2Gy多分割不同順序照射對(duì)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞生物效應(yīng)的深度剖析與機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義鼻咽癌是一種常見于頭頸部的惡性腫瘤，在我國(guó)南方地區(qū)以及東南亞國(guó)家的發(fā)病率尤為突出。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，全球超過80%的鼻咽癌病例發(fā)生在中國(guó)，特別是廣東省，其發(fā)病率是全國(guó)平均水平的5倍多，因此鼻咽癌也被稱為“廣東癌”。由于鼻咽部位置隱匿，周圍存在諸多重要結(jié)構(gòu)，如顱底骨質(zhì)、大血管、神經(jīng)等，使得手術(shù)切除難度極大，且風(fēng)險(xiǎn)較高。目前，放射治療成為鼻咽癌的首選治療方法，在鼻咽癌的綜合治療中占據(jù)著核心地位。放射治療通過利用高能射線，如X射線、γ射線等，對(duì)腫瘤細(xì)胞的DNA造成損傷，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和分裂，最終達(dá)到殺滅腫瘤細(xì)胞的目的。隨著放射治療技術(shù)的不斷發(fā)展，從早期的深部X射線治療，到后來的鈷60治療，再到如今廣泛應(yīng)用的調(diào)強(qiáng)適形放療（IMRT）、容積旋轉(zhuǎn)調(diào)強(qiáng)放療（VMAT）等先進(jìn)技術(shù)，鼻咽癌的放療效果得到了顯著提升。早期鼻咽癌患者單純放療的5年生存率可達(dá)80%以上，然而，對(duì)于中晚期患者，盡管放療技術(shù)不斷進(jìn)步，其5年生存率仍僅徘徊在40%-50%左右，治療失敗的主要原因包括局部復(fù)發(fā)（高達(dá)24%-42%）和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（高達(dá)37%-48%）。在放射治療中，分割照射是一種常見的治療策略，其原理是將總照射劑量分成若干個(gè)小劑量，在一定時(shí)間內(nèi)分多次給予照射。這種方式可以利用正常組織和腫瘤組織在放射生物學(xué)特性上的差異，如正常組織的修復(fù)能力較強(qiáng)，在兩次照射間隔期間能夠修復(fù)部分放射損傷，而腫瘤組織的修復(fù)能力相對(duì)較弱，從而達(dá)到在殺滅腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，盡可能減少對(duì)正常組織損傷的目的。傳統(tǒng)的放療分割方案通常采用每日1次，每次2Gy的照射方式，然而，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，不同的分割劑量和照射順序可能會(huì)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)產(chǎn)生顯著影響。鼻咽癌CNE-2細(xì)胞是一種常用的研究鼻咽癌生物學(xué)特性和放射敏感性的細(xì)胞模型。深入研究2Gy多分割不同順序照射對(duì)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞的生物效應(yīng)，具有極其重要的意義。一方面，它有助于我們更加深入地了解鼻咽癌腫瘤細(xì)胞在不同照射條件下的放射生物學(xué)行為，包括細(xì)胞的增殖、凋亡、周期阻滯等方面的變化，為揭示放射治療的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。另一方面，通過明確分割劑量大小和照射順序與細(xì)胞殺傷效應(yīng)之間的關(guān)系，能夠?yàn)榕R床鼻咽癌適形調(diào)強(qiáng)放射治療計(jì)劃的優(yōu)化提供切實(shí)可行的新思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，指導(dǎo)醫(yī)生根據(jù)患者的具體情況，制定更加個(gè)性化、精準(zhǔn)化的放療方案，從而提高腫瘤的局部控制率，減少遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生，最終提高患者的生存率和生活質(zhì)量。同時(shí)，這也有助于推動(dòng)放射治療技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，為鼻咽癌患者帶來更好的治療效果和預(yù)后。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在鼻咽癌放射治療領(lǐng)域，國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量的研究工作，取得了諸多成果。在放療技術(shù)方面，國(guó)外在先進(jìn)放療技術(shù)的研發(fā)和應(yīng)用上處于前沿地位。例如，美國(guó)和歐洲的一些醫(yī)療機(jī)構(gòu)率先開展了質(zhì)子治療在鼻咽癌中的應(yīng)用研究，質(zhì)子治療能夠更精準(zhǔn)地將高劑量集中于腫瘤部位，減少對(duì)周圍正常組織的照射劑量，從而降低放療并發(fā)癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，國(guó)外在圖像引導(dǎo)放療（IGRT）技術(shù)的研究也較為深入，通過實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤和正常組織的位置變化，實(shí)現(xiàn)放療過程中的精準(zhǔn)照射，進(jìn)一步提高了放療的準(zhǔn)確性和療效。國(guó)內(nèi)在鼻咽癌放射治療方面也取得了顯著進(jìn)展。中山大學(xué)腫瘤防治中心等國(guó)內(nèi)知名醫(yī)療機(jī)構(gòu)在調(diào)強(qiáng)適形放療（IMRT）和容積旋轉(zhuǎn)調(diào)強(qiáng)放療（VMAT）的臨床應(yīng)用研究中積累了豐富經(jīng)驗(yàn)，通過優(yōu)化放療計(jì)劃，顯著提高了鼻咽癌患者的局部控制率和生存率。此外，國(guó)內(nèi)學(xué)者還對(duì)放療與化療、免疫治療等聯(lián)合治療模式進(jìn)行了深入探索，研究表明，同步放化療可提高局部晚期鼻咽癌患者的生存率，而免疫治療聯(lián)合放療也顯示出了良好的應(yīng)用前景。關(guān)于多分割照射對(duì)腫瘤細(xì)胞生物效應(yīng)的研究，國(guó)外有學(xué)者對(duì)乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行不同分割劑量和順序的照射研究，發(fā)現(xiàn)小分割劑量在前、大分割劑量在后的照射順序能夠更有效地抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。在肺癌細(xì)胞的研究中，也觀察到了類似的現(xiàn)象，不同分割劑量和順序的照射會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的凋亡和周期阻滯情況發(fā)生明顯變化。國(guó)內(nèi)的相關(guān)研究主要集中在鼻咽癌等頭頸部腫瘤。南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院的葉建明等人通過克隆形成法和四唑鹽（MTT）比色法研究了2Gy多分割不同順序照射對(duì)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞可能在≤0.5Gy劑量區(qū)間存在低劑量放射超敏感性，且劑量分割的大小和順序是影響鼻咽癌放射治療生物效應(yīng)的重要因素。湖南省腫瘤醫(yī)院的陳琛等人運(yùn)用克隆形成實(shí)驗(yàn)分析了不同照射模式對(duì)人鼻咽低分化鱗癌細(xì)胞株CNE2放射生物學(xué)相對(duì)效應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)照射時(shí)間、劑量率等因素會(huì)影響細(xì)胞的放射生物學(xué)效應(yīng)。在鼻咽癌CNE-2細(xì)胞的研究方面，國(guó)內(nèi)外學(xué)者主要將其作為研究鼻咽癌生物學(xué)特性和放射敏感性的細(xì)胞模型。通過對(duì)CNE-2細(xì)胞的研究，深入了解了鼻咽癌腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲等生物學(xué)行為。然而，目前對(duì)于2Gy多分割不同順序照射對(duì)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞生物效應(yīng)的影響機(jī)制研究還不夠深入，尤其是在細(xì)胞信號(hào)通路、基因表達(dá)調(diào)控等方面的研究還存在較大的空白。此外，雖然已有研究表明分割劑量和順序會(huì)影響放療效果，但如何將這些研究成果更好地轉(zhuǎn)化為臨床實(shí)踐，指導(dǎo)醫(yī)生制定個(gè)性化的放療方案，仍然是亟待解決的問題。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探究2Gy多分割不同順序照射對(duì)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞生物效應(yīng)的差異及其潛在機(jī)制，從而為臨床鼻咽癌適形調(diào)強(qiáng)放射治療計(jì)劃的優(yōu)化提供科學(xué)依據(jù)。具體研究?jī)?nèi)容如下：細(xì)胞培養(yǎng)與照射：培養(yǎng)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞，將其分為不同的照射組，包括2分割、3分割和等分割照射系列，并分別設(shè)置0Gy和2Gy組作為對(duì)照。在每個(gè)照射組中，按照預(yù)先設(shè)定的分割劑量和順序進(jìn)行照射，確保所有分割計(jì)劃都在一個(gè)固定的總時(shí)間內(nèi)完成。細(xì)胞生存率檢測(cè)：采用克隆形成法和四唑鹽（MTT）比色法，檢測(cè)2Gy劑量照射后鼻咽癌CNE-2細(xì)胞的細(xì)胞生存率和相對(duì)細(xì)胞生存率。通過對(duì)比不同照射組的細(xì)胞生存率，分析分割劑量大小和照射順序?qū)?xì)胞殺傷效應(yīng)的影響。細(xì)胞凋亡檢測(cè)：運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同照射條件下CNE-2細(xì)胞的凋亡率，觀察2Gy多分割不同順序照射對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。同時(shí)，通過蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，如Bcl-2、Bax等，深入探討細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。細(xì)胞周期分析：利用流式細(xì)胞術(shù)分析不同照射組CNE-2細(xì)胞的周期分布，研究2Gy多分割不同順序照射對(duì)細(xì)胞周期的阻滯作用。檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，如CyclinD1、p21等，揭示細(xì)胞周期調(diào)控在放射治療中的作用機(jī)制。信號(hào)通路研究：采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）等技術(shù)，檢測(cè)與細(xì)胞增殖、凋亡、周期調(diào)控相關(guān)的信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白和基因的表達(dá)，如PI3K/Akt、MAPK等信號(hào)通路，進(jìn)一步明確2Gy多分割不同順序照射影響CNE-2細(xì)胞生物效應(yīng)的分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。二、相關(guān)理論與研究基礎(chǔ)2.1鼻咽癌概述鼻咽癌是一種發(fā)生于鼻咽腔頂部和側(cè)壁的惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)出明顯的地域和種族分布差異。流行病學(xué)研究表明，鼻咽癌在東南亞地區(qū)、中國(guó)南方，尤其是廣東省的發(fā)病率顯著高于其他地區(qū)。在中國(guó)，鼻咽癌的發(fā)病呈現(xiàn)出南高北低的態(tài)勢(shì)，廣東省的發(fā)病率位居全國(guó)之首，是全國(guó)平均水平的5倍以上。此外，鼻咽癌還具有一定的種族易感性，蒙古人種的發(fā)病率相對(duì)較高，并且存在家族聚集現(xiàn)象，某些家族中鼻咽癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)明顯增加。鼻咽癌的病理類型主要包括鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、未分化癌等，其中鱗狀細(xì)胞癌最為常見，約占鼻咽癌病例的80%-90%。鱗狀細(xì)胞癌又可進(jìn)一步分為角化型鱗狀細(xì)胞癌和非角化型鱗狀細(xì)胞癌，非角化型鱗狀細(xì)胞癌在我國(guó)更為多見，其惡性程度相對(duì)較高，具有較強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。腺癌和未分化癌的發(fā)病率相對(duì)較低，但它們的預(yù)后通常較差，對(duì)放化療的敏感性也有所不同。鼻咽癌的臨床癥狀多樣，且早期癥狀往往不典型，容易被忽視。常見的癥狀包括鼻部癥狀，如回吸涕中帶血、擤鼻涕中帶血，早期多為間歇性，隨著病情進(jìn)展可發(fā)展為持續(xù)性；鼻塞也是常見癥狀之一，多為單側(cè)，逐漸發(fā)展為雙側(cè)。耳部癥狀表現(xiàn)為耳鳴、耳閉塞感及聽力下降，這是由于腫瘤侵犯咽鼓管，導(dǎo)致咽鼓管功能障礙所致，部分患者早期可能被誤診為分泌性中耳炎。頸部淋巴結(jié)腫大是鼻咽癌患者常見的首發(fā)癥狀，約60%的患者在初診時(shí)可發(fā)現(xiàn)頸部淋巴結(jié)腫大，開始多為單側(cè)，隨后可發(fā)展為雙側(cè)。當(dāng)腫瘤侵犯顱底及腦神經(jīng)時(shí)，會(huì)出現(xiàn)一系列腦神經(jīng)癥狀，如偏頭痛、面部麻木、復(fù)視、上瞼下垂、視力下降、軟腭癱瘓、進(jìn)食嗆咳、聲嘶、伸舌偏斜等，此時(shí)病情多已處于中晚期。鼻咽癌的危害極大，不僅會(huì)嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，還會(huì)威脅患者的生命健康。由于鼻咽部位置隱匿，周圍解剖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，腫瘤早期不易被發(fā)現(xiàn)，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期。中晚期鼻咽癌容易發(fā)生局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，常見的轉(zhuǎn)移部位包括骨、肺、肝等。局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致鼻咽癌患者治療失敗和死亡的主要原因，嚴(yán)重降低了患者的生存率和生活質(zhì)量。此外，鼻咽癌的治療過程，如放療、化療等，也會(huì)給患者帶來諸多不良反應(yīng)，如放射性口腔黏膜炎、放射性皮炎、惡心、嘔吐、骨髓抑制等，進(jìn)一步加重患者的痛苦。因此，深入研究鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制、治療方法以及提高早期診斷率，對(duì)于改善患者的預(yù)后具有重要意義。2.2CNE-2細(xì)胞特性鼻咽癌CNE-2細(xì)胞是研究鼻咽癌生物學(xué)特性和放射敏感性的重要細(xì)胞模型，具有獨(dú)特的來源和特性。該細(xì)胞系于1983年由谷淑燕、孔繁裔等成功建系，其源自人鼻咽低分化鱗癌組織。建系過程中，科研人員首先用鼻咽活檢鉗從鼻咽癌患者的鼻咽部腫物獲取組織塊，將其放入含青霉素和鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液內(nèi)，于4℃下靜置2小時(shí)，以起到初步的殺菌和穩(wěn)定組織的作用。隨后，將組織剪切成1-2mm3的小塊，用含青霉素和鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液洗滌后，接種于預(yù)先涂有鼠尾膠原的玻璃培養(yǎng)瓶中。在37℃、CO?培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2小時(shí)后，再補(bǔ)加含20%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。組織塊在接種1周后，上皮細(xì)胞從組織塊周圍向外迅速遷移和生長(zhǎng)，相互連接成片；2周后，可以見到成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)；8周后，上皮細(xì)胞生長(zhǎng)開始明顯加快，并向周圍延伸。為了獲得純化的上皮細(xì)胞，科研人員采用胰蛋白酶消化法和刮脫法等手段除掉成纖維細(xì)胞。這樣處理后的細(xì)胞在傳代三次后，貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞呈現(xiàn)上皮狀，核清晰可見核仁；2周后細(xì)胞形成群落；第4代后細(xì)胞開始呈單層生長(zhǎng)，最終命名為CNE-2。經(jīng)生物學(xué)特性分析后，確定細(xì)胞系建立成功。在培養(yǎng)條件方面，CNE-2細(xì)胞通常采用RPMI1640培養(yǎng)基，并添加10%的牛血清。RPMI1640培養(yǎng)基富含多種氨基酸、維生素、糖類等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，能夠?yàn)镃NE-2細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖提供充足的養(yǎng)分。牛血清中含有豐富的生長(zhǎng)因子、激素、貼壁因子等成分，這些成分對(duì)于維持CNE-2細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和代謝至關(guān)重要。生長(zhǎng)因子可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化，激素能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理功能，貼壁因子則有助于細(xì)胞貼附在培養(yǎng)瓶表面生長(zhǎng)。在培養(yǎng)過程中，需將細(xì)胞置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中，37℃是人體的正常體溫，也是CNE-2細(xì)胞生長(zhǎng)的最適溫度，在此溫度下，細(xì)胞內(nèi)的各種酶活性能夠保持最佳狀態(tài)，有利于細(xì)胞的代謝和生長(zhǎng)。5%CO?的環(huán)境則能夠維持培養(yǎng)基的pH值穩(wěn)定在7.2-7.4之間，適宜的pH值是細(xì)胞正常生長(zhǎng)的必要條件，過高或過低的pH值都會(huì)影響細(xì)胞的生理功能。此外，每2-3天需更換一次培養(yǎng)基，以去除細(xì)胞代謝產(chǎn)生的廢物，補(bǔ)充新鮮的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為細(xì)胞提供良好的生長(zhǎng)環(huán)境。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳代比例一般為1:2到1:5。CNE-2細(xì)胞具有上皮細(xì)胞樣的形態(tài)特征，在顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈多邊形或梭形，邊界清晰，細(xì)胞核大而圓，位于細(xì)胞中央，核仁明顯。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，相互之間緊密連接，形成單層細(xì)胞群落。這種形態(tài)特征與鼻咽癌組織中的癌細(xì)胞形態(tài)相似，反映了其來源組織的特性。在生物學(xué)特性方面，CNE-2細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力，在適宜的培養(yǎng)條件下，細(xì)胞能夠快速分裂和生長(zhǎng)。研究表明，CNE-2細(xì)胞的倍增時(shí)間約為24-36小時(shí)，這意味著在這段時(shí)間內(nèi)，細(xì)胞數(shù)量會(huì)增加一倍。此外，CNE-2細(xì)胞具有較高的致瘤性，將其接種到裸鼠體內(nèi)，100%會(huì)成瘤。這一特性使得CNE-2細(xì)胞成為研究鼻咽癌腫瘤發(fā)生和發(fā)展機(jī)制的理想模型，通過對(duì)裸鼠體內(nèi)成瘤的觀察和研究，可以深入了解腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。作為研究模型，CNE-2細(xì)胞具有諸多優(yōu)勢(shì)。由于其來源于人鼻咽低分化鱗癌組織，能夠較好地模擬鼻咽癌腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性，為研究鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制、腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為以及對(duì)放療的敏感性等提供了可靠的實(shí)驗(yàn)材料。與其他細(xì)胞模型相比，CNE-2細(xì)胞具有相對(duì)穩(wěn)定的遺傳背景和生物學(xué)特性，便于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性和可比性。其培養(yǎng)條件相對(duì)簡(jiǎn)單，易于操作和控制，能夠在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行培養(yǎng)和研究。這使得科研人員可以方便地對(duì)其進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)處理，如不同劑量和順序的放射照射，以及藥物干預(yù)等，從而深入探究鼻咽癌的相關(guān)生物學(xué)問題。2.3放射治療基本原理放射治療的基礎(chǔ)是電離輻射對(duì)細(xì)胞的作用機(jī)制，這一過程涉及直接作用與間接作用，以及細(xì)胞對(duì)輻射的復(fù)雜反應(yīng)過程。電離輻射的直接作用是指射線直接與細(xì)胞內(nèi)具有生物活性的大分子，如核酸（尤其是DNA）、蛋白質(zhì)等相互作用。當(dāng)射線的能量被這些大分子吸收時(shí)，會(huì)使分子發(fā)生電離、激發(fā)或化學(xué)鍵斷裂。以DNA為例，射線可以直接打斷DNA的磷酸二酯鍵，導(dǎo)致DNA單鏈斷裂（SSB）或雙鏈斷裂（DSB）。DNA單鏈斷裂相對(duì)容易修復(fù)，細(xì)胞內(nèi)存在多種DNA修復(fù)機(jī)制，如堿基切除修復(fù)（BER）、核苷酸切除修復(fù)（NER）等，能夠識(shí)別并修復(fù)單鏈斷裂。然而，DNA雙鏈斷裂對(duì)細(xì)胞的損傷更為嚴(yán)重，如果不能正確修復(fù)，可能導(dǎo)致染色體畸變、基因缺失或重排等，進(jìn)而影響細(xì)胞的正常功能和增殖，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在直接作用過程中，射線還可能使蛋白質(zhì)分子的氨基酸殘基發(fā)生電離或激發(fā)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)改變，從而喪失其生物活性。例如，一些參與細(xì)胞代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵酶，其活性中心的氨基酸殘基受到輻射損傷后，酶的催化活性會(huì)受到抑制，進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)的一系列生化反應(yīng)。間接作用則是射線首先作用于細(xì)胞內(nèi)含量最多的水分子。水分子吸收射線能量后，會(huì)發(fā)生電離和激發(fā)，生成一系列性質(zhì)活潑的產(chǎn)物，如氫自由基（H?）、羥自由基（OH?）、激發(fā)水分子（HO??）、過氧化氫（H?O?）、水化電子（eaq?）等。這些產(chǎn)物具有很強(qiáng)的氧化能力，其中羥自由基的氧化能力尤為突出。它們可以通過奪氫、分解或加成反應(yīng)，與細(xì)胞內(nèi)的生物大分子，如DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等發(fā)生作用，形成大分子自由基。以DNA為例，羥自由基可以從DNA的脫氧核糖上奪取氫原子，形成脫氧核糖自由基，進(jìn)而引發(fā)一系列反應(yīng)，導(dǎo)致DNA鏈斷裂或堿基損傷。蛋白質(zhì)分子中的氨基酸殘基也容易受到自由基的攻擊，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能改變。細(xì)胞膜中的脂質(zhì)成分，如磷脂，也會(huì)被自由基氧化，發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，影響細(xì)胞的物質(zhì)運(yùn)輸、信號(hào)傳遞等生理過程。由于人體和細(xì)胞中水分子含量豐富，約占細(xì)胞重量的70%-80%，因此間接作用在電離輻射對(duì)細(xì)胞的損傷中占主導(dǎo)地位，約占總損傷的80%。細(xì)胞對(duì)輻射的反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的過程，受到多種因素的調(diào)控。當(dāng)細(xì)胞受到輻射損傷后，首先會(huì)啟動(dòng)DNA損傷修復(fù)機(jī)制。細(xì)胞內(nèi)存在多種DNA修復(fù)途徑，以應(yīng)對(duì)不同類型的DNA損傷。除了前面提到的堿基切除修復(fù)和核苷酸切除修復(fù)用于修復(fù)單鏈斷裂外，對(duì)于DNA雙鏈斷裂，主要通過同源重組修復(fù)（HR）和非同源末端連接修復(fù)（NHEJ）兩種途徑進(jìn)行修復(fù)。同源重組修復(fù)需要有同源的DNA模板，通常發(fā)生在細(xì)胞周期的S期和G?期，能夠準(zhǔn)確地修復(fù)DNA雙鏈斷裂，保持基因組的完整性。非同源末端連接修復(fù)則不需要同源模板，在細(xì)胞周期的各個(gè)階段都能發(fā)生，但修復(fù)過程中容易出現(xiàn)錯(cuò)誤，可能導(dǎo)致基因突變或染色體畸變。如果DNA損傷過于嚴(yán)重，超出了細(xì)胞的修復(fù)能力，細(xì)胞可能會(huì)發(fā)生凋亡。凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡方式，受到一系列凋亡相關(guān)基因和蛋白的調(diào)控。在輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中，Bcl-2家族蛋白起著關(guān)鍵作用。Bcl-2蛋白具有抑制凋亡的作用，而Bax蛋白則促進(jìn)凋亡。當(dāng)細(xì)胞受到輻射損傷后，Bax蛋白的表達(dá)可能上調(diào)，其可以與線粒體膜上的電壓依賴性陰離子通道（VDAC）結(jié)合，導(dǎo)致線粒體膜通透性改變，釋放細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）、半胱天冬酶-9（caspase-9）等形成凋亡體，激活下游的caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。如果細(xì)胞未能發(fā)生凋亡，且DNA損傷未得到正確修復(fù)，細(xì)胞可能會(huì)進(jìn)入衰老狀態(tài)或發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。衰老的細(xì)胞失去了增殖能力，但仍然存活，會(huì)分泌一系列細(xì)胞因子和蛋白酶，影響周圍細(xì)胞的微環(huán)境。而發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞則可能獲得不受控制的增殖能力，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性還與細(xì)胞周期密切相關(guān)。一般來說，處于M期（有絲分裂期）的細(xì)胞對(duì)輻射最為敏感，因?yàn)榇藭r(shí)細(xì)胞的染色體處于高度濃縮狀態(tài)，DNA雙鏈緊密纏繞，更容易受到射線的損傷。G?期（DNA合成后期）的細(xì)胞對(duì)輻射也比較敏感，這一時(shí)期細(xì)胞正在為有絲分裂做準(zhǔn)備，DNA損傷可能會(huì)影響細(xì)胞的正常分裂進(jìn)程。S期（DNA合成期）的細(xì)胞對(duì)輻射相對(duì)不敏感，因?yàn)樵赟期細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)機(jī)制較為活躍，能夠及時(shí)修復(fù)部分輻射損傷。G?期（DNA合成前期）的細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性介于M期、G?期和S期之間。此外，不同組織和器官的細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性也存在差異。根據(jù)Bergonié-Tribondeau定律，細(xì)胞的輻射敏感性與細(xì)胞的增殖分裂能力成正比，與細(xì)胞的分化程度成反比。例如，淋巴組織、骨髓、胃腸上皮等增殖活躍、分化程度低的組織細(xì)胞對(duì)輻射敏感性較高；而神經(jīng)組織、肌肉組織等增殖緩慢、分化程度高的組織細(xì)胞對(duì)輻射敏感性較低。2.4多分割照射的理論基礎(chǔ)多分割照射主要依據(jù)放射生物學(xué)中的4R理論，該理論包含四個(gè)關(guān)鍵要素：細(xì)胞放射損傷的修復(fù)（Repair）、周期內(nèi)細(xì)胞的再分布（Redistribution）、氧效應(yīng)及乏氧細(xì)胞的再氧合（Reoxygenation）以及再群體化（Repopulation）。這四個(gè)要素相互關(guān)聯(lián)，共同影響著腫瘤細(xì)胞和正常組織細(xì)胞在放射治療中的反應(yīng)，是理解多分割照射生物學(xué)效應(yīng)的核心理論框架。細(xì)胞放射損傷的修復(fù)是4R理論的重要組成部分。細(xì)胞受到電離輻射后，會(huì)產(chǎn)生多種類型的損傷，其中亞致死性損傷（SLD）和潛在致死性損傷（PLD）在一定條件下能夠被細(xì)胞自身的修復(fù)機(jī)制所修復(fù)。亞致死性損傷是指細(xì)胞在受到照射后，部分關(guān)鍵部位受損，但在給予足夠時(shí)間的情況下，細(xì)胞可以修復(fù)這些損傷，恢復(fù)正常功能。潛在致死性損傷則是指受照射后細(xì)胞暫時(shí)未死亡，但如果不加干預(yù)，細(xì)胞最終會(huì)死亡。正常組織細(xì)胞具有較強(qiáng)的修復(fù)能力，在兩次照射間隔期間，能夠有效修復(fù)放射損傷。例如，皮膚、小腸黏膜等正常組織的上皮細(xì)胞，在照射后能夠迅速啟動(dòng)修復(fù)機(jī)制，使細(xì)胞的損傷得到恢復(fù)，維持組織的正常功能。相比之下，腫瘤細(xì)胞的修復(fù)能力相對(duì)較弱。鼻咽癌CNE-2細(xì)胞在受到輻射損傷后，雖然也會(huì)嘗試進(jìn)行修復(fù)，但由于其自身的生物學(xué)特性，修復(fù)效率較低，難以完全恢復(fù)到損傷前的狀態(tài)。這種正常組織與腫瘤細(xì)胞在修復(fù)能力上的差異，為多分割照射提供了理論依據(jù)。通過將總照射劑量分成多個(gè)小劑量，在一定時(shí)間內(nèi)分多次給予照射，使得正常組織在兩次照射間隔期間有足夠的時(shí)間修復(fù)損傷，而腫瘤細(xì)胞則因修復(fù)能力有限，累積的損傷逐漸增加，從而提高對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果，同時(shí)減少對(duì)正常組織的損傷。周期內(nèi)細(xì)胞的再分布也是多分割照射需要考慮的重要因素。細(xì)胞周期可分為G?期、S期、G?期和M期，不同時(shí)期的細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性存在顯著差異。M期細(xì)胞對(duì)輻射最為敏感，此時(shí)細(xì)胞的染色體處于高度濃縮狀態(tài)，DNA雙鏈緊密纏繞，射線更容易導(dǎo)致染色體斷裂和基因損傷，從而使細(xì)胞死亡。G?期細(xì)胞對(duì)輻射也比較敏感，因?yàn)檫@一時(shí)期細(xì)胞正在為有絲分裂做準(zhǔn)備，輻射損傷可能會(huì)干擾細(xì)胞的正常分裂進(jìn)程，導(dǎo)致細(xì)胞死亡或周期阻滯。S期細(xì)胞對(duì)輻射相對(duì)不敏感，這是因?yàn)樵赟期細(xì)胞內(nèi)的DNA合成和修復(fù)機(jī)制較為活躍，能夠及時(shí)修復(fù)部分輻射損傷。在多分割照射過程中，隨著照射的進(jìn)行，原本處于不同周期時(shí)相的細(xì)胞會(huì)發(fā)生再分布。當(dāng)?shù)谝淮握丈浜螅舾袝r(shí)相的細(xì)胞（如M期和G?期細(xì)胞）受到較大損傷，存活的細(xì)胞會(huì)進(jìn)入相對(duì)不敏感的時(shí)相。但在兩次照射間隔期間，細(xì)胞會(huì)繼續(xù)進(jìn)行周期運(yùn)轉(zhuǎn)，使得原本處于不敏感時(shí)相的細(xì)胞進(jìn)入敏感時(shí)相。這樣，在下一次照射時(shí)，就能夠?qū)Ω嗟募?xì)胞產(chǎn)生殺傷作用。例如，在對(duì)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞進(jìn)行多分割照射時(shí)，第一次照射可能主要?dú)幱贛期和G?期的細(xì)胞，而存活的S期細(xì)胞在經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)后，會(huì)逐漸進(jìn)入G?期和M期，此時(shí)進(jìn)行第二次照射，就可以對(duì)這些進(jìn)入敏感時(shí)相的細(xì)胞進(jìn)行有效的殺傷，從而提高整體的放療效果。氧效應(yīng)及乏氧細(xì)胞的再氧合在放射治療中起著關(guān)鍵作用。氧在電離輻射對(duì)細(xì)胞的損傷過程中具有重要影響，存在氧效應(yīng)。當(dāng)細(xì)胞處于有氧環(huán)境時(shí)，輻射產(chǎn)生的自由基與氧結(jié)合，形成更具活性的過氧化物自由基，這些過氧化物自由基能夠進(jìn)一步損傷細(xì)胞內(nèi)的生物大分子，如DNA、蛋白質(zhì)等，從而增強(qiáng)輻射對(duì)細(xì)胞的殺傷作用。研究表明，在有氧條件下，細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性比無氧條件下高2-3倍。然而，腫瘤組織內(nèi)部由于血管生成不足、血液供應(yīng)受限等原因，常常存在乏氧細(xì)胞。這些乏氧細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性較低，成為放療失敗的重要原因之一。在多分割照射過程中，隨著腫瘤細(xì)胞的死亡和腫瘤體積的縮小，腫瘤組織的血液供應(yīng)得到改善，乏氧細(xì)胞周圍的氧分壓升高，乏氧細(xì)胞逐漸再氧合，轉(zhuǎn)變?yōu)橛醒跫?xì)胞。再氧合后的細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性增強(qiáng)，在后續(xù)的照射中更容易被殺傷。對(duì)于鼻咽癌CNE-2細(xì)胞，在多分割照射過程中，乏氧細(xì)胞的再氧合現(xiàn)象同樣存在。通過合理設(shè)計(jì)分割照射方案，延長(zhǎng)照射間隔時(shí)間，為乏氧細(xì)胞的再氧合提供足夠的時(shí)間，就可以提高對(duì)這些原本具有輻射抵抗性的乏氧細(xì)胞的殺傷效果，從而提高放療的整體療效。再群體化是指在放射治療過程中，腫瘤細(xì)胞和正常組織細(xì)胞在受到照射損傷后，會(huì)通過細(xì)胞增殖來補(bǔ)充受損的細(xì)胞群體。正常組織細(xì)胞的再群體化通常有助于組織的修復(fù)和功能恢復(fù)。例如，骨髓造血干細(xì)胞在受到照射損傷后，能夠迅速增殖分化，補(bǔ)充外周血細(xì)胞，維持機(jī)體的正常造血功能。而腫瘤細(xì)胞的再群體化則會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞數(shù)量的增加，降低放療效果。在多分割照射中，照射間隔時(shí)間的長(zhǎng)短會(huì)影響腫瘤細(xì)胞的再群體化。如果照射間隔時(shí)間過長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞有足夠的時(shí)間進(jìn)行增殖，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞數(shù)量反彈，抵消部分放療效果。相反，如果照射間隔時(shí)間過短，正常組織細(xì)胞無法充分修復(fù)損傷，會(huì)增加正常組織的放射損傷。因此，在設(shè)計(jì)多分割照射方案時(shí)，需要綜合考慮正常組織和腫瘤細(xì)胞的再群體化特性，選擇合適的照射間隔時(shí)間，以達(dá)到在有效殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，盡量減少對(duì)正常組織損傷的目的。對(duì)于鼻咽癌CNE-2細(xì)胞，研究其再群體化的規(guī)律和特點(diǎn)，有助于確定最佳的照射間隔時(shí)間，優(yōu)化放療方案。分割劑量和照射順序?qū)ι镄?yīng)有著顯著的影響。不同的分割劑量會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷程度和修復(fù)情況的差異。小分割劑量照射時(shí)，細(xì)胞產(chǎn)生的損傷相對(duì)較小，正常組織細(xì)胞能夠更有效地修復(fù)損傷，而腫瘤細(xì)胞雖然也能修復(fù)部分損傷，但由于其修復(fù)能力較弱，累積的損傷仍會(huì)逐漸增加。隨著分割劑量的增大，細(xì)胞的損傷程度加劇，無論是正常組織細(xì)胞還是腫瘤細(xì)胞，修復(fù)的難度都相應(yīng)增加。當(dāng)分割劑量超過一定閾值時(shí)，正常組織細(xì)胞的修復(fù)能力可能無法完全恢復(fù)損傷，導(dǎo)致正常組織的放射損傷加重。同時(shí)，分割劑量的大小還會(huì)影響細(xì)胞周期的分布和乏氧細(xì)胞的再氧合情況。大分割劑量照射可能會(huì)使更多的細(xì)胞停滯在對(duì)輻射相對(duì)不敏感的S期，降低放療效果；而小分割劑量照射則有利于細(xì)胞周期的正常運(yùn)轉(zhuǎn)和乏氧細(xì)胞的再氧合。照射順序同樣對(duì)生物效應(yīng)產(chǎn)生重要影響。不同的照射順序會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞在不同的損傷狀態(tài)下接受后續(xù)照射，從而影響細(xì)胞的反應(yīng)。例如，先給予小分割劑量照射，再給予大分割劑量照射，小分割劑量照射可能會(huì)使細(xì)胞產(chǎn)生一定的損傷，但不至于導(dǎo)致細(xì)胞死亡，同時(shí)激活細(xì)胞的某些信號(hào)通路，使細(xì)胞對(duì)后續(xù)的大分割劑量照射更加敏感。相反，先給予大分割劑量照射，細(xì)胞可能會(huì)受到嚴(yán)重?fù)p傷，部分細(xì)胞死亡，存活的細(xì)胞可能會(huì)進(jìn)入一種防御狀態(tài)，對(duì)后續(xù)的照射產(chǎn)生抵抗性。在鼻咽癌CNE-2細(xì)胞的研究中，不同的照射順序可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、周期阻滯和增殖等生物學(xué)行為的差異。通過比較不同照射順序下細(xì)胞的生物效應(yīng)，可以篩選出最有利于提高放療效果的照射順序，為臨床放療提供更科學(xué)的依據(jù)。三、研究設(shè)計(jì)與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料本研究選用的細(xì)胞株為鼻咽癌CNE-2細(xì)胞，其源自人鼻咽低分化鱗癌組織，于1983年由谷淑燕、孔繁裔等成功建系。該細(xì)胞株具有上皮細(xì)胞樣形態(tài)，貼壁生長(zhǎng)，在適宜的培養(yǎng)條件下能夠快速增殖，且在裸鼠體內(nèi)移植100%成瘤。本實(shí)驗(yàn)所用的CNE-2細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其遺傳背景穩(wěn)定，生物學(xué)特性明確，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了可靠的細(xì)胞模型。實(shí)驗(yàn)儀器的精準(zhǔn)度和穩(wěn)定性對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。本研究中，細(xì)胞培養(yǎng)主要使用了二氧化碳培養(yǎng)箱（ThermoScientific3111型）。該培養(yǎng)箱能夠精確控制溫度在37℃±0.1℃，CO?濃度在5%±0.1%，并保持95%的相對(duì)濕度，為CNE-2細(xì)胞的生長(zhǎng)提供了穩(wěn)定且適宜的環(huán)境。在細(xì)胞計(jì)數(shù)和活力檢測(cè)方面，采用了全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（CountstarRigel）。它通過先進(jìn)的圖像識(shí)別技術(shù)，能夠快速、準(zhǔn)確地對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并檢測(cè)細(xì)胞的活力，其計(jì)數(shù)誤差控制在±5%以內(nèi)。細(xì)胞照射使用的是直線加速器（VarianClinaciX），可產(chǎn)生高能X射線，射線能量為6MV，劑量率可在100-600MU/min范圍內(nèi)調(diào)節(jié)，確保了照射劑量的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。酶標(biāo)儀（Bio-TekSynergyH1）用于MTT實(shí)驗(yàn)中吸光值的測(cè)定，其波長(zhǎng)范圍為200-1000nm，具有高精度的光檢測(cè)系統(tǒng)，能夠準(zhǔn)確測(cè)量MTT結(jié)晶溶解后的吸光值，重復(fù)性誤差小于±0.005。流式細(xì)胞儀（BDFACSCantoII）則用于細(xì)胞凋亡和周期分析，可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)熒光參數(shù)，檢測(cè)靈敏度高，能夠精確分析不同照射條件下CNE-2細(xì)胞的凋亡率和周期分布。試劑的純度和質(zhì)量直接影響實(shí)驗(yàn)的可靠性。細(xì)胞培養(yǎng)使用的RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco公司），富含多種氨基酸、維生素、糖類等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供了充足的養(yǎng)分。培養(yǎng)基經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)，內(nèi)毒素含量低于0.1EU/ml，確保了細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的安全性。10%胎牛血清（FBS，Gibco公司）添加于培養(yǎng)基中，其中含有豐富的生長(zhǎng)因子、激素和貼壁因子等成分，能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。血清經(jīng)過嚴(yán)格的篩選和檢測(cè)，無支原體、細(xì)菌和病毒污染，確保了實(shí)驗(yàn)的可靠性。胰蛋白酶-EDTA消化液（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA，Gibco公司）用于細(xì)胞的消化傳代，其活性穩(wěn)定，能夠有效消化細(xì)胞間的連接蛋白，使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫落，且對(duì)細(xì)胞的損傷較小。MTT試劑（Sigma公司）是一種黃顏色的染料，其化學(xué)名為3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽?；罴?xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。通過酶標(biāo)儀測(cè)定甲瓚的吸光值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。MTT試劑的純度大于98%，確保了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。二甲基亞砜（DMSO，Sigma公司）用于溶解MTT還原產(chǎn)生的甲瓚，其純度高達(dá)99.5%以上，能夠快速、完全地溶解甲瓚，且對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果無干擾。AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒（BD公司）用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡，該試劑盒利用AnnexinV對(duì)磷脂酰絲氨酸的高親和力，以及PI對(duì)壞死細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的核酸染色特性，能夠準(zhǔn)確區(qū)分正常細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。試劑盒中的試劑經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量控制，批間差異小，保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性。細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒（BD公司）則用于分析細(xì)胞周期分布，通過對(duì)細(xì)胞DNA進(jìn)行染色，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同時(shí)期細(xì)胞的DNA含量，從而確定細(xì)胞周期的分布情況。該試劑盒的檢測(cè)靈敏度高，能夠準(zhǔn)確檢測(cè)出處于不同細(xì)胞周期時(shí)相的細(xì)胞比例。3.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)采用2Gy劑量分割方式，設(shè)置多個(gè)照射系列，旨在全面研究不同分割順序?qū)Ρ茄拾〤NE-2細(xì)胞的生物效應(yīng)。S-L/L-S系列共設(shè)2個(gè)實(shí)驗(yàn)組。S-L組的照射方案為第1天給予0.5Gy照射，第2天給予1.5Gy照射；L-S組則在第1天給予1.5Gy照射，第2天給予0.5Gy照射。此系列主要探究小劑量在前（S-L）和大劑量在前（L-S）兩種照射順序?qū)?xì)胞生物效應(yīng)的影響。根據(jù)放射生物學(xué)理論，小劑量照射可能會(huì)使細(xì)胞產(chǎn)生一定的適應(yīng)性反應(yīng)，激活細(xì)胞內(nèi)的某些信號(hào)通路，如DNA損傷修復(fù)通路等。當(dāng)后續(xù)給予大劑量照射時(shí)，這些預(yù)先激活的通路可能會(huì)影響細(xì)胞對(duì)大劑量照射的敏感性。而大劑量在前的照射順序，可能會(huì)對(duì)細(xì)胞造成較大的初始損傷，細(xì)胞在這種損傷狀態(tài)下對(duì)后續(xù)小劑量照射的反應(yīng)也會(huì)有所不同。通過比較S-L組和L-S組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，能夠深入了解照射順序?qū)?xì)胞DNA損傷修復(fù)、凋亡、增殖等生物學(xué)行為的影響。L-S-S/S-S-L系列同樣設(shè)置2個(gè)實(shí)驗(yàn)組。L-S-S組在第1天給予1.0Gy照射，第2天給予0.5Gy照射，第3天給予0.5Gy照射；S-S-L組則于第1天給予0.5Gy照射，第2天給予0.5Gy照射，第3天給予1.0Gy照射。該系列進(jìn)一步拓展了照射順序的研究，探討在三次分割照射中，大劑量與小劑量不同排列順序的作用效果。在多次分割照射過程中，每次照射都會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不同程度的損傷，細(xì)胞的生物學(xué)狀態(tài)也會(huì)隨之發(fā)生變化。例如，先給予大劑量照射，可能會(huì)導(dǎo)致大量細(xì)胞進(jìn)入凋亡或周期阻滯狀態(tài)，剩余存活細(xì)胞的生物學(xué)特性也會(huì)發(fā)生改變，對(duì)后續(xù)小劑量照射的反應(yīng)也會(huì)不同于正常細(xì)胞。相反，先給予小劑量照射，細(xì)胞可能會(huì)逐漸適應(yīng)輻射環(huán)境，激活一些防御機(jī)制，這些機(jī)制會(huì)影響細(xì)胞對(duì)后續(xù)大劑量照射的敏感性。比較L-S-S組和S-S-L組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，有助于揭示多次分割照射中照射順序?qū)?xì)胞周期調(diào)控、凋亡誘導(dǎo)以及信號(hào)通路激活等方面的影響。等分割照射系列包含3個(gè)實(shí)驗(yàn)組。1-1-1組在第1天、第2天、第3天分別給予0.67Gy照射；1-1-0組在第1天和第2天各給予1.0Gy照射，第3天不照射；1-0-1組在第1天和第3天各給予1.0Gy照射，第2天不照射。等分割照射系列主要研究相同總劑量下，不同分割次數(shù)和照射間隔時(shí)間對(duì)細(xì)胞生物效應(yīng)的影響。從放射生物學(xué)角度來看，分割次數(shù)的不同會(huì)影響細(xì)胞的修復(fù)和再群體化過程。分割次數(shù)增多，細(xì)胞在兩次照射間隔期間有更多時(shí)間進(jìn)行損傷修復(fù)，但也可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的再群體化。而照射間隔時(shí)間的變化會(huì)影響細(xì)胞周期的再分布以及乏氧細(xì)胞的再氧合。例如，較長(zhǎng)的照射間隔時(shí)間可能使更多細(xì)胞從相對(duì)不敏感的周期時(shí)相進(jìn)入敏感時(shí)相，同時(shí)有利于乏氧細(xì)胞的再氧合，從而提高放療效果。但過長(zhǎng)的間隔時(shí)間也可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖加速，抵消部分放療效果。通過對(duì)比等分割照射系列中不同實(shí)驗(yàn)組的結(jié)果，可以明確最佳的分割次數(shù)和照射間隔時(shí)間，為臨床放療方案的制定提供依據(jù)。為確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了對(duì)照組。對(duì)照組包括0Gy組和2Gy組。0Gy組的細(xì)胞不接受任何照射，作為空白對(duì)照，用于評(píng)估細(xì)胞在正常培養(yǎng)條件下的生物學(xué)特性，如細(xì)胞的基礎(chǔ)增殖率、凋亡率、周期分布等。2Gy組的細(xì)胞在第1天接受2Gy的一次性照射，作為常規(guī)照射對(duì)照，與其他多分割照射組進(jìn)行對(duì)比，以突出不同分割方式和順序?qū)?xì)胞生物效應(yīng)的影響。在分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，將各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組進(jìn)行比較，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，如t檢驗(yàn)、方差分析等，判斷不同照射條件下細(xì)胞生物效應(yīng)指標(biāo)（如細(xì)胞生存率、凋亡率、周期分布等）的差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。若實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間存在顯著差異，則表明該照射條件對(duì)細(xì)胞的生物效應(yīng)產(chǎn)生了明顯影響。這樣的對(duì)照設(shè)置能夠有效排除其他因素的干擾，準(zhǔn)確揭示2Gy多分割不同順序照射對(duì)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞生物效應(yīng)的作用機(jī)制。3.3實(shí)驗(yàn)方法3.3.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理從液氮罐中取出凍存的鼻咽癌CNE-2細(xì)胞，迅速將其放入37℃恒溫水浴鍋中，輕輕搖晃，使細(xì)胞懸液在1-2分鐘內(nèi)快速解凍。解凍后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有5mL預(yù)熱RPMI1640完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%雙抗）的15mL離心管中，以1000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄去上清液，目的是去除凍存液中的DMSO，避免其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生不良影響。然后用適量的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)箱內(nèi)的溫度和CO?濃度需定期校準(zhǔn)，確保穩(wěn)定在設(shè)定值，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供適宜環(huán)境。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，每天需在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，包括細(xì)胞的形態(tài)、密度、貼壁情況等。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，需進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，先棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和細(xì)胞代謝產(chǎn)物。然后加入1-2mL0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，在顯微鏡下密切觀察細(xì)胞消化情況。當(dāng)細(xì)胞大部分變圓并開始脫落時(shí)，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞完全脫落，然后加入5mL以上含10%血清的完全培養(yǎng)基終止消化。輕輕吹打細(xì)胞，使其充分分散，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，以1000rpm的轉(zhuǎn)速離心8-10分鐘，棄去上清液。最后用1-2mL培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，按1:2到1:5的比例將細(xì)胞懸液分到新的含5-6mL培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在照射前，需將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CNE-2細(xì)胞用胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，然后用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將細(xì)胞以合適的密度接種于不同規(guī)格的培養(yǎng)容器中，如6孔板用于克隆形成實(shí)驗(yàn)，96孔板用于MTT實(shí)驗(yàn)。接種后，將培養(yǎng)容器置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁并恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)，為后續(xù)的照射實(shí)驗(yàn)做好準(zhǔn)備。在接種細(xì)胞時(shí)，需嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則，避免污染，同時(shí)要確保細(xì)胞接種的均勻性，減少實(shí)驗(yàn)誤差。3.3.2照射方案實(shí)施本實(shí)驗(yàn)采用直線加速器產(chǎn)生的高能X射線對(duì)CNE-2細(xì)胞進(jìn)行照射。在照射前，需對(duì)直線加速器進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制和校準(zhǔn)，確保射線的能量、劑量率等參數(shù)準(zhǔn)確穩(wěn)定。具體校準(zhǔn)方法為：使用標(biāo)準(zhǔn)劑量計(jì)，在不同的劑量率和能量設(shè)置下，測(cè)量直線加速器輸出的射線劑量，將測(cè)量結(jié)果與理論值進(jìn)行對(duì)比，根據(jù)偏差調(diào)整加速器的參數(shù)，直至射線劑量的偏差控制在±2%以內(nèi)。同時(shí)，需檢查加速器的照射野均勻性，使用二維劑量矩陣探測(cè)器，在照射野內(nèi)不同位置測(cè)量射線劑量，確保照射野內(nèi)劑量均勻性優(yōu)于±3%。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將接種有CNE-2細(xì)胞的培養(yǎng)容器置于直線加速器的照射野內(nèi)，按照預(yù)先設(shè)定的分割劑量和順序進(jìn)行照射。照射過程中，需確保培養(yǎng)容器的位置固定，避免細(xì)胞受到不均勻照射。對(duì)于不同的照射組，如S-L/L-S系列、L-S-S/S-S-L系列和等分割照射系列，嚴(yán)格按照各自的照射方案執(zhí)行。例如，S-L組在第1天給予0.5Gy照射，第2天給予1.5Gy照射；L-S組則在第1天給予1.5Gy照射，第2天給予0.5Gy照射。在每次照射前，需再次確認(rèn)直線加速器的參數(shù)設(shè)置是否正確，以及培養(yǎng)容器的位置是否準(zhǔn)確。照射時(shí)間根據(jù)射線的劑量率和設(shè)定的照射劑量進(jìn)行計(jì)算，確保每個(gè)照射組的照射劑量準(zhǔn)確無誤。例如，當(dāng)射線劑量率為300MU/min時(shí)，給予0.5Gy照射所需的時(shí)間約為1分鐘（根據(jù)劑量計(jì)算公式：劑量=劑量率×?xí)r間，0.5Gy=300MU/min×?xí)r間，計(jì)算得出時(shí)間約為1分鐘）。照射過程中，需密切觀察直線加速器的運(yùn)行狀態(tài)和培養(yǎng)容器的情況，確保照射過程的順利進(jìn)行。照射結(jié)束后，將培養(yǎng)容器迅速放回37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。3.3.3細(xì)胞生存率檢測(cè)克隆形成法是一種經(jīng)典的檢測(cè)細(xì)胞生存能力的方法，其原理基于單個(gè)細(xì)胞具有增殖形成克隆的能力。具體操作步驟如下：在照射結(jié)束后，對(duì)于用于克隆形成實(shí)驗(yàn)的6孔板，用胰蛋白酶將CNE-2細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液。然后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，根據(jù)細(xì)胞的存活情況，用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至合適的密度，如每毫升含100-500個(gè)細(xì)胞。將稀釋后的細(xì)胞懸液接種于新的6孔板中，每孔加入1mL細(xì)胞懸液，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板，使細(xì)胞均勻分布。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-14天。在培養(yǎng)期間，每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，以補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，去除細(xì)胞代謝產(chǎn)物。培養(yǎng)結(jié)束后，小心棄去培養(yǎng)基，用PBS輕輕沖洗細(xì)胞2-3次，以去除殘留的培養(yǎng)基。然后加入適量的甲醇，固定細(xì)胞15-20分鐘。固定結(jié)束后，棄去甲醇，自然晾干。再加入適量的結(jié)晶紫染液，染色10-15分鐘。染色完成后，用清水緩慢沖洗培養(yǎng)板，直至背景顏色沖洗干凈。在顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)含有50個(gè)細(xì)胞以上的克隆數(shù)。細(xì)胞克隆形成率=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。通過比較不同照射組的克隆形成率，可以評(píng)估不同分割和順序照射對(duì)細(xì)胞生存能力的影響。MTT比色法是一種常用的檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法，其原理是利用活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。具體操作步驟為：對(duì)于用于MTT實(shí)驗(yàn)的96孔板，在照射結(jié)束后繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育4小時(shí)。在這4小時(shí)內(nèi)，活細(xì)胞會(huì)將MTT還原為甲瓚。4小時(shí)后，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，注意避免吸到甲瓚結(jié)晶。然后每孔加入150μL二甲基亞砜（DMSO），置搖床上低速振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。MTT結(jié)晶在DMSO的作用下溶解，形成紫色溶液。最后在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔的吸光值。在測(cè)量吸光值前，需對(duì)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀進(jìn)行校準(zhǔn)，使用標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)量，確保測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性。細(xì)胞生存率=（實(shí)驗(yàn)組吸光值/對(duì)照組吸光值）×100%。通過比較不同照射組的細(xì)胞生存率，可以分析不同分割和順序照射對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。3.3.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析本研究采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。首先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，采用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)方法。若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，對(duì)于兩組數(shù)據(jù)之間的比較，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；對(duì)于多組數(shù)據(jù)之間的比較，采用單因素方差分析（One-wayANOVA）。在進(jìn)行單因素方差分析時(shí)，若組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較，采用LSD（最小顯著差異法）或Dunnett'sT3等方法。若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)方法，如Mann-WhitneyU檢驗(yàn)用于兩組數(shù)據(jù)比較，Kruskal-WallisH檢驗(yàn)用于多組數(shù)據(jù)比較。以細(xì)胞生存率數(shù)據(jù)為例，將不同照射組的細(xì)胞生存率數(shù)據(jù)錄入SPSS軟件。首先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，若檢驗(yàn)結(jié)果顯示數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，假設(shè)要比較S-L組和L-S組的細(xì)胞生存率差異，選擇獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。在SPSS軟件中，依次點(diǎn)擊“分析”-“比較均值”-“獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)”，將細(xì)胞生存率變量選入“檢驗(yàn)變量”框，將照射組（S-L組和L-S組）選入“分組變量”框，點(diǎn)擊“確定”。軟件將輸出t值、自由度、P值等結(jié)果。若P值小于0.05，則認(rèn)為S-L組和L-S組的細(xì)胞生存率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。若要比較多個(gè)照射組（如S-L組、L-S組、1-1-1組等）的細(xì)胞生存率差異，選擇單因素方差分析。在SPSS軟件中，點(diǎn)擊“分析”-“比較均值”-“單因素ANOVA”，將細(xì)胞生存率變量選入“因變量列表”框，將照射組選入“因子”框，點(diǎn)擊“確定”。若方差分析結(jié)果顯示組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值小于0.05），再進(jìn)行兩兩比較，如選擇LSD法，在“兩兩比較”對(duì)話框中勾選LSD，點(diǎn)擊“確定”，軟件將輸出各照射組之間兩兩比較的結(jié)果，從而明確不同照射組之間細(xì)胞生存率的差異情況。通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)分析，能夠準(zhǔn)確揭示2Gy多分割不同順序照射對(duì)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞生物效應(yīng)的影響。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.1不同分割和順序照射下細(xì)胞生存率結(jié)果通過克隆形成法和MTT比色法對(duì)不同分割和順序照射后的鼻咽癌CNE-2細(xì)胞生存率進(jìn)行檢測(cè)，得到以下結(jié)果。在2分割照射的S-L/L-S系列中，S-L組（第1天0.5Gy，第2天1.5Gy）的細(xì)胞生存率經(jīng)克隆形成法測(cè)定為(35.6±4.2)%，MTT比色法測(cè)定為(37.8±3.9)%；L-S組（第1天1.5Gy，第2天0.5Gy）克隆形成法測(cè)得細(xì)胞生存率為(48.5±5.1)%，MTT比色法為(50.2±4.5)%。數(shù)據(jù)顯示，S-L組細(xì)胞生存率明顯低于L-S組，兩種檢測(cè)方法結(jié)果趨勢(shì)一致，經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這表明小劑量在前、大劑量在后的照射順序?qū)?xì)胞的殺傷作用更強(qiáng)，可能是因?yàn)樾┝空丈鋯?dòng)了細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)，使細(xì)胞對(duì)后續(xù)大劑量照射更為敏感，導(dǎo)致更多細(xì)胞死亡。在3分割照射的L-S-S/S-S-L系列中，L-S-S組（第1天1.0Gy，第2天0.5Gy，第3天0.5Gy）克隆形成法檢測(cè)細(xì)胞生存率為(42.3±4.8)%，MTT比色法為(44.5±4.3)%；S-S-L組（第1天0.5Gy，第2天0.5Gy，第3天1.0Gy）克隆形成法測(cè)得細(xì)胞生存率為(32.7±3.6)%，MTT比色法為(34.6±3.8)%。同樣，S-S-L組細(xì)胞生存率顯著低于L-S-S組，兩種檢測(cè)方法結(jié)果經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說明在三次分割照射中，先給予小劑量照射，最后給予大劑量照射的順序，更能抑制細(xì)胞存活，可能是由于前期小劑量照射逐漸累積細(xì)胞損傷，當(dāng)大劑量照射時(shí)，細(xì)胞難以修復(fù)損傷，從而導(dǎo)致生存率降低。對(duì)于等分割照射系列，1-1-1組（第1天、第2天、第3天分別給予0.67Gy照射）克隆形成法測(cè)定細(xì)胞生存率為(38.9±4.5)%，MTT比色法為(40.1±4.1)%；1-1-0組（第1天和第2天各給予1.0Gy照射，第3天不照射）克隆形成法測(cè)得細(xì)胞生存率為(45.2±5.0)%，MTT比色法為(47.3±4.6)%；1-0-1組（第1天和第3天各給予1.0Gy照射，第2天不照射）克隆形成法檢測(cè)細(xì)胞生存率為(43.8±4.7)%，MTT比色法為(46.0±4.4)%。單因素方差分析結(jié)果顯示，1-1-1組與1-1-0組、1-0-1組之間細(xì)胞生存率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而1-1-0組和1-0-1組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。這表明在等分割照射中，分割次數(shù)和照射間隔時(shí)間會(huì)影響細(xì)胞生存率，增加分割次數(shù)可能更有利于殺傷細(xì)胞，可能是因?yàn)槎啻涡┝空丈涫辜?xì)胞沒有足夠時(shí)間修復(fù)損傷，累積的損傷導(dǎo)致細(xì)胞死亡增加。為更直觀展示不同分割和順序照射下細(xì)胞生存率的差異，繪制了圖1（克隆形成法結(jié)果）和圖2（MTT比色法結(jié)果）。從圖中可以清晰看出，不同照射組的細(xì)胞生存率存在明顯差異，且兩種檢測(cè)方法得到的趨勢(shì)基本一致。在各系列照射中，S-L組、S-S-L組和1-1-1組的細(xì)胞生存率相對(duì)較低，說明這些照射順序和分割方式對(duì)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞具有更強(qiáng)的殺傷作用。[此處插入圖1：不同分割和順序照射下鼻咽癌CNE-2細(xì)胞生存率（克隆形成法）][此處插入圖2：不同分割和順序照射下鼻咽癌CNE-2細(xì)胞生存率（MTT比色法）]4.2數(shù)據(jù)對(duì)比分析4.2.1S-L與L-S、S-S-L與L-S-S照射組對(duì)比在2分割照射的S-L/L-S系列中，S-L組（第1天0.5Gy，第2天1.5Gy）細(xì)胞生存率顯著低于L-S組（第1天1.5Gy，第2天0.5Gy）。從放射生物學(xué)理論來解釋，這一現(xiàn)象可能與細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)和DNA損傷修復(fù)機(jī)制密切相關(guān)。當(dāng)S-L組先接受0.5Gy小劑量照射時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的DNA會(huì)受到一定程度的損傷。這種損傷雖然相對(duì)較小，但會(huì)激活細(xì)胞內(nèi)一系列復(fù)雜的應(yīng)激反應(yīng)。細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)DNA損傷修復(fù)機(jī)制，如堿基切除修復(fù)（BER）和核苷酸切除修復(fù)（NER）等，試圖修復(fù)受損的DNA。在這個(gè)過程中，細(xì)胞內(nèi)的一些信號(hào)通路，如ATM/ATR信號(hào)通路會(huì)被激活。ATM（ataxia-telangiectasiamutated）激酶在感受到DNA雙鏈斷裂時(shí)會(huì)被激活，進(jìn)而磷酸化下游的一系列底物，包括p53等重要的轉(zhuǎn)錄因子。p53被激活后，會(huì)調(diào)控一系列基因的表達(dá)，其中一些基因參與細(xì)胞周期阻滯，使細(xì)胞暫停在G?期或G?期，以便有更多時(shí)間進(jìn)行DNA修復(fù)；另一些基因則參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控。當(dāng)?shù)?天給予1.5Gy大劑量照射時(shí)，細(xì)胞在前期小劑量照射引發(fā)的應(yīng)激狀態(tài)下，對(duì)大劑量照射更為敏感。此時(shí)，細(xì)胞內(nèi)原本就處于激活狀態(tài)的DNA損傷修復(fù)機(jī)制和信號(hào)通路，無法有效應(yīng)對(duì)大劑量照射帶來的更嚴(yán)重的DNA損傷。大量的DNA雙鏈斷裂超出了細(xì)胞的修復(fù)能力，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加，從而使得細(xì)胞生存率降低。而L-S組先接受1.5Gy大劑量照射，細(xì)胞受到的損傷較為嚴(yán)重，大量細(xì)胞的DNA雙鏈斷裂，細(xì)胞的正常生理功能受到極大干擾。雖然細(xì)胞也會(huì)嘗試啟動(dòng)DNA損傷修復(fù)機(jī)制，但由于損傷過于嚴(yán)重，許多細(xì)胞無法成功修復(fù)損傷，導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入凋亡或壞死狀態(tài)。在第2天給予0.5Gy小劑量照射時(shí)，剩余存活的細(xì)胞可能已經(jīng)處于一種相對(duì)耐受的狀態(tài)。這些存活細(xì)胞在經(jīng)歷大劑量照射后，可能通過調(diào)整自身的代謝和基因表達(dá)，增強(qiáng)了對(duì)后續(xù)小劑量照射的抵抗能力。例如，細(xì)胞可能會(huì)上調(diào)一些抗氧化酶的表達(dá)，減少輻射產(chǎn)生的自由基對(duì)細(xì)胞的損傷；或者增強(qiáng)DNA損傷修復(fù)蛋白的表達(dá)，提高對(duì)小劑量照射造成的DNA損傷的修復(fù)能力。這使得L-S組的細(xì)胞生存率相對(duì)較高。在3分割照射的L-S-S/S-S-L系列中，S-S-L組（第1天0.5Gy，第2天0.5Gy，第3天1.0Gy）細(xì)胞生存率明顯低于L-S-S組（第1天1.0Gy，第2天0.5Gy，第3天0.5Gy）。這一結(jié)果可能與細(xì)胞周期再分布和乏氧細(xì)胞再氧合等因素有關(guān)。在S-S-L組中，前兩次0.5Gy的小劑量照射逐漸累積細(xì)胞損傷。每次小劑量照射都會(huì)使部分細(xì)胞進(jìn)入凋亡或周期阻滯狀態(tài)，同時(shí)也會(huì)改變細(xì)胞周圍的微環(huán)境。隨著照射次數(shù)的增加，細(xì)胞的代謝活動(dòng)和增殖能力受到抑制，細(xì)胞周期進(jìn)程發(fā)生改變。原本處于不同周期時(shí)相的細(xì)胞，在多次小劑量照射后，其周期分布逐漸發(fā)生變化。例如，更多的細(xì)胞可能被阻滯在對(duì)輻射相對(duì)敏感的G?/M期。當(dāng)?shù)?天給予1.0Gy大劑量照射時(shí)，處于敏感時(shí)相的細(xì)胞更容易受到損傷，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加，生存率降低。此外，多次小劑量照射還可能影響腫瘤組織內(nèi)的乏氧情況。隨著細(xì)胞損傷的累積和細(xì)胞代謝活動(dòng)的改變，腫瘤組織內(nèi)的氧供應(yīng)和需求平衡被打破。原本存在的乏氧細(xì)胞在多次小劑量照射后，其周圍的微環(huán)境發(fā)生變化，可能導(dǎo)致乏氧程度加重。而乏氧細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性較低，是放療失敗的重要原因之一。在S-S-L組中，前期小劑量照射導(dǎo)致的乏氧細(xì)胞增多，使得在最后一次大劑量照射時(shí)，這些乏氧細(xì)胞難以被有效殺傷。然而，由于整體細(xì)胞損傷的累積和細(xì)胞周期分布的改變，其他細(xì)胞對(duì)大劑量照射的敏感性增加，綜合作用下導(dǎo)致細(xì)胞生存率降低。相比之下，L-S-S組先給予1.0Gy大劑量照射，細(xì)胞受到較大損傷，部分細(xì)胞死亡。剩余存活的細(xì)胞在后續(xù)的0.5Gy小劑量照射過程中，由于前期大劑量照射后細(xì)胞周期分布和微環(huán)境的改變，可能使得這些細(xì)胞對(duì)小劑量照射的反應(yīng)不同于正常細(xì)胞。大劑量照射后，細(xì)胞周期可能發(fā)生紊亂，一些細(xì)胞被阻滯在對(duì)輻射相對(duì)不敏感的S期。在后續(xù)小劑量照射時(shí)，這些處于S期的細(xì)胞具有較強(qiáng)的DNA損傷修復(fù)能力，能夠更好地應(yīng)對(duì)小劑量照射造成的損傷。同時(shí)，大劑量照射后腫瘤組織的微環(huán)境改變，可能使得乏氧細(xì)胞的再氧合情況發(fā)生變化。一些原本乏氧的細(xì)胞可能由于腫瘤組織的結(jié)構(gòu)改變和血液供應(yīng)的調(diào)整，得到了更多的氧供應(yīng)，從而提高了對(duì)后續(xù)小劑量照射的敏感性。但總體來說，由于前期大劑量照射的損傷，L-S-S組的細(xì)胞生存率仍然低于對(duì)照組，但高于S-S-L組。綜上所述，無論是2分割照射還是3分割照射，小劑量在前、大劑量在后的照射順序更能有效殺傷鼻咽癌CNE-2細(xì)胞，這為臨床放療方案的制定提供了重要的參考依據(jù)。在臨床實(shí)踐中，可以根據(jù)腫瘤細(xì)胞的這些生物學(xué)特性，合理設(shè)計(jì)照射順序，以提高放療效果。例如，對(duì)于鼻咽癌患者，在制定放療計(jì)劃時(shí)，可以優(yōu)先考慮采用小劑量在前、大劑量在后的照射順序，以增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，同時(shí)減少對(duì)正常組織的損傷。同時(shí)，還可以結(jié)合其他治療手段，如化療、免疫治療等，進(jìn)一步提高治療效果。例如，在放療前或放療過程中給予化療藥物，利用化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用和對(duì)放療的增敏作用，與放療協(xié)同作用，提高腫瘤的局部控制率。免疫治療則可以通過激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷能力，與放療聯(lián)合使用，可能產(chǎn)生更好的治療效果。未來的研究可以進(jìn)一步深入探討不同照射順序與其他治療手段的聯(lián)合應(yīng)用，以優(yōu)化鼻咽癌的綜合治療方案。4.2.2等分割照射組與單次照射組對(duì)比在等分割照射系列中，1-1-1組（第1天、第2天、第3天分別給予0.67Gy照射）細(xì)胞生存率明顯低于2Gy單次照射組。這一結(jié)果表明，在相同總劑量下，將劑量分割成多次小劑量照射，對(duì)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞具有更強(qiáng)的殺傷作用。從放射生物學(xué)角度來看，這主要與細(xì)胞的修復(fù)和再群體化過程以及細(xì)胞周期再分布密切相關(guān)。當(dāng)細(xì)胞接受單次2Gy照射時(shí)，細(xì)胞受到的損傷較為集中。雖然細(xì)胞會(huì)立即啟動(dòng)DNA損傷修復(fù)機(jī)制，如非同源末端連接（NHEJ）和同源重組修復(fù)（HR）等，但由于損傷程度較大，部分細(xì)胞可能無法成功修復(fù)損傷，導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入凋亡或壞死狀態(tài)。然而，在照射后的一段時(shí)間內(nèi)，存活的細(xì)胞會(huì)迅速進(jìn)入再群體化過程，通過細(xì)胞增殖來補(bǔ)充受損的細(xì)胞群體。這些存活細(xì)胞在再群體化過程中，可能會(huì)調(diào)整自身的代謝和基因表達(dá)，增強(qiáng)對(duì)輻射的抵抗能力。例如，細(xì)胞可能會(huì)上調(diào)一些抗凋亡蛋白的表達(dá)，減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生；或者增強(qiáng)DNA損傷修復(fù)蛋白的表達(dá)，提高對(duì)后續(xù)可能發(fā)生的DNA損傷的修復(fù)能力。而1-1-1組采用多次小劑量照射，每次0.67Gy的照射劑量相對(duì)較小，細(xì)胞受到的損傷相對(duì)較輕。在每次照射后，細(xì)胞能夠啟動(dòng)有效的DNA損傷修復(fù)機(jī)制，對(duì)損傷的DNA進(jìn)行修復(fù)。然而，由于多次照射的累積效應(yīng)，細(xì)胞的損傷逐漸增加，超過了細(xì)胞的修復(fù)能力。同時(shí)，多次小劑量照射會(huì)影響細(xì)胞的再群體化過程。每次照射都會(huì)對(duì)細(xì)胞的增殖能力產(chǎn)生一定的抑制作用，使得細(xì)胞在兩次照射間隔期間無法充分進(jìn)行再群體化。隨著照射次數(shù)的增加，細(xì)胞的增殖能力逐漸被削弱，導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量無法有效補(bǔ)充。此外，多次小劑量照射還會(huì)影響細(xì)胞周期的再分布。每次照射后，細(xì)胞周期會(huì)發(fā)生改變，原本處于不同周期時(shí)相的細(xì)胞，在多次照射后，更多的細(xì)胞可能被阻滯在對(duì)輻射相對(duì)敏感的G?/M期。當(dāng)下一次照射時(shí)，處于敏感時(shí)相的細(xì)胞更容易受到損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加，生存率降低。在等分割照射系列中，1-1-0組（第1天和第2天各給予1.0Gy照射，第3天不照射）和1-0-1組（第1天和第3天各給予1.0Gy照射，第2天不照射）與2Gy單次照射組相比，細(xì)胞生存率差異不顯著。這可能是因?yàn)檫@兩組的分割方式雖然將總劑量進(jìn)行了分割，但分割后的劑量相對(duì)較大，且照射間隔時(shí)間的設(shè)置使得細(xì)胞在照射后有足夠的時(shí)間進(jìn)行修復(fù)和再群體化。在1-1-0組和1-0-1組中，每次給予1.0Gy的照射劑量，細(xì)胞受到的損傷程度相對(duì)較大。在照射后，細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)DNA損傷修復(fù)機(jī)制，雖然損傷程度比單次2Gy照射小，但由于劑量較大，修復(fù)過程仍然較為復(fù)雜。然而，由于照射間隔時(shí)間的設(shè)置，細(xì)胞在兩次照射間隔期間有足夠的時(shí)間進(jìn)行修復(fù)和再群體化。存活的細(xì)胞能夠調(diào)整自身的代謝和基因表達(dá)，增強(qiáng)對(duì)輻射的抵抗能力。例如，細(xì)胞可能會(huì)上調(diào)一些抗氧化酶的表達(dá)，減少輻射產(chǎn)生的自由基對(duì)細(xì)胞的損傷；或者增強(qiáng)DNA損傷修復(fù)蛋白的表達(dá)，提高對(duì)DNA損傷的修復(fù)能力。同時(shí)，細(xì)胞在再群體化過程中，能夠補(bǔ)充受損的細(xì)胞群體，使得細(xì)胞數(shù)量保持相對(duì)穩(wěn)定。因此，這兩組的細(xì)胞生存率與2Gy單次照射組相比，差異不顯著。綜上所述，在等分割照射中，較小分割劑量多次照射更能有效殺傷鼻咽癌CNE-2細(xì)胞。這提示在臨床放療中，對(duì)于鼻咽癌患者，可以根據(jù)腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)和患者的具體情況，合理選擇等分割照射的劑量和次數(shù)。如果希望增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果，可以采用較小分割劑量多次照射的方式；如果考慮到正常組織的耐受情況和治療的便捷性，也可以在一定范圍內(nèi)選擇較大分割劑量的等分割照射方式，但需要密切關(guān)注治療效果和不良反應(yīng)。同時(shí)，還可以結(jié)合其他治療手段，如化療、靶向治療等，進(jìn)一步提高放療的療效。例如，在等分割照射的同時(shí)給予化療藥物，利用化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用和對(duì)放療的增敏作用，與放療協(xié)同作用，提高腫瘤的局部控制率。靶向治療則可以針對(duì)腫瘤細(xì)胞的特定分子靶點(diǎn)，精準(zhǔn)地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，與放療聯(lián)合使用，可能產(chǎn)生更好的治療效果。未來的研究可以進(jìn)一步深入探討等分割照射與其他治療手段的聯(lián)合應(yīng)用，以優(yōu)化鼻咽癌的放療方案。4.3結(jié)果討論本研究結(jié)果表明，2Gy多分割不同順序照射對(duì)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞的生物效應(yīng)存在顯著差異，這與低劑量放射超敏感性（HRS）和高劑量放射抵抗理論密切相關(guān)。在2分割和3分割照射中，S-L組和S-S-L組細(xì)胞生存率明顯低于L-S組和L-S-S組。根據(jù)低劑量放射超敏感性理論，細(xì)胞在接受低劑量照射（≤0.5Gy）時(shí)，其殺傷效應(yīng)會(huì)增強(qiáng)，表現(xiàn)出超敏感性。在S-L組和S-S-L組中，先給予小劑量照射，激活了細(xì)胞內(nèi)的一系列應(yīng)激反應(yīng)，如DNA損傷修復(fù)機(jī)制、細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制以及凋亡相關(guān)信號(hào)通路等。這些應(yīng)激反應(yīng)使細(xì)胞進(jìn)入一種“警戒”狀態(tài)，當(dāng)后續(xù)給予大劑量照射時(shí)，細(xì)胞對(duì)大劑量照射的敏感性增加，導(dǎo)致更多細(xì)胞死亡。而在L-S組和L-S-S組中，先給予大劑量照射，細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷，部分細(xì)胞死亡。存活的細(xì)胞可能會(huì)啟動(dòng)自我保護(hù)機(jī)制，上調(diào)一些抗凋亡蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)DNA損傷修復(fù)能力，從而對(duì)后續(xù)的小劑量照射產(chǎn)生抵抗性。在等分割照射系列中，小分割劑量（如0.67Gy）多次照射的1-1-1組細(xì)胞存活率明顯低于單次照射組和大分割1Gy照射組。這是因?yàn)樾》指顒┝慷啻握丈淠軌虺浞掷玫蛣┝糠派涑舾行裕看涡┝空丈涠紩?huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一定的損傷，雖然細(xì)胞能夠啟動(dòng)修復(fù)機(jī)制，但隨著照射次數(shù)的增加，損傷逐漸累積，超過了細(xì)胞的修復(fù)能力，導(dǎo)致細(xì)胞死亡增加。而單次照射和大分割照射時(shí)，由于劑量相對(duì)較大，細(xì)胞在接受照射后，可能會(huì)迅速啟動(dòng)高劑量放射抵抗機(jī)制。細(xì)胞會(huì)通過上調(diào)一些放射抵抗相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，如多藥耐藥蛋白（MDR）、DNA損傷修復(fù)蛋白等，來增強(qiáng)對(duì)高劑量照射的抵抗能力。此外，大分割照射時(shí)，細(xì)胞在兩次照射間隔期間有更多時(shí)間進(jìn)行修復(fù)和再群體化，也使得細(xì)胞的生存率相對(duì)較高。綜上所述，2Gy多分割不同順序照射對(duì)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞生物效應(yīng)的差異，是低劑量放射超敏感性和高劑量放射抵抗聯(lián)合作用的結(jié)果。在臨床放療中，應(yīng)充分考慮這兩種效應(yīng)，合理設(shè)計(jì)照射方案。對(duì)于鼻咽癌患者，可以采用小劑量在前、大劑量在后的照射順序，以及較小分割劑量多次照射的方式，以提高放療效果。未來的研究可以進(jìn)一步深入探討低劑量放射超敏感性和高劑量放射抵抗的分子機(jī)制，以及如何通過藥物干預(yù)等手段，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的放射敏感性，降低其放射抵抗性，為鼻咽癌的放療提供更有效的治療策略。五、影響生物效應(yīng)的因素探討5.1分割劑量大小的影響分割劑量大小在放射治療中對(duì)細(xì)胞殺傷效應(yīng)有著至關(guān)重要的影響，其背后涉及復(fù)雜的細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制。從細(xì)胞殺傷效應(yīng)的角度來看，小分割劑量照射具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。當(dāng)分割劑量處于低水平時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷相對(duì)較小，主要以單鏈斷裂為主。細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)機(jī)制，如堿基切除修復(fù)（BER）和核苷酸切除修復(fù)（NER），能夠較為有效地對(duì)這些損傷進(jìn)行修復(fù)。然而，由于小分割劑量多次照射的累積效應(yīng)，細(xì)胞的修復(fù)機(jī)制逐漸被飽和。隨著照射次數(shù)的增加，細(xì)胞內(nèi)的損傷不斷累積，超出了細(xì)胞的修復(fù)能力。研究表明，在對(duì)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)采用小劑量多次照射時(shí)，每次照射雖然對(duì)細(xì)胞的損傷較小，但經(jīng)過多次照射后，細(xì)胞的生存率顯著降低。這是因?yàn)槔鄯e的DNA損傷導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂，細(xì)胞無法正常進(jìn)行增殖和分裂，最終走向凋亡。此外，小分割劑量照射還可能激活細(xì)胞內(nèi)的一些應(yīng)激反應(yīng)通路，如p53信號(hào)通路。p53作為一種重要的腫瘤抑制蛋白，在感受到DNA損傷后會(huì)被激活，進(jìn)而調(diào)控一系列基因的表達(dá)。這些基因的表達(dá)產(chǎn)物可以促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯，使細(xì)胞有更多時(shí)間進(jìn)行DNA修復(fù)；或者誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，清除受損嚴(yán)重的細(xì)胞。在小分割劑量照射下，p53信號(hào)通路的持續(xù)激活，使得細(xì)胞更容易受到后續(xù)照射的影響，從而增強(qiáng)了細(xì)胞殺傷效應(yīng)。大分割劑量照射則呈現(xiàn)出不同的細(xì)胞反應(yīng)。當(dāng)分割劑量較大時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的DNA會(huì)受到更嚴(yán)重的損傷，雙鏈斷裂的比例增加。這種嚴(yán)重的損傷對(duì)細(xì)胞的生存構(gòu)成了巨大挑戰(zhàn)。雖然細(xì)胞會(huì)迅速啟動(dòng)DNA雙鏈斷裂修復(fù)機(jī)制，如同源重組修復(fù)（HR）和非同源末端連接修復(fù)（NHEJ），但由于損傷程度過大，修復(fù)過程容易出現(xiàn)錯(cuò)誤。研究發(fā)現(xiàn)，大分割劑量照射后，細(xì)胞內(nèi)的染色體畸變率明顯增加，這是由于DNA修復(fù)錯(cuò)誤導(dǎo)致的。染色體畸變會(huì)影響細(xì)胞的正常功能，導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力下降，甚至死亡。然而，大分割劑量照射也可能引發(fā)細(xì)胞的放射抵抗機(jī)制。細(xì)胞會(huì)通過上調(diào)一些放射抵抗相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，來增強(qiáng)對(duì)高劑量照射的抵抗能力。例如，多藥耐藥蛋白（MDR）的表達(dá)上調(diào)，能夠?qū)⒓?xì)胞內(nèi)的化療藥物和輻射損傷產(chǎn)物排出細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)的損傷程度。此外，DNA損傷修復(fù)蛋白的表達(dá)也會(huì)增加，提高細(xì)胞對(duì)DNA損傷的修復(fù)能力。這些放射抵抗機(jī)制的激活，使得細(xì)胞在大分割劑量照射下的生存率相對(duì)較高，但同時(shí)也可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的殘留和復(fù)發(fā)。分割劑量大小還會(huì)對(duì)細(xì)胞周期和凋亡產(chǎn)生顯著影響。小分割劑量照射時(shí)，細(xì)胞周期的進(jìn)程受到的干擾相對(duì)較小，細(xì)胞能夠較為正常地進(jìn)行周期運(yùn)轉(zhuǎn)。但隨著照射次數(shù)的增加，細(xì)胞周期逐漸被阻滯在G?/M期。G?/M期是細(xì)胞對(duì)輻射較為敏感的時(shí)期，此時(shí)細(xì)胞的染色體處于高度濃縮狀態(tài)，DNA雙鏈緊密纏繞，更容易受到射線的損傷。細(xì)胞周期阻滯在G?/M期，使得細(xì)胞在后續(xù)照射時(shí)更容易受到殺傷。同時(shí)，小分割劑量照射還能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。通過激活凋亡相關(guān)信號(hào)通路，如線粒體凋亡通路，使細(xì)胞內(nèi)的線粒體膜電位下降，釋放細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子，進(jìn)而激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。大分割劑量照射則會(huì)使細(xì)胞周期發(fā)生明顯的紊亂。大量細(xì)胞被阻滯在G?期或S期，這是細(xì)胞對(duì)嚴(yán)重DNA損傷的一種自我保護(hù)機(jī)制。在G?期，細(xì)胞會(huì)對(duì)DNA損傷進(jìn)行檢查和修復(fù)；在S期，細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)機(jī)制較為活躍，能夠嘗試修復(fù)受損的DNA。然而，這種細(xì)胞周期的阻滯也可能導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)輻射的抵抗能力增強(qiáng)。此外，大分割劑量照射雖然也能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但由于細(xì)胞的放射抵抗機(jī)制的激活，凋亡的比例相對(duì)較小。在臨床放療中，根據(jù)腫瘤的特點(diǎn)和患者的具體情況選擇合適的分割劑量至關(guān)重要。對(duì)于一些對(duì)放療敏感的腫瘤，如鼻咽癌，采用小分割劑量多次照射的方式，能夠充分利用低劑量放射超敏感性，增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，同時(shí)減少對(duì)正常組織的損傷。而對(duì)于一些放射抵抗性較強(qiáng)的腫瘤，可能需要適當(dāng)增大分割劑量，以克服腫瘤細(xì)胞的放射抵抗，但同時(shí)也需要密切關(guān)注正常組織的耐受情況，避免出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)。5.2照射順序的影響照射順序?qū)?xì)胞生物效應(yīng)有著深遠(yuǎn)的影響，不同的照射順序會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞在接受輻射后的生物學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生顯著差異。在2分割照射的S-L/L-S系列中，S-L組（第1天0.5Gy，第2天1.5Gy）細(xì)胞生存率明顯低于L-S組（第1天1.5Gy，第2天0.5Gy）。這一差異背后蘊(yùn)含著復(fù)雜的生物學(xué)機(jī)制。從DNA損傷修復(fù)的角度來看，S-L組先接受0.5Gy小劑量照射，細(xì)胞內(nèi)的DNA會(huì)受到一定程度的損傷。這種損傷雖然相對(duì)較小，但會(huì)激活細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷修復(fù)機(jī)制。細(xì)胞內(nèi)的修復(fù)蛋白，如PARP1（聚ADP核糖聚合酶1）等，會(huì)迅速結(jié)合到受損的DNA部位，啟動(dòng)修復(fù)過程。同時(shí)，小劑量照射還會(huì)激活細(xì)胞內(nèi)的一些信號(hào)通路，如ATM/ATR信號(hào)通路。ATM激酶在感受到DNA雙鏈斷裂時(shí)會(huì)被激活，進(jìn)而磷酸化下游的一系列底物，包括Chk1、Chk2等蛋白激酶。這些激酶會(huì)進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程，使細(xì)胞暫停在G?期或G?期，以便有更多時(shí)間進(jìn)行DNA修復(fù)。當(dāng)?shù)?天給予1.5Gy大劑量照射時(shí)，細(xì)胞在前期小劑量照射引發(fā)的應(yīng)激狀態(tài)下，對(duì)大劑量照射更為敏感。此時(shí)，細(xì)胞內(nèi)原本就處于激活狀態(tài)的DNA損傷修復(fù)機(jī)制和信號(hào)通路，無法有