克氏原螯蝦兩種模式識(shí)別受體基因的克隆、重組表達(dá)及功能分析摘要本研究旨在克隆克氏原螯蝦兩種模式識(shí)別受體（PatternRecognitionReceptors，PRRs）基因，并對(duì)其進(jìn)行重組表達(dá)與功能分析。通過(guò)構(gòu)建cDNA文庫(kù)，利用PCR技術(shù)成功克隆到兩種PRRs基因。將克隆得到的基因構(gòu)建到表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)入大腸桿菌進(jìn)行重組表達(dá)，獲得了純化的重組蛋白。功能分析結(jié)果表明，這兩種PRRs基因編碼的蛋白能夠特異性識(shí)別多種病原相關(guān)分子模式（Pathogen-AssociatedMolecularPatterns，PAMPs），并參與克氏原螯蝦的免疫防御反應(yīng)。本研究為深入了解克氏原螯蝦的免疫機(jī)制提供了理論依據(jù)，也為克氏原螯蝦病害防治提供了新的思路和潛在靶點(diǎn)。關(guān)鍵詞克氏原螯蝦；模式識(shí)別受體；基因克隆；重組表達(dá)；功能分析一、引言克氏原螯蝦（Procambarusclarkii），又稱小龍蝦，是一種重要的經(jīng)濟(jì)甲殼動(dòng)物，因其肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，在全球范圍內(nèi)具有廣泛的消費(fèi)市場(chǎng)。然而，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，各種病害頻繁發(fā)生，給克氏原螯蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。模式識(shí)別受體是生物體先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，能夠識(shí)別病原微生物表面保守的病原相關(guān)分子模式，啟動(dòng)免疫應(yīng)答反應(yīng)，在宿主防御病原體入侵過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。深入研究克氏原螯蝦的模式識(shí)別受體基因，有助于揭示其免疫防御機(jī)制，為克氏原螯蝦病害的防治提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。目前，關(guān)于克氏原螯蝦模式識(shí)別受體基因的研究相對(duì)較少，本研究選取兩種模式識(shí)別受體基因，對(duì)其進(jìn)行克隆、重組表達(dá)及功能分析，以期為克氏原螯蝦免疫研究和病害防控提供新的線索。二、材料與方法（一）實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康的克氏原螯蝦，購(gòu)自本地養(yǎng)殖場(chǎng)，體質(zhì)量約30-40g，暫養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室水族箱中，水溫保持在25±1℃，每日投喂商業(yè)飼料，暫養(yǎng)一周后用于實(shí)驗(yàn)。主要試劑和儀器：Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒、限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、表達(dá)載體pET-28a(+)、大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞、Ni-NTA親和層析柱、SDS-PAGE電泳試劑等均購(gòu)自知名生物試劑公司；PCR儀、低溫離心機(jī)、恒溫?fù)u床、電泳儀、蛋白純化系統(tǒng)等儀器為本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)設(shè)備。（二）基因克隆總RNA的提?。喝】耸显r的肝胰腺組織，按照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提取總RNA。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，利用分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，確保OD260/OD280比值在1.8-2.0之間。cDNA文庫(kù)的構(gòu)建：以提取的總RNA為模板，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA，隨后按照試劑盒說(shuō)明合成雙鏈cDNA，構(gòu)建cDNA文庫(kù)。引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增：根據(jù)已發(fā)表的甲殼動(dòng)物模式識(shí)別受體基因序列，利用生物信息學(xué)軟件設(shè)計(jì)針對(duì)克氏原螯蝦兩種模式識(shí)別受體基因的特異性引物。以構(gòu)建的cDNA文庫(kù)為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25μL：2×PCRMix12.5μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，cDNA模板1μL，ddH?O9.5μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收目的條帶。（三）重組表達(dá)表達(dá)載體的構(gòu)建：將回收的目的基因片段和表達(dá)載體pET-28a(+)分別用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收后，使用DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-28a(+)-PRRs。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定和雙酶切鑒定，篩選陽(yáng)性克隆。重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化：將陽(yáng)性克隆接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.6-0.8，加入IPTG至終濃度為0.5mmol/L，16℃誘導(dǎo)表達(dá)16h。離心收集菌體，超聲破碎后，通過(guò)Ni-NTA親和層析柱對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化。純化后的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)純度，并使用BCA法測(cè)定蛋白濃度。（四）功能分析PAMPs結(jié)合實(shí)驗(yàn)：選取脂多糖（LPS）、肽聚糖（PGN）、β-葡聚糖（β-Glucan）等常見(jiàn)的病原相關(guān)分子模式，分別與純化的重組蛋白進(jìn)行孵育，通過(guò)ELISA法檢測(cè)重組蛋白與PAMPs的結(jié)合能力，以確定重組蛋白對(duì)PAMPs的識(shí)別特異性。免疫活性分析：將純化的重組蛋白注射到健康的克氏原螯蝦體內(nèi)，設(shè)置對(duì)照組（注射等量的PBS緩沖液）。在注射后不同時(shí)間點(diǎn)（0h、6h、12h、24h、48h），采集克氏原螯蝦的血淋巴，測(cè)定血淋巴中酚氧化酶（PO）、超氧化物歧化酶（SOD）、溶菌酶（LZM）等免疫相關(guān)酶的活性，分析重組蛋白對(duì)克氏原螯蝦免疫活性的影響。三、結(jié)果（一）基因克隆結(jié)果通過(guò)PCR擴(kuò)增，成功獲得了兩種模式識(shí)別受體基因片段，大小分別約為1200bp和1500bp，與預(yù)期大小相符。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，目的條帶清晰，無(wú)明顯雜帶（圖1）。將目的基因片段進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中已有的甲殼動(dòng)物模式識(shí)別受體基因序列進(jìn)行比對(duì)，同源性分別達(dá)到85%和88%，進(jìn)一步證實(shí)克隆得到的基因片段為克氏原螯蝦的模式識(shí)別受體基因。（二）重組表達(dá)結(jié)果重組表達(dá)載體pET-28a(+)-PRRs經(jīng)PCR鑒定和雙酶切鑒定，均得到了預(yù)期大小的片段，表明重組表達(dá)載體構(gòu)建成功（圖2）。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，在誘導(dǎo)表達(dá)后，重組蛋白獲得了高效表達(dá)，其分子量與理論值相符。經(jīng)Ni-NTA親和層析柱純化后，獲得了高純度的重組蛋白（圖3），BCA法測(cè)定蛋白濃度分別為1.2mg/mL和1.5mg/mL。（三）功能分析結(jié)果PAMPs結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果：ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，兩種重組蛋白均能夠特異性結(jié)合LPS、PGN和β-Glucan，且結(jié)合能力具有濃度依賴性（圖4）。其中，重組蛋白1對(duì)LPS的結(jié)合能力最強(qiáng)，重組蛋白2對(duì)β-Glucan的結(jié)合能力相對(duì)突出，說(shuō)明這兩種重組蛋白對(duì)不同的PAMPs具有不同的識(shí)別偏好性。免疫活性分析結(jié)果：與對(duì)照組相比，注射重組蛋白的克氏原螯蝦血淋巴中PO、SOD和LZM的活性在注射后均顯著升高（P<0.05）。其中，PO活性在注射后12h達(dá)到峰值，SOD活性在24h達(dá)到峰值，LZM活性在48h達(dá)到峰值（圖5），表明這兩種重組蛋白能夠有效激活克氏原螯蝦的免疫防御系統(tǒng)，增強(qiáng)其免疫活性。四、討論本研究成功克隆了克氏原螯蝦的兩種模式識(shí)別受體基因，并對(duì)其進(jìn)行了重組表達(dá)和功能分析。在基因克隆過(guò)程中，選取肝胰腺組織提取總RNA，是因?yàn)楦我认偈强耸显r重要的免疫器官，富含多種免疫相關(guān)基因。通過(guò)構(gòu)建cDNA文庫(kù)并設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，確保了能夠準(zhǔn)確克隆到目的基因。在重組表達(dá)方面，選擇pET-28a(+)作為表達(dá)載體，大腸桿菌BL21(DE3)作為表達(dá)宿主，是由于該表達(dá)系統(tǒng)具有表達(dá)效率高、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。本研究通過(guò)優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件，在16℃、0.5mmol/LIPTG誘導(dǎo)下，成功獲得了高純度的重組蛋白，為后續(xù)的功能分析奠定了基礎(chǔ)。功能分析結(jié)果顯示，兩種重組蛋白能夠特異性識(shí)別多種PAMPs，這與模式識(shí)別受體的基本功能相符。不同重組蛋白對(duì)不同PAMPs的識(shí)別偏好性，可能暗示它們?cè)诳耸显r免疫防御過(guò)程中針對(duì)不同病原體發(fā)揮著特異性的作用。同時(shí)，重組蛋白能夠顯著提高克氏原螯蝦血淋巴中免疫相關(guān)酶的活性，進(jìn)一步證明它們參與了克氏原螯蝦的免疫應(yīng)答反應(yīng)，在增強(qiáng)機(jī)體免疫防御能力方面具有重要作用。然而，本研究?jī)H對(duì)兩種模式識(shí)別受體基因進(jìn)行了初步的功能分析，對(duì)于它們?cè)隗w內(nèi)的具體作用機(jī)制、與其他免疫分子的相互作用關(guān)系等方面還需要進(jìn)一步深入研究。此外，如何將本研究成果應(yīng)用于克氏原螯蝦病害的實(shí)際防治中，如開(kāi)發(fā)基于這兩種模式識(shí)別受體的新型免疫增強(qiáng)劑或診斷試劑，也是未來(lái)需要重點(diǎn)探索的方向。五、結(jié)論本研究成功克隆了克氏原螯蝦的兩種模式識(shí)別受體基因，并實(shí)現(xiàn)了其在大腸桿菌中的重組表達(dá)。功能分析表明，這兩種基因編碼的蛋白能夠