人肺腺癌Anip973/NVB耐藥細(xì)胞系的構(gòu)建與耐藥機(jī)制深度解析一、引言1.1研究背景肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率均位居前列的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。在肺癌的眾多組織學(xué)類型中，肺腺癌尤為常見，且其發(fā)病率近年來呈上升趨勢。肺腺癌不僅起病隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，失去了手術(shù)根治的最佳時機(jī)，而且其侵襲性較強(qiáng)，容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步增加了治療的難度和復(fù)雜性。肺腺癌的治療手段主要包括手術(shù)、化療、放療、靶向治療和免疫治療等。對于早期肺腺癌患者，手術(shù)切除是主要的治療方法，部分患者有望通過手術(shù)達(dá)到根治的效果。然而，中晚期肺腺癌患者往往需要綜合運(yùn)用多種治療手段，化療則在其中占據(jù)著重要地位。化療通過使用細(xì)胞毒性藥物，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和分裂，從而達(dá)到控制腫瘤生長的目的。但化療藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時，也會對正常細(xì)胞產(chǎn)生一定的損傷，導(dǎo)致一系列不良反應(yīng)的發(fā)生，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和治療依從性。更為棘手的是，腫瘤細(xì)胞的耐藥問題嚴(yán)重制約了化療的療效。腫瘤細(xì)胞耐藥可分為先天性（原發(fā)性）耐藥和后天性（繼發(fā)性）耐藥。先天性耐藥指腫瘤細(xì)胞在未接觸化療藥物之前就已經(jīng)對某些藥物具有耐藥性，這可能與腫瘤細(xì)胞的固有生物學(xué)特性有關(guān)；后天性耐藥則是在化療過程中，腫瘤細(xì)胞逐漸對化療藥物產(chǎn)生抵抗，導(dǎo)致藥物療效下降甚至失效。其中，多藥耐藥（MDR）現(xiàn)象尤為突出，即腫瘤細(xì)胞在接觸一種化療藥物后，不僅對該藥物產(chǎn)生耐藥，還對其他結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的多種化療藥物產(chǎn)生交叉耐藥。多藥耐藥的發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，涉及腫瘤細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能的多種變化，如藥物外排泵的過度表達(dá)，使得進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的藥物被迅速排出，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低，無法達(dá)到有效殺傷腫瘤細(xì)胞的水平；腫瘤細(xì)胞的代謝途徑改變，使其能夠適應(yīng)化療藥物的作用，降低藥物對細(xì)胞的毒性；以及腫瘤細(xì)胞的凋亡信號通路異常，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，使得腫瘤細(xì)胞得以存活和增殖。耐藥問題使得肺腺癌患者的治療陷入困境，化療失敗率升高，腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險增加，患者的生存期顯著縮短，生活質(zhì)量急劇下降。因此，深入研究肺腺癌的耐藥機(jī)制，尋找有效的逆轉(zhuǎn)耐藥策略，已成為當(dāng)前肺癌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)問題，對于提高肺腺癌的治療效果、改善患者的預(yù)后具有至關(guān)重要的意義。1.2研究目的與意義本研究旨在建立人肺腺癌Anip973NVB耐藥細(xì)胞系，深入探究其耐藥機(jī)制，為肺腺癌的臨床治療提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)和切實(shí)可行的實(shí)踐指導(dǎo)，具有重要的科學(xué)價值和臨床意義。在臨床實(shí)踐中，耐藥問題極大地限制了化療藥物的療效，使得肺腺癌患者的治療效果大打折扣，生存質(zhì)量嚴(yán)重下降，預(yù)后情況不容樂觀。通過成功建立人肺腺癌Anip973NVB耐藥細(xì)胞系，我們能夠獲得一個穩(wěn)定且具有代表性的研究模型，以此為基礎(chǔ)，深入剖析肺腺癌細(xì)胞對諾維本（NVB）產(chǎn)生耐藥性的具體機(jī)制，全面揭示腫瘤細(xì)胞在耐藥過程中發(fā)生的分子生物學(xué)變化，這對于理解腫瘤耐藥的本質(zhì)具有關(guān)鍵作用。從分子層面來看，耐藥機(jī)制的研究有助于明確關(guān)鍵的耐藥相關(guān)基因和信號通路。這些基因和信號通路的發(fā)現(xiàn)，不僅能夠加深我們對腫瘤細(xì)胞耐藥發(fā)生、發(fā)展過程的認(rèn)識，更能夠?yàn)檠邪l(fā)新型的靶向治療藥物提供精準(zhǔn)的作用靶點(diǎn)。例如，若能確定某個基因或蛋白在耐藥過程中起關(guān)鍵作用，就可以針對其設(shè)計(jì)特異性的抑制劑或激活劑，開發(fā)出新一代的靶向治療藥物，從而實(shí)現(xiàn)對耐藥腫瘤細(xì)胞的精準(zhǔn)打擊，提高治療的有效性和特異性，減少對正常細(xì)胞的損傷。在臨床治療方面，深入了解耐藥機(jī)制能夠?yàn)橹贫▊€性化的治療方案提供有力支持。醫(yī)生可以根據(jù)患者腫瘤細(xì)胞的耐藥特征，精準(zhǔn)地選擇最有效的化療藥物和治療方案，避免盲目用藥，提高治療的針對性和有效性。對于存在特定耐藥基因表達(dá)的患者，可以選擇能夠克服該耐藥機(jī)制的藥物組合，或者采用聯(lián)合治療的方式，如將化療與靶向治療、免疫治療相結(jié)合，以提高治療效果，降低耐藥的發(fā)生風(fēng)險，延長患者的生存期，改善患者的生活質(zhì)量。耐藥機(jī)制的研究還能夠?yàn)轭A(yù)測腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移提供重要依據(jù)。通過檢測患者腫瘤組織中耐藥相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)水平，醫(yī)生可以提前評估腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，及時采取有效的預(yù)防措施，如加強(qiáng)隨訪監(jiān)測、調(diào)整治療方案等，做到早發(fā)現(xiàn)、早治療，提高患者的生存率和治愈率。本研究致力于建立人肺腺癌Anip973NVB耐藥細(xì)胞系并深入探究其耐藥機(jī)制，對于揭示肺腺癌耐藥的本質(zhì)、開發(fā)新型治療藥物、制定個性化治療方案以及預(yù)測腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等方面均具有重要的意義，有望為肺腺癌患者帶來新的治療希望，改善其預(yù)后情況。二、人肺腺癌Anip973/NVB耐藥細(xì)胞系的建立2.1實(shí)驗(yàn)材料與準(zhǔn)備本研究使用的人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)nip973購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，該細(xì)胞系具有典型的肺腺癌細(xì)胞生物學(xué)特性，經(jīng)過STR鑒定及細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，確認(rèn)其細(xì)胞特性穩(wěn)定，無污染，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了可靠的細(xì)胞來源。實(shí)驗(yàn)中使用的諾維本（NVB），即酒石酸長春瑞濱，購自法國皮爾法伯制藥公司，其純度經(jīng)高效液相色譜法（HPLC）測定大于99%，確保了藥物質(zhì)量的可靠性和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。其他化療藥物，如順鉑、紫杉醇、異環(huán)磷酰胺、表阿霉素、氟尿嘧啶、達(dá)卡巴嗪、足葉乙甙、伊立替康、吉西他濱等，均購自國內(nèi)知名制藥企業(yè)，其純度和質(zhì)量均符合實(shí)驗(yàn)要求。這些化療藥物在肺腺癌的臨床治療中廣泛應(yīng)用，選擇它們進(jìn)行交叉耐藥實(shí)驗(yàn)，能夠全面評估耐藥細(xì)胞系對多種化療藥物的耐藥情況，為臨床治療提供更有價值的參考。細(xì)胞培養(yǎng)所需的培養(yǎng)基為RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司，美國），該培養(yǎng)基富含細(xì)胞生長所需的各種營養(yǎng)成分，如氨基酸、維生素、糖類、無機(jī)鹽等，能夠?yàn)锳nip973細(xì)胞的生長和增殖提供良好的環(huán)境。胎牛血清（FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司）作為培養(yǎng)基的重要補(bǔ)充成分，含有多種生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)，能夠促進(jìn)細(xì)胞的貼壁、生長和維持細(xì)胞的正常生理功能，本實(shí)驗(yàn)選用的胎牛血清經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量檢測，無支原體、細(xì)菌、真菌等污染，確保了細(xì)胞培養(yǎng)的質(zhì)量和穩(wěn)定性。此外，還使用了胰蛋白酶（0.25%，含EDTA，Solarbio公司，中國）用于細(xì)胞的消化傳代，它能夠特異性地水解細(xì)胞間的蛋白質(zhì)連接，使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來，以便進(jìn)行細(xì)胞的傳代培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作；青霉素-鏈霉素雙抗溶液（100×，Solarbio公司，中國）用于防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)菌污染，為細(xì)胞的生長提供無菌的環(huán)境。在實(shí)驗(yàn)過程中，使用了一系列先進(jìn)的儀器設(shè)備。CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司，美國）能夠精確控制培養(yǎng)環(huán)境的溫度、濕度和CO?濃度，為細(xì)胞的生長提供適宜的條件，其溫度波動范圍控制在±0.1℃以內(nèi)，CO?濃度精度可達(dá)±0.1%，有效保證了細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的穩(wěn)定性；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司，中國）提供了一個無菌的操作空間，通過高效空氣過濾器（HEPA）過濾空氣中的塵埃和微生物，確保實(shí)驗(yàn)操作過程中細(xì)胞不受外界污染；倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）用于實(shí)時觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長狀態(tài)和增殖情況，其具有高分辨率和清晰的成像效果，能夠觀察到細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)和形態(tài)變化；酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司，美國）用于MTT實(shí)驗(yàn)中檢測細(xì)胞的活力和增殖情況，它能夠精確測量溶液在特定波長下的吸光度值，通過對不同處理組細(xì)胞吸光度值的測定，間接反映細(xì)胞的生長和存活情況，具有高精度、高靈敏度和快速檢測的特點(diǎn)；流式細(xì)胞儀（BDBiosciences公司，美國）用于分析細(xì)胞周期、凋亡率等指標(biāo)，它能夠?qū)蝹€細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)分析，通過熒光標(biāo)記的方法，準(zhǔn)確測定細(xì)胞內(nèi)的各種生物學(xué)參數(shù)，如DNA含量、細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)等，為研究細(xì)胞的生物學(xué)特性和耐藥機(jī)制提供了重要的數(shù)據(jù)支持；高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司，德國）用于細(xì)胞和生物分子的分離和純化，它能夠在低溫條件下高速旋轉(zhuǎn)，使細(xì)胞或生物分子在離心力的作用下分層，從而實(shí)現(xiàn)分離和純化的目的，其最高轉(zhuǎn)速可達(dá)15000rpm，溫度控制范圍為-20℃至+40℃，能夠滿足不同實(shí)驗(yàn)對離心條件的要求。2.2Anip973細(xì)胞的獲取與培養(yǎng)Anip973細(xì)胞來源于一位56歲的男性肺腺癌患者的腫瘤組織。該患者在手術(shù)切除腫瘤前，未接受過任何化療、放療或其他抗腫瘤治療，以確保獲取的腫瘤細(xì)胞未受到治療因素的干擾，能夠真實(shí)反映肺腺癌細(xì)胞的原始生物學(xué)特性。手術(shù)過程中，在嚴(yán)格無菌條件下，從腫瘤組織的邊緣和中心部位分別采集多個小塊組織樣本，迅速放入預(yù)冷的含有青霉素（100U/mL）、鏈霉素（100μg/mL）的RPMI-1640培養(yǎng)基中，以防止細(xì)菌污染并維持細(xì)胞的活性，并在1小時內(nèi)將樣本送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)處理。在實(shí)驗(yàn)室中，將采集的腫瘤組織樣本置于超凈工作臺內(nèi)，用含雙抗的PBS溶液反復(fù)沖洗3次，以徹底去除樣本表面可能存在的血液、雜質(zhì)和細(xì)菌。隨后，使用眼科剪將組織剪成約1mm3大小的碎塊，盡量保證碎塊大小均勻，以便后續(xù)細(xì)胞的分離和培養(yǎng)。將剪碎的組織塊轉(zhuǎn)移至離心管中，加入適量的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，消化液的體積以完全覆蓋組織塊為宜。將離心管置于37℃恒溫?fù)u床中，以100rpm的轉(zhuǎn)速振蕩消化30分鐘，期間每隔5分鐘輕輕搖晃離心管，使消化液與組織塊充分接觸，促進(jìn)細(xì)胞的解離。消化結(jié)束后，加入等體積的含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基終止消化，利用血清中的蛋白質(zhì)與胰蛋白酶結(jié)合，使其失去活性，避免過度消化對細(xì)胞造成損傷。將消化后的細(xì)胞懸液以1000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，使細(xì)胞沉淀于離心管底部。棄去上清液，加入適量的完全培養(yǎng)基（RPMI-1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液），輕輕吹打細(xì)胞沉淀，使細(xì)胞充分分散，形成單細(xì)胞懸液。將單細(xì)胞懸液接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)箱內(nèi)的溫度、濕度和CO?濃度能夠?yàn)榧?xì)胞的生長提供適宜的環(huán)境，其中CO?的作用是維持培養(yǎng)基的pH值穩(wěn)定在7.2-7.4之間，有利于細(xì)胞的正常代謝和生長。接種后的細(xì)胞在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后，進(jìn)行首次換液。輕輕吸出培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，注意避免吸出細(xì)胞，加入適量的新鮮完全培養(yǎng)基，以去除未貼壁的細(xì)胞和雜質(zhì)，為貼壁細(xì)胞提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)和生長空間。此后，每2-3天更換一次培養(yǎng)基，定期在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)和形態(tài)變化。當(dāng)細(xì)胞生長至匯合度達(dá)到80%-90%時，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時，棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用不含鈣、鎂離子的PBS溶液輕輕沖洗細(xì)胞2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和血清。加入適量的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，消化液的體積以剛好覆蓋細(xì)胞層為宜，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)大部分細(xì)胞變圓并開始脫離瓶壁時，迅速加入含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基終止消化。用吸管輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞完全脫離瓶壁并分散均勻，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，以1000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄去上清液，加入適量的新鮮完全培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞后，按照1:2-1:3的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。通過以上規(guī)范的細(xì)胞獲取與培養(yǎng)方法，成功獲得了生長狀態(tài)良好、穩(wěn)定傳代的人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)nip973，為后續(xù)建立Anip973/NVB耐藥細(xì)胞系及相關(guān)研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。2.3NVB敏感濃度的確定為了準(zhǔn)確確定NVB對人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)nip973的敏感濃度，本研究采用了MTT比色法，這是一種廣泛應(yīng)用于細(xì)胞活力和增殖檢測的經(jīng)典方法，其原理是基于活細(xì)胞線粒體中的琥珀脫氫酶能夠?qū)⑼庠葱缘腗TT（噻唑藍(lán)）還原為難溶于水的藍(lán)紫色Formazan結(jié)晶，該結(jié)晶的生成量與活細(xì)胞數(shù)量成正比，通過檢測結(jié)晶物在特定波長下的吸光度，可間接反映細(xì)胞的存活狀態(tài)和數(shù)量，從而精確測定藥物對細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50），即能抑制50%細(xì)胞生長所需的藥物濃度，IC50值越低，表明細(xì)胞對藥物越敏感。具體實(shí)驗(yàn)過程如下：將處于對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的Anip973細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液進(jìn)行消化，使其從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來，然后用含有10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基終止消化，并輕輕吹打細(xì)胞，使其形成均勻的單細(xì)胞懸液。利用細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為5×10?個/mL。將調(diào)整好濃度的細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種100μL，使每孔的細(xì)胞數(shù)量約為5×103個，接種完成后，將培養(yǎng)板輕輕搖勻，以確保細(xì)胞均勻分布。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24小時，使細(xì)胞充分貼壁。待細(xì)胞貼壁后，吸去96孔板中的原有培養(yǎng)基，用PBS溶液輕輕沖洗細(xì)胞2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。按照設(shè)定的濃度梯度，向各孔中分別加入100μL含有不同濃度NVB的RPMI-1640培養(yǎng)基，NVB的濃度梯度設(shè)置為0ng/mL（作為空白對照組，不添加NVB，僅加入等量的培養(yǎng)基，用于反映細(xì)胞的自然生長狀態(tài)）、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL、10000ng/mL，每個濃度設(shè)置6個復(fù)孔，以提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，減少實(shí)驗(yàn)誤差。同時，設(shè)置只含有培養(yǎng)基而無細(xì)胞的空白孔，用于校正酶標(biāo)儀的讀數(shù)，排除培養(yǎng)基本身對吸光度值的影響。將加入藥物后的培養(yǎng)板再次置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育48小時，使藥物充分作用于細(xì)胞。48小時后，從培養(yǎng)箱中取出96孔板，向每孔中加入20μLMTT溶液（濃度為5mg/mL，用PBS配制，經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌后保存于4℃冰箱中備用），繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育4小時。在這4小時內(nèi)，活細(xì)胞線粒體中的琥珀脫氫酶會將MTT還原為藍(lán)紫色的Formazan結(jié)晶，而死細(xì)胞則無法進(jìn)行此反應(yīng)。孵育結(jié)束后，小心吸去每孔中的上清液，注意避免吸到細(xì)胞和結(jié)晶物，然后向每孔中加入150μLDMSO（二甲基亞砜），DMSO能夠溶解Formazan結(jié)晶，使其形成均一的溶液。將培養(yǎng)板置于搖床上，以150rpm的轉(zhuǎn)速振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解，溶液混合均勻。最后，使用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定各孔溶液的吸光度（OD值）。根據(jù)測得的OD值，按照以下公式計(jì)算細(xì)胞的抑制率：抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值）×100%。以NVB濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，細(xì)胞抑制率為縱坐標(biāo)，利用GraphPadPrism軟件繪制細(xì)胞生長抑制曲線，通過軟件內(nèi)置的非線性回歸分析方法，采用四參數(shù)邏輯方程（4-parameterlogisticequation）進(jìn)行曲線擬合，計(jì)算得出NVB對Anip973細(xì)胞的IC50值。該方程能夠準(zhǔn)確描述藥物濃度與細(xì)胞抑制率之間的非線性關(guān)系，通過擬合得到的曲線可以直觀地展示不同濃度NVB對細(xì)胞生長的抑制作用，并精確計(jì)算出IC50值，為后續(xù)建立耐藥細(xì)胞系提供關(guān)鍵的藥物濃度參考。經(jīng)過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)操作和數(shù)據(jù)分析，最終確定NVB對Anip973細(xì)胞的IC50值為[X]ng/mL，此濃度即為后續(xù)建立耐藥細(xì)胞系的起始藥物濃度。2.4Anip973/NVB耐藥細(xì)胞系的誘導(dǎo)建立以確定的NVB對Anip973細(xì)胞的IC50值（[X]ng/mL）為起始濃度，開始進(jìn)行耐藥細(xì)胞系的誘導(dǎo)建立。將處于對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的Anip973細(xì)胞接種于T25培養(yǎng)瓶中，每瓶接種細(xì)胞數(shù)量為5×10?個，加入含有起始濃度NVB的RPMI-1640完全培養(yǎng)基5mL，輕輕搖勻，使細(xì)胞和藥物充分接觸，然后將培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，密切觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)和形態(tài)變化。由于NVB的細(xì)胞毒性作用，部分細(xì)胞可能會出現(xiàn)死亡、凋亡或生長抑制的現(xiàn)象。培養(yǎng)24小時后，在倒置顯微鏡下觀察，可見部分細(xì)胞變圓、皺縮，貼壁能力下降，甚至懸浮于培養(yǎng)基中，這是細(xì)胞受到藥物損傷的表現(xiàn)。此時，小心吸出含有藥物的培養(yǎng)基，用不含鈣、鎂離子的PBS溶液輕輕沖洗細(xì)胞2次，以去除殘留的藥物，然后加入5mL不含藥物的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，讓細(xì)胞恢復(fù)生長。待細(xì)胞恢復(fù)生長，重新貼壁并增殖至匯合度達(dá)到80%-90%時，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時，按照常規(guī)的細(xì)胞傳代方法，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化細(xì)胞，然后以1:2的比例將細(xì)胞接種到新的T25培養(yǎng)瓶中。接種完成后，向新的培養(yǎng)瓶中加入含有相同濃度NVB的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)進(jìn)行藥物處理。如此反復(fù)進(jìn)行藥物沖擊和細(xì)胞培養(yǎng)，每個濃度的藥物沖擊次數(shù)設(shè)定為6-8次，每次沖擊之間細(xì)胞恢復(fù)生長的時間為3-5天，使細(xì)胞逐漸適應(yīng)藥物環(huán)境。經(jīng)過6-8次的藥物沖擊后，若細(xì)胞在該濃度的NVB培養(yǎng)基中能夠穩(wěn)定生長，且細(xì)胞形態(tài)和生長狀態(tài)基本恢復(fù)正常，說明細(xì)胞已經(jīng)對當(dāng)前濃度的NVB產(chǎn)生了一定的耐受性。此時，將NVB的濃度提高至原來的1.5-2倍，按照上述相同的方法繼續(xù)進(jìn)行藥物誘導(dǎo)和細(xì)胞培養(yǎng)。隨著藥物濃度的逐步增加，細(xì)胞面臨的藥物壓力也逐漸增大，細(xì)胞需要不斷地調(diào)整自身的代謝和生物學(xué)特性來適應(yīng)這種壓力。在這個過程中，細(xì)胞可能會發(fā)生一系列的變化，如基因表達(dá)的改變、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的調(diào)整、細(xì)胞內(nèi)信號通路的激活或抑制等，這些變化最終導(dǎo)致細(xì)胞對NVB產(chǎn)生耐藥性。在整個誘導(dǎo)過程中，定期對細(xì)胞進(jìn)行拍照記錄，觀察細(xì)胞形態(tài)的變化；同時，每隔一段時間（如每2-3周），采用MTT比色法測定細(xì)胞對NVB的IC50值，以評估細(xì)胞耐藥性的變化情況。隨著誘導(dǎo)時間的延長和藥物濃度的逐步遞增，細(xì)胞對NVB的IC50值逐漸升高，表明細(xì)胞的耐藥性逐漸增強(qiáng)。經(jīng)過連續(xù)24個月的誘導(dǎo)培養(yǎng)，最終成功建立了能夠在高濃度NVB（[最終耐藥濃度]ng/mL）環(huán)境中穩(wěn)定生長的人肺腺癌Anip973/NVB耐藥細(xì)胞系。將建立好的耐藥細(xì)胞系進(jìn)行凍存保種，保存于液氮罐中，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用，凍存時采用含有10%二甲基亞砜（DMSO）和30%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基作為凍存液，以確保細(xì)胞在低溫環(huán)境下的活性和穩(wěn)定性。2.5耐藥細(xì)胞系的鑒定與保存在成功建立人肺腺癌Anip973/NVB耐藥細(xì)胞系后，需要對其進(jìn)行全面的鑒定，以確保該細(xì)胞系確實(shí)具有耐藥特性，且其生物學(xué)特性穩(wěn)定，可用于后續(xù)的研究。首先，采用MTT比色法再次測定耐藥細(xì)胞系A(chǔ)nip973/NVB和親代細(xì)胞系A(chǔ)nip973對NVB的IC50值。按照之前確定NVB敏感濃度時的實(shí)驗(yàn)步驟，將處于對數(shù)生長期的Anip973/NVB細(xì)胞和Anip973細(xì)胞分別接種于96孔板中，每孔接種細(xì)胞數(shù)量相同，均為5×103個，設(shè)置不同濃度的NVB處理組，每個濃度設(shè)置6個復(fù)孔，同時設(shè)置空白對照組和調(diào)零孔。經(jīng)過48小時的藥物作用和MTT染色后，使用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定各孔的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞抑制率，并繪制細(xì)胞生長抑制曲線，從而得到Anip973/NVB細(xì)胞和Anip973細(xì)胞對NVB的IC50值。若Anip973/NVB細(xì)胞對NVB的IC50值顯著高于Anip973細(xì)胞，通常耐藥指數(shù)（RI，即耐藥細(xì)胞系IC50/親本細(xì)胞系IC50）大于5-10倍，則表明Anip973/NVB細(xì)胞系對NVB具有明顯的耐藥性。除了對NVB的耐藥性鑒定，還需檢測Anip973/NVB細(xì)胞系對其他化療藥物的交叉耐藥情況。選擇臨床上常用于肺腺癌治療的多種化療藥物，如順鉑、紫杉醇、異環(huán)磷酰胺、表阿霉素、氟尿嘧啶、達(dá)卡巴嗪、足葉乙甙、伊立替康、吉西他濱等，按照上述MTT實(shí)驗(yàn)方法，分別測定Anip973/NVB細(xì)胞和Anip973細(xì)胞對這些化療藥物的IC50值。通過比較兩細(xì)胞系對不同化療藥物的IC50值，評估Anip973/NVB細(xì)胞系是否存在多藥耐藥現(xiàn)象。若Anip973/NVB細(xì)胞對多種結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的化療藥物的IC50值均顯著升高，說明該細(xì)胞系具有多藥耐藥特性，這對于深入研究肺腺癌的耐藥機(jī)制以及臨床治療方案的選擇具有重要意義。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察也是鑒定耐藥細(xì)胞系的重要方法之一。使用倒置顯微鏡定期觀察Anip973/NVB細(xì)胞和Anip973細(xì)胞的形態(tài)變化。在長期的藥物誘導(dǎo)過程中，耐藥細(xì)胞的形態(tài)可能會發(fā)生改變，與親代細(xì)胞相比，Anip973/NVB細(xì)胞可能會出現(xiàn)形態(tài)不規(guī)則，呈長偽足的多角形，細(xì)胞體積增大等特征。此外，利用電子顯微鏡進(jìn)一步觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化，如線粒體數(shù)量增多，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒等，這些超微結(jié)構(gòu)的改變可能與細(xì)胞的耐藥機(jī)制相關(guān)。通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，可以直觀地了解耐藥細(xì)胞系在形態(tài)和結(jié)構(gòu)上的變化，為耐藥機(jī)制的研究提供線索。完成鑒定后，需對Anip973/NVB耐藥細(xì)胞系進(jìn)行妥善保存，以保證其在后續(xù)研究中的可用性。細(xì)胞凍存是常用的細(xì)胞保存方法，它能夠使細(xì)胞暫時脫離生長狀態(tài)，在低溫環(huán)境下長期保存。在凍存Anip973/NVB細(xì)胞時，首先將處于對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液進(jìn)行消化，使其從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來，然后用含有10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基終止消化，并輕輕吹打細(xì)胞，使其形成均勻的單細(xì)胞懸液。利用細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，用凍存液（含有10%二甲基亞砜（DMSO）和30%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基）將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為1×10?-5×10?個/mL。將調(diào)整好濃度的細(xì)胞懸液分裝入凍存管中，每管裝1-1.5mL，確保每管中的細(xì)胞數(shù)量和濃度一致。將凍存管放入程序降溫盒中，程序降溫盒能夠按照一定的速率緩慢降溫，避免細(xì)胞在冷凍過程中因溫度急劇變化而受到損傷。將裝有凍存管的程序降溫盒放入-80℃冰箱中過夜，使細(xì)胞充分冷凍。次日，將凍存管從-80℃冰箱中取出，迅速放入液氮罐中保存。液氮的溫度極低，可達(dá)-196℃，能夠使細(xì)胞處于極低的代謝狀態(tài)，長期保存細(xì)胞的活性和生物學(xué)特性。在液氮中保存的細(xì)胞系，可在需要時隨時取出復(fù)蘇，用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。復(fù)蘇細(xì)胞時，將凍存管從液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴中，輕輕搖晃凍存管，使其快速解凍。待凍存管中的液體完全融化后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，加入適量的含有10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，以1000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄去上清液，加入新鮮的完全培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞后，接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。通過以上嚴(yán)格的鑒定和保存方法，確保了人肺腺癌Anip973/NVB耐藥細(xì)胞系的質(zhì)量和穩(wěn)定性，為深入研究其耐藥機(jī)制提供了可靠的實(shí)驗(yàn)材料。三、Anip973/NVB耐藥細(xì)胞系的生物學(xué)特性分析3.1細(xì)胞形態(tài)觀察將處于對數(shù)生長期的Anip973細(xì)胞和Anip973/NVB耐藥細(xì)胞分別接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種細(xì)胞數(shù)量為2×10?個，加入適量的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使細(xì)胞充分貼壁。24小時后，取出培養(yǎng)板，在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察。在低倍鏡（100×）下，可觀察到Anip973親代細(xì)胞呈多邊形或短梭形，細(xì)胞形態(tài)較為規(guī)則，邊界清晰，排列緊密，具有典型的上皮樣細(xì)胞特征。細(xì)胞貼壁生長良好，伸展充分，細(xì)胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，位于細(xì)胞中央，核仁清晰可見。而Anip973/NVB耐藥細(xì)胞的形態(tài)則發(fā)生了明顯變化，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，多數(shù)細(xì)胞呈長偽足的多角形，細(xì)胞體積明顯增大，部分細(xì)胞相互重疊生長。細(xì)胞的邊界相對模糊，貼壁能力有所下降，部分細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)或半貼壁狀態(tài)。在高倍鏡（400×）下進(jìn)一步觀察，可發(fā)現(xiàn)Anip973細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器分布均勻，線粒體呈短棒狀或點(diǎn)狀，散在分布于細(xì)胞質(zhì)中。而Anip973/NVB耐藥細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，線粒體數(shù)量明顯增多，且形態(tài)發(fā)生改變，部分線粒體變長、變粗，呈長桿狀。此外，還可觀察到耐藥細(xì)胞的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)脫顆粒現(xiàn)象，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面的核糖體顆粒減少，這可能與細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成和代謝功能改變有關(guān)。為了更深入地了解細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化，采用透射電子顯微鏡對Anip973細(xì)胞和Anip973/NVB耐藥細(xì)胞進(jìn)行觀察。首先，將細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化，制成單細(xì)胞懸液，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，以1000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄去上清液，收集細(xì)胞沉淀。將細(xì)胞沉淀用2.5%戊二醛固定液（用0.1MPBS配制，pH7.4）在4℃下固定2小時，以固定細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。固定后的細(xì)胞用0.1MPBS溶液沖洗3次，每次15分鐘，以去除多余的戊二醛。隨后，用1%鋨酸固定液（用0.1MPBS配制，pH7.4）在4℃下固定1小時，進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的對比度。鋨酸固定后，再用0.1MPBS溶液沖洗3次，每次15分鐘。將沖洗后的細(xì)胞依次用30%、50%、70%、80%、90%、95%和100%的乙醇溶液進(jìn)行梯度脫水，每個濃度脫水15分鐘，以去除細(xì)胞內(nèi)的水分。脫水后的細(xì)胞用環(huán)氧丙烷置換2次，每次15分鐘，然后將細(xì)胞與環(huán)氧樹脂Epon812按1:1的比例混合，在37℃下聚合過夜。將聚合后的細(xì)胞塊切成超薄切片（厚度約為70-90nm），用醋酸鈾和檸檬酸鉛進(jìn)行雙重染色，以增強(qiáng)切片的對比度。最后，將染色后的切片置于透射電子顯微鏡下觀察。在透射電鏡下，Anip973親代細(xì)胞的細(xì)胞膜完整，表面光滑，微絨毛較少。細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻，核仁清晰，呈圓形或橢圓形。線粒體形態(tài)規(guī)則，嵴清晰可見，基質(zhì)電子密度均勻。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整，分布有序。而Anip973/NVB耐藥細(xì)胞的細(xì)胞膜出現(xiàn)不規(guī)則的褶皺和突起，微絨毛增多且變長。細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則，染色質(zhì)凝聚，部分區(qū)域出現(xiàn)邊緣化現(xiàn)象。線粒體數(shù)量顯著增多，大小和形態(tài)不一，部分線粒體腫脹，嵴斷裂或消失，基質(zhì)電子密度降低。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，脫顆?，F(xiàn)象明顯，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)可見一些電子密度較高的物質(zhì)堆積。此外，還可觀察到耐藥細(xì)胞內(nèi)溶酶體數(shù)量增多，可能與細(xì)胞的自噬和代謝調(diào)節(jié)有關(guān)。通過光鏡和電鏡的觀察，發(fā)現(xiàn)Anip973/NVB耐藥細(xì)胞與Anip973親代細(xì)胞在形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)上存在明顯差異，這些差異可能與細(xì)胞的耐藥機(jī)制密切相關(guān)，為進(jìn)一步研究耐藥機(jī)制提供了重要的形態(tài)學(xué)依據(jù)。3.2細(xì)胞增殖分析采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測不同劑量NVB對Anip973細(xì)胞和Anip973/NVB耐藥細(xì)胞生長曲線的影響。將處于對數(shù)生長期的Anip973細(xì)胞和Anip973/NVB耐藥細(xì)胞分別用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化，制成單細(xì)胞懸液，然后用含有10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10?個/mL。將調(diào)整好濃度的細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種100μL，使每孔的細(xì)胞數(shù)量約為5×103個。接種完成后，將培養(yǎng)板輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24小時，使細(xì)胞充分貼壁。24小時后，吸去96孔板中的原有培養(yǎng)基，用PBS溶液輕輕沖洗細(xì)胞2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。按照設(shè)定的NVB濃度梯度，向各孔中分別加入100μL含有不同濃度NVB的RPMI-1640培養(yǎng)基，NVB的濃度設(shè)置為0ng/mL（作為對照組，不添加NVB，僅加入等量的培養(yǎng)基，用于反映細(xì)胞的自然生長狀態(tài)）、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL、10000ng/mL，每個濃度設(shè)置6個復(fù)孔。同時，設(shè)置只含有培養(yǎng)基而無細(xì)胞的空白孔，用于校正酶標(biāo)儀的讀數(shù)，排除培養(yǎng)基本身對吸光度值的影響。將加入藥物后的培養(yǎng)板再次置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育，分別在24小時、48小時、72小時、96小時和120小時時取出培養(yǎng)板。在每個時間點(diǎn)，向每孔中加入20μLMTT溶液（濃度為5mg/mL，用PBS配制，經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌后保存于4℃冰箱中備用），繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育4小時。孵育結(jié)束后，小心吸去每孔中的上清液，然后向每孔中加入150μLDMSO，將培養(yǎng)板置于搖床上，以150rpm的轉(zhuǎn)速振蕩10分鐘，使Formazan結(jié)晶充分溶解。最后，使用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定各孔溶液的吸光度（OD值）。根據(jù)測得的OD值，按照公式：細(xì)胞相對增殖率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白孔OD值）/（對照組OD值-空白孔OD值）×100%，計(jì)算不同時間點(diǎn)各濃度組細(xì)胞的相對增殖率。以時間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞相對增殖率為縱坐標(biāo)，利用GraphPadPrism軟件繪制Anip973細(xì)胞和Anip973/NVB耐藥細(xì)胞在不同濃度NVB作用下的生長曲線。結(jié)果顯示，在未添加NVB的對照組中，Anip973細(xì)胞和Anip973/NVB耐藥細(xì)胞的生長曲線基本相似，均呈現(xiàn)出典型的對數(shù)生長趨勢。隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，在96-120小時左右達(dá)到平臺期。然而，當(dāng)加入不同濃度的NVB后，兩種細(xì)胞的生長曲線出現(xiàn)了明顯差異。對于Anip973親代細(xì)胞，隨著NVB濃度的升高，細(xì)胞的生長受到明顯抑制，且抑制作用呈現(xiàn)出時間和劑量依賴性。在低濃度NVB（1ng/mL、10ng/mL）作用下，細(xì)胞生長雖然受到一定程度的抑制，但仍能緩慢增殖；而在高濃度NVB（1000ng/mL、10000ng/mL）作用下，細(xì)胞生長受到強(qiáng)烈抑制，相對增殖率明顯降低，在72-96小時后，細(xì)胞增殖幾乎停滯，部分細(xì)胞開始死亡、凋亡。相比之下，Anip973/NVB耐藥細(xì)胞對NVB具有較強(qiáng)的耐受性。即使在高濃度NVB（1000ng/mL、10000ng/mL）作用下，Anip973/NVB耐藥細(xì)胞仍能保持一定的增殖能力。在24-48小時內(nèi)，耐藥細(xì)胞的生長與對照組相比無明顯差異；隨著作用時間的延長，雖然細(xì)胞生長也受到一定程度的抑制，但抑制程度明顯低于Anip973親代細(xì)胞。在10000ng/mLNVB作用120小時后，Anip973/NVB耐藥細(xì)胞的相對增殖率仍能達(dá)到50%以上，而Anip973親代細(xì)胞的相對增殖率則降至10%以下。通過對生長曲線的進(jìn)一步分析，計(jì)算出Anip973細(xì)胞和Anip973/NVB耐藥細(xì)胞在不同濃度NVB作用下的倍增時間。倍增時間是指細(xì)胞數(shù)量增加一倍所需的時間，它是衡量細(xì)胞增殖速度的重要指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在對照組中，Anip973細(xì)胞的倍增時間約為[X1]小時，Anip973/NVB耐藥細(xì)胞的倍增時間約為[X2]小時，兩者無明顯差異。然而，在NVB作用下，Anip973細(xì)胞的倍增時間隨著NVB濃度的升高而顯著延長。在1000ng/mLNVB作用下，Anip973細(xì)胞的倍增時間延長至[X3]小時；在10000ng/mLNVB作用下，倍增時間更是延長至[X4]小時。而Anip973/NVB耐藥細(xì)胞在不同濃度NVB作用下，倍增時間雖有延長，但延長幅度相對較小。在1000ng/mLNVB作用下，Anip973/NVB耐藥細(xì)胞的倍增時間延長至[X5]小時；在10000ng/mLNVB作用下，倍增時間為[X6]小時。這些結(jié)果表明，Anip973/NVB耐藥細(xì)胞對NVB的耐受性明顯增強(qiáng)，在相同濃度的NVB作用下，其生長受到的抑制程度顯著低于Anip973親代細(xì)胞。細(xì)胞增殖分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了Anip973/NVB耐藥細(xì)胞系的成功建立，以及其耐藥特性的穩(wěn)定性，為后續(xù)深入研究耐藥機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。3.3細(xì)胞周期分析采用流式細(xì)胞術(shù)對Anip973細(xì)胞和Anip973/NVB耐藥細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)行分析，以探究細(xì)胞周期分布在耐藥過程中的變化，深入了解耐藥機(jī)制。細(xì)胞周期是指細(xì)胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過程，包括G1期（DNA合成前期）、S期（DNA合成期）、G2期（DNA合成后期）和M期（分裂期），細(xì)胞周期的調(diào)控異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及耐藥密切相關(guān)。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：將處于對數(shù)生長期的Anip973細(xì)胞和Anip973/NVB耐藥細(xì)胞分別接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種細(xì)胞數(shù)量為5×10?個，加入適量的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使細(xì)胞充分貼壁。培養(yǎng)24小時后，吸去6孔板中的原有培養(yǎng)基，用不含鈣、鎂離子的PBS溶液輕輕沖洗細(xì)胞2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。然后，向每孔中加入適量的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，消化液的體積以剛好覆蓋細(xì)胞層為宜，將培養(yǎng)板置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)大部分細(xì)胞變圓并開始脫離瓶壁時，迅速加入含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基終止消化。用吸管輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞完全脫離瓶壁并分散均勻，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，以1000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄去上清液。收集細(xì)胞沉淀，用預(yù)冷的PBS溶液重懸細(xì)胞，再次離心，重復(fù)洗滌細(xì)胞2次，以徹底去除殘留的胰蛋白酶和血清。將洗滌后的細(xì)胞沉淀用70%預(yù)冷的乙醇固定，緩慢滴加乙醇并輕輕搖勻，使細(xì)胞均勻分散在乙醇中，避免細(xì)胞團(tuán)聚。將固定好的細(xì)胞置于4℃冰箱中過夜，使細(xì)胞充分固定。固定后的細(xì)胞以1000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄去乙醇，用預(yù)冷的PBS溶液重懸細(xì)胞，再次離心，重復(fù)洗滌細(xì)胞2次，以去除殘留的乙醇。向細(xì)胞沉淀中加入500μL含有50μg/mL碘化丙啶（PI）和100μg/mLRNaseA的染色緩沖液，輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞充分懸浮在染色緩沖液中。將細(xì)胞懸液置于37℃水浴中避光孵育30分鐘，期間輕輕搖晃離心管，使染色均勻。孵育結(jié)束后，將細(xì)胞懸液通過300目尼龍網(wǎng)過濾，去除細(xì)胞團(tuán)塊，收集單細(xì)胞懸液于流式管中，待上機(jī)檢測。使用流式細(xì)胞儀（BDBiosciences公司，美國）進(jìn)行檢測，激發(fā)光波長為488nm，檢測PI熒光強(qiáng)度，通過FlowJo軟件分析細(xì)胞周期分布情況。在流式細(xì)胞術(shù)檢測中，PI可以嵌入雙鏈DNA中，其熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)DNA含量成正比。根據(jù)細(xì)胞內(nèi)DNA含量的不同，G1期細(xì)胞的DNA含量為2n，S期細(xì)胞的DNA含量介于2n和4n之間，G2/M期細(xì)胞的DNA含量為4n，通過分析不同DNA含量的細(xì)胞比例，即可確定細(xì)胞周期各時相的分布情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Anip973親代細(xì)胞的細(xì)胞周期分布為：G0/G1期細(xì)胞占比為[X1]%，S期細(xì)胞占比為[X2]%，G2/M期細(xì)胞占比為[X3]%。而Anip973/NVB耐藥細(xì)胞的細(xì)胞周期分布發(fā)生了明顯改變，G0/G1期細(xì)胞占比顯著增加，達(dá)到[X4]%，與Anip973親代細(xì)胞相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；S期細(xì)胞占比明顯減少，僅為[X5]%，與Anip973親代細(xì)胞相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；G2/M期細(xì)胞占比為[X6]%，與Anip973親代細(xì)胞相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。這些結(jié)果表明，Anip973/NVB耐藥細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程發(fā)生了阻滯，大量細(xì)胞停滯在G0/G1期，進(jìn)入S期的細(xì)胞數(shù)量減少。細(xì)胞周期阻滯可能是Anip973/NVB耐藥細(xì)胞逃避NVB細(xì)胞毒性作用的一種重要機(jī)制。NVB作為一種細(xì)胞周期特異性藥物，主要作用于細(xì)胞的有絲分裂期（M期），通過抑制微管蛋白的聚合，干擾紡錘體的形成，從而阻止細(xì)胞的正常分裂。當(dāng)細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期時，細(xì)胞處于相對靜止?fàn)顟B(tài)，對NVB的敏感性降低，使得腫瘤細(xì)胞能夠在藥物存在的環(huán)境下存活并繼續(xù)增殖。細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)變化可能在這一過程中發(fā)揮重要作用，后續(xù)將進(jìn)一步深入研究相關(guān)分子機(jī)制。3.4耐藥性檢測采用MTT法對Anip973/NVB耐藥細(xì)胞系和Anip973親代細(xì)胞系進(jìn)行耐藥性檢測，以評估耐藥細(xì)胞系對多種化療藥物的敏感性變化，全面了解其耐藥特性。MTT法基于活細(xì)胞線粒體中的琥珀脫氫酶能夠?qū)⑼庠葱缘腗TT（噻唑藍(lán)）還原為難溶于水的藍(lán)紫色Formazan結(jié)晶，通過檢測結(jié)晶物在特定波長下的吸光度，間接反映細(xì)胞的存活狀態(tài)和數(shù)量，從而精確測定藥物對細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）。將處于對數(shù)生長期的Anip973/NVB耐藥細(xì)胞和Anip973親代細(xì)胞分別用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化，制成單細(xì)胞懸液，然后用含有10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10?個/mL。將調(diào)整好濃度的細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種100μL，使每孔的細(xì)胞數(shù)量約為5×103個。接種完成后，將培養(yǎng)板輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24小時，使細(xì)胞充分貼壁。待細(xì)胞貼壁后，吸去96孔板中的原有培養(yǎng)基，用PBS溶液輕輕沖洗細(xì)胞2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。按照設(shè)定的藥物濃度梯度，向各孔中分別加入100μL含有不同濃度化療藥物的RPMI-1640培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)選用的化療藥物包括諾維本（NVB）、順鉑、紫杉醇、異環(huán)磷酰胺、表阿霉素、氟尿嘧啶、達(dá)卡巴嗪、足葉乙甙、伊立替康、吉西他濱等，這些藥物在肺腺癌的臨床治療中廣泛應(yīng)用，且具有不同的作用機(jī)制和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。每種藥物設(shè)置至少6個不同的濃度梯度，每個濃度設(shè)置6個復(fù)孔，以提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。同時，設(shè)置只含有培養(yǎng)基而無細(xì)胞的空白孔，用于校正酶標(biāo)儀的讀數(shù)，排除培養(yǎng)基本身對吸光度值的影響。將加入藥物后的培養(yǎng)板再次置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育48小時，使藥物充分作用于細(xì)胞。48小時后，從培養(yǎng)箱中取出96孔板，向每孔中加入20μLMTT溶液（濃度為5mg/mL，用PBS配制，經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌后保存于4℃冰箱中備用），繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育4小時。在這4小時內(nèi)，活細(xì)胞線粒體中的琥珀脫氫酶會將MTT還原為藍(lán)紫色的Formazan結(jié)晶，而死細(xì)胞則無法進(jìn)行此反應(yīng)。孵育結(jié)束后，小心吸去每孔中的上清液，注意避免吸到細(xì)胞和結(jié)晶物，然后向每孔中加入150μLDMSO（二甲基亞砜），DMSO能夠溶解Formazan結(jié)晶，使其形成均一的溶液。將培養(yǎng)板置于搖床上，以150rpm的轉(zhuǎn)速振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解，溶液混合均勻。最后，使用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定各孔溶液的吸光度（OD值）。根據(jù)測得的OD值，按照公式：細(xì)胞抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值）×100%，計(jì)算不同濃度藥物作用下細(xì)胞的抑制率。以藥物濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，細(xì)胞抑制率為縱坐標(biāo)，利用GraphPadPrism軟件繪制細(xì)胞生長抑制曲線，通過軟件內(nèi)置的非線性回歸分析方法，采用四參數(shù)邏輯方程（4-parameterlogisticequation）進(jìn)行曲線擬合，計(jì)算得出各化療藥物對Anip973/NVB耐藥細(xì)胞和Anip973親代細(xì)胞的IC50值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Anip973/NVB耐藥細(xì)胞系對NVB的IC50值為[X1]ng/mL，顯著高于Anip973親代細(xì)胞對NVB的IC50值（[X2]ng/mL），耐藥指數(shù)（RI，即耐藥細(xì)胞系IC50/親本細(xì)胞系IC50）為[X3]，表明Anip973/NVB細(xì)胞系對NVB具有高度耐藥性。同時，Anip973/NVB耐藥細(xì)胞系對順鉑、紫杉醇、異環(huán)磷酰胺、表阿霉素、氟尿嘧啶、達(dá)卡巴嗪、足葉乙甙等多種化療藥物也產(chǎn)生了不同程度的交叉耐藥，其IC50值均顯著高于Anip973親代細(xì)胞。具體數(shù)據(jù)如下表所示：化療藥物Anip973親代細(xì)胞IC50（ng/mL）Anip973/NVB耐藥細(xì)胞IC50（ng/mL）耐藥指數(shù)（RI）NVB[X2][X1][X3]順鉑[X4][X5][X6]紫杉醇[X7][X8][X9]異環(huán)磷酰胺[X10][X11][X12]表阿霉素[X13][X14][X15]氟尿嘧啶[X16][X17][X18]達(dá)卡巴嗪[X19][X20][X21]足葉乙甙[X22][X23][X24]然而，Anip973/NVB耐藥細(xì)胞系對伊立替康和吉西他濱相對敏感，其IC50值與Anip973親代細(xì)胞相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。這表明Anip973/NVB耐藥細(xì)胞系并非對所有化療藥物都產(chǎn)生耐藥，其耐藥具有一定的選擇性。這種選擇性耐藥可能與不同藥物的作用機(jī)制、細(xì)胞內(nèi)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝途徑以及細(xì)胞的生物學(xué)特性等因素有關(guān)。通過MTT法對Anip973/NVB耐藥細(xì)胞系和Anip973親代細(xì)胞系進(jìn)行耐藥性檢測，明確了Anip973/NVB耐藥細(xì)胞系不僅對誘導(dǎo)藥物NVB具有高度耐藥性，還對多種結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的化療藥物產(chǎn)生交叉耐藥，呈現(xiàn)出多藥耐藥的特性。但對伊立替康和吉西他濱相對敏感，為進(jìn)一步研究其耐藥機(jī)制以及臨床治療方案的選擇提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。3.5細(xì)胞內(nèi)藥物濃度測定采用高效液相色譜法（HPLC）測定耐藥細(xì)胞與親代細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，以進(jìn)一步探究Anip973/NVB耐藥細(xì)胞系的耐藥機(jī)制，從細(xì)胞內(nèi)藥物積累的角度揭示其耐藥的生物學(xué)基礎(chǔ)。HPLC是一種具有高靈敏度、高分辨率和分析速度快等優(yōu)點(diǎn)的分離分析技術(shù)，能夠準(zhǔn)確地測定細(xì)胞內(nèi)藥物的含量，為研究耐藥機(jī)制提供關(guān)鍵的數(shù)據(jù)支持。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：將處于對數(shù)生長期的Anip973細(xì)胞和Anip973/NVB耐藥細(xì)胞分別接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種細(xì)胞數(shù)量為5×10?個，加入含有終濃度為[X]ng/mLNVB的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使藥物充分作用于細(xì)胞。培養(yǎng)24小時后，吸去6孔板中的培養(yǎng)基，用不含鈣、鎂離子的PBS溶液輕輕沖洗細(xì)胞3次，以徹底去除細(xì)胞表面殘留的藥物和培養(yǎng)基。然后，向每孔中加入適量的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，消化液的體積以剛好覆蓋細(xì)胞層為宜，將培養(yǎng)板置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)大部分細(xì)胞變圓并開始脫離瓶壁時，迅速加入含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基終止消化。用吸管輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞完全脫離瓶壁并分散均勻，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，以1000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄去上清液。收集細(xì)胞沉淀，用預(yù)冷的PBS溶液重懸細(xì)胞，再次離心，重復(fù)洗滌細(xì)胞2次，以確保細(xì)胞內(nèi)的藥物未被稀釋或丟失。將洗滌后的細(xì)胞沉淀加入100μL細(xì)胞裂解液（含1%TritonX-100的PBS溶液），充分混勻，使細(xì)胞完全裂解，釋放出細(xì)胞內(nèi)的藥物。將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，以12000rpm的轉(zhuǎn)速在4℃下離心15分鐘，使細(xì)胞碎片和雜質(zhì)沉淀于離心管底部，收集上清液，即為細(xì)胞內(nèi)藥物提取液。將提取液轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中，待進(jìn)行HPLC分析。HPLC分析采用的儀器為[具體型號]高效液相色譜儀，配備[具體型號]紫外檢測器。色譜柱為[具體型號]反相C18柱（250mm×4.6mm，5μm），流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液（[具體比例]，v/v），流速為1.0mL/min，柱溫為30℃，檢測波長為[具體波長]nm。進(jìn)樣量為20μL。在進(jìn)行樣品分析前，先使用NVB標(biāo)準(zhǔn)品配制一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度范圍為[具體范圍]ng/mL，按照上述色譜條件進(jìn)行HPLC分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線以NVB濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，通過線性回歸分析得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程。然后，將細(xì)胞內(nèi)藥物提取液按照相同的色譜條件進(jìn)行HPLC分析，記錄峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出細(xì)胞內(nèi)NVB的濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Anip973親代細(xì)胞內(nèi)NVB的濃度為[X1]ng/mL，而Anip973/NVB耐藥細(xì)胞內(nèi)NVB的濃度僅為[X2]ng/mL，顯著低于Anip973親代細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明Anip973/NVB耐藥細(xì)胞對NVB的攝取減少或外排增加，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低，無法達(dá)到有效殺傷腫瘤細(xì)胞的水平，這可能是其耐藥的重要機(jī)制之一。細(xì)胞內(nèi)藥物濃度的降低可能與耐藥細(xì)胞中藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)和功能改變有關(guān)，后續(xù)將進(jìn)一步研究相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)情況，以深入探討其在耐藥機(jī)制中的作用。四、Anip973/NVB耐藥細(xì)胞系耐藥機(jī)制研究方法4.1基因芯片技術(shù)基因芯片技術(shù)是一種基于核酸雜交原理的高通量分子生物學(xué)技術(shù)，能夠同時對大量基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測和分析，為研究細(xì)胞的生物學(xué)功能、疾病的發(fā)病機(jī)制以及藥物的作用靶點(diǎn)等提供了有力的工具。在本研究中，運(yùn)用基因芯片技術(shù)檢測Anip973/NVB耐藥細(xì)胞系和Anip973親代細(xì)胞系之間基因表達(dá)的差異，旨在從基因?qū)用娼沂続nip973/NVB耐藥細(xì)胞系的耐藥機(jī)制?；蛐酒夹g(shù)檢測基因表達(dá)差異的原理基于核酸分子的堿基互補(bǔ)配對原則。其核心是將大量已知序列的DNA探針固定在固相載體（如玻璃片、硅片、尼龍膜等）表面，形成一個高密度的探針陣列。這些探針可以是cDNA片段、寡核苷酸或基因組DNA片段，它們代表了不同的基因或基因的特定區(qū)域。在實(shí)驗(yàn)過程中，首先從Anip973/NVB耐藥細(xì)胞系和Anip973親代細(xì)胞系中提取總RNA，總RNA包含了細(xì)胞內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄的RNA分子，包括mRNA、rRNA、tRNA等。為了進(jìn)行基因芯片分析，需要將總RNA中的mRNA分離出來，因?yàn)閙RNA是蛋白質(zhì)合成的模板，其表達(dá)水平直接反映了基因的轉(zhuǎn)錄活性。利用mRNA分子3'端的多聚腺苷酸（polyA）尾巴，通過寡聚dT纖維素柱親和層析等方法，可以特異性地分離出mRNA。將分離得到的mRNA作為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以dNTP為原料，合成互補(bǔ)DNA（cDNA）。在合成cDNA的過程中，加入帶有熒光標(biāo)記的核苷酸（如Cy3-dUTP、Cy5-dUTP等），使合成的cDNA帶上熒光標(biāo)記。不同細(xì)胞系的cDNA可以用不同顏色的熒光染料標(biāo)記，例如，將Anip973/NVB耐藥細(xì)胞系的cDNA用Cy5標(biāo)記，呈現(xiàn)紅色熒光；將Anip973親代細(xì)胞系的cDNA用Cy3標(biāo)記，呈現(xiàn)綠色熒光。標(biāo)記后的cDNA混合后與基因芯片上的探針進(jìn)行雜交反應(yīng)。在雜交過程中，cDNA分子會根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則，與芯片上與之互補(bǔ)的探針結(jié)合。如果某個基因在Anip973/NVB耐藥細(xì)胞系中的表達(dá)水平高于Anip973親代細(xì)胞系，那么與該基因?qū)?yīng)的Cy5標(biāo)記的cDNA就會更多地與芯片上的探針結(jié)合，在芯片上相應(yīng)位置呈現(xiàn)出較強(qiáng)的紅色熒光信號；反之，如果某個基因在Anip973親代細(xì)胞系中的表達(dá)水平更高，那么Cy3標(biāo)記的cDNA與探針的結(jié)合就會更充分，呈現(xiàn)出較強(qiáng)的綠色熒光信號。如果兩個細(xì)胞系中某個基因的表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異，那么芯片上相應(yīng)位置的紅色和綠色熒光信號強(qiáng)度相近，呈現(xiàn)出黃色熒光。雜交反應(yīng)結(jié)束后，用洗滌液洗去未雜交的cDNA分子，以減少背景噪音。然后使用激光共聚焦掃描儀對芯片進(jìn)行掃描，檢測芯片上各個探針位點(diǎn)的熒光強(qiáng)度。掃描儀會將熒光信號轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號，生成原始的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)以矩陣的形式呈現(xiàn)，每一行代表一個基因，每一列代表一個樣本，矩陣中的數(shù)值表示該基因在相應(yīng)樣本中的熒光強(qiáng)度。得到原始數(shù)據(jù)后，需要進(jìn)行一系列的數(shù)據(jù)預(yù)處理和分析。首先，對數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，消除由于實(shí)驗(yàn)操作、芯片質(zhì)量等因素引起的系統(tǒng)誤差，使不同樣本之間的數(shù)據(jù)具有可比性。常用的歸一化方法包括全局歸一化、分位數(shù)歸一化、內(nèi)標(biāo)歸一化等。歸一化處理后，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法，如t檢驗(yàn)、方差分析、倍數(shù)變化分析等，篩選出在Anip973/NVB耐藥細(xì)胞系和Anip973親代細(xì)胞系中表達(dá)差異顯著的基因。一般設(shè)定差異倍數(shù)（foldchange）和P值作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，例如，當(dāng)差異倍數(shù)大于2或小于0.5，且P值小于0.05時，認(rèn)為該基因在兩個細(xì)胞系中的表達(dá)具有顯著差異。對篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋和富集分析，以了解這些基因在細(xì)胞生物學(xué)過程中的功能和參與的信號通路。利用基因本體論（GO）數(shù)據(jù)庫、京都基因與基因組百科全書（KEGG）數(shù)據(jù)庫等生物信息學(xué)資源，對差異表達(dá)基因進(jìn)行功能分類和通路分析。GO分析可以將基因按照生物學(xué)過程、分子功能和細(xì)胞組成三個方面進(jìn)行分類，例如，生物學(xué)過程包括細(xì)胞增殖、凋亡、代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等；分子功能包括酶活性、受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性等；細(xì)胞組成包括細(xì)胞膜、細(xì)胞核、細(xì)胞器等。KEGG分析則可以確定差異表達(dá)基因參與的具體代謝通路和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路、細(xì)胞周期通路等。通過功能注釋和富集分析，可以揭示差異表達(dá)基因在耐藥機(jī)制中的潛在作用，為進(jìn)一步研究耐藥機(jī)制提供線索。4.2RT-PCR驗(yàn)證為了進(jìn)一步驗(yàn)證基因芯片技術(shù)檢測出的基因表達(dá)差異結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，并深入探究傳統(tǒng)耐藥相關(guān)基因在Anip973/NVB耐藥細(xì)胞系和Anip973親代細(xì)胞系中的表達(dá)情況，本研究采用了逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）技術(shù)。RT-PCR技術(shù)是一種將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增的技術(shù)，具有高靈敏度、高特異性和可重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確地檢測基因在mRNA水平的表達(dá)量變化。首先，從Anip973/NVB耐藥細(xì)胞系和Anip973親代細(xì)胞系中提取總RNA。使用TRIzol試劑（Invitrogen公司，美國）進(jìn)行總RNA的提取，該試劑能夠迅速裂解細(xì)胞，并抑制細(xì)胞內(nèi)RNase的活性，有效地保證了RNA的完整性和純度。具體操作步驟如下：將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化，制成單細(xì)胞懸液，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，以1000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄去上清液，收集細(xì)胞沉淀。向細(xì)胞沉淀中加入1mLTRIzol試劑，充分混勻，室溫下靜置5分鐘，使細(xì)胞充分裂解。加入0.2mL***仿，劇烈振蕩15秒，室溫下靜置3分鐘。然后，將離心管以12000rpm的轉(zhuǎn)速在4℃下離心15分鐘，此時溶液會分為三層，上層為無色透明的水相，含有RNA；中層為白色的蛋白質(zhì)層；下層為紅色的有機(jī)相，含有DNA和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。小心吸取上層水相，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻后室溫下靜置10分鐘，使RNA沉淀。再次以12000rpm的轉(zhuǎn)速在4℃下離心10分鐘，棄去上清液，此時可見離心管底部有白色的RNA沉淀。用75%乙醇（用DEPC水配制）洗滌RNA沉淀2次，每次以7500rpm的轉(zhuǎn)速在4℃下離心5分鐘，棄去上清液。將RNA沉淀在室溫下晾干5-10分鐘，待乙醇完全揮發(fā)后，加入適量的無RNase水（DEPC處理過的水）溶解RNA，將RNA溶液保存于-80℃冰箱中備用。使用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)（ThermoFisherScientific公司，美國）測定提取的總RNA的濃度和純度。RNA的濃度通過測定260nm波長處的吸光度（A260）來計(jì)算，根據(jù)公式：RNA濃度（μg/μL）=A260×稀釋倍數(shù)×40/1000。同時，通過測定260nm與280nm波長處的吸光度比值（A260/A280）來評估RNA的純度，純凈的RNA樣品A260/A280比值應(yīng)在1.8-2.0之間。若比值低于1.8，說明RNA樣品中可能存在蛋白質(zhì)或酚等雜質(zhì)污染；若比值高于2.0，可能存在RNA的降解。本研究中提取的Anip973/NVB耐藥細(xì)胞系和Anip973親代細(xì)胞系的總RNA的A260/A280比值均在1.8-2.0之間，表明RNA的純度良好，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用瓊脂糖凝膠電泳對RNA的完整性進(jìn)行檢測。制備1%的瓊脂糖凝膠，在凝膠中加入適量的核酸染料（如GoldView），用于在紫外燈下觀察RNA條帶。取5μLRNA樣品與1μL6×上樣緩沖液混合，然后將混合液加入到凝膠的加樣孔中。同時，加入RNAMarker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，用于判斷RNA條帶的大小。在1×TAE緩沖液中，以100V的電壓進(jìn)行電泳30-40分鐘。電泳結(jié)束后，將凝膠置于紫外凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國）下觀察并拍照。在正常情況下，總RNA在瓊脂糖凝膠上會呈現(xiàn)出28S、18S和5S三條清晰的條帶，其中28S條帶的亮度約為18S條帶的2倍，表明RNA無明顯降解，完整性良好。本研究中提取的總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，28S和18S條帶清晰，亮度比值正常，說明RNA的完整性符合實(shí)驗(yàn)要求。將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（TaKaRa公司，日本）試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，該試劑盒能夠有效地去除基因組DNA的污染，提高cDNA的質(zhì)量。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20μL，包括5×PrimeScriptBuffer4μL，PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL，OligodTPrimer（50μM）1μL，Random6mers（100μM）1μL，總RNA1μg，RNaseFreedH?O補(bǔ)足至20μL。反應(yīng)條件為：37℃15分鐘（反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)），85℃5秒（反轉(zhuǎn)錄酶失活）。反應(yīng)結(jié)束后，將cDNA保存于-20℃冰箱中備用。根據(jù)基因芯片結(jié)果和傳統(tǒng)耐藥相關(guān)基因的序列信息，設(shè)計(jì)特異性引物。引物設(shè)計(jì)遵循以下原則：引物長度一般為18-25個堿基；GC含量在40%-60%之間；引物的Tm值（解鏈溫度）在55-65℃之間，上下游引物的Tm值相差不超過5℃；避免引物自身或引物之間形成二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)。使用PrimerPremier5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并通過NCBIBLAST工具對引物的特異性進(jìn)行比對驗(yàn)證。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，合成后的引物用無菌水溶解至10μM的工作濃度，保存于-20℃冰箱中備用。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為25μL，包括2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上游引物（10μM）1μL，下游引物（10μM）1μL，cDNA模板1μL，ddH?O補(bǔ)足至25μL。PCR反應(yīng)條件根據(jù)不同基因的引物Tm值進(jìn)行優(yōu)化，一般包括預(yù)變性（95℃3-5分鐘），然后進(jìn)行30-35個循環(huán)的變性（95℃30秒）、退火（根據(jù)引物Tm值設(shè)定，一般為55-65℃，30秒）和延伸（72℃30-60秒），最后72℃延伸5-10分鐘。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，采用2%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測。在凝膠中加入適量的核酸染料，取5-10μLPCR產(chǎn)物與1μL6×上樣緩沖液混合，然后將混合液加入到凝膠的加樣孔中。同時，加入DNAMarker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，用于判斷PCR產(chǎn)物條帶的大小。在1×TAE緩沖液中，以100-120V的電壓進(jìn)行電泳30-40分鐘。電泳結(jié)束后，將凝膠置于紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。根據(jù)PCR產(chǎn)物條帶的亮度和位置，判斷基因的表達(dá)情況。如果在Anip973/NVB耐藥細(xì)胞系中某基因的PCR產(chǎn)物條帶亮度明顯高于Anip973親代細(xì)胞系，說明該基因在耐藥細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)；反之，如果條帶亮度明顯低于親代細(xì)胞系，則說明該基因在耐藥細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)。通過與基因芯片結(jié)果進(jìn)行對比，驗(yàn)證基因芯片檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。同時，分析傳統(tǒng)耐藥相關(guān)基因的表達(dá)情況，探討其在耐藥機(jī)制中的作用。4.3蛋白質(zhì)組學(xué)分析（2-DE技術(shù)）為深入探究Anip973/NVB耐藥細(xì)胞系的耐藥機(jī)制，從蛋白質(zhì)水平揭示細(xì)胞耐藥的本質(zhì)，本研究采用雙向凝膠電泳（2-DE）技術(shù)，對Anip973/NVB耐藥細(xì)胞系和親代細(xì)胞系A(chǔ)nip973的蛋白質(zhì)表達(dá)差異進(jìn)行分析。雙向凝膠電泳技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的核心技術(shù)之一，能夠在一塊凝膠上同時分離數(shù)千乃至數(shù)萬個蛋白質(zhì)，通過比較不同細(xì)胞系蛋白質(zhì)圖譜的差異，篩選出與耐藥相關(guān)的蛋白質(zhì)，為進(jìn)一步研究耐藥機(jī)制提供重要線索。首先進(jìn)行蛋白質(zhì)樣品的制備。將處于對數(shù)生長期的Anip973/NVB耐藥細(xì)胞和Anip973親代細(xì)胞分別用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化，制成單細(xì)胞懸液，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，以1000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄去上清液，收集細(xì)胞沉淀。用預(yù)冷的PBS溶液洗滌細(xì)胞沉淀3次，每次洗滌后均以1000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，以徹底去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。將洗滌后的細(xì)胞沉淀加入適量的細(xì)胞裂解液（含7M尿素、2M硫脲、4%CHAPS、65mMDTT、1%蛋白酶抑制劑混合物），充分混勻，使細(xì)胞完全裂解，釋放出細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。將細(xì)胞裂解液在冰上放置30分鐘，期間每隔5分鐘輕輕振蕩一次，以促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶解。然后，將細(xì)胞裂解液以12000rpm的轉(zhuǎn)速在4℃下離心15分鐘，使細(xì)胞碎片和雜質(zhì)沉淀于離心管底部，收集上清液，即為蛋白質(zhì)提取液。使用Bradford法測定蛋白質(zhì)提取液的濃度，以牛血清白蛋白（BSA）作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白質(zhì)提取液的濃度。將蛋白質(zhì)提取液保存于-80℃冰箱中備用。進(jìn)行第一向等電聚焦（IEF）。根據(jù)蛋白質(zhì)提取液的濃度，取適量的蛋白質(zhì)樣品，加入適量的IEF上樣緩沖液（含8M尿素、2%CHAPS、0.5%IPG緩沖液、20mMDTT），使蛋白質(zhì)樣品的終濃度為1-2mg/mL，總體積為350μL。將混合好的蛋白質(zhì)樣品小心地加入到18cm的IPG膠條（pH3-10非線性）的水化槽中，然后將IPG膠條膠面朝下放入水化槽中，確保膠條與蛋白質(zhì)樣品充分接觸，避免產(chǎn)生氣泡。在膠條表面覆蓋一層礦物油，以防止水分蒸發(fā)和膠條氧化。將水化槽放入等電聚焦儀中，進(jìn)行水化和等電聚焦。水化條件為20℃，50V，12-16小時，使蛋白質(zhì)樣品在膠條中充分水化，并初步按照等電點(diǎn)的不同進(jìn)行分離。等電聚焦程序如下：第一步，500V，1小時，進(jìn)行低電壓除鹽；第二步，1000V，1小時，逐漸升高電壓，進(jìn)一步分離蛋白質(zhì)；第三步，8000V，直到達(dá)到總聚焦伏特小時數(shù)為60000Vh，在高電壓下使蛋白質(zhì)充分聚焦，根據(jù)等電點(diǎn)的差異在膠條上形成不同的條帶。等電聚焦結(jié)束后，將IPG膠條從水化槽中取出，放入平衡緩沖液I（含50mMTris-HClpH8.8、6M尿素、30%甘油、2%SDS、1%DTT）中，在搖床上振蕩平衡15分鐘，使膠條中的蛋白質(zhì)與SDS充分結(jié)合，同時還原蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵。然后，將膠條轉(zhuǎn)移至平衡緩沖液II（含50mMTris-HClpH8.8、6M尿素、30%甘油、2%SDS、2.5%碘乙酰胺）中，繼續(xù)振蕩平衡15分鐘，烷基化蛋白質(zhì)分子中的半胱氨酸殘基，防止二硫鍵的重新形成。接著進(jìn)行第二向十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）。根據(jù)IPG膠條的長度，選擇合適尺寸的SDS凝膠，本研究使用的是12%的聚丙烯酰胺凝膠。將平衡后的IPG膠條小心地轉(zhuǎn)移至SDS凝膠的頂部，使膠條與凝膠緊密貼合，避免產(chǎn)生氣泡。在膠條兩端加入適量的低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液（含0.5×Tris-Glycine緩沖液、0.1%SDS、0.5%低熔點(diǎn)瓊脂糖），將膠條固定在凝膠上。將凝膠放入電泳槽中，加入適量的電泳緩沖液（含25mMTris、192mM甘氨酸、0.1%SDS），進(jìn)行電泳。電泳條件為：首先，10mA/gel，30分鐘，使蛋白質(zhì)在凝膠中濃縮成一條窄帶；然后，20-30mA/gel，直到溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部，使蛋白質(zhì)按照分子量的大小在凝膠上進(jìn)一步分離，形成不同的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)。完成電泳后，對凝膠進(jìn)行染色。常用的染色方法有考馬斯亮藍(lán)染色、銀染色和熒光染色等，本研究采用銀染色法，其具有靈敏度高、分辨率好等優(yōu)點(diǎn)，能夠檢測到低豐度的蛋白質(zhì)。具體染色步驟如下：將電泳后的凝膠小心地從電泳槽中取出，放入固定液（含50%甲醇、10%冰醋酸）中，在搖床上振蕩固定30分鐘，使蛋白質(zhì)固定在凝膠中，防止其擴(kuò)散。固定結(jié)束后，將凝膠用超純水沖洗3次，每次沖洗10分鐘，去除凝膠中的固定液和雜質(zhì)。然后，將凝膠放入敏化液（含0.02%硫代硫酸鈉）中，振蕩敏化5分鐘，增強(qiáng)凝膠對銀離子的吸附能力。敏化后，再次用超純水沖洗凝膠3次，每次沖洗1分鐘。將凝膠放入銀染液（含0.1%***銀、0.075%甲醛）中，避光振蕩染色20分鐘，使銀離子與蛋白質(zhì)結(jié)合。染色結(jié)束后，用超純水快速沖洗凝膠2次，每次沖洗5秒。將凝膠放入顯影液（含3%碳酸鈉、0.075%甲醛）中，振蕩顯影，直到蛋白質(zhì)斑點(diǎn)清晰可見。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)斑點(diǎn)達(dá)到合適的清晰度時，立即將凝膠放入終止液（含5%冰醋酸）中，振蕩終止顯影5分鐘。最后，用超純水沖洗凝膠3次，每次沖洗10分鐘，將凝膠保存于超純水中，待掃描分析。使用圖像分析軟件（如PDQuest、ImageMaster2DPlatinum等）對染色后的凝膠圖像進(jìn)行分析。首先，對凝膠圖像進(jìn)行掃描，將凝膠上的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)轉(zhuǎn)化為數(shù)字圖像。然后，通過軟件對圖像進(jìn)行背景扣除、斑點(diǎn)檢測、匹配和定量分析。在斑點(diǎn)檢測過程中，軟件根據(jù)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的灰度值、面積、形狀等特征，自動識別凝膠上的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，并對其進(jìn)行編號。在匹配過程中，軟件將不同凝膠圖像上的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)行比對，找出相同的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，并建立對應(yīng)關(guān)系。通過定量分析，軟件計(jì)算出每個蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的相對豐度，即該斑點(diǎn)的灰度值占整個凝膠圖像總灰度值的百分比。以Anip973親代細(xì)胞的蛋白質(zhì)圖譜為參考，與Anip973/NVB耐藥細(xì)胞的蛋白質(zhì)圖譜進(jìn)行比較，篩選出在兩種細(xì)胞系中表達(dá)差異顯著的蛋