生物制藥分離純化技術(shù)演講人：日期:目錄CATALOGUE02主要分離方法03純化核心技術(shù)04應(yīng)用案例分析05優(yōu)化與挑戰(zhàn)06發(fā)展趨勢(shì)展望01技術(shù)基礎(chǔ)概述01技術(shù)基礎(chǔ)概述PART定義與核心作用分離純化技術(shù)定義指通過(guò)物理、化學(xué)或生物方法將目標(biāo)產(chǎn)物從復(fù)雜混合物中提取并純化的過(guò)程，是生物制藥生產(chǎn)中的核心環(huán)節(jié)，直接影響藥物純度和收率。產(chǎn)業(yè)價(jià)值占生物制藥總成本的60%-80%，高效分離技術(shù)可顯著降低生產(chǎn)成本并提高產(chǎn)能，推動(dòng)生物類似藥和創(chuàng)新藥的商業(yè)化進(jìn)程。核心作用確保生物制品（如重組蛋白、疫苗、抗體等）的純度達(dá)標(biāo)（通常要求≥99%），去除宿主細(xì)胞蛋白、核酸、內(nèi)毒素等雜質(zhì)，滿足藥典和監(jiān)管機(jī)構(gòu)對(duì)安全性和有效性的嚴(yán)格要求。基本原理與流程層析分離原理典型工藝流程膜分離技術(shù)基于分子大?。z過(guò)濾）、電荷（離子交換）、疏水性（疏水作用）或親和力（親和層析）的差異實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物選擇性吸附與洗脫，需優(yōu)化緩沖液pH、電導(dǎo)率等參數(shù)。采用微濾、超濾或納濾膜實(shí)現(xiàn)分子量截留，關(guān)鍵控制參數(shù)包括跨膜壓力、切向流速和膜包再生次數(shù)，常用于病毒去除或蛋白濃縮。細(xì)胞破碎→離心澄清→初級(jí)捕獲（如ProteinA層析）→中間純化（離子交換）→精純（分子排阻）→除病毒過(guò)濾，全程需保持低溫環(huán)境防止蛋白變性。關(guān)鍵性能參數(shù)動(dòng)態(tài)載量（DBC）衡量層析介質(zhì)在特定流速下吸附目標(biāo)物的能力，通常需≥50mg/mL介質(zhì)，直接影響設(shè)備規(guī)模和運(yùn)行成本?；厥章逝c純度目標(biāo)產(chǎn)物回收率需＞90%，HCP殘留＜100ppm，DNA殘留＜10ng/劑量，需通過(guò)ELISA、SDS等方法嚴(yán)格檢測(cè)。通量與壽命深層過(guò)濾系統(tǒng)需保持＞100LMH的通量，層析介質(zhì)需耐受100次以上CIP循環(huán)，不銹鋼系統(tǒng)需符合ASMEBPE標(biāo)準(zhǔn)。02主要分離方法PART色譜技術(shù)類型利用高壓驅(qū)動(dòng)流動(dòng)相通過(guò)固定相，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜混合物中目標(biāo)成分的高分辨率分離，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、多肽等生物大分子的純化。高效液相色譜（HPLC）基于目標(biāo)分子與固定相表面帶電基團(tuán)的靜電相互作用進(jìn)行分離，特別適用于帶電荷生物分子（如核酸、抗體）的精細(xì)純化。離子交換色譜（IEC）通過(guò)生物特異性結(jié)合（如抗原-抗體、酶-底物）實(shí)現(xiàn)高選擇性分離，常用于單克隆抗體和重組蛋白的捕獲步驟。親和色譜（AC）利用蛋白質(zhì)表面疏水區(qū)域與固定相的相互作用，在高鹽條件下吸附目標(biāo)物，適用于穩(wěn)定性較差的生物分子分離。疏水作用色譜（HIC）過(guò)濾與膜分離深層過(guò)濾技術(shù)采用纖維素或硅藻土等多孔介質(zhì)，通過(guò)吸附和機(jī)械截留去除發(fā)酵液中的細(xì)胞碎片和膠體顆粒，處理量可達(dá)數(shù)千升/小時(shí)。切向流過(guò)濾（TFF）流體平行于膜表面流動(dòng)，減少膜污染，主要用于蛋白質(zhì)濃縮和緩沖液置換，典型應(yīng)用包括單抗的洗濾和透析。超濾/微濾膜分離超濾膜（1-100nm）可截留蛋白質(zhì)和病毒，微濾膜（0.1-10μm）用于細(xì)菌和細(xì)胞分離，需根據(jù)目標(biāo)分子量選擇膜截留分子量。納濾技術(shù)介于反滲透和超濾之間（1-10nm），能有效去除小分子雜質(zhì)同時(shí)保留產(chǎn)物活性，在抗生素純化中表現(xiàn)突出。離心與沉淀差速離心技術(shù)通過(guò)梯度轉(zhuǎn)速分離不同沉降系數(shù)的組分，如從細(xì)胞裂解液中分離細(xì)胞器時(shí)，需依次采用1000g（細(xì)胞核）、10000g（線粒體）等離心力。01密度梯度離心采用蔗糖或碘克沙醇建立密度梯度，利用等密度原理分離病毒顆粒或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，分辨率可達(dá)納米級(jí)別。鹽析沉淀法通過(guò)高濃度硫酸銨（40-80%飽和度）改變蛋白質(zhì)溶解度，常用于抗體初級(jí)純化，需嚴(yán)格控制pH和溫度以避免變性。等電點(diǎn)沉淀技術(shù)調(diào)節(jié)pH至目標(biāo)蛋白等電點(diǎn)使其凈電荷為零而沉淀，對(duì)兩性電解質(zhì)（如胰島素）特別有效，但需配合后續(xù)復(fù)溶步驟。02030403純化核心技術(shù)PART親和層析應(yīng)用抗體純化親和層析廣泛應(yīng)用于單克隆抗體和多克隆抗體的分離純化，通過(guò)將ProteinA/G或抗原配體固定在色譜介質(zhì)上，特異性結(jié)合抗體Fc段或抗原結(jié)合位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)高純度抗體的高效捕獲。重組蛋白純化利用His-Tag、GST-Tag等融合標(biāo)簽與鎳柱或谷胱甘肽樹脂的特異性結(jié)合，可從復(fù)雜細(xì)胞裂解液中一步純化目標(biāo)重組蛋白，純化效率可達(dá)90%以上。核酸分離通過(guò)Oligo(dT)纖維素柱與mRNA的poly(A)尾互補(bǔ)結(jié)合，可從總RNA中分離高純度mRNA，廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究。病毒顆粒捕獲肝素親和層析可選擇性結(jié)合包膜病毒的表面糖蛋白，用于疫苗生產(chǎn)中病毒樣顆粒（VLPs）的規(guī)模化純化。離子交換純化強(qiáng)陰離子交換樹脂（如QSepharose）通過(guò)結(jié)合DNA磷酸骨架，可在高鹽條件下選擇性洗脫超螺旋質(zhì)粒，去除開(kāi)環(huán)DNA和RNA。質(zhì)粒DNA純化

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混合床離子交換系統(tǒng)可同時(shí)去除水中的陽(yáng)離子（Na+,Ca2+）和陰離子（Cl-,SO42-），產(chǎn)水電阻率可達(dá)18.2MΩ·cm。水處理脫鹽根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)差異，在pH梯度洗脫條件下，陽(yáng)離子交換柱可分離pI>7的堿性蛋白，陰離子交換柱則適用于pI<7的酸性蛋白。蛋白質(zhì)電荷分離通過(guò)pH梯度或鹽梯度洗脫，可分離單抗的酸性/堿性電荷變體，用于生物類似藥的質(zhì)量控制。單抗電荷變體分析凝膠滲透色譜高分子量測(cè)定采用聚苯乙烯凝膠柱（如TSK-GEL）與多角度光散射檢測(cè)器聯(lián)用，可精確測(cè)定蛋白質(zhì)、多糖等生物大分子的絕對(duì)分子量及分布系數(shù)（PDI）。蛋白聚集體分析通過(guò)Superdex系列色譜柱可分離單體和二聚體以上的蛋白聚集體，分辨率可達(dá)5%含量差異，是生物制品穩(wěn)定性研究的關(guān)鍵技術(shù)。脫鹽與緩沖液置換SephadexG-25柱能快速分離分子量>5000Da的蛋白質(zhì)與小分子雜質(zhì)，處理量可達(dá)柱體積的30%，常用于抗體偶聯(lián)反應(yīng)前的緩沖液置換。多糖分級(jí)純化Bio-GelP系列樹脂可根據(jù)葡聚糖鏈長(zhǎng)度差異分離不同聚合度的寡糖，用于肝素、透明質(zhì)酸等糖類藥物的質(zhì)量控制。04應(yīng)用案例分析PART單克隆抗體生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)與收獲采用大規(guī)模哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)（如CHO細(xì)胞），通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件（如pH、溶氧、溫度）實(shí)現(xiàn)高密度細(xì)胞生長(zhǎng)，隨后通過(guò)離心或深層過(guò)濾技術(shù)收獲含有目標(biāo)抗體的培養(yǎng)上清液。初級(jí)純化（ProteinA親和層析）利用ProteinA樹脂特異性結(jié)合抗體Fc段的特性，實(shí)現(xiàn)高效捕獲和初步純化，洗脫階段需精確控制pH和緩沖液組成以維持抗體穩(wěn)定性，此步驟可去除90%以上的宿主細(xì)胞蛋白和DNA。精細(xì)純化（離子交換與疏水層析）通過(guò)陽(yáng)離子交換層析（CEX）或陰離子交換層析（AEX）進(jìn)一步去除殘留雜質(zhì)（如宿主蛋白、聚集體），疏水相互作用層析（HIC）可有效分離抗體片段和降解產(chǎn)物，確保終產(chǎn)品純度達(dá)99%以上。病毒清除與超濾濃縮采用納濾或低pH孵育法滅活潛在病毒，最后通過(guò)切向流過(guò)濾（TFF）進(jìn)行緩沖液置換和濃縮，使抗體達(dá)到制劑要求的濃度和穩(wěn)定性。疫苗開(kāi)發(fā)流程通過(guò)重組DNA技術(shù)或病毒培養(yǎng)系統(tǒng)（如Vero細(xì)胞、雞胚）生產(chǎn)目標(biāo)抗原，采用化學(xué)滅活（如甲醛）或物理滅活（如紫外線）確保病原體失去感染性但保留免疫原性?？乖苽渑c滅活多步層析組合（如尺寸排阻層析、離子交換層析）去除培養(yǎng)基成分、宿主蛋白和核酸，超速離心技術(shù)（如蔗糖密度梯度離心）適用于病毒樣顆粒（VLPs）的分離。層析純化技術(shù)選擇鋁鹽、脂質(zhì)體或TLR激動(dòng)劑等佐劑以增強(qiáng)免疫應(yīng)答，通過(guò)穩(wěn)定性研究?jī)?yōu)化疫苗配方（如凍干保護(hù)劑、pH緩沖體系），確保長(zhǎng)期儲(chǔ)存下的效價(jià)維持。佐劑與制劑開(kāi)發(fā)嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)菌試驗(yàn)、效力試驗(yàn)（如ELISA中和抗體檢測(cè)）和安全性評(píng)價(jià)（如異常毒性試驗(yàn)），符合藥典對(duì)疫苗純度、效力和安全性的標(biāo)準(zhǔn)。質(zhì)量控制與放行檢測(cè)基因治療制品載體生產(chǎn)與收獲利用HEK293或昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒系統(tǒng)生產(chǎn)腺相關(guān)病毒（AAV）或慢病毒載體，采用超聲破碎或化學(xué)裂解法釋放細(xì)胞內(nèi)病毒顆粒，再通過(guò)切向流過(guò)濾初步澄清。01密度梯度離心純化氯化銫或碘克沙醇密度梯度超速離心分離完整病毒顆粒，去除空殼載體和細(xì)胞碎片，此步驟對(duì)維持載體感染效率至關(guān)重要。親和層析與精純化針對(duì)AAV衣殼蛋白設(shè)計(jì)親和填料（如AVBSepharose）實(shí)現(xiàn)特異性捕獲，配合陰離子交換層析（如CaptoQ）去除殘留DNA和宿主蛋白，確保載體基因組完整性和低免疫原性。制劑與灌裝工藝添加非離子型表面活性劑（如PluronicF68）防止載體聚集，采用終端除菌過(guò)濾和灌裝于預(yù)充式注射器，需嚴(yán)格控制凍融過(guò)程以避免載體活性損失。02030405優(yōu)化與挑戰(zhàn)PART雜質(zhì)控制策略采用離子交換、疏水相互作用和親和層析等多級(jí)層析技術(shù)，可高效去除宿主細(xì)胞蛋白、核酸和內(nèi)毒素等雜質(zhì)，確保終產(chǎn)品純度符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。多級(jí)層析技術(shù)應(yīng)用膜過(guò)濾優(yōu)化工藝參數(shù)動(dòng)態(tài)監(jiān)控通過(guò)切向流過(guò)濾（TFF）和納米過(guò)濾等膜分離技術(shù)，有效截留病毒顆粒和高分子量雜質(zhì)，同時(shí)減少目標(biāo)蛋白的損失，提高產(chǎn)物回收率。實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)pH、電導(dǎo)率、溫度等關(guān)鍵參數(shù)，結(jié)合在線分析技術(shù)（如HPLC），快速調(diào)整純化條件以應(yīng)對(duì)雜質(zhì)波動(dòng)，保證批次間一致性。效率提升技巧連續(xù)流層析技術(shù)與傳統(tǒng)批次處理相比，連續(xù)流層析可縮短純化時(shí)間，提高樹脂利用率，并減少緩沖液消耗，適用于大規(guī)模生產(chǎn)中的快速純化需求。高載量填料選擇使用新型高載量層析填料（如多模態(tài)樹脂），能在單位體積內(nèi)吸附更多目標(biāo)分子，減少層析柱體積和操作步驟，顯著提升純化效率。自動(dòng)化與智能化整合引入自動(dòng)化工作站和AI驅(qū)動(dòng)的工藝控制，實(shí)現(xiàn)從樣本加載到洗脫的全流程精準(zhǔn)操作，降低人為誤差并提高重復(fù)性。成本降低方法緩沖液回收與再利用通過(guò)超濾或電滲析技術(shù)回收層析緩沖液中的有效成分，減少化學(xué)試劑的采購(gòu)和處理成本，同時(shí)降低環(huán)保壓力。替代性親和配體開(kāi)發(fā)針對(duì)單克隆抗體等產(chǎn)品，開(kāi)發(fā)低成本仿生配體（如肽類配基）替代傳統(tǒng)ProteinA填料，大幅降低層析介質(zhì)采購(gòu)費(fèi)用。模塊化工藝設(shè)計(jì)采用模塊化純化平臺(tái)（如一次性層析柱），避免設(shè)備清洗和驗(yàn)證成本，靈活適應(yīng)多產(chǎn)品線需求，降低固定資產(chǎn)投入。06發(fā)展趨勢(shì)展望PART新興技術(shù)創(chuàng)新連續(xù)流層析技術(shù)通過(guò)優(yōu)化層析柱設(shè)計(jì)和操作流程，實(shí)現(xiàn)高效、連續(xù)的生物分子分離，顯著提高生產(chǎn)效率和產(chǎn)物純度，同時(shí)降低緩沖液消耗和廢液排放。膜色譜技術(shù)結(jié)合膜過(guò)濾和色譜分離原理，利用功能化膜材料選擇性吸附目標(biāo)分子，適用于大規(guī)模生物制藥生產(chǎn)，具有高流速、低壓力降和易放大的優(yōu)勢(shì)。親和標(biāo)簽與智能配體開(kāi)發(fā)新型生物特異性配體（如納米抗體、多肽標(biāo)簽），通過(guò)定向偶聯(lián)技術(shù)提升目標(biāo)蛋白的捕獲效率，并實(shí)現(xiàn)溫和條件下的洗脫，減少產(chǎn)物損傷。自動(dòng)化與智能化集成傳感器和人工智能算法，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)層析過(guò)程中的電導(dǎo)率、pH、紫外吸收等參數(shù)，動(dòng)態(tài)調(diào)整流速和洗脫條件以優(yōu)化分離效果。在線監(jiān)測(cè)與反饋控制數(shù)字孿生技術(shù)機(jī)器人輔助平臺(tái)構(gòu)建分離純化過(guò)程的虛擬模型，通過(guò)模擬不同操作參數(shù)對(duì)產(chǎn)物收率的影響，快速篩選最優(yōu)方案，縮短工藝開(kāi)發(fā)周期并降低試錯(cuò)成本。采用自動(dòng)化液體處理系統(tǒng)和機(jī)械臂完成樣品加載、緩沖液切換