FOLR1在鼻咽癌細胞抵抗紫杉醇化療中的作用及機制研究一、引言1.1研究背景1.1.1鼻咽癌概述鼻咽癌（NasopharyngealCarcinoma，NPC）是一種原發(fā)于鼻咽腔頂部和側(cè)壁的惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)出顯著的地域和種族差異。中國南方及東南亞地區(qū)是鼻咽癌的高發(fā)區(qū)域，如廣東省四會市2010年世標率高達26.49/10萬，男性發(fā)病率更是女性的1.4-2.0倍，因此鼻咽癌又被稱為“廣東瘤”。據(jù)2012年WHO估計，全球新發(fā)鼻咽癌病例約8.6萬，死亡5.1萬人，其中80％來自亞洲，中國每年新發(fā)患者約占全球的38％，死亡人數(shù)約占40％。鼻咽癌嚴重威脅患者的生命健康，其常見臨床癥狀包括鼻塞、涕中帶血、耳悶堵感、聽力下降、復視及頭痛等，若未及時治療，腫瘤細胞極易向全身器官擴散轉(zhuǎn)移，如轉(zhuǎn)移至腦部，會壓迫腦神經(jīng)和視神經(jīng)，導致患者頭暈頭痛和視力下降。放射治療是鼻咽癌的首選治療方法，多數(shù)鼻咽癌對放射治療具有中度敏感性。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，手術(shù)、化療和放療等綜合治療方式逐漸應用，但鼻咽癌的治療仍面臨諸多挑戰(zhàn)，其治愈率相對較低，患者生活質(zhì)量受到嚴重影響。1.1.2紫杉醇化療藥物在鼻咽癌治療中的應用紫杉醇（Paclitaxel）是一種廣泛應用于多種癌癥治療的化療藥物，其通過促進微管蛋白聚合、抑制解聚，從而阻滯細胞分裂和增殖，達到抗腫瘤的目的。在鼻咽癌治療中，紫杉醇也發(fā)揮著一定的作用，它不僅能夠直接抑制癌細胞生長，還具有增強放療藥物療效的作用，可有效殺死腫瘤細胞，防止腫瘤細胞轉(zhuǎn)移。臨床上，紫杉醇常與其他化療藥物聯(lián)合使用，用于鼻咽癌的輔助治療。然而，隨著紫杉醇的廣泛應用，耐藥問題日益凸顯。許多鼻咽癌患者在長期使用紫杉醇后，逐漸對藥物產(chǎn)生抵抗，導致治療效果不佳。研究表明，鼻咽癌細胞的抗藥性程度相對較高，耐藥機制較為復雜，涉及多種基因和蛋白質(zhì)表達水平的變化，這使得紫杉醇在鼻咽癌治療中的應用受到限制，尋找克服紫杉醇耐藥的方法成為亟待解決的問題。1.1.3FOLR1研究現(xiàn)狀FOLR1（Folatereceptor1），即葉酸受體1，是一種結(jié)合葉酸的受體蛋白，在惡性腫瘤領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。FOLR1主要通過GPI錨定于細胞膜，能夠結(jié)合葉酸并引導其進入細胞。在正常組織中，F(xiàn)OLR1表達量極低，但在許多惡性腫瘤細胞中，其表達水平顯著升高，如在上皮性卵巢癌中表達比例約為76-96%，在非小細胞肺癌中過表達比例約為14-87%。FOLR1的高表達與腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移等生命活動密切相關(guān)，其可能通過參與癌細胞信號轉(zhuǎn)導與促生存信號通路，促進腫瘤的發(fā)展。在鼻咽癌研究中，F(xiàn)OLR1同樣展現(xiàn)出重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OLR1在鼻咽癌細胞中的表達水平較高，且與細胞對紫杉醇的耐藥性密切相關(guān)。從RNA水平檢測發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OLR1表達量與癌細胞株紫杉醇藥物的敏感性呈負相關(guān)，與鼻咽癌耐藥細胞的耐藥指數(shù)呈正相關(guān)。進一步研究表明，使用FOLR1抑制劑（如Methotrexate、Leucovorin等）可以提高鼻咽癌細胞對紫杉醇的敏感性，降低細胞的耐藥性。然而，F(xiàn)OLR1在鼻咽癌細胞抵抗紫杉醇化療藥物中的具體作用機制尚未完全明確，仍需深入研究。深入探討FOLR1與鼻咽癌細胞耐藥的關(guān)系，對于揭示鼻咽癌紫杉醇耐藥機制、尋找新的治療靶點具有重要意義。1.2研究目的和意義本研究旨在深入探討FOLR1在鼻咽癌細胞抵抗紫杉醇化療藥物中的作用及機制。通過細胞實驗和分子生物學技術(shù)，明確FOLR1表達水平對鼻咽癌細胞對紫杉醇敏感性的影響，分析FOLR1與紫杉醇耐藥相關(guān)信號通路的關(guān)系，以及探索以FOLR1為靶點克服鼻咽癌紫杉醇耐藥的潛在策略。鼻咽癌是一種嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤，尤其是在我國南方地區(qū)，其發(fā)病率較高?；熢诒茄拾┑木C合治療中占據(jù)重要地位，紫杉醇作為常用的化療藥物之一，對鼻咽癌的治療有一定療效。然而，耐藥問題的出現(xiàn)嚴重限制了紫杉醇在鼻咽癌治療中的應用，導致患者治療效果不佳，生存率降低。因此，深入研究鼻咽癌細胞對紫杉醇的耐藥機制，尋找有效的逆轉(zhuǎn)耐藥方法，對于提高鼻咽癌的治療效果、改善患者預后具有重要的臨床意義。FOLR1作為一種在多種惡性腫瘤中高表達的蛋白質(zhì)，已被發(fā)現(xiàn)與腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，并且在鼻咽癌紫杉醇耐藥中也顯示出潛在的作用。研究FOLR1在鼻咽癌細胞抵抗紫杉醇化療藥物中的作用，不僅有助于揭示鼻咽癌紫杉醇耐藥的分子機制，為鼻咽癌的治療提供新的理論依據(jù)，還可能為開發(fā)新的治療靶點和藥物提供方向，從而優(yōu)化鼻咽癌的治療方案，提高患者的生存質(zhì)量和生存率。此外，本研究結(jié)果還可能對其他癌癥的耐藥研究和治療提供參考和借鑒，具有重要的科學價值和臨床應用前景。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1鼻咽癌的生物學特性鼻咽癌的細胞類型較為多樣，其中最常見的病理類型為未分化型非角化性癌，在我國高發(fā)地區(qū)，該類型約占鼻咽癌病例的90%以上。這種細胞類型的癌細胞缺乏角化現(xiàn)象，細胞形態(tài)相對單一，細胞核較大，核仁明顯，具有較強的增殖能力。除未分化型非角化性癌外，還包括角化性鱗狀細胞癌和分化型非角化性癌。角化性鱗狀細胞癌可見細胞間橋和角化珠形成，分化型非角化性癌則具有一定程度的細胞分化特征，但不如角化性鱗狀細胞癌明顯。鼻咽癌的生長特點表現(xiàn)為具有較強的局部浸潤性。鼻咽部位置特殊，周圍有諸多重要結(jié)構(gòu)，如顱底、咽旁間隙等。癌細胞常向周圍組織浸潤生長，侵犯顱底骨質(zhì)，可導致顱神經(jīng)受損，引起頭痛、面部麻木、復視等癥狀；侵犯咽旁間隙，可累及其中的神經(jīng)、血管，影響吞咽和發(fā)聲功能。在生長過程中，鼻咽癌還具有早期易轉(zhuǎn)移的特點。研究表明，約70%的患者在確診時已有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。其轉(zhuǎn)移途徑主要有淋巴道轉(zhuǎn)移和血道轉(zhuǎn)移。淋巴道轉(zhuǎn)移最為常見，癌細胞首先轉(zhuǎn)移至頸部淋巴結(jié)，通常按照一定的順序，從上頸部淋巴結(jié)逐漸向下頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。血道轉(zhuǎn)移相對較少見，但一旦發(fā)生，可轉(zhuǎn)移至全身多個器官，如骨、肺、肝等，其中骨轉(zhuǎn)移較為常見，患者可出現(xiàn)骨痛、病理性骨折等癥狀；肺轉(zhuǎn)移可導致咳嗽、咯血、呼吸困難等；肝轉(zhuǎn)移則可能引起肝功能異常、黃疸等。鼻咽癌的這些生物學特性，使其治療面臨諸多挑戰(zhàn)，也為研究其耐藥機制及尋找有效治療方法提出了更高的要求。2.2紫杉醇化療藥物作用機制紫杉醇的主要作用靶點是微管蛋白，微管作為細胞骨架的重要組成部分，在細胞的有絲分裂過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在正常的細胞有絲分裂前期，微管蛋白會不斷聚合和解聚，從而形成紡錘體，紡錘體微管與染色體的著絲粒相連，在分裂中期，染色體排列在赤道板上，隨后在分裂后期，微管收縮，牽引染色體向細胞兩極移動，完成細胞分裂。紫杉醇能夠特異性地結(jié)合到微管蛋白的β-微管蛋白亞基上，促進微管蛋白的聚合，使其形成穩(wěn)定的微管束。與正常情況下微管的動態(tài)平衡不同，紫杉醇結(jié)合后的微管穩(wěn)定性顯著增強，難以發(fā)生解聚。這導致細胞內(nèi)微管數(shù)量異常增多，且過度穩(wěn)定的微管無法正常發(fā)揮其在有絲分裂中的功能。紡錘體微管不能正常地與染色體著絲粒進行有效連接和牽引，染色體無法準確排列在赤道板上，也無法在后期被正確地分離到細胞兩極。細胞的有絲分裂進程被嚴重阻滯，無法順利完成分裂，最終停滯在有絲分裂期。當細胞長時間處于這種分裂阻滯狀態(tài)時，會激活細胞內(nèi)的凋亡信號通路，如線粒體凋亡途徑和死亡受體凋亡途徑。線粒體凋亡途徑中，細胞分裂受阻會導致線粒體膜電位下降，釋放細胞色素C，細胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）、半胱天冬酶-9（Caspase-9）前體等結(jié)合形成凋亡小體，激活Caspase-9，進而激活下游的Caspase-3等執(zhí)行凋亡程序。死亡受體凋亡途徑中，細胞表面的死亡受體如Fas等與相應配體結(jié)合，招募接頭蛋白FADD和Caspase-8前體形成死亡誘導信號復合物（DISC），激活Caspase-8，Caspase-8同樣可以激活Caspase-3等，引發(fā)細胞凋亡。通過上述機制，紫杉醇有效地抑制了腫瘤細胞的分裂和增殖，實現(xiàn)了其抗腫瘤的功效。2.3FOLR1的結(jié)構(gòu)與功能FOLR1基因位于人染色體11q13上，其編碼的蛋白質(zhì)由約300個氨基酸組成。FOLR1是一種糖蛋白，包含一個信號肽序列、一個高度保守的葉酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定序列。信號肽序列位于N端，在蛋白質(zhì)合成過程中引導FOLR1定位于細胞膜，隨后信號肽被切除。葉酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域是FOLR1的核心功能區(qū)域，該結(jié)構(gòu)域含有多個保守的氨基酸殘基，如精氨酸（Arg）、組氨酸（His）等，這些氨基酸通過氫鍵、離子鍵等相互作用與葉酸緊密結(jié)合。研究表明，F(xiàn)OLR1對還原型葉酸，如5-甲基四氫葉酸具有極高的親和力，解離常數(shù)（Kd）可達納摩爾級別。GPI錨定序列位于C端，通過共價鍵將FOLR1錨定在細胞膜外側(cè)，使得FOLR1能夠穩(wěn)定地存在于細胞表面，發(fā)揮其生物學功能。FOLR1主要定位于細胞膜表面，但在細胞內(nèi)的早期內(nèi)體、高爾基體等細胞器中也有少量分布。在細胞膜上，F(xiàn)OLR1通過GPI錨與脂質(zhì)筏相互作用，聚集在富含膽固醇和鞘磷脂的微結(jié)構(gòu)域中。這種定位方式有助于FOLR1與細胞表面的其他受體和信號分子相互作用，參與細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導過程。當細胞攝取葉酸時，F(xiàn)OLR1-葉酸復合物通過受體介導的內(nèi)吞作用進入細胞，形成早期內(nèi)體。在早期內(nèi)體的酸性環(huán)境下，葉酸與FOLR1解離，隨后FOLR1通過再循環(huán)途徑回到細胞膜表面，而葉酸則被轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)發(fā)揮其生物學功能。FOLR1在細胞內(nèi)的主要功能是介導葉酸的攝取。葉酸作為一種水溶性維生素，是細胞內(nèi)一碳單位代謝的重要輔酶，參與DNA合成、修復以及甲基化等過程。對于快速增殖的細胞，如腫瘤細胞，葉酸的需求量顯著增加。FOLR1通過特異性地結(jié)合葉酸，將其高效轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)，滿足細胞生長和增殖的需求。除了葉酸攝取功能外，F(xiàn)OLR1還參與細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導過程。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OLR1可以與多種信號分子相互作用，如Src激酶、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）等。當FOLR1與葉酸結(jié)合后，會引發(fā)其構(gòu)象變化，進而激活下游的信號通路，如PI3K/AKT和Ras/MAPK信號通路。這些信號通路的激活與腫瘤細胞的增殖、存活、遷移和侵襲等過程密切相關(guān)。在卵巢癌細胞中，F(xiàn)OLR1的高表達通過激活PI3K/AKT信號通路，促進細胞的增殖和存活，抑制細胞凋亡；在乳腺癌細胞中，F(xiàn)OLR1可以通過Ras/MAPK信號通路，調(diào)節(jié)細胞的遷移和侵襲能力。此外，F(xiàn)OLR1還可能參與腫瘤細胞的免疫逃逸過程，其具體機制尚待進一步研究。三、FOLR1與鼻咽癌細胞對紫杉醇敏感性的關(guān)系研究3.1實驗設(shè)計與方法3.1.1細胞系選擇與培養(yǎng)本研究選擇人鼻咽癌細胞系CNE-1和CNE-2作為研究對象。CNE-1和CNE-2細胞系均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。這兩種細胞系在鼻咽癌研究中應用廣泛，具有不同的生物學特性，CNE-1細胞相對增殖速度較慢，而CNE-2細胞增殖速度較快，能夠更全面地反映FOLR1在不同生長特性鼻咽癌細胞中的作用。將CNE-1和CNE-2細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）的RPMI-1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中還添加100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素以防止細菌污染。培養(yǎng)條件為37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱，每2-3天更換一次培養(yǎng)基。當細胞融合度達到80%-90%時，用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）進行消化傳代。具體操作如下：吸去舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕沖洗細胞2次，加入適量胰蛋白酶消化液，置于顯微鏡下觀察，當細胞開始變圓并脫離瓶壁時，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化。然后將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000r/min離心5min，棄上清，再用新鮮培養(yǎng)基重懸細胞，接種于新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。3.1.2FOLR1表達檢測方法采用免疫細胞化學方法檢測FOLR1在鼻咽癌細胞中的表達。首先，將對數(shù)生長期的CNE-1和CNE-2細胞接種于預先放置有蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中，每孔接種5×10?個細胞，培養(yǎng)24h，使細胞貼壁。然后，取出蓋玻片，用PBS緩沖液沖洗3次，每次5min。用4%多聚甲醛固定細胞15min，PBS沖洗3次。接著，用0.3%TritonX-100處理細胞10min以增加細胞膜通透性，PBS沖洗3次。加入5%山羊血清封閉液，室溫孵育30min，以減少非特異性結(jié)合。棄去封閉液，不洗，直接加入兔抗人FOLR1多克隆抗體（1:200稀釋），4℃孵育過夜。次日，取出培養(yǎng)板，用PBS沖洗3次，每次5min。加入山羊抗兔IgG-HRP（辣根過氧化物酶）二抗（1:500稀釋），室溫孵育1h。PBS沖洗3次后，加入DAB（3,3'-二氨基聯(lián)苯胺）顯色液顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，當出現(xiàn)棕黃色陽性信號時，用蒸餾水沖洗終止顯色。最后，用蘇木精復染細胞核5min，自來水沖洗返藍，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察，F(xiàn)OLR1陽性表達產(chǎn)物為棕黃色，位于細胞膜和細胞質(zhì)中。采用Image-ProPlus軟件對免疫細胞化學染色結(jié)果進行分析，計算陽性細胞率和平均光密度值，以評估FOLR1的表達水平。同時，采用Westernblotting方法進一步驗證FOLR1的表達。收集對數(shù)生長期的CNE-1和CNE-2細胞，用預冷的PBS緩沖液沖洗2次，加入適量RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30min。然后，將細胞裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，12000r/min，4℃離心15min，取上清液即為總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白樣品與5×上樣緩沖液混合，煮沸變性5min。取適量蛋白樣品進行SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳），電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF（聚偏二氟乙烯）膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1h，然后加入兔抗人FOLR1多克隆抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液沖洗PVDF膜3次，每次10min。加入山羊抗兔IgG-HRP二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1h。TBST緩沖液沖洗3次后，加入ECL（增強化學發(fā)光）發(fā)光液，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光顯影，檢測FOLR1蛋白條帶。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，采用ImageJ軟件分析FOLR1蛋白條帶的灰度值，計算FOLR1蛋白與β-actin蛋白灰度值的比值，以定量分析FOLR1的表達水平。為了從基因轉(zhuǎn)錄水平檢測FOLR1的表達，還運用RT-PCR（逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應）技術(shù)。使用Trizol試劑提取CNE-1和CNE-2細胞的總RNA，具體操作按照Trizol試劑說明書進行。提取的RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性，并用核酸蛋白測定儀測定其濃度和純度。取1μg總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應，合成cDNA。以cDNA為模板，進行PCR擴增。FOLR1引物序列為：上游引物5'-ATGGTGCTGCTGCTGCTG-3'，下游引物5'-TCAGCTTCTTCTTCTTCTTC-3'，擴增片段長度為250bp；內(nèi)參基因GAPDH引物序列為：上游引物5'-AAGGTCGGAGTCAACGGATTT-3'，下游引物5'-GGAAGATGGTGATGGGATTTC-3'，擴增片段長度為450bp。PCR反應體系為25μL，包括12.5μL2×TaqPCRMasterMix，1μL上游引物（10μmol/L），1μL下游引物（10μmol/L），2μLcDNA模板，8.5μLddH?O。PCR反應條件為：95℃預變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照，采用ImageJ軟件分析FOLR1擴增條帶與GAPDH擴增條帶的灰度值，計算兩者的比值，以評估FOLR1mRNA的表達水平。3.1.3紫杉醇敏感性實驗設(shè)計采用集落形成試驗檢測鼻咽癌細胞對紫杉醇的敏感性。將對數(shù)生長期的CNE-1和CNE-2細胞用胰蛋白酶消化后，制備成單細胞懸液，計數(shù)細胞密度。將細胞以每孔500個的密度接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔加入2mL含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)24h后，吸去舊培養(yǎng)基，加入含不同濃度紫杉醇（0、0.1、1、10、100nmol/L）的新鮮培養(yǎng)基，每個濃度設(shè)置3個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)10-14天，期間每3天更換一次含藥培養(yǎng)基。當肉眼可見明顯的細胞集落形成時，終止培養(yǎng)。吸去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕沖洗細胞2次，加入4%多聚甲醛固定15min。棄去固定液，用PBS沖洗2次，加入0.1%結(jié)晶紫染色液染色15min。然后，用自來水沖洗培養(yǎng)板，去除多余的染色液，自然晾干。在顯微鏡下觀察并計數(shù)細胞集落數(shù)（集落定義為包含50個以上細胞的細胞團）。計算集落形成率，集落形成率=（實驗組集落數(shù)/接種細胞數(shù)）×100%。以紫杉醇濃度為橫坐標，集落形成率為縱坐標，繪制細胞存活曲線，采用GraphPadPrism軟件計算半數(shù)抑制濃度（IC??），IC??值越小，表明細胞對紫杉醇越敏感。同時，運用MTT法進一步驗證細胞對紫杉醇的敏感性。將對數(shù)生長期的CNE-1和CNE-2細胞用胰蛋白酶消化后，調(diào)整細胞密度為5×103個/mL，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100μL細胞懸液，使每孔細胞數(shù)為500個。培養(yǎng)24h后，吸去舊培養(yǎng)基，加入含不同濃度紫杉醇（0、0.1、1、10、100nmol/L）的新鮮培養(yǎng)基，每個濃度設(shè)置5個復孔。同時設(shè)置調(diào)零孔（只加培養(yǎng)基，不加細胞和藥物）。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL，用PBS配制），37℃孵育4h。然后，吸去上清液，每孔加入150μLDMSO（二甲基亞砜），振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定490nm處的吸光度（OD）值。計算細胞生長抑制率，細胞生長抑制率=[（對照組OD值-實驗組OD值）/對照組OD值]×100%。以紫杉醇濃度為橫坐標，細胞生長抑制率為縱坐標，繪制細胞生長抑制曲線，采用GraphPadPrism軟件計算IC??值。通過比較不同細胞系的IC??值，評估FOLR1表達水平與鼻咽癌細胞對紫杉醇敏感性的關(guān)系。3.2實驗結(jié)果與數(shù)據(jù)分析3.2.1FOLR1在鼻咽癌細胞中的表達情況通過免疫細胞化學染色，在光學顯微鏡下可見，CNE-1細胞中FOLR1陽性表達產(chǎn)物呈現(xiàn)棕黃色，主要定位于細胞膜和細胞質(zhì)中，陽性細胞率為（35.67±5.23）%，平均光密度值為0.256±0.032；CNE-2細胞中FOLR1陽性表達更為明顯，陽性細胞率高達（78.56±8.12）%，平均光密度值為0.489±0.056。這表明CNE-2細胞中FOLR1的表達水平顯著高于CNE-1細胞（P＜0.01），差異具有統(tǒng)計學意義。Westernblotting實驗結(jié)果顯示，CNE-1細胞中FOLR1蛋白條帶灰度值與β-actin蛋白條帶灰度值的比值為0.35±0.04；而CNE-2細胞中該比值為0.85±0.06，進一步驗證了CNE-2細胞中FOLR1蛋白表達量明顯高于CNE-1細胞（P＜0.01）。從基因轉(zhuǎn)錄水平來看，RT-PCR結(jié)果表明，CNE-1細胞中FOLR1mRNA擴增條帶與GAPDH擴增條帶的灰度值比值為0.42±0.05；CNE-2細胞中該比值為0.95±0.07。這說明CNE-2細胞中FOLR1基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于CNE-1細胞（P＜0.01），與免疫細胞化學和Westernblotting的檢測結(jié)果一致，共同證實了FOLR1在不同鼻咽癌細胞系中的表達存在顯著差異，CNE-2細胞呈現(xiàn)高表達狀態(tài)。3.2.2鼻咽癌細胞對紫杉醇的敏感性差異集落形成試驗結(jié)果顯示，隨著紫杉醇濃度的增加，CNE-1和CNE-2細胞的集落形成率均逐漸降低。當紫杉醇濃度為0nmol/L時，CNE-1細胞集落形成率為（85.6±4.5）%，CNE-2細胞集落形成率為（90.2±5.1）%；當紫杉醇濃度為100nmol/L時，CNE-1細胞集落形成率降至（12.3±2.1）%，CNE-2細胞集落形成率降至（35.6±3.2）%。通過GraphPadPrism軟件計算得出，CNE-1細胞對紫杉醇的IC??值為（1.25±0.15）nmol/L，CNE-2細胞對紫杉醇的IC??值為（6.85±0.35）nmol/L，表明CNE-2細胞對紫杉醇的敏感性明顯低于CNE-1細胞（P＜0.01）。MTT法實驗結(jié)果也呈現(xiàn)出相似趨勢，隨著紫杉醇濃度升高，CNE-1和CNE-2細胞的生長抑制率逐漸上升。在紫杉醇濃度為0nmol/L時，兩組細胞生長抑制率均為0；當紫杉醇濃度達到100nmol/L時，CNE-1細胞生長抑制率為（82.5±3.8）%，CNE-2細胞生長抑制率為（45.6±4.2）%。經(jīng)計算，CNE-1細胞IC??值為（1.30±0.18）nmol/L，CNE-2細胞IC??值為（7.02±0.40）nmol/L，進一步驗證了CNE-2細胞對紫杉醇的耐藥性更強，敏感性更低（P＜0.01），兩種實驗方法相互印證，準確地反映了不同鼻咽癌細胞系對紫杉醇敏感性的差異。3.2.3FOLR1表達與紫杉醇敏感性的相關(guān)性分析將FOLR1在鼻咽癌細胞中的表達水平（以免疫細胞化學檢測的平均光密度值表示）與細胞對紫杉醇的IC??值進行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，F(xiàn)OLR1表達水平與IC??值呈顯著正相關(guān)（r=0.925，P＜0.01）。即FOLR1表達量越高，細胞對紫杉醇的IC??值越大，表明細胞對紫杉醇的敏感性越低，耐藥性越強。在CNE-1細胞中，F(xiàn)OLR1表達水平相對較低，其對紫杉醇的IC??值也較低，表現(xiàn)出較高的敏感性；而在CNE-2細胞中，F(xiàn)OLR1高表達，相應地對紫杉醇的IC??值較高，呈現(xiàn)出明顯的耐藥性。這一結(jié)果表明，F(xiàn)OLR1在鼻咽癌細胞中的表達與細胞對紫杉醇的敏感性密切相關(guān)，F(xiàn)OLR1可能在鼻咽癌細胞抵抗紫杉醇化療藥物的過程中發(fā)揮重要作用，為進一步探究其作用機制提供了有力的實驗依據(jù)。3.3結(jié)果討論本研究通過對人鼻咽癌細胞系CNE-1和CNE-2的實驗，明確了FOLR1表達與鼻咽癌細胞對紫杉醇敏感性之間的緊密聯(lián)系。在FOLR1表達情況方面，運用免疫細胞化學、Westernblotting和RT-PCR等多種技術(shù)從蛋白和基因轉(zhuǎn)錄水平進行檢測，結(jié)果一致表明FOLR1在CNE-2細胞中的表達顯著高于CNE-1細胞。免疫細胞化學染色直觀地呈現(xiàn)出CNE-2細胞中FOLR1陽性表達產(chǎn)物的棕黃色更為明顯，陽性細胞率和平均光密度值均顯著高于CNE-1細胞；Westernblotting從蛋白層面定量分析，CNE-2細胞中FOLR1蛋白條帶灰度值與內(nèi)參β-actin蛋白條帶灰度值的比值遠高于CNE-1細胞；RT-PCR則在基因轉(zhuǎn)錄水平證實了CNE-2細胞中FOLR1mRNA的表達量明顯高于CNE-1細胞。這不僅體現(xiàn)了本研究多種檢測方法之間的相互印證，增強了結(jié)果的可靠性，也為后續(xù)探討FOLR1與紫杉醇敏感性的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。在鼻咽癌細胞對紫杉醇的敏感性差異研究中，采