色譜法揮發(fā)性化合物的高效分離氣相色譜法（GC）通過載氣帶動(dòng)樣品在固定相中分配，適用于沸點(diǎn)低于400℃的揮發(fā)性或半揮發(fā)性有機(jī)物分析，如石油組分、農(nóng)藥殘留及香料成分的分離鑒定。高靈敏度與快速分析配備氫火焰離子化檢測器（FID）或電子捕獲檢測器（ECD）的GC系統(tǒng)可達(dá)到ppb級檢測限，且單次分析通常僅需數(shù)分鐘至半小時(shí)，適合批量樣本篩查。需衍生化處理的局限性對于非揮發(fā)性或熱不穩(wěn)定的化合物，需通過衍生化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為易揮發(fā)衍生物后方能檢測，增加了前處理步驟的復(fù)雜性。薄層色譜法快速定性分析與低成本優(yōu)勢半定量分析的局限性顯色技術(shù)的多樣性薄層色譜法（TLC）通過毛細(xì)作用使樣品在固定相薄層上展開，依據(jù)比移值（Rf）進(jìn)行定性鑒別，設(shè)備簡單、操作便捷，常用于中藥材真?zhèn)舞b別或化學(xué)反應(yīng)進(jìn)程監(jiān)控?？刹捎米贤鉄粽丈?、碘蒸氣熏蒸或特異性顯色劑（如茚三酮用于氨基酸）對分離斑點(diǎn)進(jìn)行可視化，靈活適應(yīng)不同化合物的檢測需求。雖然可通過斑點(diǎn)面積掃描實(shí)現(xiàn)半定量，但準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性低于HPLC或GC，通常作為實(shí)驗(yàn)室初步篩查手段。免疫檢測技術(shù)04PART030201酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)該方法通過將捕獲抗體固定在固相載體上，與樣本中的抗原結(jié)合后，再加入酶標(biāo)記的檢測抗體形成“夾心”復(fù)合物，最后通過底物顯色定量檢測抗原濃度。適用于大分子抗原（如腫瘤標(biāo)志物、激素）的高靈敏度檢測，臨床廣泛用于肝炎病毒、HIV篩查及妊娠檢測。雙抗體夾心法原理與應(yīng)用先將已知抗原包被于固相載體，加入待測血清后，若存在特異性抗體則與之結(jié)合，再通過酶標(biāo)記的二抗與一抗結(jié)合，顯色后測定抗體水平。常用于自身免疫?。ㄈ缈购丝贵w）和傳染病（如梅毒螺旋體抗體）的診斷，具有高通量和成本優(yōu)勢。間接法檢測抗體需嚴(yán)格校準(zhǔn)酶標(biāo)儀光密度值，設(shè)置空白對照、陰性對照和標(biāo)準(zhǔn)品曲線；洗滌步驟需徹底避免非特異性結(jié)合，同時(shí)注意酶標(biāo)板批間差和試劑穩(wěn)定性對結(jié)果的影響。實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制要點(diǎn)競爭性結(jié)合反應(yīng)機(jī)制在內(nèi)分泌領(lǐng)域（如胰島素、皮質(zhì)醇測定）和藥物濃度監(jiān)測中具有不可替代性，但存在放射性廢物處理難題和試劑半衰期短（通常30-60天）的缺點(diǎn)，正逐漸被化學(xué)發(fā)光法取代。臨床應(yīng)用與局限性數(shù)據(jù)處理方法需采用Logit-Log轉(zhuǎn)換或四參數(shù)邏輯曲線擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，并引入B/B0（結(jié)合率）指標(biāo)消除實(shí)驗(yàn)變異，同時(shí)要求每批次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行質(zhì)控品回收率驗(yàn)證（85%-115%為可接受范圍）。利用放射性同位素（如碘-125）標(biāo)記抗原與樣本中未標(biāo)記抗原競爭結(jié)合有限量抗體，通過測量沉淀物放射性強(qiáng)度，推算待測物濃度。該方法靈敏度可達(dá)皮克級，特別適用于小分子物質(zhì)（如甲狀腺激素、地高辛）的微量檢測。放射免疫分析法免疫熒光技術(shù)直接法與間接法比較直接法將熒光素（如FITC）標(biāo)記在特異性抗體上直接檢測抗原，操作簡單但靈敏度低；間接法通過二抗放大信號，適用于低豐度抗原（如腎活檢中的免疫復(fù)合物）檢測，但需注意種屬交叉反應(yīng)引起的假陽性。流式細(xì)胞術(shù)聯(lián)用結(jié)合熒光標(biāo)記單克隆抗體，可對細(xì)胞表面標(biāo)志物（如CD系列）進(jìn)行多參數(shù)分析，在白血病分型、淋巴細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)中具有關(guān)鍵作用，需配置488nm激光器和特定濾光片系統(tǒng)。組織切片應(yīng)用規(guī)范冷凍切片需保持-20℃操作防止抗原降解，石蠟切片需進(jìn)行熱修復(fù)（檸檬酸緩沖液，95℃20分鐘）暴露隱蔽表位，封片時(shí)使用抗淬滅劑（如DABCO）延長熒光信號持續(xù)時(shí)間。分子診斷技術(shù)05PARTPCR擴(kuò)增技術(shù)原理與流程衍生技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）通過變性、退火、延伸三步驟循環(huán)擴(kuò)增目標(biāo)DNA片段，依賴熱穩(wěn)定DNA聚合酶（如Taq酶）和特異性引物實(shí)現(xiàn)指數(shù)級復(fù)制，靈敏度可達(dá)單拷貝級別。廣泛用于病原體檢測（如新冠病毒、HPV分型）、遺傳病篩查（如地中海貧血基因突變）、法醫(yī)DNA鑒定及科研基因克隆，具有高特異性和快速出結(jié)果的優(yōu)勢。包括實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）用于絕對定量分析、逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）檢測RNA表達(dá)、數(shù)字PCR（dPCR）實(shí)現(xiàn)單分子級別精確定量，滿足不同場景需求?；阪溄K止原理，采用熒光標(biāo)記ddNTP和毛細(xì)管電泳技術(shù)，準(zhǔn)確率達(dá)99.99%，適用于小片段靶向測序（如線粒體基因組）和突變驗(yàn)證。DNA測序技術(shù)第一代測序（Sanger法）通過邊合成邊測序（Illumina平臺(tái)）或半導(dǎo)體測序（IonTorrent）實(shí)現(xiàn)大規(guī)模并行測序，全基因組測序成本降至千美元內(nèi)，應(yīng)用于腫瘤panel檢測、宏基因組分析和無創(chuàng)產(chǎn)前篩查。高通量測序（NGS）如PacBioSMRT和OxfordNanopore技術(shù)，無需PCR擴(kuò)增直接讀取長讀長序列（>10kb），解決結(jié)構(gòu)變異和高度重復(fù)區(qū)域組裝難題。單分子測序（第三代技術(shù)）核酸雜交技術(shù)固相雜交方法包括Southernblot（DNA檢測）、Northernblot（RNA分析）和斑點(diǎn)雜交，將核酸固定于尼龍膜后與標(biāo)記探針雜交，通過放射自顯影或化學(xué)發(fā)光成像，特異性強(qiáng)但操作繁瑣耗時(shí)。液相雜交技術(shù)如熒光原位雜交（FISH）可在細(xì)胞或組織原位定位靶序列，用于染色體異常（如唐氏綜合征）和HER2基因擴(kuò)增檢測，分辨率達(dá)1-10Mb。微陣列芯片集成數(shù)千至百萬探針的高通量平臺(tái)，一次性完成全基因組SNP分型（如Affymetrix芯片）或表達(dá)譜分析，需配合生物信息學(xué)工具解析海量數(shù)據(jù)。質(zhì)譜分析技術(shù)06PART液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）結(jié)合了液相色譜的分離能力和質(zhì)譜的高靈敏度檢測能力，適用于復(fù)雜基質(zhì)中痕量化合物的定性與定量分析，尤其在藥物代謝、環(huán)境污染物檢測等領(lǐng)域表現(xiàn)卓越。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用高靈敏度與高選擇性該技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物樣本中的蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)研究，以及食品安全中的農(nóng)藥殘留、獸藥殘留檢測，能夠有效分離和鑒定極性大、熱不穩(wěn)定的化合物。廣泛應(yīng)用領(lǐng)域LC-MS的關(guān)鍵挑戰(zhàn)在于接口技術(shù)的優(yōu)化，如電噴霧電離（ESI）和大氣壓化學(xué)電離（APCI）的選擇，需根據(jù)待測物性質(zhì)調(diào)整流動(dòng)相組成、離子源參數(shù)以提高離子化效率。技術(shù)難點(diǎn)與優(yōu)化氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用揮發(fā)性化合物分析前處理要求嚴(yán)格高分辨率與結(jié)構(gòu)解析氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）特別適用于揮發(fā)性、半揮發(fā)性有機(jī)化合物的分析，如石油化工產(chǎn)品、香料成分及環(huán)境中的有機(jī)污染物（如多環(huán)芳烴、持久性有機(jī)污染物）。通過電子轟擊電離（EI）產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)譜圖庫，可快速匹配化合物結(jié)構(gòu)，結(jié)合高分辨率質(zhì)譜（HRMS）還能實(shí)現(xiàn)同位素精細(xì)結(jié)構(gòu)分析，用于法醫(yī)毒理學(xué)或興奮劑檢測。GC-MS對樣品前處理要求較高，常需衍生化處理以增強(qiáng)揮發(fā)性，且進(jìn)樣口溫度、載氣流速等參數(shù)需精確控制以避免熱分解或色譜峰展寬。大分子分析優(yōu)勢MALDI-TOF（飛行時(shí)間質(zhì)譜）具備