魚類血液非特異性免疫指標檢測技術(shù)2012-06-04發(fā)布2012-09-15實施本標準起草單位：中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所、咸陽師范學院、武漢工業(yè)學院、西北農(nóng)林科技大學、中國人民解放軍第八一醫(yī)院、陜西本標準主要起草人：王文博、李明、凌飛、鮑本標準規(guī)定了魚類血樣的采集、血液非特異性免疫指標的檢測項目和檢本標準適用于魚體的血液非特異性免疫指標檢測，其他水產(chǎn)養(yǎng)成品下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。SC/T7014水生動物檢疫實驗技術(shù)規(guī)范SC/T7201.1魚類細菌病檢疫技術(shù)規(guī)程3.2將魚迅速撈入濃度為200mg/L的間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(MS-222)中做0.5min～1min3.3每份血樣分為兩份，一份以肝素抗凝，另一份以3000r/min轉(zhuǎn)速在4℃下離心10min,獲得血清，置4℃冰箱備用，盡早檢測，放置時間不超過一周。4檢測項目血液溶菌酶活性、血液殺菌活性、血液白細胞吞噬活性、血液白細胞壓積、血液紅細胞壓積、血對檢測中用到的試劑和器械設(shè)備按SC/T7201.1中第1部分通用技術(shù)規(guī)定準備。按分光光度計法進行，測定波長為540nm。用0.5%NaCl溶液配制濃度為0.2mg/mL的溶壁微球菌 4.5min后記錄吸光值OD?,以1min內(nèi)吸光值下降0.001為1個活性單位(U),按公式(1)計算。每毫升活性單位數(shù)(U)=[(OD?-OD?)/(4×0.001×5)]×1000………………(1)在無菌條件下，用0.5%NaCl溶液將河弧菌(Vibrofluvialis)配加入到等量菌懸液中，22℃孵育5h后，將混合液做10倍、100倍、1000倍稀釋，不同稀釋度各取10L替50μL血清加入等量菌懸液作為陽性對照。結(jié)果用殺菌百分率表示，按公式(2)計算。2 X——為殺菌百分率，單位為百分比(%);5.3血液白細胞吞噬活性檢測取抗凝血以600r/min離心10min,收集白細胞層，用RPMI1640細胞培養(yǎng)液將濃度調(diào)整至1.0×10?個/mL備用，實驗菌株為嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila),22℃下反應(yīng)30min。顯微鏡下計數(shù)100個白細胞中吞噬細菌的白細胞數(shù)及所吞噬的細菌總數(shù)，按公式(3)和公式(4)分別求出吞噬百分吞噬百分率(%)=(吞噬細菌的白細胞數(shù)/100)×100 吞噬指數(shù)=100個白細胞所吞噬的細菌總數(shù)/100 5.4血液白細胞壓積和紅細胞壓積檢測將抗凝血吸入壓積管中，置水平離心機內(nèi)，以2000r/min轉(zhuǎn)速在22℃下離心30min,小心取出壓積管，用游標卡尺量出白細胞和紅細胞壓積的厚度，分別計算其占總血全長的百分比，即為白細胞壓積值和紅細胞壓積值。按公式(5)和公式(6)計算。白細胞壓積值(%)=(白細胞壓積厚度/總血全長)×100 紅細胞壓積值(%)=(紅細胞壓積厚度/總血全長)×100 5.5血液淋巴細胞計數(shù)檢測下統(tǒng)計此型