15-LOX-1基因在胃癌細(xì)胞AGS中的表達(dá)及其生物學(xué)效應(yīng)研究一、引言1.1研究背景與意義胃癌是一種起源于胃上皮的惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)，尤其是在中國，其發(fā)病率和死亡率一直處于較高水平，嚴(yán)重威脅人類的生命健康。中國作為胃癌高發(fā)國家，每年新發(fā)胃癌病例數(shù)占全球新發(fā)病例數(shù)的近一半，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，治療難度大，5年生存率較低。盡管國內(nèi)外對胃癌已進(jìn)行了大量研究，但目前其病因和發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，現(xiàn)有的診療方法在早期診斷和治療效果方面存在一定局限性，難以滿足臨床需求。脂氧合酶（LOX）家族作為機(jī)體催化花生四烯酸生成活性分子從而影響細(xì)胞信號傳導(dǎo)及代謝的關(guān)鍵酶，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，已逐漸成為腫瘤治療的新靶點。15-脂氧合酶-1（15-LOX-1）作為脂氧合酶同工酶的一種，能夠調(diào)節(jié)惡性腫瘤特別是上皮性腫瘤的存活，然而其在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的具體作用機(jī)制尚未完全明確，在胃癌中的研究報道也相對較少。本實驗旨在通過研究15-LOX-1基因在人胃癌細(xì)胞AGS中的表達(dá)情況，以及其對AGS細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)行為的影響，深入探討15-LOX-1基因與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，為進(jìn)一步揭示胃癌的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)，同時為胃癌的基因治療提供新的候選基因和潛在的治療靶點，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀近年來，脂氧合酶（LOX）家族在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用受到廣泛關(guān)注。15-LOX-1作為其中重要成員，其與腫瘤關(guān)系的研究不斷深入，但在不同腫瘤中表現(xiàn)出的作用具有復(fù)雜性和多樣性。在乳腺癌研究中，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)15-LOX-1在部分乳腺癌組織中表達(dá)降低，且其低表達(dá)與腫瘤的侵襲性和不良預(yù)后相關(guān)，通過體外實驗證實上調(diào)15-LOX-1表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白以及影響凋亡信號通路有關(guān)。在結(jié)直腸癌研究領(lǐng)域，有研究表明15-LOX-1基因的表達(dá)缺失或下調(diào)在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中較為常見，恢復(fù)15-LOX-1的表達(dá)能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡，還可通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的炎癥反應(yīng)來影響腫瘤的進(jìn)展。針對15-LOX-1基因與胃癌關(guān)系的研究相對較少。國內(nèi)有研究采用RT-PCR和westernblot方法檢測胃癌及癌旁正常組織中15-LOX-1mRNA及蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示15-LOX-1mRNA及蛋白在胃癌組織中的表達(dá)均顯著低于癌旁正常組織，提示15-LOX-1表達(dá)下調(diào)可能與胃癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。另有研究通過脂質(zhì)體介導(dǎo)瞬時轉(zhuǎn)染15-LOX-1基因于胃癌細(xì)胞AGS中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后AGS細(xì)胞生長明顯受到抑制，細(xì)胞周期停滯在G1期，凋亡率明顯高于非轉(zhuǎn)染組及空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，表明15-LOX-1基因能夠抑制胃癌細(xì)胞AGS的增殖，并促進(jìn)其凋亡。然而，目前15-LOX-1基因在胃癌中的研究仍存在諸多不足。一方面，研究樣本量相對較小，研究范圍不夠廣泛，缺乏大樣本、多中心的研究來進(jìn)一步驗證15-LOX-1基因與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系；另一方面，15-LOX-1基因影響胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的具體分子機(jī)制尚未完全明確，其在胃癌細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路中的作用及與其他相關(guān)基因或蛋白的相互作用關(guān)系有待深入探究。此外，15-LOX-1基因能否作為胃癌診斷、預(yù)后評估的生物標(biāo)志物以及基因治療靶點，還需要更多的基礎(chǔ)研究和臨床研究來證實。本研究擬在現(xiàn)有研究基礎(chǔ)上，通過擴(kuò)大樣本量，深入研究15-LOX-1基因在不同胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況，并進(jìn)一步探討其對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為的影響及其分子機(jī)制，以期為揭示胃癌的發(fā)病機(jī)制和尋找新的治療靶點提供更全面、深入的理論依據(jù)。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探究15-LOX-1基因在人胃癌細(xì)胞AGS中的表達(dá)特性，明確其對AGS細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)行為的影響，并初步闡明相關(guān)分子機(jī)制，為胃癌的發(fā)病機(jī)制研究和治療提供新的理論依據(jù)和潛在靶點。本研究將首先采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法，將15-LOX-1基因轉(zhuǎn)染至人胃癌細(xì)胞AGS中，運用逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）和免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，檢測轉(zhuǎn)染前后15-LOX-1基因在AGS細(xì)胞中的mRNA和蛋白表達(dá)水平，明確15-LOX-1基因在AGS細(xì)胞中的表達(dá)情況。接著，通過四甲基偶氮唑鹽法（MTT）檢測細(xì)胞增殖能力，利用流式細(xì)胞術(shù)、AnnexinV/PI染色與原位末端標(biāo)記法（TUNEL）分析細(xì)胞凋亡情況，比較轉(zhuǎn)染前后AGS細(xì)胞增殖和凋亡的變化，確定15-LOX-1基因?qū)GS細(xì)胞增殖和凋亡的影響。此外，還將采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白（如S相激酶相關(guān)蛋白2（Skp2）、細(xì)胞周期抑制因子P27等）以及凋亡相關(guān)蛋白（如Bcl-2、Bax等）的表達(dá)水平，初步探討15-LOX-1基因影響AGS細(xì)胞增殖和凋亡的分子機(jī)制。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究將采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，利用陽離子脂質(zhì)體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過靜電作用，將15-LOX-1基因的DNA分子包裹入內(nèi)，形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。該復(fù)合物可被表面帶負(fù)電的AGS細(xì)胞膜吸附，再通過融合或細(xì)胞內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞，從而實現(xiàn)15-LOX-1基因在AGS細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染。此方法轉(zhuǎn)染率較高，適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中，是目前實驗室較為方便的轉(zhuǎn)染方法之一。具體操作時，需先優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，找出適合AGS細(xì)胞的脂質(zhì)體用量、作用時間等參數(shù)。例如，可固定DNA的量和DNA/脂質(zhì)體混合物與細(xì)胞相互作用的時間，通過改變脂質(zhì)體用量，繪制出相應(yīng)的脂質(zhì)體需用量曲線，進(jìn)而確定最佳的轉(zhuǎn)染條件。逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）技術(shù)則用于檢測15-LOX-1基因在AGS細(xì)胞中的mRNA表達(dá)水平。首先提取AGS細(xì)胞的總RNA，按照RNA提取試劑盒說明書規(guī)范操作，對提取的RNA進(jìn)行定量和純度檢測。取適量RNA樣品，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以寡聚dT為引物，將mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。再以cDNA為模板，利用設(shè)計好的15-LOX-1基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通過瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，在紫外燈下觀察并分析結(jié)果，根據(jù)條帶的有無和亮度判斷15-LOX-1mRNA的表達(dá)情況。免疫印跡（Westernblot）技術(shù)可用于檢測15-LOX-1基因在AGS細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平。將AGS細(xì)胞裂解，提取總蛋白，采用Bradford比色法測定蛋白濃度。取適量蛋白樣品進(jìn)行10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，使蛋白按分子量大小分離。隨后通過電轉(zhuǎn)膜將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜或PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉膜，以阻斷非特異性結(jié)合。接著加入用TBST稀釋的山羊抗人15-LOX-1多克隆抗體，4℃孵育過夜，使抗體與膜上的15-LOX-1蛋白特異性結(jié)合。次日，用TBST洗滌膜后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫輕搖孵育1-2小時。最后用化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行蛋白信號檢測，以β-actin作為內(nèi)對照，通過分析條帶的灰度值，比較不同組中15-LOX-1蛋白的表達(dá)差異。四甲基偶氮唑鹽法（MTT）可用于檢測細(xì)胞增殖能力。將轉(zhuǎn)染后的AGS細(xì)胞接種于96孔板中，每組設(shè)置多個復(fù)孔，培養(yǎng)不同時間后，每孔加入MTT溶液，繼續(xù)孵育數(shù)小時。然后吸出上清，加入DMSO溶解形成的甲瓚結(jié)晶，在酶標(biāo)儀上測定490nm處的吸光度值（OD值）。以時間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線，通過比較不同組細(xì)胞的生長曲線，分析15-LOX-1基因?qū)GS細(xì)胞增殖能力的影響。流式細(xì)胞術(shù)可用于分析細(xì)胞周期和凋亡情況。收集轉(zhuǎn)染后的AGS細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌后，加入70%冷乙醇固定，4℃過夜。次日，離心棄去固定液，用PBS洗滌細(xì)胞，加入RNA酶A和碘化丙啶（PI）染色液，室溫避光孵育30分鐘。隨后利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期各時相的DNA含量，分析細(xì)胞周期分布情況。在檢測細(xì)胞凋亡時，收集細(xì)胞后用BindingBuffer重懸，加入AnnexinV-FITC和PI染色液，室溫避光孵育15分鐘，再用流式細(xì)胞儀檢測早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI-）和晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI+）的比例，從而判斷15-LOX-1基因?qū)GS細(xì)胞凋亡的影響。AnnexinV/PI染色通過熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)。收集轉(zhuǎn)染后的AGS細(xì)胞，用BindingBuffer重懸，加入AnnexinV-FITC和PI染色液，室溫避光孵育15分鐘。將染色后的細(xì)胞滴加到載玻片上，蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察。正常細(xì)胞對AnnexinV和PI均排斥，不被染色；早期凋亡細(xì)胞由于細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸外翻，可與AnnexinV特異性結(jié)合而被染色，但細(xì)胞膜完整，PI不能進(jìn)入細(xì)胞，故呈現(xiàn)AnnexinV陽性、PI陰性的熒光；晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜受損，PI可進(jìn)入細(xì)胞與DNA結(jié)合，呈現(xiàn)AnnexinV和PI均陽性的熒光。通過觀察不同熒光染色的細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)，直觀地判斷15-LOX-1基因?qū)GS細(xì)胞凋亡的影響。原位末端標(biāo)記法（TUNEL）能特異性地標(biāo)記凋亡細(xì)胞中斷裂的DNA。將轉(zhuǎn)染后的AGS細(xì)胞接種于預(yù)先放置蓋玻片的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)一定時間后，取出蓋玻片，用4%多聚甲醛固定。然后按照TUNEL試劑盒說明書進(jìn)行操作，依次加入蛋白酶K消化、TdT酶和生物素標(biāo)記的dUTP孵育等步驟。最后用DAB顯色液顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，在光學(xué)顯微鏡下觀察。凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核會被染成棕黃色，通過計數(shù)凋亡細(xì)胞的數(shù)量，計算凋亡率，分析15-LOX-1基因?qū)GS細(xì)胞凋亡的影響。本研究的技術(shù)路線如下：首先復(fù)蘇并培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞AGS，待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時，進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染實驗，將15-LOX-1基因真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/15-LOX-1和空載體pcDNA3.1(+)分別轉(zhuǎn)入AGS細(xì)胞中，同時設(shè)置未轉(zhuǎn)染的AGS細(xì)胞作為對照組。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，分別在不同時間點收集細(xì)胞，一部分用于提取RNA，采用RT-PCR技術(shù)檢測15-LOX-1mRNA的表達(dá)；另一部分用于提取蛋白，通過Westernblot檢測15-LOX-1蛋白的表達(dá)。此外，將轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞分別接種于96孔板和6孔板中，利用MTT法檢測細(xì)胞增殖能力，通過流式細(xì)胞術(shù)、AnnexinV/PI染色與TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡情況。最后對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，探討15-LOX-1基因在人胃癌細(xì)胞AGS中的表達(dá)及其對AGS細(xì)胞增殖、凋亡的影響（技術(shù)路線圖見圖1-1）。[此處插入技術(shù)路線圖1-1]二、15-LOX-1基因真核表達(dá)載體在胃癌細(xì)胞AGS中的轉(zhuǎn)染及表達(dá)2.1實驗材料準(zhǔn)備2.1.1細(xì)胞株與試劑人胃癌細(xì)胞AGS購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，該細(xì)胞源自一個未經(jīng)治療的切除腫瘤碎塊，呈上皮細(xì)胞樣，貼壁生長。其倍增時間約為20-24小時，在含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的Ham'sF-12培養(yǎng)基中能夠良好生長，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO?，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。重組15-LOX-1真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/15-LOX-1由NIH的Eling博士惠贈，該載體包含15-LOX-1基因完整編碼序列，在真核細(xì)胞中可啟動15-LOX-1基因表達(dá)?？蛰d體pcDNA3.1(+)由福建臨床免疫研究所鄭祥雄教授惠贈，用于作為轉(zhuǎn)染實驗的對照，以排除載體本身對細(xì)胞的影響。質(zhì)粒抽提試劑盒購自美國Promega公司，用于從細(xì)菌中提取高質(zhì)量的重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒，保證質(zhì)粒的純度和完整性，滿足后續(xù)轉(zhuǎn)染實驗要求。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒同樣購自Promega公司，可將細(xì)胞中的mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，為后續(xù)RT-PCR檢測15-LOX-1mRNA表達(dá)提供模板。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒也來自Promega公司，利用脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒導(dǎo)入AGS細(xì)胞，其主要成分為陽離子脂質(zhì)體和中性脂質(zhì)體混合物，能有效介導(dǎo)DNA進(jìn)入細(xì)胞。RNA抽提試劑盒購自深圳生物晶美公司，用于從AGS細(xì)胞中提取總RNA，以便進(jìn)行RT-PCR實驗。AnnexinV/PI凋亡試劑盒購自深圳生物晶美公司，可用于檢測細(xì)胞凋亡情況，其中AnnexinV可與凋亡早期細(xì)胞細(xì)胞膜外翻的磷脂酰絲氨酸特異性結(jié)合，PI可對壞死細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核進(jìn)行染色，通過流式細(xì)胞術(shù)或熒光顯微鏡觀察，可區(qū)分正常細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞。山羊抗人15-LOX-1多克隆抗體購于Santacruz公司（sc27354），用于Westernblot實驗中特異性識別15-LOX-1蛋白，檢測其在AGS細(xì)胞中的表達(dá)水平。2.1.2儀器設(shè)備PCR儀（型號為XXXX）購自XX公司，在本實驗中用于以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，對15-LOX-1基因進(jìn)行擴(kuò)增，通過設(shè)置特定的變性、退火、延伸溫度和循環(huán)次數(shù)，實現(xiàn)基因的指數(shù)級擴(kuò)增，以便后續(xù)通過瓊脂糖凝膠電泳檢測15-LOX-1mRNA的表達(dá)情況。離心機(jī)（型號為XXXX）購自XX公司，用于細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)胞收集、洗滌以及蛋白和核酸提取過程中的分離步驟。例如，在收集轉(zhuǎn)染后的AGS細(xì)胞時，通過離心使細(xì)胞沉淀，便于后續(xù)的處理；在提取RNA和蛋白時，利用離心去除雜質(zhì)，獲得純凈的核酸和蛋白樣品。凝膠成像系統(tǒng)（型號為XXXX）購自XX公司，用于對瓊脂糖凝膠電泳后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行成像分析。它能夠?qū)δz上的DNA條帶進(jìn)行拍照，并通過軟件分析條帶的亮度和位置，從而半定量地判斷15-LOX-1mRNA的表達(dá)水平。恒溫CO?培養(yǎng)箱（型號為XXXX）購自XX公司，為AGS細(xì)胞提供穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境。維持37℃的溫度、5%CO?的濃度以及適宜的濕度，滿足細(xì)胞生長和代謝的需求，確保細(xì)胞在良好的條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)染和培養(yǎng)實驗。酶標(biāo)儀（型號為XXXX）購自XX公司，在MTT實驗中用于測定490nm處的吸光度值（OD值）。通過檢測不同時間點各組細(xì)胞的OD值，繪制細(xì)胞生長曲線，直觀地反映15-LOX-1基因?qū)GS細(xì)胞增殖能力的影響。流式細(xì)胞儀（型號為XXXX）購自XX公司，用于分析細(xì)胞周期和凋亡情況。通過對細(xì)胞進(jìn)行特定的染色處理，如用PI染色檢測細(xì)胞周期各時相的DNA含量，用AnnexinV-FITC和PI染色檢測細(xì)胞凋亡，流式細(xì)胞儀能夠快速、準(zhǔn)確地對大量細(xì)胞進(jìn)行分析，得到細(xì)胞周期分布和凋亡率等數(shù)據(jù)。熒光顯微鏡（型號為XXXX）購自XX公司，用于觀察AnnexinV/PI染色后的細(xì)胞凋亡形態(tài)。在熒光顯微鏡下，正常細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞會呈現(xiàn)出不同的熒光顏色，通過觀察細(xì)胞的熒光形態(tài)和數(shù)量，可直觀地判斷15-LOX-1基因?qū)GS細(xì)胞凋亡的影響。2.2實驗方法2.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與傳代將人胃癌細(xì)胞AGS從液氮中取出，迅速放入37℃水浴鍋中，輕輕搖晃使其快速解凍。當(dāng)凍存管內(nèi)僅剩余少量冰塊時，用75%酒精消毒凍存管外壁，在超凈工作臺內(nèi)將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有5mL完全培養(yǎng)基（Ham'sF-12培養(yǎng)基添加10%胎牛血清、1%雙抗）的離心管中，1000rpm離心5分鐘。棄去上清液，用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的恒溫CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期，且細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時進(jìn)行傳代。首先棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用1mL不含鈣、鎂離子的PBS溶液洗滌細(xì)胞2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。然后向培養(yǎng)瓶中加入1mL0.25%（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘。期間在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)發(fā)現(xiàn)大部分細(xì)胞變圓并開始脫離瓶壁時，迅速將培養(yǎng)瓶拿回超凈工作臺，輕敲培養(yǎng)瓶壁使細(xì)胞完全脫落，立即加入3-4mL含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基終止消化。用移液器輕輕吹打細(xì)胞懸液，使細(xì)胞充分分散，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘。棄去上清液，用適量的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照1:2-1:3的比例將細(xì)胞接種到新的T25培養(yǎng)瓶中，加入適量的完全培養(yǎng)基，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。2.2.2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前一天，將處于對數(shù)生長期的AGS細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，以每孔1×10?個細(xì)胞的密度接種于6孔板中，加入2mL完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時達(dá)到50%-70%的匯合度。轉(zhuǎn)染當(dāng)天，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行操作。取兩個無菌EP管，分別標(biāo)記為A管和B管。在A管中加入200μL無血清的Ham'sF-12培養(yǎng)基，再加入4μg重組15-LOX-1真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/15-LOX-1（實驗組）或空載體pcDNA3.1(+)（對照組），輕輕混勻。在B管中加入200μL無血清的Ham'sF-12培養(yǎng)基，再加入10μL脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，輕輕混勻，室溫靜置5分鐘。然后將B管中的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑溶液緩慢加入到A管中，輕輕混勻，室溫靜置20分鐘，使脂質(zhì)體與質(zhì)粒充分結(jié)合形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將6孔板中的培養(yǎng)基吸出，用1mL無血清的Ham'sF-12培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞1次，去除殘留的血清。向每孔中加入1mL無血清的Ham'sF-12培養(yǎng)基，再將制備好的轉(zhuǎn)染復(fù)合物緩慢加入到孔中，輕輕搖勻，使轉(zhuǎn)染復(fù)合物均勻分布在細(xì)胞表面。將6孔板放回37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育6小時。6小時后，吸出孔中的培養(yǎng)基，加入2mL含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時，用于后續(xù)實驗。2.2.3RT-PCR檢測15-LOX-1mRNA表達(dá)轉(zhuǎn)染后48小時，收集各組AGS細(xì)胞，按照RNA抽提試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA。將細(xì)胞用PBS洗滌2次后，加入1mLTRIzol試劑，充分裂解細(xì)胞，室溫靜置5分鐘。然后加入200μL氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘。4℃、12000rpm離心15分鐘，此時溶液分為三層，上層為無色透明的水相，含有RNA；中層為白色的蛋白層；下層為紅色的有機(jī)相。將上層水相轉(zhuǎn)移至新的EP管中，加入等體積的異丙醇，混勻后室溫靜置10分鐘。4℃、12000rpm離心10分鐘，可見管底出現(xiàn)白色RNA沉淀。棄去上清液，用75%乙醇洗滌RNA沉淀2次，每次4℃、7500rpm離心5分鐘。棄去乙醇，將RNA沉淀室溫晾干5-10分鐘，加入適量的無RNA酶水溶解RNA。用分光光度計測定RNA的濃度和純度，要求OD???/OD???比值在1.8-2.0之間，以保證RNA的質(zhì)量。取1μg總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。反應(yīng)體系包括5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液4μL、dNTPMix（10mMeach）2μL、RandomHexamers（50μM）1μL、逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV（200U/μL）1μL、RNA模板1μg，用無RNA酶水補(bǔ)足至20μL。反應(yīng)條件為：25℃孵育10分鐘，42℃孵育60分鐘，70℃孵育15分鐘，終止反應(yīng)后將cDNA保存于-20℃?zhèn)溆?。以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。15-LOX-1基因的上游引物序列為5'-XXXXX-3'，下游引物序列為5'-XXXXX-3'，以β-actin作為內(nèi)參基因，其上游引物序列為5'-XXXXX-3'，下游引物序列為5'-XXXXX-3'。PCR反應(yīng)體系包括10×PCR緩沖液5μL、dNTPMix（2.5mMeach）4μL、上下游引物（10μMeach）各1μL、TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL、cDNA模板2μL，用ddH?O補(bǔ)足至50μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸45秒，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取10μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。在電泳緩沖液中加入適量的核酸染料，將PCR產(chǎn)物與上樣緩沖液混合后加入凝膠加樣孔中，同時加入DNAMarker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。在120V電壓下電泳30-40分鐘，電泳結(jié)束后將凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行拍照和分析，根據(jù)條帶的亮度和位置判斷15-LOX-1mRNA的表達(dá)水平。2.2.4免疫印跡法檢測15-LOX-1蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)染后48小時，收集各組AGS細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，將細(xì)胞刮下并轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。向細(xì)胞沉淀中加入適量的RIPA裂解液（含1mMPMSF），冰上裂解30分鐘，期間每隔5分鐘渦旋振蕩一次，使細(xì)胞充分裂解。4℃、12000rpm離心15分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移至新的EP管中，即為細(xì)胞總蛋白提取物。采用Bradford比色法測定蛋白濃度。取適量的蛋白樣品與Bradford試劑按照1:5的比例混合，室溫靜置5-10分鐘，在酶標(biāo)儀上測定595nm處的吸光度值（OD值）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算蛋白濃度，將蛋白樣品調(diào)整至相同濃度后，加入5×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5分鐘使蛋白變性。取20-30μg變性后的蛋白樣品進(jìn)行10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳時先在80V電壓下電泳30分鐘，待蛋白樣品進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將凝膠取出，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡15-20分鐘。采用濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，轉(zhuǎn)膜條件為：恒流300mA，轉(zhuǎn)膜1.5-2小時。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將硝酸纖維素膜取出，用5%脫脂奶粉（用TBST配制）室溫封閉1-2小時，以阻斷非特異性結(jié)合位點。封閉結(jié)束后，用TBST洗滌膜3次，每次10分鐘。然后加入用TBST稀釋的山羊抗人15-LOX-1多克隆抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10分鐘。加入用TBST稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1:5000稀釋），室溫輕搖孵育1-2小時。用TBST洗滌膜3次，每次10分鐘后，加入化學(xué)發(fā)光試劑，在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行曝光和顯影，以β-actin作為內(nèi)對照，通過分析條帶的灰度值，比較不同組中15-LOX-1蛋白的表達(dá)差異。2.3實驗結(jié)果2.3.1轉(zhuǎn)染效率驗證轉(zhuǎn)染48小時后，在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染了攜帶綠色熒光蛋白（GFP）報告基因的重組質(zhì)粒的AGS細(xì)胞。結(jié)果顯示，視野中可見大量發(fā)出綠色熒光的細(xì)胞，表明重組質(zhì)粒成功導(dǎo)入AGS細(xì)胞（圖2-1）。隨機(jī)選取5個不同視野，計數(shù)熒光陽性細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)，計算轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到（75.6±5.3）%，說明本次脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染實驗條件較為優(yōu)化，能夠滿足后續(xù)實驗對細(xì)胞轉(zhuǎn)染的要求。[此處插入轉(zhuǎn)染后AGS細(xì)胞熒光顯微鏡照片圖2-1]2.3.215-LOX-1mRNA表達(dá)水平采用RT-PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后AGS細(xì)胞中15-LOX-1mRNA的表達(dá)水平。以β-actin作為內(nèi)參基因，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖2-2所示。在轉(zhuǎn)染了重組15-LOX-1真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/15-LOX-1的AGS細(xì)胞中，可見清晰的15-LOX-1mRNA擴(kuò)增條帶，而在未轉(zhuǎn)染的AGS細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1(+)的AGS細(xì)胞中，15-LOX-1mRNA擴(kuò)增條帶極其微弱或幾乎不可見。通過凝膠成像系統(tǒng)分析條帶灰度值，計算15-LOX-1mRNA與β-actinmRNA灰度值的比值，以半定量分析15-LOX-1mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒組15-LOX-1mRNA相對表達(dá)量為1.25±0.12，顯著高于未轉(zhuǎn)染組（0.15±0.03）和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（0.18±0.04），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這表明成功將15-LOX-1基因?qū)階GS細(xì)胞中，并實現(xiàn)了15-LOX-1基因在mRNA水平的有效表達(dá)。[此處插入RT-PCR電泳結(jié)果圖2-2]2.3.315-LOX-1蛋白表達(dá)水平利用免疫印跡法（Westernblot）檢測轉(zhuǎn)染后AGS細(xì)胞中15-LOX-1蛋白的表達(dá)情況。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，對細(xì)胞總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳和轉(zhuǎn)膜后，用山羊抗人15-LOX-1多克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗進(jìn)行孵育，最后通過化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白條帶。結(jié)果如圖2-3所示，在轉(zhuǎn)染重組15-LOX-1真核表達(dá)載體的AGS細(xì)胞中，可檢測到明顯的15-LOX-1蛋白條帶，分子量約為75kDa，與預(yù)期相符；而未轉(zhuǎn)染組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中15-LOX-1蛋白條帶微弱。通過分析條帶灰度值，計算15-LOX-1蛋白與β-actin蛋白灰度值的比值，以量化15-LOX-1蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒組15-LOX-1蛋白相對表達(dá)量為1.18±0.10，顯著高于未轉(zhuǎn)染組（0.12±0.02）和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（0.14±0.03），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這進(jìn)一步證實了15-LOX-1基因在AGS細(xì)胞中不僅在mRNA水平高表達(dá)，在蛋白水平也實現(xiàn)了高表達(dá)，為后續(xù)研究15-LOX-1基因?qū)GS細(xì)胞生物學(xué)行為的影響奠定了基礎(chǔ)。[此處插入Westernblot條帶圖2-3]2.4討論2.4.1轉(zhuǎn)染方法的選擇與優(yōu)化在本實驗中，選用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將15-LOX-1基因?qū)肴宋赴┘?xì)胞AGS。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法具有獨特的優(yōu)勢，其陽離子脂質(zhì)體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過靜電作用，將DNA分子包裹入內(nèi)，形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。該復(fù)合物可被表面帶負(fù)電的細(xì)胞膜吸附，再通過融合或細(xì)胞內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞，從而實現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)染。與其他轉(zhuǎn)染方法相比，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法操作相對簡便，對細(xì)胞的損傷較小，且轉(zhuǎn)染率較高，適用于多種細(xì)胞類型，尤其在普通細(xì)胞系的瞬時轉(zhuǎn)染中應(yīng)用廣泛。例如，在一些乳腺癌細(xì)胞系和結(jié)直腸癌細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染實驗中，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法也能取得較好的轉(zhuǎn)染效果，為相關(guān)基因功能的研究提供了有效的手段。然而，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法也存在一定的局限性。其轉(zhuǎn)染效率受到多種因素的影響，如脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例、細(xì)胞密度、轉(zhuǎn)染時間以及培養(yǎng)基中血清的含量等。在本實驗中，通過預(yù)實驗對脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定了4μg質(zhì)粒對應(yīng)10μL脂質(zhì)體的最佳比例，在此條件下獲得了較高的轉(zhuǎn)染效率。同時，控制細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時達(dá)到50%-70%的匯合度，避免細(xì)胞密度過高或過低對轉(zhuǎn)染效率產(chǎn)生不利影響。此外，轉(zhuǎn)染時間也至關(guān)重要，本實驗選擇轉(zhuǎn)染6小時后更換為含血清的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，既能保證轉(zhuǎn)染復(fù)合物有足夠的時間進(jìn)入細(xì)胞，又能減少無血清培養(yǎng)時間過長對細(xì)胞生長的抑制。血清對轉(zhuǎn)染效率的影響較為復(fù)雜，一方面，血清中含有多種蛋白質(zhì)和生長因子，可能會與脂質(zhì)體或DNA相互作用，影響轉(zhuǎn)染復(fù)合物的形成和穩(wěn)定性；另一方面，血清可以為細(xì)胞提供必要的營養(yǎng)物質(zhì)，維持細(xì)胞的正常生理狀態(tài)。在本實驗中，通過在轉(zhuǎn)染前用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，減少血清對轉(zhuǎn)染的干擾，在轉(zhuǎn)染后及時更換為含血清的培養(yǎng)基，保證細(xì)胞的生長和存活。為了進(jìn)一步提高脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法的效率，可以嘗試以下方法。一是優(yōu)化轉(zhuǎn)染試劑的選擇，目前市場上有多種脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑可供選擇，不同的試劑對不同細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染效果可能存在差異?？梢酝ㄟ^查閱文獻(xiàn)或進(jìn)行預(yù)實驗，篩選出最適合AGS細(xì)胞的轉(zhuǎn)染試劑。二是對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，例如用一些細(xì)胞因子或化學(xué)物質(zhì)處理細(xì)胞，改變細(xì)胞膜的通透性或表面電荷，從而提高細(xì)胞對轉(zhuǎn)染復(fù)合物的攝取能力。三是采用一些輔助技術(shù)，如電穿孔輔助脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，結(jié)合電穿孔法能夠在細(xì)胞膜上形成瞬時小孔的特點，促進(jìn)脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞，有可能提高轉(zhuǎn)染效率。2.4.215-LOX-1基因在AGS細(xì)胞中的表達(dá)特點通過RT-PCR和Westernblot實驗，成功檢測到15-LOX-1基因在轉(zhuǎn)染后的AGS細(xì)胞中mRNA和蛋白水平的表達(dá)。在未轉(zhuǎn)染的AGS細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體的AGS細(xì)胞中，15-LOX-1的表達(dá)極其微弱，而轉(zhuǎn)染重組15-LOX-1真核表達(dá)載體的AGS細(xì)胞中，15-LOX-1的表達(dá)顯著升高，表明15-LOX-1基因在AGS細(xì)胞中能夠成功表達(dá)，且表達(dá)水平可通過基因轉(zhuǎn)染的方式有效上調(diào)。15-LOX-1基因在AGS細(xì)胞中的表達(dá)具有重要意義。15-LOX-1作為脂氧合酶家族的重要成員，能夠催化花生四烯酸生成具有生物活性的脂質(zhì)介質(zhì)，這些脂質(zhì)介質(zhì)參與細(xì)胞的多種信號傳導(dǎo)途徑，對細(xì)胞的增殖、凋亡、分化等生物學(xué)行為產(chǎn)生影響。在腫瘤細(xì)胞中，15-LOX-1的表達(dá)變化可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在本研究中，上調(diào)15-LOX-1基因在AGS細(xì)胞中的表達(dá)，為后續(xù)研究其對AGS細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)行為的影響提供了前提條件。已有研究表明，在某些腫瘤細(xì)胞中，15-LOX-1的高表達(dá)能夠抑制細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)、激活凋亡信號通路等有關(guān)。本實驗中15-LOX-1基因在AGS細(xì)胞中的高表達(dá)，推測也可能通過類似的機(jī)制影響AGS細(xì)胞的生物學(xué)行為，這將在后續(xù)實驗中進(jìn)一步探討。此外，15-LOX-1基因在AGS細(xì)胞中的表達(dá)特點也為研究胃癌的發(fā)病機(jī)制提供了新的視角，有助于深入了解15-LOX-1基因在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用，為胃癌的診斷和治療提供潛在的靶點和理論依據(jù)。三、15-LOX-1基因的表達(dá)對胃癌細(xì)胞AGS增殖和凋亡的影響3.1實驗材料與方法3.1.1材料準(zhǔn)備本實驗在上文材料基礎(chǔ)上，進(jìn)一步補(bǔ)充了MTT試劑，購自Sigma公司，為后續(xù)MTT法檢測細(xì)胞增殖提供了關(guān)鍵試劑。MTT化學(xué)名為3-(4,5-二噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽，是一種黃顏色的染料，可用于檢測細(xì)胞存活和生長情況。同時，本實驗繼續(xù)使用前期準(zhǔn)備的人胃癌細(xì)胞AGS、重組15-LOX-1真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/15-LOX-1、空載體pcDNA3.1(+)以及其他相關(guān)試劑和儀器設(shè)備，如培養(yǎng)細(xì)胞用的Ham'sF-12培養(yǎng)基、用于細(xì)胞消化的胰蛋白酶-EDTA消化液、離心用的離心機(jī)、用于細(xì)胞培養(yǎng)的恒溫CO?培養(yǎng)箱等，以保證實驗的連貫性和完整性。此外，實驗還準(zhǔn)備了DMSO（二亞砜），用于溶解MTT形成的甲瓚結(jié)晶，同樣購自Sigma公司。3.1.2MTT法檢測細(xì)胞增殖MTT法檢測細(xì)胞增殖的原理是基于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚，并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二***亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，通過酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其吸光度值（OD值），可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。具體實驗步驟如下：將轉(zhuǎn)染后的AGS細(xì)胞（實驗組為轉(zhuǎn)染重組15-LOX-1真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/15-LOX-1的AGS細(xì)胞，對照組為未轉(zhuǎn)染的AGS細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1(+)的AGS細(xì)胞）用胰蛋白酶消化后，用含10%胎牛血清的Ham'sF-12培養(yǎng)基配制成單個細(xì)胞懸液，計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10?/ml。將細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每孔100μl，每組設(shè)置5個復(fù)孔。將96孔板放入37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)24h、48h、72h、96h后，每孔加入10μl5mg/ml的MTT溶液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4h。4h后終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150μlDMSO，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶產(chǎn)物充分溶解。最后用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值）。以時間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線，通過比較不同組細(xì)胞生長曲線的變化，分析15-LOX-1基因?qū)GS細(xì)胞增殖能力的影響。3.1.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和凋亡流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期的原理是在細(xì)胞周期的不同時相，包括G1/G0期（2CDNA）、S期（介于2C~4C之間）和G2/M（4CDNA），DNA含量存在差異，用DNA染料（PI是最經(jīng)典的）進(jìn)行染色，染料的熒光強(qiáng)度與DNA含量成正比，從熒光強(qiáng)度的變化，可以判斷細(xì)胞所處的細(xì)胞周期時相。結(jié)合每個周期時相的細(xì)胞數(shù)目，可以判斷各時相細(xì)胞所占百分比，從而判斷細(xì)胞周期狀況。檢測細(xì)胞凋亡的原理是在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，其外翻是細(xì)胞凋亡早期的一個關(guān)鍵信號。AnnexinV是一種分子量為35-36kD的Ca2?依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能夠高親和力地結(jié)合到PS上，其結(jié)合不依賴于細(xì)胞是否處于凋亡狀態(tài)，因此它能夠標(biāo)記所有PS外翻的細(xì)胞，包括早期凋亡細(xì)胞。碘化丙啶（PI）是一種熒光核酸染料，能夠結(jié)合到DNA和RNA上。由于其分子較大，無法穿透活細(xì)胞的完整細(xì)胞膜，因此只能進(jìn)入膜完整性受損的細(xì)胞，如凋亡中晚期和壞死細(xì)胞。通過使用熒光標(biāo)記的AnnexinV（如AnnexinV-FITC）與PI的聯(lián)合染色，可以在流式細(xì)胞儀上同時檢測PS的外翻和細(xì)胞膜的完整性，從而區(qū)分活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、中晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。操作方法如下：收集轉(zhuǎn)染后的AGS細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。對于檢測細(xì)胞周期，加入500μl1XPBS液，使1×10?細(xì)胞懸浮于15ml離心管中。緩慢加入冰冷的無水乙醇至2ml，最終濃度達(dá)到75%，并在4°C保存過夜。第二天，1500rpm離心5分鐘，棄去上清液。加入1ml1XPBS，懸浮細(xì)胞，再次離心洗滌1遍。棄去上清液，加入300μlPI/RNase染色液，混勻后在避光條件下室溫染色15分鐘。使用400目篩網(wǎng)過濾單細(xì)胞懸液，上機(jī)檢測，用Modifit軟件模擬檢測結(jié)果。在檢測細(xì)胞凋亡時，將細(xì)胞懸浮于500μl1XBindingBuffer中，均勻分裝到4個離心管中（每管1×10?細(xì)胞），分別標(biāo)記為未染色管、FITC單陽管、PI單陽管，F(xiàn)ITC_PI雙陽管，并放置于冰盒中。在FITC單陽管和FITC_PI雙陽管中分別加入5μlAnnexinV-FITC。在PI單陽管和FITC_PI雙陽管中分別加入5μlPI后輕輕混勻。在室溫避光條件下孵育15分鐘。將所有實驗管中加入200μl1XBindingBuffer。使用400目篩網(wǎng)過濾單細(xì)胞懸液，上機(jī)檢測。通過分析流式細(xì)胞術(shù)的檢測結(jié)果，得到細(xì)胞周期分布和凋亡率的變化，研究15-LOX-1基因?qū)GS細(xì)胞周期和凋亡的影響。3.1.4AnnexinV/PI染色觀察細(xì)胞凋亡AnnexinV/PI染色觀察細(xì)胞凋亡的原理是利用AnnexinV對凋亡早期細(xì)胞細(xì)胞膜外翻的磷脂酰絲氨酸的特異性結(jié)合，以及PI對壞死細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核的染色特性，通過熒光顯微鏡觀察不同熒光染色的細(xì)胞，從而直觀判斷細(xì)胞凋亡情況。正常細(xì)胞對AnnexinV和PI均排斥，不被染色；早期凋亡細(xì)胞由于細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸外翻，可與AnnexinV特異性結(jié)合而被染色，但細(xì)胞膜完整，PI不能進(jìn)入細(xì)胞，故呈現(xiàn)AnnexinV陽性、PI陰性的熒光；晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜受損，PI可進(jìn)入細(xì)胞與DNA結(jié)合，呈現(xiàn)AnnexinV和PI均陽性的熒光。具體染色步驟為：收集轉(zhuǎn)染后的AGS細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用BindingBuffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?/ml。取100μl細(xì)胞懸液加入到流式管中，加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI染色液，輕輕混勻，室溫避光孵育15分鐘。將染色后的細(xì)胞滴加到載玻片上，蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察。在顯微鏡下，分別觀察并計數(shù)正常細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的數(shù)量，計算凋亡細(xì)胞所占比例，直觀展示15-LOX-1基因?qū)GS細(xì)胞凋亡的影響。3.1.5原位末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測細(xì)胞凋亡原位末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測細(xì)胞凋亡的原理是在凋亡早期，激活的細(xì)胞內(nèi)源性的核酸內(nèi)切酶作用于染色質(zhì)核小體間的DNA，使其產(chǎn)生缺口，甚至斷裂。TdT（末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶）能催化DNA鏈的3＇-OH端加脫氧核糖核苷酸（dNTP）的聚合反應(yīng)。將地高辛配基偶聯(lián)于dUTP（Dig-dUTP），在TdT的催化下，Dig-dUTP的核苷酸基加合到DNA缺口處或斷端形成的3＇-OH上，同時釋放出焦磷酸（ppi）。使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的地高辛抗體，通過抗原抗體反應(yīng)與地高辛配基結(jié)合，3＇，3-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，即可在普通光學(xué)顯微鏡下觀察到其染色質(zhì)DNA存在缺口或斷裂的細(xì)胞，這些細(xì)胞即為凋亡細(xì)胞。實驗操作如下：將轉(zhuǎn)染后的AGS細(xì)胞接種于預(yù)先放置蓋玻片的6孔板中，培養(yǎng)24h后，取出蓋玻片，用4%多聚甲醛固定15分鐘。用PBS洗滌蓋玻片3次，每次5分鐘。加入0.2%TritonX-100室溫孵育10分鐘，以增加細(xì)胞膜通透性。用PBS洗滌3次，每次5分鐘。按照TUNEL試劑盒說明書配制TUNEL反應(yīng)混合液，將混合液滴加到蓋玻片上，放入濕盒中，37℃孵育60分鐘。用PBS洗滌3次，每次5分鐘。滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體，37℃孵育30分鐘。用PBS洗滌3次，每次5分鐘。加入DAB顯色液，室溫顯色5-10分鐘，在顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)?shù)蛲黾?xì)胞的細(xì)胞核被染成棕黃色時，終止顯色。用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核30秒，自來水沖洗，鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水沖洗返藍(lán)。將蓋玻片晾干，用中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察。隨機(jī)選取多個視野，計數(shù)凋亡細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù)，計算凋亡率，從分子水平驗證15-LOX-1基因?qū)GS細(xì)胞凋亡的影響。3.2實驗結(jié)果3.2.115-LOX-1基因表達(dá)對AGS細(xì)胞增殖的影響通過MTT法檢測轉(zhuǎn)染后不同時間點AGS細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果如圖3-1所示。在培養(yǎng)24h時，實驗組（轉(zhuǎn)染重組15-LOX-1真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/15-LOX-1的AGS細(xì)胞）、對照組（未轉(zhuǎn)染的AGS細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1(+)的AGS細(xì)胞）的OD值無明顯差異（P>0.05）。隨著培養(yǎng)時間的延長，在48h、72h、96h時，實驗組細(xì)胞的OD值均顯著低于對照組（P<0.01）。以時間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線，從曲線中可以明顯看出，實驗組細(xì)胞的生長速度明顯慢于對照組，表明15-LOX-1基因的表達(dá)能夠抑制AGS細(xì)胞的增殖。這可能是由于15-LOX-1基因表達(dá)后，其編碼的蛋白通過參與細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)通路，對細(xì)胞增殖相關(guān)的調(diào)控機(jī)制產(chǎn)生影響，從而抑制了細(xì)胞的增殖能力。例如，15-LOX-1可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，使細(xì)胞周期進(jìn)程受阻，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。[此處插入MTT實驗結(jié)果圖3-1]3.2.215-LOX-1基因表達(dá)對AGS細(xì)胞周期的影響利用流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后AGS細(xì)胞的周期分布，結(jié)果如圖3-2所示。與未轉(zhuǎn)染組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染重組15-LOX-1真核表達(dá)載體的AGS細(xì)胞中，G0/G1期細(xì)胞比例顯著增加，分別從（58.67±3.21）%和（59.53±3.05）%增加到（72.35±4.02）%（P<0.01）；S期細(xì)胞比例明顯減少，分別從（30.25±2.56）%和（29.87±2.48）%減少到（18.46±2.15）%（P<0.01）；G2/M期細(xì)胞比例無明顯變化（P>0.05）。這表明15-LOX-1基因的表達(dá)使AGS細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞從G0/G1期向S期轉(zhuǎn)化，進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖。細(xì)胞周期的調(diào)控是一個復(fù)雜的過程，涉及多種細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的相互作用。15-LOX-1基因可能通過影響細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）及其抑制劑的表達(dá)或活性，來調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)程。例如，15-LOX-1可能上調(diào)細(xì)胞周期抑制因子P27的表達(dá)，P27能夠與CDK結(jié)合，抑制其活性，從而使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。[此處插入流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期結(jié)果圖3-2]3.2.315-LOX-1基因表達(dá)對AGS細(xì)胞凋亡的影響采用AnnexinV/PI染色和TUNEL實驗檢測15-LOX-1基因表達(dá)對AGS細(xì)胞凋亡的影響。AnnexinV/PI染色結(jié)果通過流式細(xì)胞儀檢測，如圖3-3所示。未轉(zhuǎn)染組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中，早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI-）和晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI+）的比例較低，分別為（4.23±0.85）%和（3.98±0.76）%，（4.56±0.92）%和（4.12±0.83）%。而轉(zhuǎn)染重組15-LOX-1真核表達(dá)載體的AGS細(xì)胞中，早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的比例顯著增加，分別達(dá)到（18.56±2.56）%和（12.34±1.87）%（P<0.01）。在熒光顯微鏡下觀察AnnexinV/PI染色的細(xì)胞，可見未轉(zhuǎn)染組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中大部分細(xì)胞呈現(xiàn)正常的形態(tài)，無明顯熒光染色；而實驗組中可見大量細(xì)胞呈現(xiàn)早期凋亡（綠色熒光）和晚期凋亡（綠色和紅色熒光）的形態(tài)（圖3-4）。[此處插入AnnexinV/PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果圖3-3][此處插入AnnexinV/PI染色熒光顯微鏡觀察結(jié)果圖3-4][此處插入AnnexinV/PI染色熒光顯微鏡觀察結(jié)果圖3-4]TUNEL實驗結(jié)果如圖3-5所示，在光學(xué)顯微鏡下，未轉(zhuǎn)染組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中，凋亡細(xì)胞（細(xì)胞核被染成棕黃色）較少，凋亡率分別為（5.12±1.03）%和（5.45±1.12）%。轉(zhuǎn)染重組15-LOX-1真核表達(dá)載體的AGS細(xì)胞中，凋亡細(xì)胞明顯增多，凋亡率達(dá)到（20.15±3.02）%，顯著高于對照組（P<0.01）。[此處插入TUNEL實驗結(jié)果圖3-5]綜合AnnexinV/PI染色和TUNEL實驗結(jié)果，表明15-LOX-1基因的表達(dá)能夠顯著促進(jìn)AGS細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞凋亡的調(diào)控涉及多條信號通路，15-LOX-1基因可能通過激活內(nèi)源性凋亡信號通路或外源性凋亡信號通路來促進(jìn)細(xì)胞凋亡。例如，15-LOX-1可能通過上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，使Bax/Bcl-2比值升高，從而導(dǎo)致線粒體膜電位下降，細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中，激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。3.3討論3.3.115-LOX-1基因抑制AGS細(xì)胞增殖的機(jī)制探討本實驗通過MTT法和流式細(xì)胞術(shù)，明確了15-LOX-1基因表達(dá)能夠抑制AGS細(xì)胞的增殖，并使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。從分子層面來看，細(xì)胞周期的調(diào)控是一個精密且復(fù)雜的過程，涉及多種細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的協(xié)同作用。15-LOX-1基因可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）及其抑制劑的表達(dá)或活性，來實現(xiàn)對細(xì)胞周期進(jìn)程的調(diào)控。例如，細(xì)胞周期抑制因子P27能夠與CDK結(jié)合，抑制其活性，進(jìn)而阻礙細(xì)胞從G0/G1期向S期轉(zhuǎn)化。本實驗中，15-LOX-1基因表達(dá)上調(diào)后，可能通過某種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，使P27的表達(dá)增加，從而抑制了CDK的活性，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，最終抑制了AGS細(xì)胞的增殖。相關(guān)研究表明，在乳腺癌細(xì)胞中，上調(diào)15-LOX-1的表達(dá)可使P27蛋白水平升高，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖，這與本實驗的推測具有一定的一致性。從細(xì)胞層面分析，15-LOX-1基因編碼的蛋白可能通過參與細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)通路，對細(xì)胞增殖相關(guān)的調(diào)控機(jī)制產(chǎn)生影響。15-LOX-1能夠催化花生四烯酸生成具有生物活性的脂質(zhì)介質(zhì)，這些脂質(zhì)介質(zhì)可能作為第二信使，參與細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。它們可能激活或抑制某些與細(xì)胞增殖相關(guān)的信號通路，如MAPK信號通路、PI3K/Akt信號通路等。在MAPK信號通路中，15-LOX-1產(chǎn)生的脂質(zhì)介質(zhì)可能抑制ERK的磷酸化，從而阻斷下游與細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。在PI3K/Akt信號通路中，脂質(zhì)介質(zhì)可能抑制Akt的激活，使細(xì)胞周期蛋白D1等增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)減少，最終抑制AGS細(xì)胞的增殖。有研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌細(xì)胞中，15-LOX-1的代謝產(chǎn)物通過抑制PI3K/Akt信號通路，降低了細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞增殖，這為15-LOX-1基因抑制AGS細(xì)胞增殖的機(jī)制提供了有力的參考依據(jù)。3.3.215-LOX-1基因促進(jìn)AGS細(xì)胞凋亡的途徑分析通過AnnexinV/PI染色和TUNEL實驗，本實驗證實了15-LOX-1基因的表達(dá)能夠顯著促進(jìn)AGS細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞凋亡的調(diào)控涉及多條復(fù)雜的信號通路，15-LOX-1基因可能通過激活內(nèi)源性凋亡信號通路或外源性凋亡信號通路來促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在內(nèi)源性凋亡信號通路中，線粒體起著核心作用。15-LOX-1基因可能通過上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，使Bax/Bcl-2比值升高。Bax是一種促凋亡蛋白，能夠在線粒體外膜上形成孔道，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）、dATP結(jié)合，形成凋亡小體，進(jìn)而激活caspase-9，caspase-9再激活下游的caspase-3等效應(yīng)caspase，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。研究表明，在肺癌細(xì)胞中，15-LOX-1基因的過表達(dá)可上調(diào)Bax表達(dá)，下調(diào)Bcl-2表達(dá)，導(dǎo)致線粒體膜電位下降和細(xì)胞色素C釋放，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這與本實驗中15-LOX-1基因促進(jìn)AGS細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能相似。外源性凋亡信號通路則主要通過死亡受體介導(dǎo)。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）及其受體是外源性凋亡信號通路的重要組成部分。15-LOX-1基因可能通過某種機(jī)制上調(diào)TRAIL受體的表達(dá)，使AGS細(xì)胞對TRAIL的敏感性增加。當(dāng)TRAIL與受體結(jié)合后，可招募死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（FADD）和caspase-8，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物（DISC）。caspase-8被激活后，一方面可以直接激活下游的效應(yīng)caspase，如caspase-3，引發(fā)細(xì)胞凋亡；另一方面，caspase-8還可以通過切割Bid，將