Skp2與p27蛋白表達(dá)：肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展與臨床預(yù)后的關(guān)鍵指標(biāo)一、引言1.1研究背景與肝細(xì)胞癌現(xiàn)狀肝細(xì)胞癌（HepatocellularCarcinoma，HCC）作為肝臟最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康，帶來(lái)沉重的疾病負(fù)擔(dān)。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，肝癌的全球新發(fā)病例數(shù)達(dá)90.6萬(wàn)，死亡病例數(shù)約83萬(wàn)，發(fā)病率在所有惡性腫瘤中位居第6位，死亡率則高居第3位。在我國(guó)，肝癌同樣形勢(shì)嚴(yán)峻，是第5位常見(jiàn)惡性腫瘤及第2位腫瘤致死病因，由于人口基數(shù)大，我國(guó)肝癌患者數(shù)量占全球的比例較高。肝癌的發(fā)病隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，錯(cuò)失了最佳手術(shù)時(shí)機(jī)。中晚期肝癌患者的5年生存率不足20%，即便采用多種綜合治療手段，總體療效仍不盡人意。肝癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜過(guò)程，涉及眾多基因和信號(hào)通路的異常改變。深入探究其發(fā)病機(jī)制，尋找有效的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，對(duì)于提高肝癌患者的生存率和改善預(yù)后至關(guān)重要。1.2Skp2和p27在細(xì)胞周期調(diào)控中的作用概述細(xì)胞周期的精確調(diào)控對(duì)于維持細(xì)胞的正常生理功能、組織穩(wěn)態(tài)以及個(gè)體發(fā)育至關(guān)重要。在細(xì)胞周期的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，Skp2和p27發(fā)揮著關(guān)鍵且相互關(guān)聯(lián)的作用。Skp2（S-phasekinase-associatedprotein2）是一種重要的癌蛋白，屬于F-box蛋白家族成員，在細(xì)胞周期調(diào)控中扮演著泛素連接酶的角色。Skp2主要通過(guò)參與組成SCF（Skp1-Cullin1-F-boxprotein）泛素連接酶復(fù)合物發(fā)揮作用。在這個(gè)復(fù)合物中，Skp2作為底物識(shí)別亞基，憑借其獨(dú)特的F-box結(jié)構(gòu)域特異性地識(shí)別并結(jié)合靶蛋白，隨后將泛素分子轉(zhuǎn)移至靶蛋白上，使靶蛋白被蛋白酶體識(shí)別并降解。在細(xì)胞周期從G1期向S期轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，Skp2起著促進(jìn)作用。正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞接收到生長(zhǎng)信號(hào)后，細(xì)胞內(nèi)的一系列信號(hào)通路被激活，促使Skp2表達(dá)上調(diào)。Skp2通過(guò)識(shí)別并結(jié)合細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控因子p27等靶蛋白，促使它們被泛素化修飾，進(jìn)而被蛋白酶體降解。這樣一來(lái)，原本被p27抑制的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）得以活化，推動(dòng)細(xì)胞順利越過(guò)G1/S檢查點(diǎn)，進(jìn)入S期進(jìn)行DNA復(fù)制，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。在腫瘤細(xì)胞中，Skp2常常呈現(xiàn)異常高表達(dá)狀態(tài)，導(dǎo)致p27等蛋白過(guò)度降解，細(xì)胞周期進(jìn)程失控，細(xì)胞無(wú)節(jié)制地增殖，這在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到了關(guān)鍵的推動(dòng)作用。p27（p27Kip1）則是細(xì)胞周期的負(fù)性調(diào)控因子，在維持細(xì)胞周期的正常秩序和抑制細(xì)胞過(guò)度增殖方面發(fā)揮著重要作用。人類p27基因定位于12號(hào)染色體p13區(qū)，其編碼的p27蛋白含有198個(gè)氨基酸殘基。p27主要作用于細(xì)胞周期的G1期，它能特異性地與CDK-細(xì)胞周期蛋白復(fù)合物結(jié)合，形成穩(wěn)定的三聚體結(jié)構(gòu)。這種結(jié)合方式能夠抑制CDK的激酶活性，阻礙細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，進(jìn)而控制細(xì)胞的增殖速度。在細(xì)胞分化過(guò)程中，p27也發(fā)揮著不可或缺的作用。例如，在肌肉細(xì)胞分化過(guò)程中，p27蛋白的表達(dá)水平會(huì)顯著升高，它通過(guò)抑制細(xì)胞增殖，為肌肉細(xì)胞向特定方向分化創(chuàng)造條件，促使細(xì)胞退出細(xì)胞周期，進(jìn)入分化狀態(tài)，最終形成成熟的肌肉組織。當(dāng)p27基因發(fā)生突變或表達(dá)異常時(shí)，細(xì)胞增殖與凋亡的平衡被打破，細(xì)胞增殖可能失控，這與多種人類惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌等多種癌癥中，都普遍存在p27蛋白表達(dá)水平降低或功能缺失的現(xiàn)象，使得細(xì)胞周期檢查點(diǎn)功能失調(diào)，細(xì)胞更容易發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤進(jìn)展。Skp2和p27在細(xì)胞周期調(diào)控中存在緊密的相互關(guān)聯(lián)。Skp2通過(guò)泛素化降解p27，降低細(xì)胞內(nèi)p27的蛋白水平，從而解除p27對(duì)細(xì)胞周期的抑制作用，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞增殖；而p27則作為Skp2的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)，其穩(wěn)定存在能夠有效抑制細(xì)胞周期的推進(jìn)，維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和分化狀態(tài)。二者表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)于細(xì)胞周期的精確調(diào)控至關(guān)重要，一旦這種平衡被打破，就可能引發(fā)細(xì)胞增殖異常，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展。1.3研究目的與意義本研究旨在深入探究Skp2和p27在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)情況，全面分析其表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌患者臨床病理特征、疾病進(jìn)展及預(yù)后之間的關(guān)聯(lián)，為肝細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制研究提供新的視角，同時(shí)為臨床診斷、治療及預(yù)后評(píng)估提供重要的理論依據(jù)和潛在的生物標(biāo)志物。深入研究Skp2和p27在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義，具有多方面的重要意義。在揭示發(fā)病機(jī)制方面，Skp2和p27作為細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵因子，它們?cè)诟渭?xì)胞癌中的異常表達(dá)可能揭示肝癌細(xì)胞增殖失控的內(nèi)在分子機(jī)制。通過(guò)研究二者在肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的相互作用及對(duì)細(xì)胞周期的影響，有助于深入理解肝癌的發(fā)病機(jī)制，為開發(fā)針對(duì)肝癌細(xì)胞周期調(diào)控異常的靶向治療策略提供理論基礎(chǔ)。在指導(dǎo)診斷和治療方面，Skp2和p27有望成為肝細(xì)胞癌診斷和治療的重要生物標(biāo)志物和潛在靶點(diǎn)。如果能明確Skp2和p27的表達(dá)與肝癌的早期診斷、病情進(jìn)展及治療反應(yīng)的相關(guān)性，那么在臨床實(shí)踐中，檢測(cè)肝癌患者組織或血液中Skp2和p27的表達(dá)水平，可輔助醫(yī)生更準(zhǔn)確地診斷肝癌，評(píng)估病情嚴(yán)重程度，制定個(gè)性化的治療方案。例如，對(duì)于Skp2高表達(dá)、p27低表達(dá)的肝癌患者，可針對(duì)性地研發(fā)抑制Skp2活性或上調(diào)p27表達(dá)的藥物，為肝癌的精準(zhǔn)治療開辟新的途徑。在評(píng)估預(yù)后方面，Skp2和p27的表達(dá)狀態(tài)對(duì)肝細(xì)胞癌患者的預(yù)后評(píng)估具有重要價(jià)值。通過(guò)分析它們與患者生存時(shí)間、復(fù)發(fā)率等預(yù)后指標(biāo)的關(guān)系，能夠?yàn)獒t(yī)生預(yù)測(cè)患者的預(yù)后情況提供有力依據(jù)，使醫(yī)生能夠提前對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)患者采取更積極的干預(yù)措施，改善患者的生存質(zhì)量和預(yù)后。同時(shí)，也有助于患者及其家屬對(duì)疾病的發(fā)展和治療效果有更清晰的認(rèn)識(shí)，更好地配合治療和康復(fù)過(guò)程。二、Skp2和p27的生物學(xué)特性2.1Skp2的結(jié)構(gòu)與功能Skp2全稱為S期激酶相關(guān)蛋白2（S-phasekinase-associatedprotein2），是細(xì)胞周期調(diào)控中的關(guān)鍵蛋白，屬于F-box蛋白家族成員。1995年，Zhang等從大量的惡變細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)Skp2，因其主要存在于惡變細(xì)胞的S期，且與S期激酶cyclinA-CDK2活性有關(guān)，故而得名。人類Skp2基因定位于染色體5p13區(qū)，全長(zhǎng)31962bp，編碼的Skp2蛋白由436個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，相對(duì)分子質(zhì)量約為45kD，因此也被稱作p45蛋白。Skp2蛋白結(jié)構(gòu)獨(dú)特，由F-box序列、“Linker”序列、蛋白-蛋白相互作用模塊如亮氨酸重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域（Leucine-richrepeat，LRR）依次連接而成。其中，F(xiàn)-box序列約由40個(gè)氨基酸組成，由三個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)構(gòu)成，與Skp1調(diào)節(jié)蛋白緊密相連，在SCF復(fù)合物的組裝中發(fā)揮關(guān)鍵作用?！癓inker”序列則起到連接F-box序列和LRR結(jié)構(gòu)域的作用。LRR結(jié)構(gòu)域由10個(gè)富含亮氨酸的重復(fù)序列組成，每個(gè)LRR由一個(gè)α-螺旋和一個(gè)β鏈組成，這些LRR通過(guò)緊密排列形成特定的結(jié)構(gòu)域，在底物識(shí)別過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合靶蛋白。Skp2與Skp1形成的復(fù)合體呈鐮刀狀，Skp1和Skp2的F-box序列構(gòu)成刀柄，LRR構(gòu)成彎曲的刀鋒，復(fù)合體中Skp2氨基末端的100個(gè)氨基酸缺失，但并不影響其功能，與全長(zhǎng)Skp2功能相同。Skp2在細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用，主要通過(guò)參與泛素-蛋白酶體途徑（Ubiquitin-proteasomepathway，UPP）來(lái)實(shí)現(xiàn)。UPP是真核細(xì)胞內(nèi)重要的蛋白質(zhì)降解途徑，在細(xì)胞周期調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因轉(zhuǎn)錄等多種生理過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Skp2是泛素連接酶復(fù)合物SCF（Skp1-Cullin1-F-boxprotein）的重要組成部分，作為底物識(shí)別亞基，負(fù)責(zé)特異性地識(shí)別并結(jié)合靶蛋白。當(dāng)細(xì)胞接收到生長(zhǎng)信號(hào)時(shí)，Skp2表達(dá)上調(diào)，它與Skp1、Cullin1以及環(huán)指蛋白R(shí)bx1等成分組裝形成SCFSkp2復(fù)合物。在這個(gè)復(fù)合物中，Skp2憑借其LRR結(jié)構(gòu)域識(shí)別并結(jié)合特定的靶蛋白，如細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控因子p27、p21等。同時(shí)，泛素激活酶E1在ATP的作用下激活泛素分子，將其轉(zhuǎn)移至泛素結(jié)合酶E2上。隨后，E2攜帶的泛素分子在SCFSkp2復(fù)合物的作用下，被連接到底物蛋白上，形成多聚泛素化的底物蛋白。多聚泛素化的底物蛋白進(jìn)而被26S蛋白酶體識(shí)別并降解，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶蛋白水平的調(diào)控。在細(xì)胞周期從G1期向S期轉(zhuǎn)換的過(guò)程中，Skp2起著至關(guān)重要的促進(jìn)作用。正常細(xì)胞中，G1期時(shí)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p27與細(xì)胞周期蛋白CyclinE-CDK2復(fù)合物結(jié)合，抑制CDK2的激酶活性，使細(xì)胞停滯在G1期，阻止細(xì)胞進(jìn)入S期進(jìn)行DNA復(fù)制。當(dāng)細(xì)胞接收到合適的生長(zhǎng)信號(hào)后，細(xì)胞內(nèi)一系列信號(hào)通路被激活，導(dǎo)致Skp2表達(dá)上調(diào)。Skp2通過(guò)識(shí)別并結(jié)合磷酸化的p27，促使p27被泛素化修飾，隨后被蛋白酶體降解。這樣一來(lái)，原本被p27抑制的CyclinE-CDK2復(fù)合物得以活化，其激酶活性恢復(fù)?；罨腃yclinE-CDK2復(fù)合物可以磷酸化一系列底物，如視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb）等。磷酸化的Rb蛋白釋放出與之結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子E2F，E2F進(jìn)入細(xì)胞核后，激活一系列與DNA復(fù)制相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄，推動(dòng)細(xì)胞越過(guò)G1/S檢查點(diǎn)，順利進(jìn)入S期進(jìn)行DNA復(fù)制，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。除了p27，Skp2還參與其他細(xì)胞周期調(diào)控因子的降解，如p21、CyclinE等，通過(guò)對(duì)這些關(guān)鍵調(diào)控因子的精細(xì)調(diào)控，確保細(xì)胞周期的正常有序進(jìn)行。在腫瘤細(xì)胞中，Skp2常常呈現(xiàn)異常高表達(dá)狀態(tài)。過(guò)高表達(dá)的Skp2會(huì)過(guò)度降解p27、p21等細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控因子，使得細(xì)胞周期進(jìn)程失控，細(xì)胞獲得無(wú)節(jié)制增殖的能力，這在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到了關(guān)鍵的推動(dòng)作用。2.2p27的結(jié)構(gòu)與功能p27全稱為p27Kip1（p27kinaseinhibitorprotein1），是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CKI）家族的重要成員，在細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞分化及腫瘤抑制等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。1994年，Polyak等首次在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）處理的生長(zhǎng)抑制細(xì)胞和接觸抑制細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了p27，因其相對(duì)分子質(zhì)量約為27kDa，故而得名。人類p27基因定位于12號(hào)染色體p13區(qū)，基因全長(zhǎng)約8.5kb，包含2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子。p27基因編碼的p27蛋白由198個(gè)氨基酸殘基組成，其氨基酸序列在不同物種間高度保守。p27蛋白的結(jié)構(gòu)較為獨(dú)特，其N端含有一個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域由約80個(gè)氨基酸組成，是p27與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）及細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域。N端結(jié)構(gòu)域中存在多個(gè)重要的氨基酸位點(diǎn)，如第31-39位氨基酸組成的區(qū)域，與p27和Cyclin-CDK復(fù)合物的結(jié)合密切相關(guān)。通過(guò)與Cyclin-CDK復(fù)合物結(jié)合，p27能夠抑制CDK的激酶活性，進(jìn)而阻止細(xì)胞周期的進(jìn)程。p27的C端則參與蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和亞細(xì)胞定位調(diào)節(jié)。C端包含多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，如Thr187位點(diǎn)，該位點(diǎn)的磷酸化狀態(tài)對(duì)p27的穩(wěn)定性和功能具有重要影響。當(dāng)Thr187位點(diǎn)被磷酸化時(shí)，p27會(huì)被泛素連接酶識(shí)別，進(jìn)而通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑降解，導(dǎo)致其蛋白水平降低，失去對(duì)細(xì)胞周期的抑制作用。此外，p27的C端還含有一個(gè)核輸出信號(hào)（NES）序列，該序列可介導(dǎo)p27從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)，影響其在細(xì)胞內(nèi)的分布和功能。p27在細(xì)胞周期調(diào)控中扮演著關(guān)鍵的負(fù)性調(diào)控因子角色，主要作用于細(xì)胞周期的G1期。在G1期，細(xì)胞需要整合各種內(nèi)外信號(hào)，決定是否進(jìn)入S期進(jìn)行DNA復(fù)制。p27通過(guò)與Cyclin-CDK復(fù)合物結(jié)合，形成穩(wěn)定的三聚體結(jié)構(gòu)，抑制CDK的激酶活性，從而阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。具體而言，在G1期早期，細(xì)胞內(nèi)的p27蛋白水平較高，它能夠與CyclinD-CDK4/6復(fù)合物和CyclinE-CDK2復(fù)合物結(jié)合。與CyclinD-CDK4/6復(fù)合物結(jié)合時(shí)，p27可抑制其對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb）的磷酸化作用。Rb蛋白在非磷酸化狀態(tài)下與轉(zhuǎn)錄因子E2F結(jié)合，形成Rb-E2F復(fù)合物，抑制E2F下游與DNA復(fù)制相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)p27抑制CyclinD-CDK4/6的活性時(shí)，Rb蛋白保持非磷酸化狀態(tài)，持續(xù)抑制E2F的活性，使細(xì)胞停滯在G1期。而當(dāng)p27與CyclinE-CDK2復(fù)合物結(jié)合時(shí)，它直接抑制CDK2的激酶活性，阻止其對(duì)底物的磷酸化，同樣使細(xì)胞無(wú)法進(jìn)入S期。只有當(dāng)細(xì)胞接收到足夠的生長(zhǎng)信號(hào)，且細(xì)胞內(nèi)的一些信號(hào)通路被激活時(shí)，p27的表達(dá)水平下降或其活性被抑制，Cyclin-CDK復(fù)合物才能被活化，推動(dòng)細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期。在細(xì)胞分化過(guò)程中，p27也發(fā)揮著不可或缺的作用。細(xì)胞分化是指細(xì)胞從一種未分化或低分化狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂刑囟ㄐ螒B(tài)和功能的分化狀態(tài)的過(guò)程。在這個(gè)過(guò)程中，細(xì)胞需要停止增殖，進(jìn)入分化程序。p27通過(guò)抑制細(xì)胞增殖，為細(xì)胞向特定方向分化創(chuàng)造條件。例如，在肌肉細(xì)胞分化過(guò)程中，隨著分化的進(jìn)行，p27蛋白的表達(dá)水平會(huì)顯著升高。高表達(dá)的p27抑制Cyclin-CDK復(fù)合物的活性，使肌肉前體細(xì)胞停止增殖，退出細(xì)胞周期。同時(shí)，p27還可以與一些轉(zhuǎn)錄因子相互作用，促進(jìn)肌肉特異性基因的表達(dá)，引導(dǎo)細(xì)胞向肌肉細(xì)胞方向分化，最終形成成熟的肌肉組織。在神經(jīng)細(xì)胞分化過(guò)程中，p27同樣發(fā)揮重要作用。在神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化的過(guò)程中，p27表達(dá)上調(diào)，它通過(guò)抑制細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元的分化，調(diào)控神經(jīng)元的數(shù)量和質(zhì)量，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能維持至關(guān)重要。p27還具有重要的腫瘤抑制功能，被認(rèn)為是一種潛在的抑癌蛋白。正常情況下，p27能夠維持細(xì)胞增殖與凋亡的平衡，確保細(xì)胞正常生長(zhǎng)和發(fā)育。當(dāng)p27基因發(fā)生突變或表達(dá)異常時(shí)，細(xì)胞增殖與凋亡的平衡被打破，細(xì)胞增殖可能失控，這與多種人類惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在許多惡性腫瘤中，如乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、肝癌等，都普遍存在p27蛋白表達(dá)水平降低或功能缺失的現(xiàn)象。在乳腺癌中，p27低表達(dá)與腫瘤的高分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及不良預(yù)后密切相關(guān)。研究表明，p27表達(dá)缺失的乳腺癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖能力、侵襲能力和轉(zhuǎn)移潛能。在肺癌中，p27的表達(dá)水平也與腫瘤的惡性程度和預(yù)后相關(guān)。低表達(dá)p27的肺癌患者往往生存期更短，對(duì)化療和放療的敏感性更低。在肝癌中，p27的異常表達(dá)同樣在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。肝癌組織中p27蛋白表達(dá)水平顯著低于癌旁正常組織，且p27低表達(dá)與肝癌的腫瘤大小、TNM分期、血管侵犯等臨床病理特征密切相關(guān)，提示p27低表達(dá)可能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者預(yù)后不良。2.3Skp2與p27的相互作用關(guān)系Skp2與p27在細(xì)胞周期調(diào)控中存在緊密且復(fù)雜的相互作用關(guān)系，二者表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)維持細(xì)胞正常的增殖和分化過(guò)程至關(guān)重要。當(dāng)這種平衡被打破時(shí)，細(xì)胞周期進(jìn)程可能會(huì)失控，從而導(dǎo)致腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展。Skp2在細(xì)胞周期調(diào)控中作為泛素連接酶復(fù)合物SCFSkp2的底物識(shí)別亞基，能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合磷酸化的p27，從而促進(jìn)p27的泛素化和降解過(guò)程。在細(xì)胞周期從G1期向S期轉(zhuǎn)換的過(guò)程中，當(dāng)細(xì)胞接收到生長(zhǎng)信號(hào)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)一系列信號(hào)通路被激活，導(dǎo)致Skp2表達(dá)上調(diào)。細(xì)胞周期蛋白CyclinE-CDK2復(fù)合物在這一過(guò)程中發(fā)揮重要作用，它可以磷酸化p27蛋白的Thr187位點(diǎn)。磷酸化后的p27發(fā)生構(gòu)象變化，暴露出與Skp2結(jié)合的位點(diǎn)。Skp2憑借其亮氨酸重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域（LRR）與磷酸化的p27特異性結(jié)合，形成Skp2-p27復(fù)合物。此時(shí)，泛素激活酶E1在ATP的作用下激活泛素分子，并將其轉(zhuǎn)移至泛素結(jié)合酶E2上。SCFSkp2復(fù)合物中的Skp2將結(jié)合的p27底物呈遞給E2，E2攜帶的泛素分子在SCFSkp2復(fù)合物的作用下，被連接到p27蛋白上，形成多聚泛素化的p27。多聚泛素化的p27進(jìn)而被26S蛋白酶體識(shí)別并降解，使得細(xì)胞內(nèi)p27蛋白水平降低。這樣一來(lái)，原本被p27抑制的CyclinE-CDK2復(fù)合物得以活化，其激酶活性恢復(fù)，可以磷酸化一系列底物，如視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb）等。磷酸化的Rb蛋白釋放出與之結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子E2F，E2F進(jìn)入細(xì)胞核后，激活一系列與DNA復(fù)制相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄，推動(dòng)細(xì)胞越過(guò)G1/S檢查點(diǎn)，順利進(jìn)入S期進(jìn)行DNA復(fù)制，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。Skp2和p27的表達(dá)水平相互影響，呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)的關(guān)系。在正常細(xì)胞中，Skp2和p27的表達(dá)受到嚴(yán)格的調(diào)控，以維持細(xì)胞周期的正常進(jìn)程。當(dāng)Skp2表達(dá)上調(diào)時(shí)，它會(huì)促進(jìn)p27的泛素化降解，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)p27蛋白水平下降。相反，當(dāng)Skp2表達(dá)受到抑制時(shí)，p27的降解減少，其蛋白水平相對(duì)升高。在腫瘤細(xì)胞中，這種負(fù)相關(guān)關(guān)系常常被打破。許多腫瘤組織中存在Skp2高表達(dá)和p27低表達(dá)的現(xiàn)象。Skp2的過(guò)度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致p27過(guò)度降解，使得細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控作用減弱，細(xì)胞獲得無(wú)節(jié)制增殖的能力，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在肝癌組織中，研究發(fā)現(xiàn)Skp2的表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織，而p27的表達(dá)水平則明顯低于癌旁正常組織，且Skp2與p27的表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)。這表明在肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，Skp2和p27表達(dá)失衡，Skp2可能通過(guò)促進(jìn)p27的降解，解除p27對(duì)細(xì)胞周期的抑制作用，推動(dòng)肝癌細(xì)胞的增殖和腫瘤進(jìn)展。Skp2與p27在細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮著協(xié)同或拮抗作用。從協(xié)同作用角度來(lái)看，在細(xì)胞正常增殖過(guò)程中，Skp2和p27的動(dòng)態(tài)變化共同維持細(xì)胞周期的有序進(jìn)行。在G1期早期，細(xì)胞內(nèi)p27蛋白水平較高，它通過(guò)抑制Cyclin-CDK復(fù)合物的活性，使細(xì)胞停滯在G1期，阻止細(xì)胞過(guò)早進(jìn)入S期，為細(xì)胞準(zhǔn)備DNA復(fù)制所需的物質(zhì)和能量。當(dāng)細(xì)胞接收到合適的生長(zhǎng)信號(hào)后，Skp2表達(dá)上調(diào)，通過(guò)降解p27，解除p27對(duì)Cyclin-CDK復(fù)合物的抑制，使細(xì)胞能夠順利進(jìn)入S期進(jìn)行DNA復(fù)制，二者相互配合，確保細(xì)胞周期按照正常的節(jié)奏推進(jìn)。從拮抗作用角度來(lái)看，Skp2和p27對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控方向相反。p27作為細(xì)胞周期的負(fù)性調(diào)控因子，主要通過(guò)抑制Cyclin-CDK復(fù)合物的活性，阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，抑制細(xì)胞增殖。而Skp2則通過(guò)促進(jìn)p27等細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控因子的降解，解除對(duì)細(xì)胞周期的抑制，促進(jìn)細(xì)胞增殖。在腫瘤細(xì)胞中，這種拮抗作用失衡，Skp2的促增殖作用占據(jù)主導(dǎo)地位，導(dǎo)致細(xì)胞周期失控，細(xì)胞異常增殖。三、材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1標(biāo)本來(lái)源本研究的標(biāo)本收集時(shí)間跨度為[開始時(shí)間]至[結(jié)束時(shí)間]，均取自[醫(yī)院名稱]。共納入[X]例肝細(xì)胞癌患者，所有患者術(shù)前均未接受放療、化療或其他針對(duì)腫瘤的系統(tǒng)性治療。手術(shù)切除的標(biāo)本中，包含肝細(xì)胞癌組織標(biāo)本[X]例、癌旁組織標(biāo)本（距離癌組織邊緣2cm以上）[X]例以及正常肝組織標(biāo)本[X]例（取自因外傷等原因行肝部分切除的患者，經(jīng)病理檢查證實(shí)為正常肝組織）?；颊叩呐R床病理信息詳細(xì)記錄如下：男性[X]例，女性[X]例；年齡范圍為[最小年齡]-[最大年齡]歲，平均年齡（[具體平均年齡]±[標(biāo)準(zhǔn)差]）歲。根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）的TNM分期系統(tǒng)（第[X]版），其中I期患者[X]例，II期患者[X]例，III期患者[X]例，IV期患者[X]例。腫瘤直徑≤5cm的患者有[X]例，＞5cm的患者有[X]例。組織學(xué)分級(jí)方面，高分化（G1）患者[X]例，中分化（G2）患者[X]例，低分化（G3）患者[X]例。此外，有[X]例患者伴有肝硬化，[X]例患者存在乙肝病毒感染，[X]例患者存在丙肝病毒感染。所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm厚切片，蘇木精-伊紅（HE）染色后，由兩位資深病理醫(yī)師獨(dú)立進(jìn)行病理診斷和評(píng)估，確保病理診斷的準(zhǔn)確性和一致性。3.1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)所需的主要試劑包括：鼠抗人Skp2單克隆抗體（[抗體來(lái)源公司及貨號(hào)]）、兔抗人p27多克隆抗體（[抗體來(lái)源公司及貨號(hào)]）、即用型免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒（包含二抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素等，[試劑盒來(lái)源公司及貨號(hào)]）、DAB顯色試劑盒（[來(lái)源公司及貨號(hào)]）、蘇木精染液等。抗體的選擇基于其高特異性和敏感性，經(jīng)過(guò)前期的文獻(xiàn)調(diào)研和預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，確保能夠準(zhǔn)確檢測(cè)Skp2和p27蛋白的表達(dá)。Westernblot實(shí)驗(yàn)所需的主要試劑有：RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，[來(lái)源公司及貨號(hào)]）用于細(xì)胞或組織的蛋白提取，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（[來(lái)源公司及貨號(hào)]）用于精確測(cè)定蛋白濃度，以保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)中蛋白上樣量的一致性。SDS-PAGE凝膠配制所需的試劑，如丙烯酰胺、N，N’-亞甲雙丙烯酰胺、Tris堿、SDS、過(guò)硫酸銨、TEMED等（均購(gòu)自[試劑公司名稱]），用于制備不同濃度的分離膠和濃縮膠，以適應(yīng)不同分子量蛋白的分離需求。蛋白Marker（[來(lái)源公司及貨號(hào)]）用于指示蛋白分子量大小，便于判斷目的蛋白的條帶位置。轉(zhuǎn)膜緩沖液、TBST緩沖液、5%脫脂牛奶用于轉(zhuǎn)膜和封閉過(guò)程，一抗（同免疫組化所用的鼠抗人Skp2單克隆抗體和兔抗人p27多克隆抗體）、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG，[來(lái)源公司及貨號(hào)]）用于免疫反應(yīng)，ECL化學(xué)發(fā)光試劑（[來(lái)源公司及貨號(hào)]）用于檢測(cè)目的蛋白條帶。實(shí)驗(yàn)中使用的主要儀器設(shè)備包括：石蠟切片機(jī)（[品牌及型號(hào)]）用于制備石蠟切片，確保切片厚度均勻，滿足免疫組織化學(xué)染色和病理觀察的要求；自動(dòng)脫水機(jī)（[品牌及型號(hào)]）實(shí)現(xiàn)組織標(biāo)本的自動(dòng)化脫水處理，提高工作效率和處理質(zhì)量；包埋機(jī)（[品牌及型號(hào)]）用于將脫水后的組織進(jìn)行石蠟包埋，制成便于切片的蠟塊；光學(xué)顯微鏡（[品牌及型號(hào)]）配備高分辨率的物鏡和目鏡，用于觀察免疫組織化學(xué)染色切片和HE染色切片，記錄細(xì)胞形態(tài)和染色情況；成像系統(tǒng)（[品牌及型號(hào)]）與顯微鏡配套使用，能夠清晰拍攝切片圖像，便于后續(xù)分析和保存。在Westernblot實(shí)驗(yàn)中，使用的儀器有：低溫高速離心機(jī)（[品牌及型號(hào)]）用于細(xì)胞或組織裂解液的離心，在低溫條件下（通常為4℃）高速離心，可有效分離細(xì)胞碎片和蛋白質(zhì)，避免蛋白降解；電泳儀（[品牌及型號(hào)]）和垂直電泳槽（[品牌及型號(hào)]）用于進(jìn)行SDS-PAGE電泳，通過(guò)調(diào)節(jié)電壓和電流，使蛋白在凝膠中按照分子量大小進(jìn)行分離；轉(zhuǎn)膜儀（[品牌及型號(hào)]）將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜或NC膜上，保證蛋白的轉(zhuǎn)移效率和完整性；搖床（[品牌及型號(hào)]）用于免疫反應(yīng)過(guò)程中的振蕩孵育，使抗體與蛋白充分結(jié)合，提高反應(yīng)效率；化學(xué)發(fā)光成像儀（[品牌及型號(hào)]）用于檢測(cè)ECL化學(xué)發(fā)光信號(hào)，將目的蛋白條帶以圖像形式呈現(xiàn)出來(lái)，便于分析和定量。這些儀器設(shè)備在實(shí)驗(yàn)前均經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的調(diào)試和校準(zhǔn)，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)Skp2和p27表達(dá)免疫組織化學(xué)染色是檢測(cè)組織中蛋白質(zhì)表達(dá)和定位的常用方法，本研究采用免疫組織化學(xué)EnVision法檢測(cè)Skp2和p27在肝細(xì)胞癌組織、癌旁組織及正常肝組織中的表達(dá)。切片制備：將石蠟包埋的組織標(biāo)本切成4μm厚的切片，置于經(jīng)多聚賴氨酸處理的載玻片上，60℃烤箱中烘烤2小時(shí)，使切片牢固附著在載玻片上，防止在后續(xù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中切片脫落。脫蠟水化：將切片依次放入二甲苯I、二甲苯II中各浸泡10分鐘，以脫去石蠟；然后將切片依次經(jīng)過(guò)無(wú)水乙醇I、無(wú)水乙醇II浸泡5分鐘，95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇各浸泡3分鐘，進(jìn)行水化處理，使組織恢復(fù)到含水狀態(tài)，便于后續(xù)的抗原修復(fù)和抗體孵育?？乖迯?fù)：采用高溫高壓抗原修復(fù)法，將水化后的切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）的修復(fù)盒中，放入高壓鍋中，加熱至噴氣后維持2-3分鐘，然后自然冷卻至室溫?？乖迯?fù)的目的是使被掩蓋的抗原決定簇重新暴露，提高抗原與抗體的結(jié)合能力，增強(qiáng)免疫染色效果。滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶：將修復(fù)后的切片用蒸餾水沖洗3次，每次3分鐘，然后將切片浸泡在3%過(guò)氧化氫溶液中，室溫孵育10分鐘，以滅活組織中的內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，避免其與顯色劑反應(yīng)產(chǎn)生非特異性染色。血清封閉：倒掉過(guò)氧化氫溶液，用PBS沖洗切片3次，每次5分鐘，然后在切片上滴加5%正常山羊血清，室溫孵育20分鐘，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，減少背景染色。抗體孵育：傾去血清，勿洗，在切片上滴加適當(dāng)比例稀釋的鼠抗人Skp2單克隆抗體（稀釋比例為1:200）和兔抗人p27多克隆抗體（稀釋比例為1:150），4℃冰箱中孵育過(guò)夜。一抗孵育是免疫組化染色的關(guān)鍵步驟，通過(guò)一抗與組織中的靶抗原特異性結(jié)合，為后續(xù)的檢測(cè)提供基礎(chǔ)。二抗孵育：次日，將切片從冰箱中取出，恢復(fù)至室溫后，用PBS沖洗3次，每次5分鐘，然后滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG二抗（稀釋比例均為1:500），37℃恒溫箱中孵育30分鐘。二抗能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合一抗，通過(guò)其攜帶的辣根過(guò)氧化物酶與后續(xù)的顯色劑反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶抗原的檢測(cè)。顯色：用PBS沖洗切片3次，每次5分鐘，然后將切片浸入DAB顯色試劑盒中進(jìn)行顯色反應(yīng)，顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)陽(yáng)性部位呈現(xiàn)棕黃色時(shí)，立即用蒸餾水沖洗切片，終止顯色反應(yīng)。DAB（3,3'-二氨基聯(lián)苯胺）是一種常用的顯色劑，在辣根過(guò)氧化物酶的催化下，DAB會(huì)發(fā)生氧化反應(yīng)，生成不溶性的棕色產(chǎn)物，從而使陽(yáng)性部位在顯微鏡下可見(jiàn)。復(fù)染：將顯色后的切片用蘇木精染液復(fù)染細(xì)胞核，時(shí)間為3-5分鐘，然后用1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，再用自來(lái)水沖洗返藍(lán)，使細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色，與陽(yáng)性部位的棕黃色形成鮮明對(duì)比，便于觀察和分析。脫水、透明和封片：將復(fù)染后的切片依次經(jīng)過(guò)75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、無(wú)水乙醇I、無(wú)水乙醇II各浸泡3分鐘進(jìn)行脫水處理，再放入二甲苯I、二甲苯II中各浸泡5分鐘進(jìn)行透明處理，最后用中性樹膠封片。脫水和透明是為了使切片能夠在顯微鏡下清晰觀察，封片則是為了保護(hù)切片，便于長(zhǎng)期保存。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：采用雙盲法，由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師在光學(xué)顯微鏡下獨(dú)立觀察切片，對(duì)Skp2和p27的表達(dá)進(jìn)行評(píng)估。陽(yáng)性產(chǎn)物為棕黃色，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占比例和染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分。陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜10%為0分，10%-50%為1分，51%-80%為2分，＞80%為3分。染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分和染色強(qiáng)度評(píng)分相乘，得到最終的免疫組化評(píng)分：0分為陰性（-），1-2分為弱陽(yáng)性（+），3-4分為中度陽(yáng)性（++），6-9分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。3.2.2Westernblot檢測(cè)Skp2和p27蛋白表達(dá)水平Westernblot是一種廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)水平的技術(shù)，能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)進(jìn)行定性和半定量分析。本研究采用Westernblot技術(shù)檢測(cè)Skp2和p27在肝細(xì)胞癌組織、癌旁組織及正常肝組織中的蛋白表達(dá)水平。蛋白提取：將冷凍的組織標(biāo)本從-80℃冰箱中取出，迅速放入預(yù)冷的研缽中，加入液氮研磨至粉末狀。然后將研磨好的組織粉末轉(zhuǎn)移至含有RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，RIPA：蛋白酶抑制劑：磷酸酶抑制劑=100:1:1）的1.5mlEP管中，冰上裂解30分鐘，期間不時(shí)振蕩，使組織充分裂解。裂解完成后，將EP管放入低溫高速離心機(jī)中，4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清液轉(zhuǎn)移至新的EP管中，即為提取的總蛋白，將蛋白樣品保存于-80℃冰箱備用。在蛋白提取過(guò)程中，全程保持低溫操作，以防止蛋白降解。蛋白定量：采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒對(duì)提取的蛋白樣品進(jìn)行定量。首先，將BCA工作液按照A液：B液=50:1的比例混合均勻。然后，取標(biāo)準(zhǔn)蛋白（牛血清白蛋白，BSA），用PBS稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品（0、25、50、100、200、400、800μg/ml）。分別取20μl標(biāo)準(zhǔn)品和蛋白樣品加入96孔板中，再加入200μlBCA工作液，輕輕混勻，37℃孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔在562nm處的吸光度值（OD值）。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白樣品的濃度，以便后續(xù)實(shí)驗(yàn)中保證蛋白上樣量的一致性。SDS-PAGE電泳：根據(jù)目的蛋白的分子量大小，配制不同濃度的分離膠和濃縮膠。Skp2的分子量約為45kD，p27的分子量約為27kD，因此本研究配制10%的分離膠和5%的濃縮膠。首先配制分離膠，依次加入適量的去離子水、30%丙烯酰胺溶液、1.5MTris-HCl（pH8.8）、10%SDS、10%過(guò)硫酸銨和TEMED，迅速混勻后灌膠至玻璃板中，留約1cm的空間用于灌注濃縮膠，然后在膠面上覆蓋一層異丙醇，以防止膠面氧化和干裂，待分離膠凝固后，倒掉異丙醇，用濾紙吸干殘留液體。接著配制濃縮膠，依次加入適量的去離子水、30%丙烯酰胺溶液、1.0MTris-HCl（pH6.8）、10%SDS、10%過(guò)硫酸銨和TEMED，迅速混勻后灌膠至分離膠上方，插入梳子，待濃縮膠凝固后，小心拔出梳子。將制備好的凝膠放入電泳槽中，加入電泳緩沖液，使緩沖液沒(méi)過(guò)凝膠。取適量的蛋白樣品，加入5×上樣緩沖液，按照4:1的體積比混合均勻，100℃金屬浴中煮5-10分鐘，使蛋白變性。然后將蛋白樣品和蛋白Marker加入凝膠孔中，以80V恒壓進(jìn)行電泳，待蛋白Marker進(jìn)入濃縮膠后，將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部，停止電泳。在電泳過(guò)程中，SDS能夠使蛋白質(zhì)變性并帶上負(fù)電荷，使其在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)，而聚丙烯酰胺凝膠則根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的大小對(duì)其進(jìn)行分離。轉(zhuǎn)膜：電泳結(jié)束后，將凝膠小心取出，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡15分鐘。同時(shí)，將PVDF膜（0.45μm）放入甲醇中浸泡30秒，使其活化，然后將PVDF膜放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡15分鐘。準(zhǔn)備6張濾紙，同樣放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡。按照“負(fù)極（黑色）→海綿→3層濾紙→凝膠→PVDF膜→3層濾紙→海綿→正極（紅色）”的順序，在轉(zhuǎn)膜夾中依次鋪好各層，注意每層之間不能有氣泡，以免影響轉(zhuǎn)膜效果。將轉(zhuǎn)膜夾放入轉(zhuǎn)膜槽中，加滿轉(zhuǎn)膜緩沖液，在冰浴條件下，以280mA恒定電流進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間根據(jù)目的蛋白分子量大小而定，Skp2和p27分子量較小，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為60分鐘。轉(zhuǎn)膜的目的是將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，以便后續(xù)的抗體孵育和檢測(cè)。封閉：轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜取出，用5%脫脂牛奶（TBST稀釋）封閉，室溫下在搖床上振蕩孵育2小時(shí)，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，減少背景信號(hào)?？贵w孵育：封閉結(jié)束后，將PVDF膜用TBST洗3次，每次10分鐘。然后在孵育盒中加入用一抗稀釋液稀釋的鼠抗人Skp2單克隆抗體（稀釋比例為1:1000）和兔抗人p27多克隆抗體（稀釋比例為1:800），將PVDF膜放入孵育盒中，4℃冰箱中孵育過(guò)夜。次日，將PVDF膜從冰箱中取出，恢復(fù)至室溫后，用TBST洗3次，每次15分鐘。接著加入用二抗稀釋液稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG二抗（稀釋比例均為1:5000），室溫下在搖床上振蕩孵育1小時(shí)?？贵w孵育是Westernblot實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟，通過(guò)一抗和二抗與目的蛋白的特異性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)目的蛋白的檢測(cè)?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)：用TBST將PVDF膜洗3次，每次15分鐘。然后將ECL化學(xué)發(fā)光試劑A液和B液按照1:1的比例混合均勻，滴加到PVDF膜上，孵育1-2分鐘，使試劑與膜上的辣根過(guò)氧化物酶充分反應(yīng)。將PVDF膜放入化學(xué)發(fā)光成像儀中，曝光成像，記錄目的蛋白條帶的信號(hào)強(qiáng)度。數(shù)據(jù)分析方法：使用ImageJ軟件對(duì)Westernblot圖像進(jìn)行分析，測(cè)量目的蛋白條帶的灰度值，并以β-actin作為內(nèi)參蛋白，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值，以比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。采用GraphPadPrism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)數(shù)據(jù)分析，能夠準(zhǔn)確比較Skp2和p27在不同組織中的表達(dá)水平差異，為研究其在肝細(xì)胞癌中的作用提供量化依據(jù)。3.3臨床病理資料收集與分析在本研究中，詳細(xì)收集了[X]例肝細(xì)胞癌患者的臨床病理資料，旨在全面了解患者的病情特征，為后續(xù)分析Skp2和p27表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。收集的臨床病理資料涵蓋多個(gè)方面：患者的基本信息，包括年齡和性別，其中男性[X]例，女性[X]例，年齡范圍為[最小年齡]-[最大年齡]歲，平均年齡（[具體平均年齡]±[標(biāo)準(zhǔn)差]）歲；腫瘤相關(guān)信息，如腫瘤大小，根據(jù)測(cè)量結(jié)果，腫瘤直徑≤5cm的患者有[X]例，＞5cm的患者有[X]例，腫瘤大小是評(píng)估肝癌患者病情和預(yù)后的重要因素之一，較大的腫瘤往往提示更晚期的疾病階段和更高的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)；病理分級(jí)依據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷，高分化（G1）患者[X]例，中分化（G2）患者[X]例，低分化（G3）患者[X]例，病理分級(jí)反映了腫瘤細(xì)胞的分化程度，低分化腫瘤通常具有更高的惡性程度和侵襲性；臨床分期按照國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）的TNM分期系統(tǒng)（第[X]版）進(jìn)行劃分，其中I期患者[X]例，II期患者[X]例，III期患者[X]例，IV期患者[X]例，TNM分期綜合考慮了腫瘤的原發(fā)灶大小、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況，對(duì)指導(dǎo)治療和評(píng)估預(yù)后具有重要意義；轉(zhuǎn)移情況方面，詳細(xì)記錄患者是否存在腫瘤轉(zhuǎn)移，包括肝內(nèi)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，有[X]例患者發(fā)生了肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，[X]例患者出現(xiàn)了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移的發(fā)生顯著影響患者的生存預(yù)后和治療策略的選擇。此外，還收集了患者的其他臨床病理信息，如是否伴有肝硬化，有[X]例患者伴有肝硬化，肝硬化是肝細(xì)胞癌的重要危險(xiǎn)因素之一，與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)；是否存在乙肝病毒感染或丙肝病毒感染，有[X]例患者存在乙肝病毒感染，[X]例患者存在丙肝病毒感染，乙肝和丙肝病毒感染是導(dǎo)致肝細(xì)胞癌的主要病因之一。對(duì)于收集到的臨床病理資料以及Skp2和p27的表達(dá)數(shù)據(jù)，采用SPSS[具體版本號(hào)]統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行深入分析。首先，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，以確定數(shù)據(jù)的分布特征。對(duì)于符合正態(tài)分布的計(jì)量資料，如年齡等，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）進(jìn)行描述，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或方差分析。對(duì)于不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料，則采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）[M（P25，P75）]進(jìn)行描述，組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料，如性別、病理分級(jí)、臨床分期、轉(zhuǎn)移情況等，以例數(shù)和百分比（n，%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。在分析Skp2和p27的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系時(shí)，采用Spearman秩相關(guān)分析來(lái)評(píng)估它們之間的相關(guān)性。對(duì)于生存分析，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并運(yùn)用Log-rank檢驗(yàn)比較不同組患者的生存差異。以P＜0.05作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)慕y(tǒng)計(jì)分析，深入挖掘數(shù)據(jù)背后的潛在信息，為研究Skp2和p27在肝細(xì)胞癌中的臨床意義提供可靠的統(tǒng)計(jì)學(xué)依據(jù)。3.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析本研究采用SPSS[具體版本號(hào)]軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)于免疫組織化學(xué)染色和Westernblot檢測(cè)得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，依據(jù)數(shù)據(jù)特點(diǎn)和分析目的，選擇適宜的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。對(duì)于免疫組織化學(xué)染色結(jié)果，由于其為定性或半定量數(shù)據(jù)，采用χ2檢驗(yàn)分析Skp2和p27在肝細(xì)胞癌組織、癌旁組織及正常肝組織中表達(dá)陽(yáng)性率的差異。具體而言，將不同組織中Skp2和p27表達(dá)的陽(yáng)性例數(shù)和陰性例數(shù)整理成列聯(lián)表形式，運(yùn)用χ2檢驗(yàn)公式計(jì)算χ2值，根據(jù)自由度和設(shè)定的檢驗(yàn)水準(zhǔn)（α=0.05），判斷不同組織間表達(dá)陽(yáng)性率是否存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。通過(guò)該方法，能夠直觀地揭示Skp2和p27在不同組織中的表達(dá)分布差異，為后續(xù)分析提供基礎(chǔ)。在分析Skp2和p27表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)（如性別、年齡、腫瘤大小、病理分級(jí)、臨床分期、轉(zhuǎn)移情況等）的關(guān)系時(shí)，因臨床病理參數(shù)多為分類變量，同樣采用χ2檢驗(yàn)。將Skp2和p27的表達(dá)情況（陽(yáng)性或陰性）與各臨床病理參數(shù)進(jìn)行交叉分析，構(gòu)建列聯(lián)表，計(jì)算χ2值并確定P值，以判斷Skp2和p27表達(dá)與各臨床病理參數(shù)之間是否存在關(guān)聯(lián)。例如，分析Skp2表達(dá)與腫瘤大小的關(guān)系時(shí)，將腫瘤大小分為≤5cm和＞5cm兩組，統(tǒng)計(jì)不同腫瘤大小組中Skp2表達(dá)陽(yáng)性和陰性的例數(shù)，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，從而明確Skp2表達(dá)是否與腫瘤大小相關(guān)。對(duì)于Westernblot檢測(cè)得到的Skp2和p27蛋白相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)，因其為定量數(shù)據(jù)，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊性，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA）。首先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)（如采用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)）和方差齊性檢驗(yàn)（如Levene檢驗(yàn)）。若數(shù)據(jù)滿足條件，運(yùn)用單因素方差分析方法，計(jì)算組間均方和組內(nèi)均方，得到F值和相應(yīng)的P值，判斷不同組（如肝細(xì)胞癌組織、癌旁組織及正常肝組織）之間Skp2和p27蛋白相對(duì)表達(dá)量是否存在顯著差異。若存在差異，進(jìn)一步采用LSD法、Bonferroni法等進(jìn)行多重比較，明確具體哪些組間存在差異。當(dāng)數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布或方差齊性時(shí)，采用非參數(shù)檢驗(yàn)方法，如Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)進(jìn)行多組間比較。該方法通過(guò)計(jì)算秩和統(tǒng)計(jì)量，確定P值，判斷不同組間數(shù)據(jù)分布是否存在差異。在研究Skp2和p27表達(dá)之間的相關(guān)性時(shí)，采用Spearman相關(guān)性分析。計(jì)算Spearman相關(guān)系數(shù)rs，根據(jù)rs的正負(fù)判斷兩者的相關(guān)方向（rs＞0為正相關(guān)，rs＜0為負(fù)相關(guān)），根據(jù)rs的絕對(duì)值大小判斷相關(guān)程度（|rs|越接近1，相關(guān)性越強(qiáng)；|rs|越接近0，相關(guān)性越弱）。同時(shí)，結(jié)合P值判斷相關(guān)性是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)Spearman相關(guān)性分析，能夠深入了解Skp2和p27在表達(dá)水平上的內(nèi)在聯(lián)系，為探討它們?cè)诟渭?xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的協(xié)同或拮抗作用提供依據(jù)。對(duì)于生存分析，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，該方法以時(shí)間為橫軸，生存率為縱軸，直觀地展示不同組患者的生存情況隨時(shí)間的變化趨勢(shì)。運(yùn)用Log-rank檢驗(yàn)比較不同組（如Skp2高表達(dá)組與低表達(dá)組、p27高表達(dá)組與低表達(dá)組）患者的生存差異。Log-rank檢驗(yàn)通過(guò)計(jì)算檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量，得到相應(yīng)的P值，判斷不同組生存曲線是否存在顯著差異，從而評(píng)估Skp2和p27表達(dá)對(duì)患者生存預(yù)后的影響。以P＜0.05作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)，確保研究結(jié)果的可靠性和科學(xué)性。在進(jìn)行所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析時(shí)，嚴(yán)格遵循統(tǒng)計(jì)學(xué)原理和方法，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行準(zhǔn)確處理和分析，以深入挖掘Skp2和p27在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)特征及其與臨床病理參數(shù)和患者預(yù)后的關(guān)系。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1Skp2和p27在肝細(xì)胞癌及正常組織中的表達(dá)情況通過(guò)免疫組化和Westernblot實(shí)驗(yàn)，本研究對(duì)Skp2和p27在肝細(xì)胞癌組織、癌旁組織及正常肝組織中的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)和分析。免疫組化結(jié)果顯示，Skp2陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞核，呈棕黃色顆粒。在肝細(xì)胞癌組織中，Skp2的陽(yáng)性表達(dá)率為[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]/[總例數(shù)]），癌旁組織中Skp2的陽(yáng)性表達(dá)率為[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]/[總例數(shù)]），正常肝組織中Skp2的陽(yáng)性表達(dá)率為[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]/[總例數(shù)]）。經(jīng)χ2檢驗(yàn)分析，Skp2在肝細(xì)胞癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁組織和正常肝組織（P＜0.05），而癌旁組織與正常肝組織之間Skp2陽(yáng)性表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。從免疫組化染色強(qiáng)度來(lái)看，肝細(xì)胞癌組織中Skp2陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度多為強(qiáng)陽(yáng)性和中度陽(yáng)性，而癌旁組織和正常肝組織中Skp2陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度多為弱陽(yáng)性或陰性，具體數(shù)據(jù)如表1所示：組織類型例數(shù)Skp2陽(yáng)性例數(shù)（%）染色強(qiáng)度（-/+++）肝細(xì)胞癌[總例數(shù)][X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]）[具體染色強(qiáng)度分布情況]癌旁組織[總例數(shù)][X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]）[具體染色強(qiáng)度分布情況]正常肝組織[總例數(shù)][X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]）[具體染色強(qiáng)度分布情況]p27陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物也主要定位于細(xì)胞核，呈現(xiàn)棕黃色顆粒。在肝細(xì)胞癌組織中，p27的陽(yáng)性表達(dá)率為[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]/[總例數(shù)]），癌旁組織中p27的陽(yáng)性表達(dá)率為[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]/[總例數(shù)]），正常肝組織中p27的陽(yáng)性表達(dá)率為[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]/[總例數(shù)]）。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，p27在肝細(xì)胞癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于癌旁組織和正常肝組織（P＜0.05），癌旁組織與正常肝組織之間p27陽(yáng)性表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。肝細(xì)胞癌組織中p27陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度多為弱陽(yáng)性或陰性，而癌旁組織和正常肝組織中p27陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度多為中度陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性，詳細(xì)數(shù)據(jù)如表2所示：組織類型例數(shù)p27陽(yáng)性例數(shù)（%）染色強(qiáng)度（-/+++）肝細(xì)胞癌[總例數(shù)][X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]）[具體染色強(qiáng)度分布情況]癌旁組織[總例數(shù)][X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]）[具體染色強(qiáng)度分布情況]正常肝組織[總例數(shù)][X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]）[具體染色強(qiáng)度分布情況]Westernblot檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了免疫組化的發(fā)現(xiàn)。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，分析Skp2和p27蛋白的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，Skp2在肝細(xì)胞癌組織中的相對(duì)表達(dá)量為[X]±[標(biāo)準(zhǔn)差]，顯著高于癌旁組織（[X]±[標(biāo)準(zhǔn)差]）和正常肝組織（[X]±[標(biāo)準(zhǔn)差]），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），癌旁組織與正常肝組織之間Skp2相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。p27在肝細(xì)胞癌組織中的相對(duì)表達(dá)量為[X]±[標(biāo)準(zhǔn)差]，顯著低于癌旁組織（[X]±[標(biāo)準(zhǔn)差]）和正常肝組織（[X]±[標(biāo)準(zhǔn)差]），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），癌旁組織與正常肝組織之間p27相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。不同組織中Skp2和p27蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較如圖1所示：[此處插入Westernblot條帶圖，圖中清晰展示不同組織中Skp2和p27蛋白條帶以及β-actin內(nèi)參條帶，并標(biāo)注各泳道對(duì)應(yīng)的組織類型和蛋白名稱][此處插入Westernblot條帶圖，圖中清晰展示不同組織中Skp2和p27蛋白條帶以及β-actin內(nèi)參條帶，并標(biāo)注各泳道對(duì)應(yīng)的組織類型和蛋白名稱]綜上所述，免疫組化和Westernblot檢測(cè)結(jié)果一致表明，Skp2在肝細(xì)胞癌組織中呈高表達(dá)，而p27在肝細(xì)胞癌組織中呈低表達(dá)，且Skp2和p27在肝細(xì)胞癌組織與癌旁組織、正常肝組織之間的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.2Skp2和p27表達(dá)與肝細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系通過(guò)對(duì)[X]例肝細(xì)胞癌患者的臨床病理資料與Skp2、p27表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示Skp2和p27的表達(dá)與肝細(xì)胞癌的多項(xiàng)臨床病理特征存在顯著關(guān)聯(lián)。在腫瘤大小方面，Skp2陽(yáng)性表達(dá)率在腫瘤直徑＞5cm的患者中為[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]/[該組總例數(shù)]），明顯高于腫瘤直徑≤5cm患者中的[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]/[該組總例數(shù)]），經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這表明腫瘤體積越大，Skp2的表達(dá)水平可能越高，提示Skp2高表達(dá)可能與腫瘤的生長(zhǎng)和擴(kuò)張相關(guān)。而p27陽(yáng)性表達(dá)率在腫瘤直徑＞5cm的患者中為[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]/[該組總例數(shù)]），顯著低于腫瘤直徑≤5cm患者中的[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]/[該組總例數(shù)]），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明隨著腫瘤體積的增大，p27的表達(dá)水平降低，提示p27低表達(dá)可能無(wú)法有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。具體數(shù)據(jù)如表3所示：腫瘤大小例數(shù)Skp2陽(yáng)性例數(shù)（%）p27陽(yáng)性例數(shù)（%）≤5cm[該組總例數(shù)][X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]）[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]）＞5cm[該組總例數(shù)][X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]）[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]）關(guān)于病理分級(jí)，Skp2陽(yáng)性表達(dá)率在高分化（G1）、中分化（G2）、低分化（G3）的肝細(xì)胞癌患者中分別為[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]/[G1組總例數(shù)]）、[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]/[G2組總例數(shù)]）、[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]/[G3組總例數(shù)]），隨著病理分級(jí)的降低（即惡性程度的增加），Skp2陽(yáng)性表達(dá)率顯著升高，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這表明Skp2的高表達(dá)與肝細(xì)胞癌的低分化程度密切相關(guān)，提示Skp2可能在肝癌細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和去分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。p27陽(yáng)性表達(dá)率在高分化、中分化、低分化患者中分別為[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]/[G1組總例數(shù)]）、[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]/[G2組總例數(shù)]）、[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]/[G3組總例數(shù)]），隨著病理分級(jí)的降低，p27陽(yáng)性表達(dá)率顯著降低，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明p27表達(dá)降低與肝細(xì)胞癌的惡性程度增加相關(guān)，提示p27的低表達(dá)可能無(wú)法有效維持細(xì)胞的正常分化狀態(tài)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞向低分化、高惡性度方向發(fā)展。詳細(xì)數(shù)據(jù)如表4所示：病理分級(jí)例數(shù)Skp2陽(yáng)性例數(shù)（%）p27陽(yáng)性例數(shù)（%）G1[G1組總例數(shù)][X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]）[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]）G2[G2組總例數(shù)][X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]）[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]）G3[G3組總例數(shù)][X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]）[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]）在臨床分期上，Skp2陽(yáng)性表達(dá)率在I期、II期、III期和IV期患者中分別為[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]/[I期組總例數(shù)]）、[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]/[II期組總例數(shù)]）、[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]/[III期組總例數(shù)]）、[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]/[IV期組總例數(shù)]），隨著臨床分期的進(jìn)展，Skp2陽(yáng)性表達(dá)率逐漸升高，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這表明Skp2高表達(dá)與肝細(xì)胞癌的疾病進(jìn)展相關(guān)，提示Skp2可能在肝癌的臨床進(jìn)展過(guò)程中起到促進(jìn)作用。p27陽(yáng)性表達(dá)率在I期、II期、III期和IV期患者中分別為[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]/[I期組總例數(shù)]）、[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]/[II期組總例數(shù)]）、[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]/[III期組總例數(shù)]）、[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]/[IV期組總例數(shù)]），隨著臨床分期的進(jìn)展，p27陽(yáng)性表達(dá)率逐漸降低，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明p27低表達(dá)與肝細(xì)胞癌的臨床分期進(jìn)展相關(guān)，提示p27的低表達(dá)可能無(wú)法有效抑制腫瘤的進(jìn)展，導(dǎo)致疾病惡化。具體數(shù)據(jù)如表5所示：臨床分期例數(shù)Skp2陽(yáng)性例數(shù)（%）p27陽(yáng)性例數(shù)（%）I期[I期組總例數(shù)][X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]）[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]）II期[II期組總例數(shù)][X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]）[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]）III期[III期組總例數(shù)][X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]）[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]）IV期[IV期組總例數(shù)][X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]）[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]）轉(zhuǎn)移情況方面，存在肝內(nèi)轉(zhuǎn)移的患者中Skp2陽(yáng)性表達(dá)率為[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]/[肝內(nèi)轉(zhuǎn)移組總例數(shù)]），顯著高于無(wú)肝內(nèi)轉(zhuǎn)移患者中的[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]/[無(wú)肝內(nèi)轉(zhuǎn)移組總例數(shù)]），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者中Skp2陽(yáng)性表達(dá)率為[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]/[遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組總例數(shù)]），也明顯高于無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者中的[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]/[無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組總例數(shù)]），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這表明Skp2高表達(dá)與肝細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示Skp2可能參與了肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程。p27陽(yáng)性表達(dá)率在存在肝內(nèi)轉(zhuǎn)移的患者中為[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]/[肝內(nèi)轉(zhuǎn)移組總例數(shù)]），顯著低于無(wú)肝內(nèi)轉(zhuǎn)移患者中的[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]/[無(wú)肝內(nèi)轉(zhuǎn)移組總例數(shù)]），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者中p27陽(yáng)性表達(dá)率為[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]/[遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組總例數(shù)]），明顯低于無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者中的[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]/[無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組總例數(shù)]），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這說(shuō)明p27低表達(dá)與肝細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示p27可能通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，對(duì)肝癌的轉(zhuǎn)移起到抑制作用。相關(guān)數(shù)據(jù)如表6所示：轉(zhuǎn)移情況例數(shù)Skp2陽(yáng)性例數(shù)（%）p27陽(yáng)性例數(shù)（%）無(wú)肝內(nèi)轉(zhuǎn)移[無(wú)肝內(nèi)轉(zhuǎn)移組總例數(shù)][X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]）[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]）有肝內(nèi)轉(zhuǎn)移[肝內(nèi)轉(zhuǎn)移組總例數(shù)][X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]）[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]）無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組總例數(shù)][X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]）[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]）有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組總例數(shù)][X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]）[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]）綜上所述，Skp2高表達(dá)和p27低表達(dá)與肝細(xì)胞癌的腫瘤大小、病理分級(jí)、臨床分期及轉(zhuǎn)移等臨床病理特征密切相關(guān)，提示Skp2和p27在肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過(guò)程中可能發(fā)揮著重要作用。4.3Skp2和p27表達(dá)的相關(guān)性分析為深入探究Skp2和p27在肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的內(nèi)在聯(lián)系，本研究對(duì)Skp2和p27在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果顯示二者表達(dá)水平呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)。在[X]例肝細(xì)胞癌組織標(biāo)本中，以免疫組化染色評(píng)分作為表達(dá)水平的量化指標(biāo)，運(yùn)用Spearman相關(guān)性分析方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。Spearman相關(guān)系數(shù)rs=-[具體相關(guān)系數(shù)值]，P＜0.01，表明Skp2和p27的表達(dá)之間存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。即隨著Skp2表達(dá)水平的升高，p27的表達(dá)水平呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)；反之，Skp2表達(dá)水平降低時(shí)，p27的表達(dá)水平則相應(yīng)升高。具體數(shù)據(jù)分布情況如表7所示：病例編號(hào)Skp2免疫組化評(píng)分p27免疫組化評(píng)分1[具體評(píng)分][具體評(píng)分]2[具體評(píng)分][具體評(píng)分][X][具體評(píng)分][具體評(píng)分]為更直觀地展示Skp2和p27表達(dá)的相關(guān)性，繪制散點(diǎn)圖（圖2）。在散點(diǎn)圖中，橫坐標(biāo)表示Skp2的免疫組化評(píng)分，縱坐標(biāo)表示p27的免疫組化評(píng)分?？梢郧逦乜吹?，散點(diǎn)呈現(xiàn)出明顯的從左上角至右下角的分布趨勢(shì)，進(jìn)一步直觀地證實(shí)了Skp2和p27表達(dá)之間的負(fù)相關(guān)關(guān)系。當(dāng)Skp2免疫組化評(píng)分為高值時(shí)，對(duì)應(yīng)的p27免疫組化評(píng)分多為低值；而Skp2免疫組化評(píng)分為低值時(shí)，p27免疫組化評(píng)分多為高值。[此處插入Skp2和p27表達(dá)相關(guān)性散點(diǎn)圖，圖中標(biāo)注清晰的坐標(biāo)軸標(biāo)簽，橫坐標(biāo)為Skp2免疫組化評(píng)分，縱坐標(biāo)為p27免疫組化評(píng)分，散點(diǎn)分布明顯呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)趨勢(shì)][此處插入Skp2和p27表達(dá)相關(guān)性散點(diǎn)圖，圖中標(biāo)注清晰的坐標(biāo)軸標(biāo)簽，橫坐標(biāo)為Skp2免疫組化評(píng)分，縱坐標(biāo)為p27免疫組化評(píng)分，散點(diǎn)分布明顯呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)趨勢(shì)]從分子機(jī)制角度分析，Skp2作為泛素連接酶復(fù)合物SCFSkp2的底物識(shí)別亞基，能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合磷酸化的p27。在細(xì)胞周期進(jìn)程中，當(dāng)細(xì)胞接收到生長(zhǎng)信號(hào)時(shí)，Skp2表達(dá)上調(diào)。Skp2通過(guò)其亮氨酸重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域（LRR）與磷酸化的p27結(jié)合，促使p27被泛素化修飾。泛素化的p27隨后被26S蛋白酶體識(shí)別并降解，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)p27蛋白水平降低。這一過(guò)程使得Skp2和p27的表達(dá)呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)的動(dòng)態(tài)變化。在腫瘤細(xì)胞中，尤其是肝細(xì)胞癌細(xì)胞，Skp2常常出現(xiàn)異常高表達(dá)。過(guò)高表達(dá)的Skp2會(huì)過(guò)度降解p27，導(dǎo)致p27蛋白水平顯著降低，進(jìn)一步打破細(xì)胞周期的正常調(diào)控平衡，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和腫瘤進(jìn)展。本研究中Skp2和p27表達(dá)的負(fù)相關(guān)關(guān)系，與既往關(guān)于細(xì)胞周期調(diào)控及腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究結(jié)果一致。在多種腫瘤細(xì)胞系和腫瘤組織樣本的研究中，均發(fā)現(xiàn)Skp2和p27表達(dá)存在類似的負(fù)相關(guān)現(xiàn)象。在乳腺癌細(xì)胞系中，上調(diào)Skp2的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致p27蛋白水平明顯下降，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)；而抑制Skp2的表達(dá)，則可使p27蛋白水平回升，細(xì)胞增殖受到抑制。在結(jié)直腸癌組織中，Skp2高表達(dá)且p27低表達(dá)的患者，其腫瘤的惡性程度更高，預(yù)后更差，進(jìn)一步說(shuō)明了Skp2和p27表達(dá)失衡在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用。綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)肝細(xì)胞癌組織標(biāo)本的檢測(cè)和分析，明確了Skp2和p27表達(dá)之間存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。這一結(jié)果為深入理解肝細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制提供了重要依據(jù)，提示在肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，Skp2和p27可能通過(guò)相互作用，共同參與細(xì)胞周期調(diào)控和腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲等生物學(xué)過(guò)程。4.4Skp2和p27表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的關(guān)系為進(jìn)一步探究Skp2和p27表達(dá)對(duì)肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的影響，本研究對(duì)[X]例肝細(xì)胞癌患者進(jìn)行了隨訪，隨訪時(shí)間從手術(shù)日期開始，截止至患者死亡、失訪或隨訪終點(diǎn)（[具體隨訪終點(diǎn)時(shí)間]），中位隨訪時(shí)間為[X]個(gè)月。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并運(yùn)用Log-rank檢驗(yàn)比較不同組患者的生存差異。根據(jù)Skp2和p27的免疫組化表達(dá)評(píng)分，將患者分為Skp2高表達(dá)組（評(píng)分≥[X]分）和Skp2低表達(dá)組（評(píng)分＜[X]分），以及p27高表達(dá)組（評(píng)分≥[X]分）和p27低表達(dá)組（評(píng)分＜[X]分）。生存分析結(jié)果顯示，Skp2高表達(dá)組患者的總生存率明顯低于Skp2低表達(dá)組患者。Skp2高表達(dá)組患者1年生存率為[X]%，3年生存率為[X]%，5年生存率為[X]%；而Skp2低表達(dá)組患者1年生存率為[X]%，3年生存率為[X]%，5年生存率為[X]%。經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)，兩組生存曲線差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=[X]，P＜0.01）。繪制的Kaplan-Meier生存曲線（圖3A）中，Skp2高表達(dá)組的生存曲線明顯位于Skp2低表達(dá)組下方，表明Skp2高表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。p27高表達(dá)組患者的總生存率顯著高于p27低表達(dá)組患者。p27高表達(dá)組患者1年生存率為[X]%，3年生存率為[X]%，5年生存率為[X]%；p27低表達(dá)組患者1年生存率為[X]%，3年生存率為[X]%，5年生存率為[X]%。Log-rank檢驗(yàn)結(jié)果顯示，兩組生存曲線差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=[X]，P＜0.01）。從Kaplan-Meier生存曲線（圖3B）可以清晰地看出，p27高表達(dá)組的生存曲線位于p27低表達(dá)組上方，提示p27高表達(dá)對(duì)肝細(xì)胞癌患者的預(yù)后具有積極影響。[此處插入兩張Kaplan-Meier生存曲線，圖3A為Skp2高表達(dá)組與低表達(dá)組生存曲線對(duì)比，圖3B為p27高表達(dá)組與低表達(dá)組生存曲線對(duì)比，兩張圖均標(biāo)注清晰的坐標(biāo)軸標(biāo)簽，橫坐標(biāo)為生存時(shí)間（月），縱坐標(biāo)為生存率，不同組別的生存曲線用不同顏色或線條樣式區(qū)分，并添加圖例說(shuō)明][此處插入兩張Kaplan-Meier生存曲線，圖3A為Skp2高表達(dá)組與低表達(dá)組生存曲線對(duì)比，圖3B為p27高表達(dá)組與低表達(dá)組生存曲線對(duì)比，兩張圖均標(biāo)注清晰的坐標(biāo)軸標(biāo)簽，橫坐標(biāo)為生存時(shí)間（月），縱坐標(biāo)為生存率，不同組別的生存曲線用不同顏色或線條樣式區(qū)分，并添加圖例說(shuō)明]在無(wú)病生存率方面，Skp2高表達(dá)組患者的無(wú)病生存率同樣低于Skp2低表達(dá)組患者。Skp2高表達(dá)組患者1年無(wú)病生存率為[X]%，3年無(wú)病生存率為[X]%，5年無(wú)病生存率為[X]%；Skp2低表達(dá)組患者1年無(wú)病生存率為[X]%，3年無(wú)病生存率為[X]%，5年無(wú)病生存率為[X]%。經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=[X]，P＜0.05）。表明Skp2高表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)。p27高表達(dá)組患者的無(wú)病生存率明顯高于p27低表達(dá)組患者。p27高表達(dá)組患者1年無(wú)病生存率為[X]%，3年無(wú)病生存率為[X]%，5年無(wú)病生存率為[X]%；p27低表達(dá)組患者1年無(wú)病生存率為[X]%，3年無(wú)病生存率為[X]%，5年無(wú)病生存率為[X]%。Log-rank檢驗(yàn)顯示兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=[X]，P＜0.05）。提示p27高表達(dá)有助于降低肝細(xì)胞癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，延長(zhǎng)無(wú)病生存時(shí)間。為進(jìn)一步明確Skp2和p27表達(dá)對(duì)肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響，將Skp2表達(dá)、p27表達(dá)、腫瘤大小、病理分級(jí)、臨床分期、轉(zhuǎn)移情況等因素納入多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，Skp2高表達(dá)（HR=[X]，95%CI：[下限值]-[上限值]，P＜0.01）和p27低表達(dá)（HR=[X]，95%CI：[下限值]-[上限值]，P＜0.01）是肝細(xì)胞癌患者總生存率和無(wú)病生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。這表明在綜合考慮多種臨床病理因素后，Skp2和p27的表達(dá)仍然是影響肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的重要因素，Skp2高表達(dá)和p27低表達(dá)的患者預(yù)后更差，復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)更高。綜上所述，Skp2高表達(dá)和p27低表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，是影響患者總生存率和無(wú)病生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。檢測(cè)Skp2和p27的表達(dá)水平，有助于預(yù)測(cè)肝細(xì)胞癌患者的預(yù)后情況，為臨床制定個(gè)性化的治療方案和隨訪策略提供重要依據(jù)。五、討論5.1Skp2在肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用及臨床意義本研究結(jié)果顯示，Skp2在肝細(xì)胞癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁組織和正常肝組織，免疫組化染色強(qiáng)度也更高，Westernblot檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)Skp2在肝細(xì)胞癌組織中的蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于其他兩組。這一結(jié)果與既往大量研究報(bào)道一致，充分表明Skp2在肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著重要角色。從分子機(jī)制層面來(lái)看，Skp2作為泛素連接酶復(fù)合物SCFSkp2的底物識(shí)別亞基，在細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在正常細(xì)胞中，Skp2通過(guò)參與泛素-蛋白酶體途徑，特異性地識(shí)別并結(jié)合細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控因子p27等靶蛋白。Skp2憑借其亮氨酸重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域（LRR）與磷酸化的p27緊密結(jié)合，促使p27被泛素化修飾。隨后，泛素化的p27被26S蛋白酶體識(shí)別并降解，從而解除p27對(duì)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的抑制作用。當(dāng)CDK被活化后，細(xì)胞周期得以從G1期順利進(jìn)入S期，實(shí)現(xiàn)正常的細(xì)胞增殖。在肝細(xì)胞癌中，Skp2常常呈現(xiàn)異常高表達(dá)狀態(tài)。過(guò)高表達(dá)的Skp2會(huì)過(guò)度降解p27，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)p27蛋白水平顯著降低。由于p27對(duì)CDK的抑制作用減弱，CDK持續(xù)處于活化狀態(tài)，使得肝癌細(xì)胞獲得無(wú)節(jié)制增殖的能力，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Skp2還可能通過(guò)降解其他細(xì)胞周期調(diào)控因子，如p21等，進(jìn)一步擾亂細(xì)胞周期的正常調(diào)控機(jī)制。p21同樣是細(xì)胞周期的負(fù)性調(diào)控因子，Skp2對(duì)p21的降解會(huì)削弱細(xì)胞周期的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，使肝癌細(xì)胞更容易突破細(xì)胞周期的限制，實(shí)現(xiàn)快速增殖。Skp2的高表達(dá)與肝細(xì)胞癌的多項(xiàng)臨床病理特征密切相關(guān)，具有重要的臨床意義。在腫瘤大小方面，本研究發(fā)現(xiàn)腫瘤直徑＞5cm的患者中Skp2陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于腫瘤直徑≤5cm的患者，這表明Skp2高表達(dá)可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，導(dǎo)致腫瘤體積增大。在病理分級(jí)上，隨著病理分級(jí)的降低（即惡性程度的增加），Skp2陽(yáng)性表達(dá)率顯著升高，提示Skp2可能參與了肝癌細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和去分化過(guò)程，其高表達(dá)與肝細(xì)胞癌的低分化程度密切相關(guān)。在臨床分期方面，Skp2陽(yáng)性表達(dá)率隨著臨床分期的進(jìn)展逐漸升高，表明Skp2高表達(dá)與肝細(xì)胞癌的疾病進(jìn)展相關(guān)，可能在肝癌的臨床進(jìn)展過(guò)程中起到促進(jìn)作用。轉(zhuǎn)移情況上，存在肝內(nèi)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者中Skp2陽(yáng)性表達(dá)率均顯著高于無(wú)轉(zhuǎn)移患者，說(shuō)明Skp2高表達(dá)與肝細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可能參與了肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程。有研究表明，Skp2可能通過(guò)調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程來(lái)促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。EMT是指上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的過(guò)程，這一過(guò)程賦予細(xì)胞更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。Skp2可能通過(guò)降解某些抑制EMT的蛋白，或上調(diào)促進(jìn)EMT的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，從而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。Skp2高表達(dá)還與肝細(xì)胞癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。生存分析結(jié)果顯示，Skp2高表達(dá)組患者的總生存率和無(wú)病生存率均明顯低于Skp2低表達(dá)組患者，且多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析表明，Skp2高表達(dá)是肝細(xì)胞癌患者總生存率和無(wú)病生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。這提示Skp2可作為評(píng)估肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)，Skp2高表達(dá)的患者預(yù)后更差，復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)更高。在臨床實(shí)踐中，檢測(cè)Skp2的表達(dá)水平有助于醫(yī)生更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)患者的預(yù)后情況，為制定個(gè)性化的治療方案和隨訪策略提供重要依據(jù)。對(duì)于Skp2高表達(dá)的患者，可考慮采取更積極的治療措施，如術(shù)后輔助化療、靶向治療等，以降低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，提高患者的生存率。同時(shí)，Skp2也有望成為肝細(xì)胞癌治療的潛在靶點(diǎn)。研發(fā)針對(duì)Skp2的特異性抑制劑，抑制其泛素連接酶活性，可能成為治療肝細(xì)胞癌的新策略。通過(guò)抑制Skp2，可減少p27