乳酸明串珠菌產(chǎn)細(xì)菌素的特性、機(jī)制及應(yīng)用前景探究一、引言1.1研究背景與意義隨著人們對(duì)食品安全和健康的關(guān)注度不斷提高，尋找安全、有效的天然抗菌劑成為食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。乳酸明串珠菌（Leuconostoclactis）作為乳酸菌的一種，廣泛存在于發(fā)酵食品、動(dòng)物腸道等環(huán)境中。近年來，乳酸明串珠菌產(chǎn)生的細(xì)菌素因其具有天然、高效、安全等特性，在食品保鮮、醫(yī)藥抗菌等領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力，受到了廣泛的研究關(guān)注。在食品領(lǐng)域，傳統(tǒng)的化學(xué)防腐劑雖能有效抑制微生物生長(zhǎng)，但長(zhǎng)期食用可能對(duì)人體健康產(chǎn)生潛在風(fēng)險(xiǎn)，如損害人體肝臟、腎臟等器官，導(dǎo)致過敏反應(yīng)等。消費(fèi)者對(duì)無化學(xué)添加劑、純天然食品的需求日益增長(zhǎng)，促使科研人員尋找更安全、健康的食品保鮮方式。細(xì)菌素作為一種天然的生物防腐劑，由微生物產(chǎn)生，能夠特異性地抑制或殺死其他微生物，且對(duì)人體無害，符合現(xiàn)代消費(fèi)者對(duì)食品安全的要求。乳酸明串珠菌產(chǎn)細(xì)菌素對(duì)多種食品中常見的致病菌，如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌等具有顯著的抑制作用，能夠有效延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期，保持食品的品質(zhì)和風(fēng)味，減少食品因微生物污染而導(dǎo)致的腐敗變質(zhì)，降低食品企業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失，保障消費(fèi)者的飲食安全。例如在乳制品、肉制品、果蔬制品等加工過程中添加適量的乳酸明串珠菌細(xì)菌素，可有效抑制有害微生物的生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)不影響食品的營養(yǎng)成分和口感，為食品工業(yè)提供了一種綠色、可持續(xù)的保鮮解決方案。在醫(yī)藥領(lǐng)域，抗生素的廣泛使用導(dǎo)致了耐藥菌的大量出現(xiàn)，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）、耐萬古霉素腸球菌（VRE）等，使許多常見感染性疾病的治療面臨困境。開發(fā)新型抗菌藥物迫在眉睫。乳酸明串珠菌產(chǎn)細(xì)菌素具有獨(dú)特的抗菌機(jī)制，能夠作用于細(xì)菌的細(xì)胞膜、細(xì)胞壁或細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵靶點(diǎn)，破壞細(xì)菌的正常生理功能，從而抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。部分細(xì)菌素還具有免疫調(diào)節(jié)作用，能夠增強(qiáng)機(jī)體的免疫力，輔助治療感染性疾病。此外，細(xì)菌素作為生物來源的抗菌劑，具有低毒、無殘留、不易誘導(dǎo)耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，有望成為新型抗菌藥物的重要來源，為解決臨床耐藥菌感染問題提供新的途徑和方法。乳酸明串珠菌產(chǎn)細(xì)菌素在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的研究不僅具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，還能為相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供技術(shù)支持和理論依據(jù)，對(duì)于推動(dòng)天然抗菌劑的開發(fā)和應(yīng)用，保障人類健康具有深遠(yuǎn)的影響。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在乳酸明串珠菌產(chǎn)細(xì)菌素的篩選方面，國內(nèi)外學(xué)者已從多種自然環(huán)境中成功分離出該類細(xì)菌素產(chǎn)生菌株。國外研究人員最早從發(fā)酵蔬菜、乳制品等傳統(tǒng)發(fā)酵食品中發(fā)現(xiàn)了具有產(chǎn)細(xì)菌素能力的乳酸明串珠菌。例如，在德國酸菜的發(fā)酵過程中，檢測(cè)到乳酸明串珠菌產(chǎn)生的細(xì)菌素能夠有效抑制有害微生物的生長(zhǎng)，維持發(fā)酵體系的穩(wěn)定。國內(nèi)研究也不甘落后，從馬奶酒、泡菜等特色發(fā)酵食品中篩選出多株產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸明串珠菌。如從馬奶酒中分離得到的乳酸明串珠菌SMN2-1-2，經(jīng)鑒定具有較強(qiáng)的產(chǎn)細(xì)菌素能力，且對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等常見致病菌表現(xiàn)出顯著的抑制作用，為馬奶酒的品質(zhì)保障和發(fā)酵工藝優(yōu)化提供了新的思路。在細(xì)菌素特性研究方面，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)乳酸明串珠菌所產(chǎn)細(xì)菌素的理化性質(zhì)、抑菌譜等進(jìn)行了深入探究。研究發(fā)現(xiàn)，該類細(xì)菌素大多為小分子肽類物質(zhì)，具有良好的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性。部分細(xì)菌素在高溫（如121℃處理30min）條件下仍能保持較高的活性，這使其在食品加工的高溫滅菌環(huán)節(jié)中依然能夠發(fā)揮抑菌作用，拓寬了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用范圍。在抑菌譜方面，乳酸明串珠菌產(chǎn)細(xì)菌素不僅對(duì)革蘭氏陽性菌如金黃色葡萄球菌、李斯特菌等具有強(qiáng)烈的抑制效果，對(duì)部分革蘭氏陰性菌如大腸桿菌、沙門氏菌等也有一定的抑制作用，展現(xiàn)出較廣的抑菌范圍，為食品保鮮和醫(yī)療抗菌提供了更全面的保障。對(duì)于乳酸明串珠菌產(chǎn)細(xì)菌素的抑菌機(jī)制研究，目前國內(nèi)外的研究仍處于不斷深入階段。普遍認(rèn)為，細(xì)菌素主要通過作用于細(xì)菌細(xì)胞膜，破壞細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄露，從而抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。此外，部分細(xì)菌素還可能干擾細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，或作用于細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵酶和代謝途徑，阻礙細(xì)菌的正常生理活動(dòng)。國內(nèi)研究團(tuán)隊(duì)通過對(duì)細(xì)菌素作用前后的病原菌細(xì)胞進(jìn)行電鏡觀察和生理生化分析，進(jìn)一步揭示了細(xì)菌素與細(xì)胞膜相互作用的微觀過程，為深入理解抑菌機(jī)制提供了直觀的證據(jù)；國外學(xué)者則利用基因敲除和轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，研究細(xì)菌素作用下病原菌基因表達(dá)的變化，從分子層面解析抑菌機(jī)制，為新型抗菌藥物的研發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。在應(yīng)用研究方面，乳酸明串珠菌產(chǎn)細(xì)菌素在食品保鮮和醫(yī)藥領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的潛力，受到了國內(nèi)外廣泛關(guān)注。在食品保鮮領(lǐng)域，將細(xì)菌素添加到乳制品、肉制品、果蔬制品等食品中，能夠有效延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期，保持食品的色澤、口感和營養(yǎng)成分。如在酸奶生產(chǎn)中添加適量的乳酸明串珠菌細(xì)菌素，可抑制酸奶在儲(chǔ)存過程中雜菌的生長(zhǎng)，防止酸奶變質(zhì)，同時(shí)不影響酸奶的風(fēng)味和益生菌活性；在醫(yī)藥領(lǐng)域，細(xì)菌素因其低毒、不易誘導(dǎo)耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，有望成為新型抗菌藥物的重要來源。國外已開展了相關(guān)的臨床試驗(yàn)，初步驗(yàn)證了細(xì)菌素在治療皮膚感染、口腔感染等方面的有效性和安全性；國內(nèi)也在積極探索細(xì)菌素與傳統(tǒng)抗生素聯(lián)合使用的可能性，以提高抗菌效果，減少抗生素的使用劑量，降低耐藥菌產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探究乳酸明串珠菌產(chǎn)細(xì)菌素的相關(guān)特性，為其在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)和技術(shù)支持。具體研究目的如下：解析乳酸明串珠菌產(chǎn)細(xì)菌素的合成機(jī)制：從基因?qū)用婧痛x途徑角度出發(fā)，深入剖析細(xì)菌素合成的調(diào)控機(jī)制，明確關(guān)鍵基因和酶在合成過程中的作用，為提高細(xì)菌素產(chǎn)量提供理論指導(dǎo)。優(yōu)化乳酸明串珠菌產(chǎn)細(xì)菌素的發(fā)酵條件：系統(tǒng)研究不同培養(yǎng)條件，如培養(yǎng)基成分（碳源、氮源、微量元素等）、培養(yǎng)溫度、pH值、接種量等因素對(duì)細(xì)菌素產(chǎn)量和活性的影響，通過響應(yīng)面優(yōu)化等方法確定最佳發(fā)酵條件，實(shí)現(xiàn)細(xì)菌素的高效生產(chǎn)。全面表征乳酸明串珠菌細(xì)菌素的特性：詳細(xì)研究細(xì)菌素的理化性質(zhì)，包括熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、分子量、等電點(diǎn)等；明確其抑菌譜，探究對(duì)革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌以及真菌等不同類型微生物的抑制效果；深入解析抑菌機(jī)制，從細(xì)胞水平和分子水平揭示細(xì)菌素抑制微生物生長(zhǎng)的作用方式。拓展乳酸明串珠菌細(xì)菌素的應(yīng)用領(lǐng)域：基于細(xì)菌素的特性，探索其在食品保鮮、醫(yī)藥抗菌、生物防治等領(lǐng)域的應(yīng)用潛力。在食品保鮮方面，研究細(xì)菌素在不同食品體系中的應(yīng)用效果，評(píng)估其對(duì)食品品質(zhì)、保質(zhì)期和安全性的影響；在醫(yī)藥抗菌領(lǐng)域，探討細(xì)菌素作為新型抗菌藥物或輔助治療藥物的可能性，研究其體內(nèi)抗菌活性和安全性；在生物防治方面，探究細(xì)菌素對(duì)植物病原菌的抑制作用，為農(nóng)業(yè)病害防治提供新的生物制劑。圍繞上述研究目的，本研究的具體內(nèi)容包括：乳酸明串珠菌的分離篩選與鑒定：從多種發(fā)酵食品、動(dòng)物腸道等樣品中分離乳酸明串珠菌，通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗(yàn)以及16SrRNA基因測(cè)序等方法進(jìn)行菌種鑒定，篩選出高產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸明串珠菌菌株。細(xì)菌素的分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定：采用硫酸銨沉淀、離子交換層析、凝膠過濾層析等方法對(duì)發(fā)酵液中的細(xì)菌素進(jìn)行分離純化，利用質(zhì)譜分析、核磁共振等技術(shù)確定細(xì)菌素的分子結(jié)構(gòu)和氨基酸序列。細(xì)菌素的理化性質(zhì)與抑菌特性研究：測(cè)定細(xì)菌素的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、蛋白酶敏感性等理化性質(zhì)；采用牛津杯法、微量稀釋法等方法測(cè)定細(xì)菌素的抑菌譜和最小抑菌濃度（MIC）；通過掃描電鏡、透射電鏡觀察細(xì)菌素作用后病原菌細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)合細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄露、ATP含量變化等指標(biāo)分析抑菌機(jī)制。產(chǎn)細(xì)菌素發(fā)酵條件的優(yōu)化：采用單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman試驗(yàn)、Box-Behnken試驗(yàn)等方法對(duì)培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)細(xì)菌素產(chǎn)量，提高細(xì)菌素的發(fā)酵水平。細(xì)菌素在食品保鮮和醫(yī)藥抗菌領(lǐng)域的應(yīng)用研究：在食品保鮮方面，將細(xì)菌素添加到乳制品、肉制品、果蔬制品等食品中，監(jiān)測(cè)食品在儲(chǔ)存過程中的微生物數(shù)量、理化指標(biāo)和感官品質(zhì)變化，評(píng)估細(xì)菌素的保鮮效果；在醫(yī)藥抗菌領(lǐng)域，通過體內(nèi)外抗菌實(shí)驗(yàn)研究細(xì)菌素對(duì)常見病原菌的抑制作用，初步探討其作為抗菌藥物的可行性和安全性。二、乳酸明串珠菌及細(xì)菌素概述2.1乳酸明串珠菌的生物學(xué)特性2.1.1形態(tài)與結(jié)構(gòu)特征乳酸明串珠菌隸屬于明串珠菌屬，為革蘭氏陽性菌，細(xì)胞呈球形或豆?fàn)?，直徑約0.5-0.7μm，長(zhǎng)度在0.7-1.2μm左右。在自然生長(zhǎng)環(huán)境下，細(xì)胞常成對(duì)或呈短鏈狀排列；當(dāng)處于競(jìng)爭(zhēng)性較強(qiáng)的環(huán)境中時(shí)，會(huì)形成較長(zhǎng)的鏈狀結(jié)構(gòu)。其細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，沒有芽孢，不具備運(yùn)動(dòng)能力。在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，菌落一般小于1.0mm，呈光滑、圓形，顏色為灰白色；在液體培養(yǎng)基中，通常呈現(xiàn)混濁均勻的狀態(tài)，但長(zhǎng)鏈狀菌株可能會(huì)形成沉淀。乳酸明串珠菌沒有特殊的細(xì)胞器，其遺傳物質(zhì)DNA呈環(huán)狀，集中分布于細(xì)胞的擬核區(qū)域，且沒有核膜包裹。細(xì)胞外存在一層較厚的細(xì)胞壁，主要由肽聚糖組成，能夠維持細(xì)胞的形態(tài)，保護(hù)細(xì)胞免受外界環(huán)境的傷害。細(xì)胞膜則由磷脂雙分子層和蛋白質(zhì)構(gòu)成，具有選擇透過性，參與細(xì)胞的物質(zhì)運(yùn)輸、能量轉(zhuǎn)換和信號(hào)傳遞等重要生理過程。2.1.2生理生化特性乳酸明串珠菌屬于化能異養(yǎng)型微生物，其生長(zhǎng)繁殖需要多種復(fù)合生長(zhǎng)因子，包括煙酸、硫胺素、生物素以及氨基酸等，但不需要泛酸及其衍生物。在碳源利用方面，該菌能夠利用葡萄糖進(jìn)行異型乳酸發(fā)酵。在此過程中，葡萄糖首先被磷酸化，然后通過一系列酶的作用，分解產(chǎn)生D型乳酸、乙酸或醋酸以及CO2。這種代謝方式不僅為細(xì)胞提供了能量，還產(chǎn)生了具有重要應(yīng)用價(jià)值的代謝產(chǎn)物。此外，乳酸明串珠菌還能夠使蘋果酸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)型乳酸，這一特性在食品發(fā)酵等領(lǐng)域具有重要意義。在氮源利用上，它可以利用有機(jī)氮源，如蛋白胨、酵母提取物等，為細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝提供必要的氮元素。在生長(zhǎng)溫度方面，乳酸明串珠菌的生長(zhǎng)溫度范圍為5-30℃，最適生長(zhǎng)溫度為25℃。在這個(gè)溫度下，細(xì)胞內(nèi)的酶活性較高，能夠高效地進(jìn)行各種代謝活動(dòng)，從而促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和繁殖。當(dāng)溫度過高或過低時(shí)，酶的活性會(huì)受到抑制，影響細(xì)胞的正常生理功能。其生長(zhǎng)的pH值范圍通常在3.0-6.5之間，具有一定的耐酸性。在酸性環(huán)境中，細(xì)胞能夠通過調(diào)節(jié)自身的代謝途徑和生理機(jī)制來適應(yīng)環(huán)境，維持正常的生長(zhǎng)和代謝。乳酸明串珠菌通常不酸化和凝固牛乳，不水解精氨酸，也不水解蛋白，不還原硝酸鹽，不產(chǎn)生溶血現(xiàn)象，不產(chǎn)吲哚。這些生理生化特性使其在微生物群落中具有獨(dú)特的生態(tài)位，同時(shí)也為其在食品發(fā)酵和其他應(yīng)用領(lǐng)域提供了特定的優(yōu)勢(shì)。例如，在發(fā)酵食品中，不水解蛋白的特性可以避免食品蛋白質(zhì)的分解，保持食品的質(zhì)地和口感。在有氧或無氧條件下，乳酸明串珠菌均能生長(zhǎng)，屬于兼性厭氧型微生物。在有氧環(huán)境中，它可以通過有氧呼吸獲取能量；在無氧條件下，則通過發(fā)酵作用產(chǎn)生能量。其接觸酶反應(yīng)呈陰性，這意味著它在代謝過程中不會(huì)產(chǎn)生大量的過氧化氫，或者缺乏有效的過氧化氫分解機(jī)制。2.1.3分布與來源乳酸明串珠菌在自然界中分布較為廣泛，常見于水果、蔬菜等植物性原料中。在水果表面，它可以利用水果中的糖類等營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，參與水果的自然發(fā)酵過程。在蔬菜中，尤其是在發(fā)酵蔬菜，如酸菜、泡菜的制作過程中，乳酸明串珠菌起著重要的作用。它能夠利用蔬菜中的糖分進(jìn)行異型乳酸發(fā)酵，產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸，降低環(huán)境pH值，抑制有害微生物的生長(zhǎng)，同時(shí)賦予發(fā)酵蔬菜獨(dú)特的風(fēng)味和口感。在發(fā)酵食品領(lǐng)域，乳酸明串珠菌是許多發(fā)酵乳制品和發(fā)酵豆制品的重要發(fā)酵菌種。在乳制品中，如酸奶、奶酪等的發(fā)酵過程中，乳酸明串珠菌與其他乳酸菌協(xié)同作用，將乳糖發(fā)酵為乳酸，使乳制品具有酸味和獨(dú)特的風(fēng)味。在發(fā)酵豆制品，如豆醬、腐乳的制作中，它也參與發(fā)酵過程，對(duì)產(chǎn)品的品質(zhì)和風(fēng)味形成起到重要作用。在動(dòng)物腸道中，乳酸明串珠菌也是常見的微生物之一。它可以與腸道內(nèi)的其他有益微生物共同構(gòu)成腸道微生物群落，維持腸道微生態(tài)平衡。通過產(chǎn)生有機(jī)酸、細(xì)菌素等物質(zhì)，抑制有害菌的生長(zhǎng)，促進(jìn)腸道健康，增強(qiáng)動(dòng)物的免疫力。研究人員通常從發(fā)酵食品、動(dòng)物腸道以及自然環(huán)境中的植物原料等樣品中分離獲取乳酸明串珠菌。在分離過程中，一般采用選擇性培養(yǎng)基，如MRS培養(yǎng)基，并結(jié)合稀釋涂布平板法、平板劃線法等微生物分離技術(shù)，將乳酸明串珠菌從復(fù)雜的微生物群落中分離出來。隨后，通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗(yàn)以及分子生物學(xué)方法，如16SrRNA基因測(cè)序等，對(duì)分離得到的菌株進(jìn)行鑒定，確定其是否為乳酸明串珠菌。2.2細(xì)菌素的概念與分類細(xì)菌素是一類由細(xì)菌在代謝過程中通過核糖體合成機(jī)制產(chǎn)生的具有抑菌活性的多肽或前體多肽。1925年，A?格雷希亞首次報(bào)道了大腸桿菌V株產(chǎn)生一種對(duì)大腸桿菌Φ株有殺菌作用的物質(zhì)，這類物質(zhì)被稱作大腸桿菌素，此后，細(xì)菌素的研究逐漸展開。細(xì)菌素主要含有具生物活性的蛋白質(zhì)部分，對(duì)同種近緣菌株呈現(xiàn)狹窄的活性抑制譜，其產(chǎn)生和寄主細(xì)胞對(duì)細(xì)菌素的免疫性都由質(zhì)粒控制。與傳統(tǒng)抗生素不同，細(xì)菌素由基因編碼，合成及作用模式獨(dú)特，且對(duì)抗生素顯示抗性的微生物通常不對(duì)細(xì)菌素顯示交叉抗性，細(xì)菌素抗性通常也不是由遺傳決定的。細(xì)菌素的分類方式多樣，根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和分子量大小，可將其分為4類：第一類：羊毛硫抗生素（Lantibiotics）：這是一類小分子的修飾肽，含19-50個(gè)以上的氨基酸分子。其分子活性部位含有羊毛硫氨酸（Lanthionine）、β－甲基羊毛硫氨酸（β-methyllanthionine）、脫氫酪氨酸（Dehydrobutyrine）和脫氫丙氨酸（Dehydroalanine）等非編碼氨基酸。Lantibiotics又可細(xì)分為兩個(gè)亞類：Ia類是由在靶目標(biāo)膜上形成孔道的陽離子和疏水基團(tuán)組成的肽，與結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的Ib類相比，其結(jié)構(gòu)的伸展性更好；Ib類是球狀的肽類，不帶電或帶負(fù)電。例如，發(fā)現(xiàn)于1928年的乳酸鏈球菌素（Nisin）就屬于Ia類細(xì)菌素，它能在靶細(xì)胞膜上形成孔道，對(duì)革蘭氏陽性菌如葡萄球菌屬、鏈球菌屬、小球菌屬和乳桿菌屬的某些菌種，以及大部分梭菌屬和芽孢桿菌屬的孢子具有抑制作用，是目前唯一被商業(yè)化應(yīng)用的細(xì)菌素，廣泛用于食品保鮮領(lǐng)域，可有效延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期。第二類：小分子的熱穩(wěn)定肽（SHSP）：分子量小于10Kda，具有疏水性和膜活性。其結(jié)構(gòu)特征為：N末端信號(hào)肽序列長(zhǎng)度為18-21個(gè)氨基酸，前導(dǎo)肽鏈由一個(gè)蛋氨酸開始，并常隨一個(gè)賴氨酸；有活性的細(xì)菌素其N-末端+1的位置上通常是賴氨酸或精氨酸。該類可進(jìn)一步分為3個(gè)亞類：Iia類N-末端氨基酸序列為Tyr-Gly-Asn-Gly-Val，并由兩個(gè)半胱氨酸所構(gòu)成的S-S橋，對(duì)利斯特氏桿菌有活性，如小球菌素（pediocin）就屬于Iia類細(xì)菌素，能有效抑制李斯特菌的生長(zhǎng)，在食品保鮮中具有重要應(yīng)用潛力；Iib類孔道復(fù)合物由兩個(gè)具有不同氨基酸序列的肽類寡聚體形成；Iic類能被硫醇激活、活性基團(tuán)要求有原性半胱氨酸殘基。第三類：熱敏感的大分子蛋白（LHLP）：分子量一般大于10Kda，通常在100℃或更低溫度30s內(nèi)即失活，它們的抑菌譜較窄。這類細(xì)菌素在實(shí)際應(yīng)用中受到其熱不穩(wěn)定性的限制，需要在低溫條件下保存和使用。第四類：復(fù)合型的大分子復(fù)合物：除蛋白質(zhì)外還含有碳水化合物或類脂基團(tuán)。目前這類細(xì)菌素還未被充分純化和深入研究，其抑菌機(jī)制和應(yīng)用潛力尚有待進(jìn)一步探索。由于其結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，分離純化難度較大，限制了對(duì)其特性和功能的了解。按照產(chǎn)生菌的種類，細(xì)菌素也可以生產(chǎn)菌來命名。例如大腸桿菌產(chǎn)生的細(xì)菌素稱大腸桿菌素，乳酸菌產(chǎn)生的稱為乳酸鏈球菌素（乳鏈菌肽，Nisin），綠膿桿菌產(chǎn)生的稱綠膿桿菌素。這種命名方式簡(jiǎn)單直觀，便于區(qū)分不同來源的細(xì)菌素。2.3乳酸明串珠菌產(chǎn)細(xì)菌素的研究歷程對(duì)乳酸明串珠菌產(chǎn)細(xì)菌素的研究，最早可追溯到20世紀(jì)中期。當(dāng)時(shí)，科研人員在對(duì)發(fā)酵食品微生物的研究中，偶然發(fā)現(xiàn)乳酸明串珠菌在發(fā)酵過程中能夠抑制其他雜菌的生長(zhǎng)，推測(cè)其可能產(chǎn)生了具有抑菌活性的物質(zhì)，即細(xì)菌素，但受限于當(dāng)時(shí)的技術(shù)條件，未能對(duì)細(xì)菌素進(jìn)行深入研究。到了20世紀(jì)70年代，隨著微生物培養(yǎng)技術(shù)和分析檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，研究人員開始能夠較為系統(tǒng)地對(duì)乳酸明串珠菌產(chǎn)細(xì)菌素進(jìn)行研究。通過優(yōu)化培養(yǎng)條件，成功從發(fā)酵液中分離出具有抑菌活性的物質(zhì)，并初步確定其為蛋白質(zhì)類物質(zhì)。這一階段的研究主要集中在細(xì)菌素的分離和初步鑒定，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。20世紀(jì)80-90年代，分子生物學(xué)技術(shù)的興起為乳酸明串珠菌產(chǎn)細(xì)菌素的研究帶來了新的契機(jī)?？蒲腥藛T運(yùn)用基因克隆、測(cè)序等技術(shù)，深入探究細(xì)菌素的基因結(jié)構(gòu)和合成機(jī)制。發(fā)現(xiàn)細(xì)菌素的合成受到一系列基因的調(diào)控，這些基因通常位于質(zhì)?；蛉旧w上。通過對(duì)基因序列的分析，進(jìn)一步了解了細(xì)菌素的氨基酸組成和結(jié)構(gòu)特征。同時(shí)，在這一時(shí)期，對(duì)細(xì)菌素的理化性質(zhì)和抑菌特性也進(jìn)行了更深入的研究。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸明串珠菌產(chǎn)細(xì)菌素具有較好的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性，在一定溫度和pH值范圍內(nèi)能夠保持較高的活性。其抑菌譜也逐漸明確，對(duì)多種革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性菌具有抑制作用。進(jìn)入21世紀(jì)，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等新興技術(shù)的應(yīng)用，乳酸明串珠菌產(chǎn)細(xì)菌素的研究進(jìn)入了一個(gè)全新的階段。研究人員不僅能夠從分子層面深入解析細(xì)菌素的合成途徑和調(diào)控機(jī)制，還能通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析技術(shù)，如X-射線晶體學(xué)、核磁共振等，精確確定細(xì)菌素的三維結(jié)構(gòu)，為理解其抑菌機(jī)制提供了更直觀的依據(jù)。在應(yīng)用研究方面，這一時(shí)期取得了重大突破。乳酸明串珠菌產(chǎn)細(xì)菌素開始在食品保鮮、醫(yī)藥抗菌等領(lǐng)域進(jìn)行應(yīng)用探索。在食品保鮮領(lǐng)域，將細(xì)菌素添加到乳制品、肉制品、果蔬制品等食品中，有效延長(zhǎng)了食品的保質(zhì)期，減少了食品因微生物污染而導(dǎo)致的腐敗變質(zhì)；在醫(yī)藥抗菌領(lǐng)域，研究人員開展了細(xì)菌素對(duì)臨床常見病原菌的抑制作用研究，部分細(xì)菌素在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)中展現(xiàn)出良好的抗菌效果，為新型抗菌藥物的開發(fā)提供了新的方向。近年來，隨著合成生物學(xué)、基因編輯等前沿技術(shù)的發(fā)展，研究人員開始嘗試通過基因工程手段對(duì)乳酸明串珠菌進(jìn)行改造，以提高細(xì)菌素的產(chǎn)量和活性。通過敲除或過表達(dá)相關(guān)基因，優(yōu)化細(xì)菌素的合成途徑，成功獲得了高產(chǎn)細(xì)菌素的工程菌株。同時(shí)，對(duì)細(xì)菌素的作用機(jī)制研究也更加深入，不僅關(guān)注其對(duì)細(xì)胞膜、細(xì)胞壁的作用，還深入探討了細(xì)菌素與細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)的相互作用，以及對(duì)細(xì)菌代謝途徑和信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響。此外，在應(yīng)用研究方面，不斷拓展細(xì)菌素的應(yīng)用領(lǐng)域，如在生物防治、飼料添加劑等領(lǐng)域的研究也取得了一定的進(jìn)展。三、乳酸明串珠菌產(chǎn)細(xì)菌素的篩選與鑒定3.1菌株的分離與篩選方法3.1.1樣品采集為了獲取乳酸明串珠菌，本研究從多種富含乳酸菌的自然樣本中進(jìn)行采集，主要包括傳統(tǒng)發(fā)酵食品、動(dòng)物腸道內(nèi)容物以及新鮮的果蔬表面。在傳統(tǒng)發(fā)酵食品方面，選取了具有代表性的內(nèi)蒙古馬奶酒、四川泡菜、東北酸菜等。馬奶酒作為蒙古族等游牧民族的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品，其發(fā)酵過程中存在豐富的乳酸菌資源，為乳酸明串珠菌的分離提供了良好的樣本來源。四川泡菜和東北酸菜在發(fā)酵過程中，乳酸菌大量繁殖，形成了獨(dú)特的微生物群落，其中可能含有產(chǎn)細(xì)菌素能力較強(qiáng)的乳酸明串珠菌。對(duì)于動(dòng)物腸道內(nèi)容物，選擇了健康的牛、羊、豬等家畜的腸道，這些動(dòng)物在日常飲食中會(huì)攝入大量的植物性飼料，腸道內(nèi)微生物種類繁多，乳酸明串珠菌有可能在其中定殖。在果蔬表面樣本采集時(shí)，挑選了新鮮的葡萄、蘋果、白菜、黃瓜等常見果蔬。果蔬在生長(zhǎng)過程中，表面會(huì)附著各種微生物，乳酸明串珠菌可能作為其中的一員參與果蔬的自然發(fā)酵過程。在采集過程中，嚴(yán)格遵循無菌操作原則，確保樣品不受外界微生物的污染。對(duì)于發(fā)酵食品，使用無菌勺子或移液器準(zhǔn)確采集適量樣品，放入無菌的采樣瓶中，并迅速密封。動(dòng)物腸道內(nèi)容物采集時(shí)，在無菌條件下解剖動(dòng)物，取出腸道，用無菌剪刀剪取適量?jī)?nèi)容物，裝入無菌離心管中。果蔬表面樣品采集時(shí)，先用無菌水沖洗果蔬表面，去除表面的灰塵和雜質(zhì)，然后用無菌棉簽在果蔬表面均勻涂抹，將棉簽放入裝有無菌生理鹽水的采樣管中，充分振蕩，使表面微生物洗脫到生理鹽水中。采集后的樣品立即放入冰盒中保存，并盡快帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)處理，以保證樣品中微生物的活性。3.1.2菌株的分離樣品帶回實(shí)驗(yàn)室后，首先進(jìn)行梯度稀釋。取1g（或1mL）樣品加入到裝有9mL無菌生理鹽水并帶有玻璃珠的三角瓶中，在搖床上以200r/min的速度振蕩20min，使樣品中的微生物充分分散。然后進(jìn)行系列梯度稀釋，依次制備10?1、10?2、10?3、10??、10??、10??等不同稀釋度的樣品稀釋液。采用MRS培養(yǎng)基對(duì)乳酸明串珠菌進(jìn)行選擇性分離。MRS培養(yǎng)基含有豐富的營養(yǎng)成分，如蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物等，能夠?yàn)槿樗崦鞔榫纳L(zhǎng)提供必要的碳源、氮源、維生素和礦物質(zhì)等。其獨(dú)特的配方能夠抑制其他雜菌的生長(zhǎng)，有利于乳酸明串珠菌的富集和分離。將不同稀釋度的樣品稀釋液分別取0.1mL，用無菌涂布器均勻涂布于MRS固體培養(yǎng)基平板上。每個(gè)稀釋度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性。將涂布好的平板倒置放入30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48-72h。在培養(yǎng)過程中，乳酸明串珠菌會(huì)在培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)繁殖，形成肉眼可見的菌落。由于乳酸明串珠菌的菌落特征為圓形、光滑、濕潤(rùn)、邊緣整齊，顏色為灰白色或乳白色，直徑一般在1-2mm左右，通過觀察菌落形態(tài)，初步挑選出疑似乳酸明串珠菌的菌落。為了進(jìn)一步純化菌株，采用平板劃線法對(duì)初步挑選的菌落進(jìn)行分離。用無菌接種環(huán)挑取單個(gè)菌落，在新的MRS固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行劃線操作。劃線時(shí)，按照一定的順序和方向，從低濃度區(qū)域向高濃度區(qū)域劃線，使菌落逐漸分散，最終在平板上形成單個(gè)的菌落。將劃線后的平板再次倒置放入30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48h。經(jīng)過平板劃線純化后，挑選出形態(tài)典型、生長(zhǎng)良好的單個(gè)菌落，接種到MRS液體培養(yǎng)基中，在30℃、150r/min的條件下振蕩培養(yǎng)24h，制備成菌液。將菌液保存于含有20%甘油的凍存管中，置于-80℃冰箱中冷凍保藏，以備后續(xù)鑒定和實(shí)驗(yàn)使用。3.1.3產(chǎn)細(xì)菌素菌株的篩選采用牛津杯法對(duì)分離得到的乳酸明串珠菌菌株進(jìn)行產(chǎn)細(xì)菌素能力的初步篩選。以常見的致病菌金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）ATCC25923和大腸桿菌（Escherichiacoli）ATCC25922作為指示菌。金黃色葡萄球菌是一種常見的革蘭氏陽性致病菌，能夠引起多種感染性疾病，如皮膚感染、肺炎、敗血癥等。大腸桿菌是革蘭氏陰性菌的代表，在食品和環(huán)境中廣泛存在，部分致病性大腸桿菌可導(dǎo)致腸道感染、泌尿系統(tǒng)感染等疾病。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的指示菌菌液以1%的接種量加入到冷卻至50℃左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，充分混勻后，取10mL倒入直徑為90mm的無菌培養(yǎng)皿中，制成含指示菌的平板。待平板凝固后，用無菌鑷子夾取滅菌后的牛津杯，輕輕放置在平板上。取培養(yǎng)24h的乳酸明串珠菌發(fā)酵上清液，加入到牛津杯中，每個(gè)牛津杯加入200μL。以未接種乳酸明串珠菌的MRS液體培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。將加樣后的平板放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24h。培養(yǎng)結(jié)束后，觀察平板上是否出現(xiàn)抑菌圈。若在牛津杯周圍出現(xiàn)明顯的抑菌圈，則表明該菌株可能產(chǎn)生了細(xì)菌素，具有抑制指示菌生長(zhǎng)的能力。測(cè)量抑菌圈的直徑，記錄數(shù)據(jù)。根據(jù)抑菌圈直徑的大小，初步篩選出產(chǎn)細(xì)菌素能力較強(qiáng)的乳酸明串珠菌菌株。為了進(jìn)一步確定篩選出的菌株所產(chǎn)抑菌物質(zhì)為細(xì)菌素，需要排除其他非特異性抑菌因素的干擾。乳酸菌在生長(zhǎng)代謝過程中，除了產(chǎn)生細(xì)菌素外，還可能產(chǎn)生有機(jī)酸、過氧化氫等具有抑菌作用的物質(zhì)。采用以下方法排除這些干擾因素：排除有機(jī)酸的干擾：取發(fā)酵上清液，用1mol/L的NaOH溶液將其pH值調(diào)至6.5-7.0，使有機(jī)酸被中和。然后采用牛津杯法，以調(diào)整pH值后的發(fā)酵上清液為樣品，再次進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。若抑菌圈消失或明顯減小，則說明抑菌作用可能是由有機(jī)酸引起的；若抑菌圈仍然存在且大小變化不明顯，則說明抑菌物質(zhì)不是有機(jī)酸。排除過氧化氫的干擾：向發(fā)酵上清液中加入過氧化氫酶，使其終濃度為5mg/mL，在37℃水浴中溫浴2h，使過氧化氫分解。之后，用處理后的發(fā)酵上清液進(jìn)行牛津杯抑菌實(shí)驗(yàn)。若抑菌圈消失或明顯減小，說明抑菌作用可能與過氧化氫有關(guān)；若抑菌圈無明顯變化，則說明抑菌物質(zhì)不是過氧化氫。確定抑菌物質(zhì)的蛋白質(zhì)本質(zhì)：將發(fā)酵上清液分別加入等體積的蛋白酶K（1mg/mL）、胰蛋白酶（1mg/mL）和胃蛋白酶（1mg/mL），在37℃恒溫孵育30min，使蛋白質(zhì)類物質(zhì)被酶解。然后進(jìn)行牛津杯抑菌實(shí)驗(yàn)，觀察抑菌圈大小的變化。若抑菌圈消失或明顯減小，說明抑菌物質(zhì)可能是蛋白質(zhì)類物質(zhì)，即細(xì)菌素；若抑菌圈無明顯變化，則說明抑菌物質(zhì)不是蛋白質(zhì)，可能是其他類型的抑菌物質(zhì)。通過以上一系列實(shí)驗(yàn)，排除了有機(jī)酸、過氧化氫等非特異性抑菌因素的干擾，最終確定了產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸明串珠菌菌株。3.2細(xì)菌素的鑒定技術(shù)3.2.1蛋白質(zhì)分析技術(shù)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）：聚丙烯酰胺凝膠電泳是一種常用的蛋白質(zhì)分離技術(shù)，依據(jù)蛋白質(zhì)的電荷、大小和形狀等差異，在電場(chǎng)作用下使蛋白質(zhì)在凝膠中遷移，從而實(shí)現(xiàn)分離。在乳酸明串珠菌細(xì)菌素鑒定中，可采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），SDS能使蛋白質(zhì)變性并帶上負(fù)電荷，消除蛋白質(zhì)自身電荷的影響，使蛋白質(zhì)遷移率主要取決于分子量大小。通過與已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白進(jìn)行比對(duì)，可初步確定細(xì)菌素的分子量。如將乳酸明串珠菌發(fā)酵液經(jīng)硫酸銨沉淀、透析等初步純化后，進(jìn)行SDS-PAGE分析，在凝膠上出現(xiàn)特定條帶，根據(jù)條帶位置可估算細(xì)菌素的分子量。此外，還可利用等電聚焦聚丙烯酰胺凝膠電泳（IEF-PAGE），根據(jù)細(xì)菌素等電點(diǎn)的不同進(jìn)行分離。細(xì)菌素在具有pH梯度的凝膠中遷移，當(dāng)?shù)竭_(dá)其等電點(diǎn)位置時(shí)，凈電荷為零，停止遷移，從而實(shí)現(xiàn)分離。這種方法可用于確定細(xì)菌素的等電點(diǎn)，為細(xì)菌素的鑒定提供重要信息。質(zhì)譜分析：質(zhì)譜分析技術(shù)是確定細(xì)菌素結(jié)構(gòu)和氨基酸序列的關(guān)鍵技術(shù)之一?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOFMS）通過將細(xì)菌素樣品與基質(zhì)混合，在激光作用下使樣品離子化，離子在電場(chǎng)中加速并飛行，根據(jù)飛行時(shí)間的不同來確定離子的質(zhì)荷比（m/z）。通過與數(shù)據(jù)庫中已知蛋白質(zhì)的質(zhì)荷比數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，可鑒定細(xì)菌素。例如，將純化后的乳酸明串珠菌細(xì)菌素進(jìn)行MALDI-TOFMS分析，獲得其精確的分子量信息，與數(shù)據(jù)庫中已報(bào)道的細(xì)菌素分子量進(jìn)行匹配，初步判斷細(xì)菌素的種類。電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）則是使樣品溶液在電場(chǎng)作用下形成帶電液滴，隨著溶劑揮發(fā)，液滴變小，離子強(qiáng)度增大，最終離子從液滴中發(fā)射出來，進(jìn)入質(zhì)量分析器進(jìn)行檢測(cè)。ESI-MS可提供細(xì)菌素的多級(jí)質(zhì)譜信息，通過對(duì)碎片離子的分析，能夠確定細(xì)菌素的氨基酸序列和修飾情況。將細(xì)菌素酶解后，利用ESI-MS/MS對(duì)酶解肽段進(jìn)行分析，通過分析肽段的碎裂模式，確定氨基酸序列，進(jìn)而推斷細(xì)菌素的一級(jí)結(jié)構(gòu)。3.2.2分子生物學(xué)技術(shù)PCR擴(kuò)增與基因測(cè)序：基于細(xì)菌素合成基因的保守序列設(shè)計(jì)特異性引物，提取乳酸明串珠菌的基因組DNA，以其為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增。通過PCR擴(kuò)增，可獲得細(xì)菌素合成相關(guān)基因片段。將擴(kuò)增得到的基因片段進(jìn)行測(cè)序，得到其核苷酸序列。將測(cè)序結(jié)果在GenBank等核酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)，與已知細(xì)菌素合成基因序列進(jìn)行同源性分析。若同源性較高，則可初步確定該菌株產(chǎn)生的細(xì)菌素與數(shù)據(jù)庫中已知細(xì)菌素具有相似的基因結(jié)構(gòu)和功能。例如，對(duì)一株乳酸明串珠菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一段與已知乳酸明串珠菌細(xì)菌素合成基因具有95%同源性的序列，從而推測(cè)該菌株產(chǎn)生的細(xì)菌素可能與已知細(xì)菌素屬于同一類。此外，還可利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)，對(duì)細(xì)菌素合成基因的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。通過檢測(cè)不同培養(yǎng)條件下細(xì)菌素合成基因的表達(dá)量變化，研究基因表達(dá)與細(xì)菌素產(chǎn)量之間的關(guān)系，為優(yōu)化細(xì)菌素發(fā)酵條件提供理論依據(jù)?；蚩寺∨c表達(dá)：將PCR擴(kuò)增得到的細(xì)菌素合成基因克隆到合適的表達(dá)載體中，如pET系列載體。構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒后，將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌等宿主細(xì)胞中。通過誘導(dǎo)宿主細(xì)胞表達(dá)，使細(xì)菌素在宿主細(xì)胞中大量合成。對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化和活性檢測(cè)，驗(yàn)證克隆基因是否能夠編碼具有活性的細(xì)菌素。例如，將乳酸明串珠菌細(xì)菌素合成基因克隆到pET-28a載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鎳柱親和層析純化，得到純化的細(xì)菌素蛋白。通過抑菌實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其活性，證實(shí)克隆基因表達(dá)的產(chǎn)物具有抑菌活性，從而確定該基因與細(xì)菌素合成相關(guān)?；蚩寺∨c表達(dá)技術(shù)不僅有助于細(xì)菌素的鑒定，還為細(xì)菌素的大量制備和功能研究提供了基礎(chǔ)。3.3案例分析：某具體菌株的篩選與鑒定過程以從內(nèi)蒙古馬奶酒中成功篩選和鑒定的乳酸明串珠菌Lact-1菌株為例，詳細(xì)闡述其篩選與鑒定過程。馬奶酒作為蒙古族等游牧民族的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品，其獨(dú)特的發(fā)酵環(huán)境蘊(yùn)含著豐富的微生物資源，是篩選產(chǎn)細(xì)菌素乳酸明串珠菌的理想樣本。在菌株分離階段，從內(nèi)蒙古當(dāng)?shù)貍鹘y(tǒng)釀造的馬奶酒中準(zhǔn)確稱取10g樣品，迅速放入裝有90mL無菌生理鹽水并帶有玻璃珠的250mL三角瓶中。將三角瓶置于搖床上，以200r/min的速度劇烈振蕩30min，使馬奶酒中的微生物充分分散在生理鹽水中。隨后，進(jìn)行系列梯度稀釋，依次制備10?1、10?2、10?3、10??、10??、10??等不同稀釋度的樣品稀釋液。取0.1mL不同稀釋度的樣品稀釋液，用無菌涂布器均勻涂布于MRS固體培養(yǎng)基平板上。每個(gè)稀釋度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。將涂布好的平板倒置放入30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束后，仔細(xì)觀察平板上菌落的形態(tài)。依據(jù)乳酸明串珠菌的菌落特征，即圓形、光滑、濕潤(rùn)、邊緣整齊，顏色為灰白色或乳白色，直徑一般在1-2mm左右，初步挑選出5個(gè)疑似乳酸明串珠菌的菌落，分別標(biāo)記為L(zhǎng)act-1、Lact-2、Lact-3、Lact-4、Lact-5。為了獲得純化的菌株，采用平板劃線法對(duì)這5個(gè)疑似菌落進(jìn)行進(jìn)一步分離。用無菌接種環(huán)挑取單個(gè)菌落，在新的MRS固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行細(xì)致的劃線操作。劃線時(shí)，嚴(yán)格按照從低濃度區(qū)域向高濃度區(qū)域劃線的順序，使菌落逐漸分散，以確保最終在平板上形成單個(gè)的、獨(dú)立的菌落。將劃線后的平板再次倒置放入30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。經(jīng)過平板劃線純化后，挑選出形態(tài)典型、生長(zhǎng)良好的單個(gè)菌落，接種到MRS液體培養(yǎng)基中，在30℃、150r/min的條件下振蕩培養(yǎng)24h，制備成菌液。將菌液保存于含有20%甘油的凍存管中，置于-80℃冰箱中冷凍保藏，以備后續(xù)鑒定和實(shí)驗(yàn)使用。在產(chǎn)細(xì)菌素菌株篩選階段，采用牛津杯法對(duì)分離得到的5株疑似乳酸明串珠菌進(jìn)行產(chǎn)細(xì)菌素能力的初步篩選。以金黃色葡萄球菌ATCC25923和大腸桿菌ATCC25922作為指示菌。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的指示菌菌液以1%的接種量加入到冷卻至50℃左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，充分混勻后，取10mL倒入直徑為90mm的無菌培養(yǎng)皿中，制成含指示菌的平板。待平板凝固后，用無菌鑷子夾取滅菌后的牛津杯，輕輕放置在平板上。取培養(yǎng)24h的5株疑似乳酸明串珠菌發(fā)酵上清液，分別加入到牛津杯中，每個(gè)牛津杯加入200μL。以未接種乳酸明串珠菌的MRS液體培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。將加樣后的平板放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，觀察平板上是否出現(xiàn)抑菌圈。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Lact-1、Lact-3和Lact-5菌株的發(fā)酵上清液周圍出現(xiàn)了明顯的抑菌圈，而Lact-2和Lact-4菌株的發(fā)酵上清液周圍無抑菌圈出現(xiàn)。測(cè)量抑菌圈的直徑，Lact-1菌株發(fā)酵上清液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為18mm，對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑為15mm；Lact-3菌株對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為14mm，對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑為12mm；Lact-5菌株對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為16mm，對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑為13mm。根據(jù)抑菌圈直徑的大小，初步判斷Lact-1菌株產(chǎn)細(xì)菌素能力較強(qiáng)。為了進(jìn)一步確定Lact-1菌株所產(chǎn)抑菌物質(zhì)為細(xì)菌素，需要排除其他非特異性抑菌因素的干擾。首先排除有機(jī)酸的干擾，取Lact-1菌株的發(fā)酵上清液，用1mol/L的NaOH溶液將其pH值調(diào)至6.5-7.0，使有機(jī)酸被中和。然后采用牛津杯法，以調(diào)整pH值后的發(fā)酵上清液為樣品，再次進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，抑菌圈仍然存在，且大小變化不明顯，說明抑菌作用不是由有機(jī)酸引起的。接著排除過氧化氫的干擾，向發(fā)酵上清液中加入過氧化氫酶，使其終濃度為5mg/mL，在37℃水浴中溫浴2h，使過氧化氫分解。之后，用處理后的發(fā)酵上清液進(jìn)行牛津杯抑菌實(shí)驗(yàn)。抑菌圈依然存在，表明抑菌作用與過氧化氫無關(guān)。最后確定抑菌物質(zhì)的蛋白質(zhì)本質(zhì)，將發(fā)酵上清液分別加入等體積的蛋白酶K（1mg/mL）、胰蛋白酶（1mg/mL）和胃蛋白酶（1mg/mL），在37℃恒溫孵育30min，使蛋白質(zhì)類物質(zhì)被酶解。然后進(jìn)行牛津杯抑菌實(shí)驗(yàn)，觀察到抑菌圈消失，說明抑菌物質(zhì)是蛋白質(zhì)類物質(zhì)，即細(xì)菌素。通過以上一系列實(shí)驗(yàn)，最終確定Lact-1菌株為產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸明串珠菌。在菌株鑒定階段，首先進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。將Lact-1菌株接種到MRS固體培養(yǎng)基上，在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，觀察菌落形態(tài)。其菌落呈圓形，表面光滑、濕潤(rùn)，邊緣整齊，顏色為灰白色，直徑約1.5mm，符合乳酸明串珠菌的菌落特征。然后進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察，菌體呈紫色，為革蘭氏陽性菌，細(xì)胞呈球形或豆?fàn)?，成?duì)或呈短鏈狀排列，與乳酸明串珠菌的形態(tài)特征一致。接著進(jìn)行生理生化鑒定，Lact-1菌株在MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，能夠利用葡萄糖進(jìn)行異型乳酸發(fā)酵，使培養(yǎng)基pH值降低；不酸化和凝固牛乳，不水解精氨酸，不水解蛋白，不還原硝酸鹽，不產(chǎn)生溶血現(xiàn)象，不產(chǎn)吲哚。這些生理生化特性與乳酸明串珠菌的特性相符。最后進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，提取Lact-1菌株的基因組DNA，以其為模板，采用細(xì)菌16SrRNA基因通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增得到的16SrRNA基因片段進(jìn)行測(cè)序，得到其核苷酸序列。將測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與乳酸明串珠菌的16SrRNA基因序列同源性高達(dá)99%。綜合形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化鑒定和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，確定Lact-1菌株為乳酸明串珠菌。四、乳酸明串珠菌產(chǎn)細(xì)菌素的特性研究4.1理化特性4.1.1分子量與結(jié)構(gòu)確定乳酸明串珠菌產(chǎn)細(xì)菌素分子量和結(jié)構(gòu)的方法豐富多樣。在分子量測(cè)定方面，凝膠過濾層析是常用手段之一。其原理基于不同分子量的分子在具有特定孔徑的凝膠柱中擴(kuò)散速度不同，小分子物質(zhì)能夠進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，路徑長(zhǎng)，洗脫時(shí)間長(zhǎng)；大分子物質(zhì)則被排阻在凝膠顆粒外，路徑短，洗脫時(shí)間短。通過使用已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)細(xì)菌素在凝膠柱中的洗脫體積，即可推算出其分子量。例如，將乳酸明串珠菌細(xì)菌素粗提物上樣到SephadexG-75凝膠柱，以磷酸鹽緩沖液洗脫，收集洗脫峰，與標(biāo)準(zhǔn)蛋白的洗脫曲線對(duì)比，可確定細(xì)菌素的分子量范圍。SDS-PAGE也是確定分子量的重要方法。SDS（十二烷基硫酸鈉）能使蛋白質(zhì)變性并帶上大量負(fù)電荷，消除蛋白質(zhì)自身電荷差異的影響，使蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率僅與分子量相關(guān)。將細(xì)菌素樣品與SDS和還原劑混合，加熱變性后進(jìn)行電泳，與標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量Marker一同電泳，根據(jù)細(xì)菌素條帶在凝膠中的位置，與標(biāo)準(zhǔn)蛋白條帶對(duì)比，可估算出其分子量。如對(duì)純化后的乳酸明串珠菌細(xì)菌素進(jìn)行SDS-PAGE分析，在凝膠上出現(xiàn)清晰條帶，通過與標(biāo)準(zhǔn)蛋白比對(duì)，確定其分子量約為5kDa。在結(jié)構(gòu)鑒定方面，核磁共振（NMR）技術(shù)發(fā)揮著關(guān)鍵作用。NMR能夠提供分子中原子的化學(xué)位移、耦合常數(shù)等信息，從而推斷分子的三維結(jié)構(gòu)。通過對(duì)細(xì)菌素進(jìn)行一維和二維NMR實(shí)驗(yàn)，如1H-NMR、13C-NMR、COSY（相關(guān)譜）、HSQC（異核單量子相干譜）等，可確定細(xì)菌素分子中不同原子的連接方式和空間位置關(guān)系。例如，通過1H-NMR譜圖中不同化學(xué)位移的信號(hào)峰，可判斷細(xì)菌素分子中不同類型氫原子的存在；COSY譜圖則能揭示相鄰氫原子之間的耦合關(guān)系，進(jìn)而確定分子的部分結(jié)構(gòu)片段。X-射線晶體學(xué)技術(shù)則通過測(cè)定細(xì)菌素晶體的X-射線衍射圖譜，利用晶體結(jié)構(gòu)解析軟件，可精確確定細(xì)菌素的三維原子坐標(biāo)，得到其晶體結(jié)構(gòu)。這需要首先培養(yǎng)出高質(zhì)量的細(xì)菌素單晶，然后將單晶置于X-射線衍射儀中進(jìn)行衍射實(shí)驗(yàn)。通過對(duì)衍射數(shù)據(jù)的收集和分析，計(jì)算電子密度圖，最終構(gòu)建出細(xì)菌素的三維結(jié)構(gòu)模型。如對(duì)某乳酸明串珠菌細(xì)菌素進(jìn)行X-射線晶體學(xué)分析，成功解析了其含有α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)的三維空間結(jié)構(gòu)，為深入理解其抑菌機(jī)制提供了重要依據(jù)。常見的乳酸明串珠菌產(chǎn)細(xì)菌素分子量通常在3-10kDa之間，屬于小分子肽類物質(zhì)。從結(jié)構(gòu)上看，許多細(xì)菌素含有α-螺旋和β-折疊等二級(jí)結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)通過氫鍵、疏水相互作用等維持穩(wěn)定。部分細(xì)菌素還含有特殊的氨基酸修飾，如羊毛硫氨酸等，這些修飾不僅影響細(xì)菌素的穩(wěn)定性，還可能與其抑菌活性密切相關(guān)。例如，某些含有羊毛硫氨酸的細(xì)菌素，其分子內(nèi)形成特殊的硫醚鍵，增強(qiáng)了分子的穩(wěn)定性，使其在復(fù)雜環(huán)境中仍能保持較高的抑菌活性。4.1.2穩(wěn)定性細(xì)菌素的穩(wěn)定性是其能否在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)揮作用的關(guān)鍵因素之一，受到多種因素的影響。在溫度穩(wěn)定性方面，乳酸明串珠菌產(chǎn)細(xì)菌素表現(xiàn)出較好的熱穩(wěn)定性。研究表明，部分細(xì)菌素在60-80℃處理30-60min后，仍能保持較高的活性。如從馬奶酒中分離得到的乳酸明串珠菌產(chǎn)細(xì)菌素，在80℃處理60min后，其抑菌活性僅下降了10%左右。這是因?yàn)榧?xì)菌素的肽鏈結(jié)構(gòu)通過分子內(nèi)的氫鍵、疏水相互作用等形成了較為穩(wěn)定的空間構(gòu)象，在一定溫度范圍內(nèi)，這些相互作用能夠抵抗熱運(yùn)動(dòng)的影響，維持細(xì)菌素的活性結(jié)構(gòu)。然而，當(dāng)溫度超過100℃時(shí)，部分細(xì)菌素的活性會(huì)顯著下降。高溫會(huì)破壞細(xì)菌素分子內(nèi)的氫鍵和疏水相互作用，導(dǎo)致肽鏈展開，空間構(gòu)象發(fā)生改變，從而使抑菌活性降低。例如，將某乳酸明串珠菌細(xì)菌素在121℃處理30min后，其抑菌活性下降了50%以上。pH值對(duì)細(xì)菌素穩(wěn)定性也有顯著影響。一般來說，乳酸明串珠菌產(chǎn)細(xì)菌素在酸性和中性條件下較為穩(wěn)定。在pH3.0-7.0的范圍內(nèi)，多數(shù)細(xì)菌素能夠保持較高的活性。在pH5.0-6.0時(shí)，細(xì)菌素的活性基本不受影響。這是因?yàn)樵谒嵝院椭行原h(huán)境中，細(xì)菌素分子的電荷分布較為穩(wěn)定，有利于維持其空間結(jié)構(gòu)和活性。當(dāng)pH值超出這個(gè)范圍，進(jìn)入堿性環(huán)境時(shí)，細(xì)菌素的活性會(huì)逐漸降低。堿性條件下，細(xì)菌素分子中的某些基團(tuán)會(huì)發(fā)生解離，改變分子的電荷分布和空間構(gòu)象，進(jìn)而影響其抑菌活性。如當(dāng)pH值達(dá)到9.0時(shí)，部分細(xì)菌素的活性下降了30%-40%?；瘜W(xué)物質(zhì)對(duì)細(xì)菌素穩(wěn)定性的影響較為復(fù)雜。常見的有機(jī)溶劑，如乙醇、丙酮等，在低濃度時(shí)對(duì)細(xì)菌素活性影響較小。當(dāng)乙醇濃度低于20%時(shí)，細(xì)菌素的活性基本保持不變。但高濃度的有機(jī)溶劑會(huì)破壞細(xì)菌素分子的疏水相互作用，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)改變，活性降低。當(dāng)乙醇濃度達(dá)到50%時(shí)，細(xì)菌素的活性下降了約50%。金屬離子對(duì)細(xì)菌素穩(wěn)定性也有不同影響。一些金屬離子，如Ca2+、Mg2+等，在一定濃度下能夠與細(xì)菌素分子結(jié)合，增強(qiáng)其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，提高抑菌活性。當(dāng)Ca2+濃度為5mmol/L時(shí)，細(xì)菌素的抑菌活性提高了20%左右。而另一些金屬離子，如Fe3+、Cu2+等，可能會(huì)與細(xì)菌素發(fā)生氧化還原反應(yīng)，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)破壞，活性降低。當(dāng)Fe3+濃度為1mmol/L時(shí)，細(xì)菌素的活性下降了30%左右。4.2生物學(xué)特性4.2.1抗菌譜乳酸明串珠菌產(chǎn)細(xì)菌素展現(xiàn)出較為廣泛的抗菌譜，對(duì)多種常見致病菌具有顯著的抑制效果。在革蘭氏陽性菌方面，對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeriamonocytogenes）、枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）等均有抑制作用。其中，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用尤為突出，研究表明，當(dāng)采用牛津杯法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，在細(xì)菌素濃度為50μg/mL的條件下，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑可達(dá)15-20mm。金黃色葡萄球菌是一種常見的食源性致病菌，可引發(fā)多種疾病，如食物中毒、皮膚感染等。乳酸明串珠菌產(chǎn)細(xì)菌素能夠有效抑制其生長(zhǎng)，這對(duì)于預(yù)防和控制由金黃色葡萄球菌引起的食品污染和疾病傳播具有重要意義。對(duì)于單核細(xì)胞增生李斯特菌，該細(xì)菌素也能表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性。在食品加工和儲(chǔ)存過程中，單核細(xì)胞增生李斯特菌是一種極具威脅的致病菌，它可以在低溫環(huán)境下生長(zhǎng)繁殖，容易污染乳制品、肉制品等食品。當(dāng)細(xì)菌素濃度為80μg/mL時(shí)，對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌的抑菌圈直徑可達(dá)12-18mm，能夠顯著抑制其在食品中的生長(zhǎng)，降低食品安全風(fēng)險(xiǎn)。在革蘭氏陰性菌方面，乳酸明串珠菌產(chǎn)細(xì)菌素對(duì)大腸桿菌（Escherichiacoli）、沙門氏菌（Salmonella）等也具有一定的抑制能力。雖然相比革蘭氏陽性菌，抑制效果相對(duì)較弱，但在實(shí)際應(yīng)用中仍具有重要價(jià)值。例如，對(duì)大腸桿菌的抑制實(shí)驗(yàn)顯示，在細(xì)菌素濃度為100μg/mL時(shí)，抑菌圈直徑可達(dá)8-12mm。大腸桿菌是食品和飲用水中常見的指示菌，部分致病性大腸桿菌可導(dǎo)致腸道感染、腹瀉等疾病。細(xì)菌素對(duì)大腸桿菌的抑制作用，有助于保障食品和飲用水的安全。對(duì)于沙門氏菌，研究表明，當(dāng)細(xì)菌素濃度為120μg/mL時(shí)，抑菌圈直徑可達(dá)6-10mm。沙門氏菌是引起食物中毒的主要病原菌之一，可通過污染食物和水源傳播。乳酸明串珠菌產(chǎn)細(xì)菌素對(duì)沙門氏菌的抑制，能夠在一定程度上減少食物中毒事件的發(fā)生，保障公眾健康。乳酸明串珠菌產(chǎn)細(xì)菌素對(duì)一些真菌，如白色念珠菌（Candidaalbicans）等也有一定的抑制效果。白色念珠菌是一種常見的條件致病性真菌，可引起皮膚、黏膜和深部組織的感染。在醫(yī)藥領(lǐng)域，細(xì)菌素對(duì)白色念珠菌的抑制作用為治療真菌感染提供了新的思路和方法。當(dāng)細(xì)菌素濃度為150μg/mL時(shí)，對(duì)白色念珠菌的抑菌圈直徑可達(dá)5-8mm，雖然抑制效果相對(duì)有限，但為進(jìn)一步研究和開發(fā)抗真菌細(xì)菌素提供了基礎(chǔ)。4.2.2作用機(jī)制從細(xì)胞層面來看，乳酸明串珠菌產(chǎn)細(xì)菌素主要通過作用于病原菌的細(xì)胞膜，破壞細(xì)胞膜的完整性，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄露，抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。當(dāng)細(xì)菌素與細(xì)胞膜接觸后，會(huì)與細(xì)胞膜上的特定受體結(jié)合，改變細(xì)胞膜的通透性。通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)細(xì)菌素處理后的金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜出現(xiàn)明顯的皺縮、凹陷，部分區(qū)域破裂，細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞質(zhì)流出。這是因?yàn)榧?xì)菌素分子中的疏水基團(tuán)與細(xì)胞膜中的磷脂雙分子層相互作用，插入到細(xì)胞膜中，形成跨膜通道，使得細(xì)胞內(nèi)的離子、小分子物質(zhì)等大量泄露，破壞了細(xì)胞的滲透壓平衡，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。從分子層面分析，細(xì)菌素還可能干擾病原菌細(xì)胞壁的合成。細(xì)胞壁是細(xì)菌維持細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的重要組成部分，其合成過程涉及多種酶和代謝途徑。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸明串珠菌產(chǎn)細(xì)菌素能夠抑制病原菌細(xì)胞壁合成相關(guān)酶的活性，如轉(zhuǎn)肽酶、轉(zhuǎn)糖基酶等。通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在細(xì)菌素作用下，金黃色葡萄球菌中參與細(xì)胞壁合成的相關(guān)蛋白表達(dá)量顯著下降，從而阻礙了細(xì)胞壁的正常合成，使細(xì)菌失去細(xì)胞壁的保護(hù)，對(duì)環(huán)境的抵抗力下降，最終導(dǎo)致細(xì)菌生長(zhǎng)受到抑制。此外，細(xì)菌素還可能作用于病原菌細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵酶和代謝途徑。細(xì)胞內(nèi)的代謝過程是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，涉及多種酶和代謝途徑的協(xié)同作用。乳酸明串珠菌產(chǎn)細(xì)菌素可以與細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵酶結(jié)合，改變酶的活性中心結(jié)構(gòu)，使其失去催化活性。研究表明，細(xì)菌素能夠抑制大腸桿菌中參與能量代謝的琥珀酸脫氫酶的活性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)能量代謝受阻，ATP合成減少，細(xì)胞無法獲得足夠的能量來維持正常的生理活動(dòng)，從而抑制了大腸桿菌的生長(zhǎng)。細(xì)菌素還可能干擾病原菌的蛋白質(zhì)合成、核酸合成等代謝途徑，從多個(gè)方面影響病原菌的正常生理功能，達(dá)到抑菌或殺菌的目的。4.3影響細(xì)菌素產(chǎn)量與活性的因素4.3.1培養(yǎng)條件培養(yǎng)基成分對(duì)乳酸明串珠菌產(chǎn)細(xì)菌素的產(chǎn)量和活性有著顯著影響。碳源作為細(xì)菌生長(zhǎng)和代謝的重要能源物質(zhì)，不同種類的碳源會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌素產(chǎn)量的差異。研究表明，乳酸明串珠菌在以葡萄糖為碳源時(shí)，細(xì)菌素產(chǎn)量較高。葡萄糖能夠被乳酸明串珠菌快速利用，為細(xì)菌的生長(zhǎng)和細(xì)菌素合成提供充足的能量和碳骨架。當(dāng)葡萄糖濃度為20g/L時(shí)，細(xì)菌素產(chǎn)量達(dá)到峰值。而當(dāng)使用乳糖、蔗糖等碳源時(shí)，細(xì)菌素產(chǎn)量相對(duì)較低。乳糖需要乳糖酶的分解才能被細(xì)菌利用，代謝途徑相對(duì)復(fù)雜，可能影響了細(xì)菌素的合成效率。氮源同樣對(duì)細(xì)菌素合成至關(guān)重要。有機(jī)氮源，如蛋白胨、酵母提取物等，能夠?yàn)榧?xì)菌提供豐富的氨基酸和氮源，有利于細(xì)菌素的合成。以蛋白胨和酵母提取物按3:1比例組成的復(fù)合氮源，可使細(xì)菌素產(chǎn)量顯著提高。這是因?yàn)閺?fù)合氮源提供了更全面的營養(yǎng)成分，滿足了細(xì)菌生長(zhǎng)和代謝的多種需求。無機(jī)氮源，如硫酸銨、硝酸銨等，單獨(dú)使用時(shí)往往不能有效促進(jìn)細(xì)菌素的合成。這是由于無機(jī)氮源的利用需要細(xì)菌進(jìn)行更多的代謝轉(zhuǎn)化，過程較為復(fù)雜，不利于細(xì)菌素合成代謝的高效進(jìn)行。微量元素在細(xì)菌的代謝過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。適量的鎂離子（Mg2+）能夠激活參與細(xì)菌素合成的關(guān)鍵酶，促進(jìn)細(xì)菌素的合成。當(dāng)培養(yǎng)基中Mg2+濃度為0.05mmol/L時(shí)，細(xì)菌素產(chǎn)量比未添加Mg2+時(shí)提高了30%。鋅離子（Zn2+）也對(duì)細(xì)菌素的合成有促進(jìn)作用，它可能參與了細(xì)菌素合成基因的調(diào)控，影響細(xì)菌素的表達(dá)水平。而鐵離子（Fe3+）在高濃度時(shí)會(huì)對(duì)細(xì)菌素合成產(chǎn)生抑制作用。這是因?yàn)镕e3+可能會(huì)與細(xì)菌素合成過程中的某些關(guān)鍵物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，干擾了細(xì)菌素的合成途徑。培養(yǎng)溫度對(duì)乳酸明串珠菌的生長(zhǎng)和細(xì)菌素合成具有重要影響。一般來說，乳酸明串珠菌的最適生長(zhǎng)溫度為25-30℃，在這個(gè)溫度范圍內(nèi)，細(xì)菌的代謝活性較高，能夠高效地進(jìn)行生長(zhǎng)和繁殖。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)溫度為28℃時(shí)，細(xì)菌素產(chǎn)量達(dá)到最高。在這個(gè)溫度下，細(xì)胞內(nèi)參與細(xì)菌素合成的酶活性較高，能夠促進(jìn)細(xì)菌素的合成。當(dāng)溫度低于25℃時(shí)，細(xì)菌的生長(zhǎng)速度明顯減緩，細(xì)菌素產(chǎn)量也隨之降低。這是因?yàn)榈蜏貢?huì)降低酶的活性，使細(xì)菌的代謝速率減慢，影響了細(xì)菌素合成所需的能量和物質(zhì)供應(yīng)。當(dāng)溫度高于30℃時(shí)，雖然細(xì)菌的生長(zhǎng)速度可能在短期內(nèi)加快，但細(xì)菌素產(chǎn)量卻會(huì)下降。高溫可能導(dǎo)致細(xì)菌素合成相關(guān)的酶失活，或者影響了細(xì)菌的代謝途徑，不利于細(xì)菌素的合成。pH值是影響乳酸明串珠菌產(chǎn)細(xì)菌素的另一個(gè)重要因素。乳酸明串珠菌生長(zhǎng)的適宜pH值范圍通常在5.5-6.5之間。在這個(gè)pH值范圍內(nèi)，細(xì)菌的細(xì)胞膜穩(wěn)定性較好，能夠正常地進(jìn)行物質(zhì)運(yùn)輸和代謝活動(dòng)。當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值為6.0時(shí)，細(xì)菌素產(chǎn)量和活性最佳。在酸性環(huán)境下，細(xì)菌能夠通過調(diào)節(jié)自身的代謝途徑，維持細(xì)胞內(nèi)的酸堿平衡。當(dāng)pH值低于5.5時(shí)，酸性過強(qiáng)會(huì)抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)和細(xì)菌素合成。這是因?yàn)樗嵝原h(huán)境會(huì)影響細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性，干擾細(xì)胞內(nèi)的代謝過程，使細(xì)菌素合成受到抑制。當(dāng)pH值高于6.5時(shí)，堿性環(huán)境同樣會(huì)對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)和細(xì)菌素合成產(chǎn)生不利影響。堿性條件可能會(huì)改變細(xì)菌素合成相關(guān)酶的活性中心結(jié)構(gòu)，使其活性降低，從而影響細(xì)菌素的合成。溶解氧對(duì)乳酸明串珠菌產(chǎn)細(xì)菌素也有一定影響。乳酸明串珠菌是兼性厭氧菌，在有氧和無氧條件下均能生長(zhǎng)。在有氧條件下，適量的溶解氧能夠促進(jìn)細(xì)菌的生長(zhǎng)，為細(xì)菌素合成提供更多的能量。當(dāng)溶解氧含量為5mg/L時(shí)，細(xì)菌生長(zhǎng)良好，細(xì)菌素產(chǎn)量也有所提高。然而，過高的溶解氧可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生過多的過氧化氫等有害物質(zhì)，對(duì)細(xì)菌自身和細(xì)菌素合成產(chǎn)生負(fù)面影響。在無氧條件下，細(xì)菌主要通過發(fā)酵作用獲取能量，雖然細(xì)菌生長(zhǎng)速度相對(duì)較慢，但部分菌株在無氧條件下仍能保持較高的細(xì)菌素合成能力。這可能是因?yàn)闊o氧條件下細(xì)菌的代謝途徑發(fā)生了改變，有利于細(xì)菌素合成相關(guān)基因的表達(dá)。4.3.2菌株自身因素菌株的遺傳特性是影響其產(chǎn)細(xì)菌素能力的關(guān)鍵內(nèi)在因素。不同的乳酸明串珠菌菌株，由于其基因序列和遺傳背景的差異，產(chǎn)細(xì)菌素的能力存在顯著不同。通過對(duì)多株乳酸明串珠菌的基因組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，高產(chǎn)細(xì)菌素的菌株通常含有完整且高效表達(dá)的細(xì)菌素合成基因簇。這些基因簇包含了編碼細(xì)菌素前體、修飾酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等的基因，它們協(xié)同作用，確保細(xì)菌素的合成、修飾和分泌過程順利進(jìn)行。某高產(chǎn)菌株的細(xì)菌素合成基因簇中，編碼修飾酶的基因發(fā)生了特定的突變，使得修飾酶的活性提高，從而促進(jìn)了細(xì)菌素前體的修飾和成熟，最終提高了細(xì)菌素的產(chǎn)量和活性。而低產(chǎn)菌株可能存在基因缺失、突變或基因表達(dá)調(diào)控異常等問題，導(dǎo)致細(xì)菌素合成受阻。如部分低產(chǎn)菌株的細(xì)菌素合成基因啟動(dòng)子區(qū)域存在甲基化修飾，抑制了基因的轉(zhuǎn)錄，使得細(xì)菌素合成量極低。菌株的生長(zhǎng)階段對(duì)產(chǎn)細(xì)菌素能力也有重要影響。在生長(zhǎng)初期的遲緩期，乳酸明串珠菌細(xì)胞主要進(jìn)行生理調(diào)整，適應(yīng)新的環(huán)境，此時(shí)細(xì)菌素合成量極少。隨著進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)菌生長(zhǎng)迅速，代謝活性增強(qiáng)，細(xì)菌素合成基因開始大量表達(dá)，細(xì)菌素產(chǎn)量逐漸增加。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期，細(xì)菌素產(chǎn)量達(dá)到峰值。這是因?yàn)樵趯?duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞內(nèi)的各種代謝活動(dòng)旺盛，充足的能量和物質(zhì)供應(yīng)為細(xì)菌素合成提供了保障。進(jìn)入穩(wěn)定期后，由于營養(yǎng)物質(zhì)逐漸消耗，代謝產(chǎn)物積累，細(xì)菌生長(zhǎng)速度減緩，細(xì)菌素合成也逐漸減少。在衰亡期，細(xì)菌開始死亡裂解，細(xì)菌素產(chǎn)量進(jìn)一步下降。研究表明，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期，即培養(yǎng)16-20h時(shí)，收獲發(fā)酵液，可獲得較高產(chǎn)量的細(xì)菌素。在這個(gè)階段，細(xì)菌的生長(zhǎng)和代謝狀態(tài)最有利于細(xì)菌素的合成，細(xì)胞內(nèi)的合成機(jī)制處于高效運(yùn)轉(zhuǎn)狀態(tài)。五、乳酸明串珠菌產(chǎn)細(xì)菌素的機(jī)制研究5.1基因?qū)用娴恼{(diào)控機(jī)制在乳酸明串珠菌中，細(xì)菌素的合成由特定的基因簇負(fù)責(zé)編碼。以從馬奶酒中分離得到的乳酸明串珠菌Lact-1菌株為例，其細(xì)菌素合成基因簇包含多個(gè)關(guān)鍵基因，如結(jié)構(gòu)基因、修飾基因、轉(zhuǎn)運(yùn)基因以及調(diào)控基因等。結(jié)構(gòu)基因直接編碼細(xì)菌素前體肽，這些前體肽通常需要經(jīng)過一系列的修飾和加工才能成為具有生物活性的細(xì)菌素。在Lact-1菌株中，結(jié)構(gòu)基因blnA編碼細(xì)菌素前體，其氨基酸序列包含一段信號(hào)肽和成熟肽。信號(hào)肽在細(xì)菌素的分泌過程中發(fā)揮重要作用，能夠引導(dǎo)前體肽穿過細(xì)胞膜，到達(dá)細(xì)胞外環(huán)境。成熟肽則是具有抑菌活性的部分，其氨基酸組成和序列決定了細(xì)菌素的抑菌特異性和活性強(qiáng)度。修飾基因在細(xì)菌素的成熟過程中起著不可或缺的作用。在乳酸明串珠菌中，修飾基因blnM編碼一種修飾酶，能夠?qū)?xì)菌素前體肽進(jìn)行特定的修飾，如甲基化、磷酸化等。這些修飾能夠改變細(xì)菌素的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，增強(qiáng)其穩(wěn)定性和抑菌活性。研究表明，當(dāng)blnM基因缺失時(shí)，細(xì)菌素前體無法被正確修飾，導(dǎo)致產(chǎn)生的細(xì)菌素活性顯著降低。這說明修飾基因?qū)τ诩?xì)菌素的成熟和活性發(fā)揮至關(guān)重要。轉(zhuǎn)運(yùn)基因負(fù)責(zé)將合成和修飾后的細(xì)菌素轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外。在Lact-1菌株中，轉(zhuǎn)運(yùn)基因blnT編碼一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能夠識(shí)別并結(jié)合細(xì)菌素，利用細(xì)胞膜兩側(cè)的能量梯度，將細(xì)菌素從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外環(huán)境中。當(dāng)blnT基因被敲除后，細(xì)菌素?zé)o法正常轉(zhuǎn)運(yùn)，在細(xì)胞內(nèi)積累，導(dǎo)致細(xì)胞外的細(xì)菌素產(chǎn)量大幅下降，抑菌活性也隨之降低。這表明轉(zhuǎn)運(yùn)基因?qū)τ诩?xì)菌素的分泌和發(fā)揮抑菌作用至關(guān)重要。調(diào)控基因在細(xì)菌素合成過程中起著調(diào)節(jié)作用，能夠根據(jù)環(huán)境信號(hào)和細(xì)胞內(nèi)的代謝狀態(tài)，調(diào)控細(xì)菌素合成基因的表達(dá)。在乳酸明串珠菌中，調(diào)控基因blnR編碼一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，它可以與細(xì)菌素合成基因簇的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)或抑制基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)環(huán)境中存在其他微生物的競(jìng)爭(zhēng)或脅迫時(shí)，blnR基因的表達(dá)會(huì)發(fā)生變化，從而調(diào)節(jié)細(xì)菌素合成基因的表達(dá)水平，使乳酸明串珠菌能夠根據(jù)環(huán)境變化產(chǎn)生適量的細(xì)菌素，以增強(qiáng)自身的競(jìng)爭(zhēng)力。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將乳酸明串珠菌與金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)時(shí)，blnR基因的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)了細(xì)菌素合成基因的表達(dá)，使細(xì)菌素產(chǎn)量增加，以抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)。細(xì)菌素合成基因簇中的各個(gè)基因之間存在著復(fù)雜的相互作用。結(jié)構(gòu)基因、修飾基因和轉(zhuǎn)運(yùn)基因在調(diào)控基因的作用下，協(xié)同表達(dá)，確保細(xì)菌素的合成、修飾和分泌過程順利進(jìn)行。調(diào)控基因通過感知環(huán)境信號(hào)和細(xì)胞內(nèi)的代謝狀態(tài)，調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基因、修飾基因和轉(zhuǎn)運(yùn)基因的表達(dá)水平，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌素合成的精細(xì)調(diào)控。當(dāng)環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)豐富時(shí)，調(diào)控基因會(huì)促進(jìn)細(xì)菌素合成基因的表達(dá)，使細(xì)菌能夠大量合成細(xì)菌素，以應(yīng)對(duì)可能出現(xiàn)的競(jìng)爭(zhēng)。當(dāng)營養(yǎng)物質(zhì)匱乏時(shí)，調(diào)控基因則會(huì)抑制細(xì)菌素合成基因的表達(dá)，減少能量消耗，保證細(xì)胞的生存。此外，修飾基因和轉(zhuǎn)運(yùn)基因的表達(dá)也會(huì)影響結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。如果修飾基因或轉(zhuǎn)運(yùn)基因的表達(dá)受到抑制，導(dǎo)致細(xì)菌素前體無法被正確修飾或轉(zhuǎn)運(yùn)，會(huì)反饋調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，減少細(xì)菌素前體的合成，以維持細(xì)胞內(nèi)的代謝平衡。5.2代謝途徑與調(diào)控乳酸明串珠菌產(chǎn)細(xì)菌素的代謝途徑是一個(gè)復(fù)雜且精細(xì)調(diào)控的過程，涉及多個(gè)關(guān)鍵步驟和酶的參與。在整個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)中，碳源首先通過糖酵解途徑進(jìn)入細(xì)胞代謝。以葡萄糖為例，葡萄糖在己糖激酶的催化下，消耗ATP磷酸化生成葡萄糖-6-磷酸，然后依次經(jīng)過磷酸己糖異構(gòu)酶、磷酸果糖激酶等多種酶的作用，逐步轉(zhuǎn)化為丙酮酸。在這個(gè)過程中，產(chǎn)生了NADH和ATP等重要的代謝產(chǎn)物，為細(xì)菌的生長(zhǎng)和代謝提供能量和還原力。在細(xì)菌素合成過程中，丙酮酸作為關(guān)鍵的中間代謝產(chǎn)物，發(fā)揮著重要作用。一部分丙酮酸會(huì)進(jìn)入乳酸發(fā)酵途徑，在乳酸脫氫酶的作用下，被還原為乳酸，這是乳酸明串珠菌進(jìn)行異型乳酸發(fā)酵的重要環(huán)節(jié)。另一部分丙酮酸則會(huì)參與到細(xì)菌素合成的前體物質(zhì)合成中。例如，丙酮酸可以通過一系列反應(yīng)轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，乙酰輔酶A是脂肪酸合成和某些氨基酸合成的重要前體。在細(xì)菌素合成過程中，需要多種氨基酸作為原料，這些氨基酸的合成與丙酮酸的代謝密切相關(guān)。通過三羧酸循環(huán)（TCA循環(huán)）的部分反應(yīng)，丙酮酸轉(zhuǎn)化生成的乙酰輔酶A與草酰乙酸縮合形成檸檬酸，檸檬酸經(jīng)過一系列酶促反應(yīng)，生成α-酮戊二酸、琥珀酰輔酶A等中間產(chǎn)物，這些中間產(chǎn)物可以進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為谷氨酸、天冬氨酸等氨基酸，為細(xì)菌素的合成提供原料。在氨基酸合成的基礎(chǔ)上，細(xì)菌素的合成通過核糖體合成途徑進(jìn)行。首先，細(xì)菌素的編碼基因轉(zhuǎn)錄生成mRNA，mRNA從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中的核糖體上。在核糖體上，tRNA攜帶特定的氨基酸，根據(jù)mRNA上的密碼子順序，將氨基酸依次連接起來，形成細(xì)菌素前體肽鏈。在這個(gè)過程中，需要多種酶和蛋白質(zhì)因子的參與，如氨酰-tRNA合成酶，它能夠?qū)被崤c對(duì)應(yīng)的tRNA連接，保證氨基酸準(zhǔn)確地參與到肽鏈合成中。延伸因子則協(xié)助核糖體在mRNA上移動(dòng)，促進(jìn)肽鏈的延伸。細(xì)菌素前體肽鏈合成后，還需要經(jīng)過一系列的修飾和加工才能成為具有生物活性的細(xì)菌素。這一過程涉及多種修飾酶的作用，如脫水酶、環(huán)化酶等。脫水酶能夠催化細(xì)菌素前體肽鏈中的絲氨酸和蘇氨酸殘基脫水，形成脫氫丙氨酸和脫氫丁氨酸等特殊的氨基酸殘基。這些特殊的氨基酸殘基可以進(jìn)一步通過硫醚鍵等方式形成特殊的結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)細(xì)菌素的穩(wěn)定性和活性。環(huán)化酶則可以催化肽鏈的環(huán)化反應(yīng)，使細(xì)菌素形成特定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)對(duì)于細(xì)菌素的抑菌活性至關(guān)重要。在細(xì)菌素的代謝途徑中，關(guān)鍵酶的活性調(diào)控起著核心作用。磷酸果糖激酶是糖酵解途徑中的關(guān)鍵調(diào)控酶，它受到多種因素的調(diào)節(jié)。ATP作為細(xì)胞內(nèi)的能量貨幣，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ATP濃度較高時(shí)，ATP會(huì)作為別構(gòu)抑制劑與磷酸果糖激酶結(jié)合，降低其活性，從而抑制糖酵解的速度，減少丙酮酸的生成。這是因?yàn)楫?dāng)細(xì)胞內(nèi)能量充足時(shí)，不需要過多地進(jìn)行糖酵解來產(chǎn)生能量，避免能量的浪費(fèi)。檸檬酸也可以對(duì)磷酸果糖激酶產(chǎn)生別構(gòu)抑制作用。當(dāng)TCA循環(huán)活躍，檸檬酸積累時(shí)，檸檬酸會(huì)反饋抑制磷酸果糖激酶的活性，調(diào)節(jié)糖酵解與TCA循環(huán)之間的平衡。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)檸檬酸含量升高時(shí)，表明TCA循環(huán)代謝產(chǎn)物充足，此時(shí)抑制磷酸果糖激酶的活性，可以減少丙酮酸進(jìn)入TCA循環(huán)，防止代謝產(chǎn)物的過度積累。乳酸脫氫酶在乳酸發(fā)酵途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其活性也受到多種因素的調(diào)控。NADH作為乳酸脫氫酶催化反應(yīng)的輔酶，其濃度對(duì)酶活性有重要影響。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)NADH濃度較高時(shí)，會(huì)促進(jìn)乳酸脫氫酶催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸的反應(yīng)，以消耗多余的NADH，維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡。這是因?yàn)樵谔墙徒膺^程中產(chǎn)生的NADH需要及時(shí)被氧化為NAD+，以保證糖酵解的持續(xù)進(jìn)行。而當(dāng)NADH濃度較低時(shí)，乳酸脫氫酶的活性會(huì)受到抑制，乳酸的生成減少。此外，細(xì)胞內(nèi)的pH值也會(huì)影響乳酸脫氫酶的活性。在酸性環(huán)境下，乳酸脫氫酶的活性會(huì)增強(qiáng)，促進(jìn)乳酸的生成，這有助于維持細(xì)胞內(nèi)的酸堿平衡。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)酸性增強(qiáng)時(shí)，乳酸脫氫酶催化產(chǎn)生更多的乳酸，進(jìn)一步降低環(huán)境pH值，抑制其他有害微生物的生長(zhǎng)。代謝產(chǎn)物在細(xì)菌素合成的調(diào)控中也發(fā)揮著重要作用。乳酸作為乳酸明串珠菌的主要代謝產(chǎn)物之一，對(duì)細(xì)菌素的合成具有反饋調(diào)節(jié)作用。當(dāng)發(fā)酵液中乳酸濃度升高時(shí)，會(huì)抑制細(xì)菌素合成相關(guān)基因的表達(dá)。這是因?yàn)槿樗岬姆e累會(huì)改變細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境，如降低pH值，影響細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而抑制細(xì)菌素合成基因的轉(zhuǎn)錄。高濃度的乳酸還可能影響細(xì)胞內(nèi)的能量代謝和物質(zhì)代謝平衡，使細(xì)胞將更多的能量和物質(zhì)用于維持自身的生存和生長(zhǎng)，而減少細(xì)菌素的合成。細(xì)菌素本身也會(huì)對(duì)其合成產(chǎn)生反饋抑制作用。當(dāng)細(xì)胞外的細(xì)菌素濃度達(dá)到一定水平時(shí)，會(huì)通過某種信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，反饋調(diào)節(jié)細(xì)菌素合成基因的表達(dá)，減少細(xì)菌素的合成。這是一種自我調(diào)節(jié)機(jī)制，避免細(xì)菌素的過度合成，造成能量和物質(zhì)的浪費(fèi)。細(xì)胞可能通過感受細(xì)菌素與細(xì)胞膜上特定受體的結(jié)合，觸發(fā)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，最終調(diào)節(jié)細(xì)菌素合成基因的啟動(dòng)子活性，抑制基因的轉(zhuǎn)錄。5.3環(huán)境因素對(duì)產(chǎn)細(xì)菌素機(jī)制的影響環(huán)境壓力對(duì)乳酸明串珠菌產(chǎn)細(xì)菌素的基因表達(dá)和代謝過程有著顯著影響。當(dāng)乳酸明串珠菌處于營養(yǎng)匱乏的環(huán)境中時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的代謝狀態(tài)會(huì)發(fā)生改變，這種改變會(huì)觸發(fā)一系列的應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而影響細(xì)菌素合成相關(guān)基因的表達(dá)。在碳源缺乏的情況下，細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)碳源饑餓響應(yīng)機(jī)制。此時(shí)，一些調(diào)控因子會(huì)被激活，它們會(huì)與細(xì)菌素合成基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，改變基因的轉(zhuǎn)錄效率。研究表明，碳源饑餓會(huì)導(dǎo)致某些轉(zhuǎn)錄激活因子的表達(dá)上調(diào)，這些激活因子能夠增強(qiáng)細(xì)菌素合成基因的轉(zhuǎn)錄，使細(xì)菌素的合成量增加。這是因?yàn)樵跔I養(yǎng)匱乏時(shí)，細(xì)菌通過產(chǎn)生細(xì)菌素抑制其他微生物的生長(zhǎng)，減少競(jìng)爭(zhēng)，從而為自身爭(zhēng)取更多的生存資源。溫度變化也是一種重要的環(huán)境壓力。當(dāng)乳酸明串珠菌面臨高溫或低溫脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能會(huì)受到影響。在高溫條件下，細(xì)菌會(huì)啟動(dòng)熱休克響應(yīng)機(jī)制。熱休克蛋白的表達(dá)會(huì)增加，這些蛋白能夠幫助維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的正確折疊和功能。同時(shí)，熱休克響應(yīng)也會(huì)影響細(xì)菌素合成基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，適度的高溫脅迫會(huì)誘導(dǎo)細(xì)菌素合成基因的表達(dá)上調(diào)，使細(xì)菌素產(chǎn)量增加。這可能是因?yàn)楦邷丨h(huán)境下，細(xì)菌需要通過產(chǎn)生細(xì)菌素增強(qiáng)自身的競(jìng)爭(zhēng)力，以應(yīng)對(duì)可能出現(xiàn)的微生物入侵。而在低溫條件下，細(xì)胞的代謝速率會(huì)減慢，細(xì)菌素合成相關(guān)的酶活性也會(huì)受到抑制。低溫會(huì)降低參與細(xì)菌素合成的關(guān)鍵酶的活性，導(dǎo)致細(xì)菌素合成過程受阻，產(chǎn)量下降。這是因?yàn)榈蜏貢?huì)影響酶分子的構(gòu)象，使其活性中心與底物的結(jié)合能力減弱，從而影響酶促反應(yīng)的進(jìn)行。營養(yǎng)物質(zhì)對(duì)乳酸明串珠菌產(chǎn)細(xì)菌素的影響同樣不容忽視。不同種類和濃度的碳源、氮源以及微量元素等營養(yǎng)物質(zhì)，都會(huì)對(duì)細(xì)菌素的合成產(chǎn)生影響。碳源作為細(xì)菌生長(zhǎng)和代謝的主要能源物質(zhì)，其種類和濃度直接關(guān)系到細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)和代謝途徑。如前所述，葡萄糖是乳酸明串珠菌較為偏好的碳源。在以葡萄糖為碳源時(shí)，細(xì)菌能夠快速利用葡萄糖進(jìn)行代謝，產(chǎn)生大量的能量和中間代謝產(chǎn)物，為細(xì)菌素的合成提供充足的物質(zhì)和能量基礎(chǔ)。當(dāng)葡萄糖濃度適宜時(shí)，細(xì)菌的生長(zhǎng)和細(xì)菌素合成處于最佳狀態(tài)。然而，當(dāng)葡萄糖濃度過高時(shí)，會(huì)產(chǎn)生葡萄糖效應(yīng)。高濃度的葡萄糖會(huì)抑制細(xì)菌對(duì)其他營養(yǎng)物質(zhì)的攝取，同時(shí)影響細(xì)菌的代謝途徑，導(dǎo)致細(xì)菌素合成受到抑制。這是因?yàn)楦邼舛绕咸烟菚?huì)使細(xì)胞內(nèi)的cAMP濃度降低，cAMP-CRP復(fù)合物的形成減少，從而影響了與細(xì)菌素合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。氮源也是影響細(xì)菌素合成的重要營養(yǎng)因素。有機(jī)氮源，如蛋白胨、酵母提取物等，富含多種氨基酸和小分子肽，能夠?yàn)榧?xì)菌提供豐富的氮源和其他營養(yǎng)成分。這些有機(jī)氮源能夠被細(xì)菌快速吸收和利用，促進(jìn)細(xì)菌的生長(zhǎng)和代謝。在含有適量有機(jī)氮源的培養(yǎng)基中，乳酸明串珠菌的生長(zhǎng)旺盛，細(xì)菌素合成相關(guān)基因的表達(dá)也較為活躍，從而促進(jìn)了細(xì)菌素的合成。而無機(jī)氮源，如硫酸銨、硝酸銨等，雖然也能為細(xì)菌提供氮源，但由于其利用過程相對(duì)復(fù)雜，需要細(xì)菌進(jìn)行更多的代謝轉(zhuǎn)化，因此單獨(dú)使用時(shí)往往不能有效促進(jìn)細(xì)菌素的合成。無機(jī)氮源的吸收和利用需要細(xì)菌消耗更多的能量和物質(zhì)，可能會(huì)影響細(xì)菌的生長(zhǎng)和代謝平衡，不利于細(xì)菌素合成相關(guān)基因的表達(dá)和代謝途徑的順暢進(jìn)行。微量元素在細(xì)菌的代謝過程中起著不可或缺的作用，對(duì)細(xì)菌素合成也有重要影響。鎂離子（Mg2+）是許多酶的激活劑，在細(xì)菌素合成過程中，參與糖酵解、TCA循環(huán)等關(guān)鍵代謝途徑的酶需要Mg2+的激活才能發(fā)揮正常功能。適量的Mg2+能夠提高這些酶的活性，促進(jìn)代謝產(chǎn)物的生成，為細(xì)菌素的合成提供充足的前體物質(zhì)，從而促進(jìn)細(xì)菌素的合成。鋅離子（Zn2+）則可能參與了細(xì)菌素合成基因的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，Zn2+能夠與某些轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合，改變其結(jié)構(gòu)和功能，從而影響細(xì)菌素合成基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)培養(yǎng)基中Zn2+濃度適宜時(shí)，能夠促進(jìn)細(xì)菌素合成基因的表達(dá)，提高細(xì)菌素的產(chǎn)量。而鐵離子（Fe3+）在高濃度時(shí)會(huì)對(duì)細(xì)菌素合成產(chǎn)生抑制作用。這可能是因?yàn)镕e3+具有較強(qiáng)的氧化性，高濃度的Fe3+會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡失調(diào)，產(chǎn)生過多的活性氧物質(zhì)（ROS）。ROS會(huì)對(duì)細(xì)胞內(nèi)的生物大分子，如DNA、蛋白質(zhì)等造成損傷，影響細(xì)菌素合成相關(guān)基因的表達(dá)和酶的活性，進(jìn)而抑制細(xì)菌素的合成。六、乳酸明串珠菌產(chǎn)細(xì)菌素的應(yīng)用研究6.1在食品工業(yè)中的應(yīng)用6.1.1食品保鮮在乳制品領(lǐng)域，酸奶是一種深受消費(fèi)者喜愛的發(fā)酵乳制品，但在儲(chǔ)存過程中容易受到微生物污染而變質(zhì)。研究表明，將乳酸明串珠菌產(chǎn)細(xì)菌素添加到酸奶中，能夠顯著延長(zhǎng)酸奶的保質(zhì)期。在一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，向酸奶中添加濃度為50μg/mL的細(xì)菌素，在4℃冷藏條件下儲(chǔ)存21天，與對(duì)照組相比，添加細(xì)菌素的酸奶中乳酸菌數(shù)量保持穩(wěn)定，而大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等有害菌數(shù)量明顯減少，酸奶的酸度、口感和風(fēng)味基本保持不變。這是因?yàn)榧?xì)菌素能夠抑制有害菌的生長(zhǎng)繁殖，維持酸奶中微生物群落的平衡，從而延長(zhǎng)酸奶的保質(zhì)期。在肉制品方面，火腿、香腸等肉制品在加工和儲(chǔ)存過程中容易受到微生物污染，導(dǎo)致腐敗變質(zhì)。將乳酸明串珠菌產(chǎn)細(xì)菌素應(yīng)用于肉制品保鮮，可有效抑制肉毒桿菌、李斯特菌等致病菌的生長(zhǎng)。有研究將細(xì)菌素以噴霧的形式均勻噴灑在火腿表面，在常溫下儲(chǔ)存15天，結(jié)果顯示，添加細(xì)菌素的火腿表面微生物數(shù)量明顯低于對(duì)照組，火腿的色澤、質(zhì)地和風(fēng)味保持良好，未出現(xiàn)明顯的腐敗跡象。細(xì)菌素通過破壞致病菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使其細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄露，從而抑制致病菌的生長(zhǎng)，保證了肉制品的安全和品質(zhì)。在果蔬制品領(lǐng)域，新鮮的果蔬在采摘后容易受到霉菌、酵母菌等微生物的侵襲，導(dǎo)致腐爛變質(zhì)。將乳酸明串珠菌產(chǎn)細(xì)菌素制成涂膜劑，涂抹在果蔬表面，可形成一層保護(hù)膜，抑制微生物的生長(zhǎng)。如將細(xì)菌素涂膜劑應(yīng)用于草莓保鮮，在常溫下儲(chǔ)存7天，與未處理的草莓相比，涂膜處理的草莓表面霉菌和酵母菌數(shù)量顯著降低，果實(shí)的硬度、色澤和維生素C含量保持較好，腐爛率明顯降低。細(xì)菌素涂膜劑不僅能夠抑制微生物的生長(zhǎng)，還能減少果蔬水分的散失，延緩果蔬的衰老，保持果蔬的新鮮度和品質(zhì)。6.1.2食品發(fā)酵在發(fā)酵乳制品中，乳酸明串珠菌產(chǎn)細(xì)菌素對(duì)發(fā)酵進(jìn)程有著重要影響。以酸奶發(fā)酵為例，在酸奶發(fā)酵過程中，適量添加細(xì)菌素可以調(diào)節(jié)發(fā)酵體系中的微生物群落結(jié)構(gòu)。細(xì)菌素能夠抑制有害雜菌的生長(zhǎng)，為乳酸菌的生長(zhǎng)提供有