1布魯氏菌超快速熒光PCR檢測技術(shù)規(guī)范GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術(shù)規(guī)范3.1超快速熒光PCRultra-fastReal），4縮略語PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReactioCt值：閾值循環(huán)數(shù)（CyclethrDNA：脫氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）F：上游引物（ForwardprimBHQ2：黑洞淬滅劑2（BlackHoleQuenchFAM：6-羧基熒光素（6-CarboxyfluoresceiMGB：MinorGrooveBinderQuencher淬滅基團Cy5：近紅外熒光染料（Near-infraredfluorescentdyPBS：磷酸鹽緩沖液（Phosphatebuffersolution）25試劑和耗材5.1.1除非另有說明，所用試劑均為分析純，試5.1.3陽性對照為布魯氏菌滅活抗原或pUC-virB10重組陽性質(zhì)粒，重組陽性質(zhì)粒制備方法按照附錄超快速熒光PCR擴增（布魯氏菌和內(nèi)參）上、下游引采樣及樣品前處理過程須戴一次性口罩、一次性PE手套、穿防護服，樣品不得交剪刀、鑷子、注射器、棉拭子、1.5mL離心管、研磨管等采樣工具經(jīng)過121℃(±2℃),高壓滅蒸去離子水漱洗，密閉包裝后置高壓滅菌鍋，121℃(±2℃),高壓滅菌20min，冷卻后，烘干，備待檢樣品可包括動物陰道拭子、全血、乳汁樣品、流產(chǎn)胎兒及流產(chǎn)物、糞便、尿液、臟、腎臟、淋巴結(jié)、關(guān)節(jié)液、骨髓、環(huán)境拭子等樣品。流產(chǎn)胎兒及流產(chǎn)物、脾臟、肝臟、腎臟、淋巴3凝管中。陰道拭子和環(huán)境拭子：采集陰道或環(huán)境拭子時，將拭子來回刮2次～3次。糞便/尿液：取適取細(xì)菌培養(yǎng)液1mL，12000r/min離心5min次間隔20s進行勻漿，瞬時離心后獲組織勻漿液，取200μL可直接用于核酸提取用量(μL）4快速啟動聚合酶（5U/μL）在各設(shè)定的超快速熒光PCR管中分別加入8.4.1上機），9結(jié)果判定9.2質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)5陽性對照FAM通道（布魯氏菌）Ct值≤30.0，Cy5通道（內(nèi)參）的“S”型擴增曲線。陰性對照FAM通道無Ct值，或無典型擴增曲線；Cy5“S”型擴增曲線。陽性對照、陰性對照和內(nèi)參通道同時成立可判定試驗有效，否則試驗無效。9.3結(jié)果判定9.3.3FAM通道36＜Ct值＜42且有典型“S”型擴增曲線，Cy5通道（內(nèi)參）的Ct值≤35.0，判為可疑?？梢蓸悠窇?yīng)重新檢測，若重新檢測FAM通道無特異性擴增曲線或無Ct值或等于42則為布魯氏6溶液配置A.10.01mol/LPBS(pH7.2)溶液的配置7GGGGTTCAAATCAGATCAACCTCAATACCGGCGGAGGTGAATCGACGAGCAACCTGGCTTCAACTGCCTTGAAGGATACGB.2pUC-virB10重組陽切后，連接至pUC57載體上，再轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，得到重組質(zhì)粒，提取重組進行PCR檢測和測序，鑒定為重組陽性質(zhì)粒（pUC57TGTCCACCTTCCAGCAGATGTGGATCAGCAAGCAGGAGTACGACGAGTCCGGCCCCTCCATCGTCCACCGCAAATGCTTCpUC57載體上，再轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，得到重組質(zhì)粒，提取重組質(zhì)粒進行PCR檢測），8工作濃度(μmol/L）FAM-CTCGTCGATTCACCTCCGCCGGCy5-AGTCCGGCCCCTCCATCGTC9D.3