課時規(guī)范練60基因工程的基本工具與操作程序

（選擇題每小題3分）

必備知識基礎練

考點一重組DNA技術的基本工具

1.（2025?山西呂梁開學模擬）DNA重組技術可以賦予生物以新的遺傳特性,創(chuàng)造出更符合

人類需要的生物產品。在此過程中需要使用多種工具酶。下列相關敘述正確的是（）

A.所有的限制酶都具有專一性，不同限制酶切割產生的黏性末端都不同

B.限制酶和DNA連接酶分別能催化磷酸二酯鍵的斷裂和形成

C.限制酶識別序列越短，則相應酶切位點在DNA中出現(xiàn)的概率越小

D.DNA連接酶可以將游離的單個脫氧核甘酸連接成雙鏈結構

2.（2025?四川綿陽模擬）下圖表示pBR322質粒和人生長激素基因所在片段的結構信息，將

二者構建的重組質粒導入受體菌并進行篩選。下列敘述錯誤的是（）

pBR322質粒

酶F

I酶E酶G

I匚_|_

人生長激素基因

注:A呻R：氨平青霉素抗性基因;嶷嚴:四環(huán)素抗性基因。

A.用含氨茉青霉素的培養(yǎng)基篩選出的是含重組質粒的受體菌

B.應選擇的限制酶組合是酶F和酶G

C.pBR322質粒含有的A呻R基因和南R基因都屬于標記基因

D.同時用三種限制酶處理圖中質粒，完全反應后可得到4種長度DNA

3.（2025?北京西城開學模擬）用X/wI和SHI兩種限制性內切核酸酶分別處理同一DNA

片段，酶切位點及酶切產物分離結果如圖。以下敘述不正確的是（）

XhoTSRISallSalIXhoI

___I______I_____________________I_____I_____1______

圖1酶切位點圖

①②

圖2電泳結果示意圖

A.圖1中兩種酶識別的核甘酸序列不同

B.圖2中酶切產物可用于構建重組DNA

C泳道①中是用SalI處理得到的酶切產物

D.圖中被酶切的DNA片段是單鏈DNA

4.（2023?湖北卷）用氨葦青霉素抗性基因（A呻R）、四環(huán)素抗性基因（寬再作為標記基因構建

的質粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質粒，構建基因

表達載體（重組質粒），并轉化到受體菌中。下列敘述錯誤的是（）

A.若用“沅dill酶切，目的基因轉錄的產物可能不同

B.若用PvuI酶切，在含Tet（四環(huán)素）培養(yǎng)基中的菌落,不一定含有目的基因

C.若用SphI酶切,可通過DNA凝膠電泳技術鑒定重組質粒構建成功與否

D.若用SphI酶切,攜帶目的基因的受體菌在含Amp（氨葦青霉素）和Tet（四環(huán)素）的培養(yǎng)基

中能形成菌落

考點二基因工程的基本操作程序

5.（2025?甘肅白銀模擬）釀酒酵母耐酸能力較強，但不產生乳酸。研究者將乳酸菌內催化乳

酸生成的乳酸脫氫酶（LDH）基因導入釀酒酵母,獲得能產生乳酸的酵母工程菌株。下圖為

乳酸脫氫酶基因對應的DNA片段結構示意圖，其中1~4表示DNA上引物可能結合的位置。

下列分析錯誤的是（）

?MUI1一儂因4川川皿

HO349

A.構建基因表達載體時，需用到的工具酶有限制酶和DNA連接酶

B.若從圖中的DNA片段中直接獲取基因,則被破壞的磷酸二酯鍵共有4個

C.用PCR技術擴增LDH基因時，變性后需要先升溫后降溫

D.用PCR技術擴增LDH基因時，圖中的2、3分別是兩種引物結合的位置

6.（2025?云南文山模擬）除草劑的有效成分草甘瞬能夠專一性抑制EPSP合成酶的作用，從

而使植物多種代謝途徑受影響而導致植物死亡，草甘瞬沒有選擇性，除掉雜草的同時作物

也會受損,培育抗草甘瞬作物是解決辦法之一，下列關于轉入外源EPSP合成酶基因使矮牽

?？共莞仕擦鞒痰臄⑹稣_的是（）

A.可以通過mRNA在逆轉錄酶的作用下構建DNA,從而獲取EPSP合成酶基因

B.用限制酶和DNA連接酶處理目的基因和Ti質粒，僅涉及磷酸二酯鍵的斷裂和形成

C.基因表達載體組件中的起始密碼子是RNA聚合酶識別和結合的部位,驅動基因轉錄

D.目的基因插入Ti質粒的T-DNA上,農桿菌的轉化能使植物細胞都培育出轉基因植株

7.（2024.福建龍巖模擬）為提高紅豆杉細胞培養(yǎng)物中紫杉醇的產量，研究人員構建紫杉醇合

成關鍵酶基因（及?0）的超表達載體，并將其導入紅豆杉細胞，具體流程如下圖。下列相關說

法錯誤的是（）

紅豆杉?紅豆杉_②?Bapt9pi30i載體

mRNAcDNA氏5引物基因一印,超表

P1301載體/達載體

I?

紅豆杉細胞-潮霉素強-紅豆杉細胞烏農桿菌

A.pl301載體上應含有增強及/“基因表達的序列

B.超表達載體中應含有潮霉素抗性基因作為標記基因

C.可使用3卬/基因制成的探針檢測過程⑤是否成功

D.工廠化生產紫杉醇需將改造后的紅豆杉細胞培養(yǎng)至愈傷組織

8.（2025?云南昆明模擬）Ca2+在多項生物技術與工程中發(fā)揮重要作用，下列說法錯誤的是

（）

A.Ca2+載體等可激活通過核移植得到的重構胚,促進其細胞分裂和發(fā)育進程

B.Ca2+處理可以使大腸桿菌細胞處于能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)

C.真核細胞和細菌的DNA聚合酶需要Ca2+激活，故PCR反應緩沖液中需要添加該離子

D.在植物體細胞雜交過程中,可用高Ca2+—高pH融合法誘導原生質體的融合

9.（12分）（2024.甘肅卷）源于細菌的纖維素酶是一種復合酶，能降解纖維素。為了提高纖維

素酶的降解效率，某課題組通過篩選高產纖維素酶菌株，克隆表達降解纖維素的三種酶（如

下圖），研究了三種酶混合的協(xié)同降解作用，以提高生物質資源的利用效率。回答下列問題。

質粒載體-

酶A基因

受

質

體

粒

質粒載體-

細

載

胞

酶B基因體

質粒載體-

重組酶酶基因

c酶C基因c

⑴過程①②采用以竣甲基纖維素鈉為唯一碳源的培養(yǎng)基篩選菌株X,能起到篩選作用的

原因是。高產纖維素酶菌株篩選時,剛果紅

培養(yǎng)基上的菌落周圍透明圈大小反映

了。

⑵過程④擴增不同目的基因片段需要的關鍵酶是。

⑶過程⑤在基因工程中稱為，該過程需要的主要酶

有。

⑷過程⑥大腸桿菌作為受體細胞的優(yōu)點

有

。該過程用Ca2+處理細胞，使其處于一種

的生理狀態(tài)。

⑸課題組用三種酶及酶混合物對不同生物質原料進行降解處理，結果如下表。表中協(xié)同系

數(shù)存在差異的原因是（答出兩點）。

降解率/%協(xié)同系數(shù)

生物質原料

酶A酶B酶C混1混2混1混2

小麥秸稈7.086.038.198.6126.9874.33114.64

玉米秸稈2.621.483.763.929.8824.9877.02

玉米芯0.620.480.860.986.791.8211.34

注:混1和混2表示三種酶的混合物。

10.（13分）（2025?河北模擬）流感病毒表面的HA蛋白是疫苗研制的重要位點。圖甲表示獲

得流感病毒HA蛋白基因的過程，圖乙是被特定限制酶切割后的質粒部分結構示意圖。回

答下列問題。

引蛆I?

^HA蛋白基因

引物2

圖甲

IC

圖乙

⑴①②過程需要的原料為，③過程需要向反應體系中添加

酶，該過程需要添加引物的原因

是，若

HA蛋白基因轉錄的方向為從左向右，則為了使HA蛋白基因能夠插入圖乙的啟動子和終

止子之間，需要在引物1的（填“3"或"5。）端加上

（按照順序寫出6個堿基）堿基序列。

（2）HA蛋白基因經限制酶切割后,與圖乙質粒經連接形成重組

質粒，作為基因表達載體，重組質粒上還應含有。

⑶若用大腸桿菌生產HA蛋白疫苗，則將目的基因導入大腸桿菌時需用對其進行

處理的目的是,

利用大腸桿菌生產疫苗的優(yōu)點有

（答出2點）。

考點三實驗:DNA的粗提取與鑒定、DNA片段的擴增及電泳鑒定

11.（2024.安徽卷）下列關于“DNA粗提取與鑒定”實驗的敘述，錯誤的是（）

A.實驗中如果將研磨液更換為蒸儲水,DNA提取的效率會降低

B.利用DNA和蛋白質在酒精中的溶解度差異，可初步分離DNA

C.DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同，該原理可用于純化DNA粗提物

D.將溶解的DNA粗提物與二苯胺試劑反應,可檢測溶液中是否含有蛋白質雜質

12.（2025?山東臨沂開學模擬）下列關于“DNA的粗提取與鑒定”實驗的敘述，正確的是

（）

A.粗提取的DNA溶于2mol/L的NaCl溶液中，加入二苯胺試劑后即顯藍色

B.選用花菜、香蕉等植物細胞提取DNA時,應該先用洗滌劑溶解細胞壁

C.向溶解DNA的濃鹽溶液中加蒸儲水是為了析出DNA

D.析出DNA時，玻璃棒來回向不同方向攪拌可快速獲得DNA

13.（多選）（2025?江蘇開學模擬）利用PCR擴增下面DNA分子，下列敘述正確的是（）

5'-TAAACTTCAGGGT……TGATTTGTTGACC-3'

3-ATTTGAAGTCCCA……ACTAAACAACTGG-5Z

A.其中一種引物的部分堿基序列應為3,-ATTTGAAGTCCCA-5,

B.變性時，在高溫的作用下雙鏈DNA解聚為單鏈DNA

C.復制n輪后，同時含有兩種引物的子代DNA分子有2"-2個

D.復性時，溫度過高會導致PCR擴增出多種DNA片段

關鍵能力提升練

14.（2025?八省聯(lián)考云南卷）Hv-Lv肽鏈是抗體與抗原識別并結合的關鍵結構。為篩選特異

性高、結合能力強的Hv-Lv肽鏈,將編碼Hv-Lv肽鏈的DNA片段與絲狀噬菌體固有外殼

蛋白pVID的基因連接并一起表達，最后用固定化抗原篩選（過程如圖）。

下列說法錯誤的是（

A.Hv-LvDNA片段上游需要設計并連接啟動子

B.Hv-LvDNA片段上無需連接標記基因

C.目標是獲得能耐受多次沖洗的噬菌體

D.實驗過程須嚴格遵循生物防護措施

15.（2024.四川眉山期中）下圖為構建茴麻抗除草劑基因A重組質粒的技術流程淇中

是卡那霉素抗性基因,GUS基因僅在真核細胞中表達，表達產物可催化底物呈藍色。下列

說法錯誤的是（）

HindisBamHIEcoRI

二＞啟動子■終止子

A.PCR擴增A時可在引物中加入PstI和XhoI的酶切位點

B.在培養(yǎng)基中添加卡那霉素初步篩選導入重組質粒的農桿菌

C.用農桿菌轉化植物愈傷組織時選擇呈現(xiàn)藍色的農桿菌與植物進行培養(yǎng)

D.啟動子若為除草劑誘導啟動子將減少細胞物質和能量浪費

16.(8分)(2024.全國新課標卷)某研究小組將纖維素酶基因(N)插入某種細菌(B1)的基因組

中,構建高效降解纖維素的菌株(B2)。該小組在含有N基因的質粒中插入B1基因組的Ml

與M2片段;再經限制酶切割獲得含N基因的片段甲，片段甲兩端分別為Ml與M2;利用

CRISPR/Cas9基因組編輯技術將片段甲插入B1的基因組，得到菌株B2。酶切位點(I~1￥)、

弓I物(P1~P4)的結合位置、片段甲替換區(qū)如圖所示，一表示引物方向。回答下列問題。

⑴限制酶切割的化學鍵是。為保證N基因能在菌株B2中表達，在構建片

段甲時，應將Ml與M2片段分別插入質粒的I和H、HI和IV酶切位點之間，原因

是。

(2)CRISPR/Cas9技術可以切割細菌B1基因組中與向導RNA結合的DNA。向導RNA

與B1基因組DNA互補配對可以形成的堿基對有G—C

和O

⑶用引物P1和P2進行PCR可驗證片段甲插入了細菌B1基因組，所用的模板

是；若用該模板與引物P3和P4進行PCR,實驗結果

是o

⑷與秸稈焚燒相比，利用高效降解纖維素的細菌處理秸稈的優(yōu)點是

(答出2點即可)。

參考答案

課時規(guī)范練60基因工程的基本工具與操作程序

必備知識基礎練

1.B解析所有的限制酶都具有專一性，不同限制酶切割產生的黏性末端可能相同,A項

錯誤;限制酶能夠識別特定的DNA序列并催化磷酸二酯鍵的斷裂，而DNA連接酶能夠催

化磷酸二酯鍵的形成，將DNA片段連接起來,B項正確;限制酶識別序列越短，則相應酶切

位點在DNA中出現(xiàn)的概率越大,因為短序列在DNA中出現(xiàn)的頻率較高,C項錯誤;DNA連

接酶的功能是將DNA片段連接起來，而不是將游離的單個脫氧核甘酸連接成雙鏈結構,D

項錯誤。

2.A解析酶E會破壞兩種標記基因，為避免切割后DNA片段的自身環(huán)化,又保留質粒上

的標記基因，切割時應選擇的限制酶組合是酶F和酶G,由于酶F會破壞四環(huán)素抗性基因，

故使用含氨葦青霉素的培養(yǎng)基篩選出的是導入重組質粒的受體菌和導入原質粒的受體

菌,A項錯誤,B項正確;pBR322質粒含有的A呻R基因和竊R基因都屬于標記基因，以便于

對含有目的基因的受體菌進行選擇,C項正確;據圖可知,同時用三種限制酶處理圖中質粒，

因酶E有兩個作用位點,故同時用三種限制酶處理圖中質粒，完全反應后可得到4種長度

DNA,D項正確。

3.D解析酶具有專一性，不同的限制酶識別并切割不同的核甘酸序列，故圖1中兩種酶

識別的核昔酸序列不同,A項正確;重組DNA通常是連接兩個不同的DNA片段，故圖2中

酶切產物可用于構建重組DNA,B項正確;分析圖1,限制酶Sa/1有三處切割位點，切割后產

生4個DNA片段,泳道①中是用Sall處理得到的酶切產物,C項正確;圖中限制酶能夠識

別雙鏈DNA分子的某種特定核甘酸序列，圖中被酶切的DNA片段是雙鏈DNA,D項錯誤。

4.D解析用一種限制酶切割，目的基因在質粒上可以正向或反向插入，進而導致基因轉

錄產物的不同,A項正確;用PVMI酶切,氨葦青霉素抗性基因被破壞用含四環(huán)素的培養(yǎng)基

培養(yǎng),能生長的受體菌可能含重組質粒、正常質粒及自身環(huán)化的質粒,B項正確;Sp/zI酶切

會在重組質粒上產生特定的片段，通過DNA凝膠電泳技術可以分離和檢測這些片段，從而

確定重組質粒是否構建成功,C項正確;根據質粒圖示，攜帶目的基因的受體菌需要同時具

有A在R和竟嚴基因才能在含有氨平青霉素和四環(huán)素的培養(yǎng)基中形成菌落，若用SphI酶

切，會破壞四環(huán)素抗性基因（寬嚴）,D項錯誤。

5.C解析構建基因表達載體時，需要用到的工具酶有限制酶和DNA連接酶,A項正確；

若從圖中的DNA片段中直接獲取LDH基因，由于DNA每條鏈上有2個磷酸二酯鍵會被

破壞，因此被破壞的磷酸二酯鍵共有4個,B項正確;PCR反應過程分為變性（溫度上升到90℃

以上）、復性（溫度下降到50℃左右）和延伸（溫度上升到72℃左右）三大步驟，故變性后要

先降溫后升溫,C項錯誤油于TaqDNA聚合酶只能從5端-3端延伸子鏈,圖中含磷酸基

團端為5端，含羥基端為3端，子鏈和模板鏈反向平行，因此根據引物的延伸方向可知，圖中

與引物結合的部位是2、3,D項正確。

6.A解析可以通過mRNA在逆轉錄酶的作用下合成cDNA,從中獲取目的基因,A項正

確;用限制酶和DNA連接酶處理目的基因和Ti質粒，涉及堿基之間的氫鍵和DNA片段之

間的磷酸二酯鍵的斷裂和形成,B項錯誤;起始密碼子位于mRNA上,RNA聚合酶識別的位

點是基因中的啟動子,C項錯誤;T-DNA可轉移到受體細胞并整合到受體細胞染色體的

DNA上，但不能保證目的基因導入率為100%,所以農桿菌的轉化不都能培育出轉基因植

株,D項錯誤。

7.C解析根據題干推測,pl301載體上應含有增強Bapt基因表達的序列,A項正確;超表

達載體中應含有潮霉素抗性基因作為標記基因，在含有潮霉素的培養(yǎng)基上，超表達載體能

夠存活，從而起到篩選作用,B項正確;由于紅豆杉細胞中本身存在3卬/基因,無論超表達載

體是否成功導入,都能與5am基因探針形成雜交分子，因此不能通過及如基因探針來檢測

過程⑤是否成功,C項錯誤;工廠化生產紫杉醇屬于細胞產物的獲得,只需要培養(yǎng)到愈傷組

織階段即可,D項正確。

8.C解析在核移植過程中,形成重構胚后，還需要用物理或化學方法（如電刺激、Ca2+載體

等）激活重構胚，促進其細胞分裂和發(fā)育進程,A項正確;導入重組質粒前,需要用Ca2+處理大

腸桿菌細胞,使其處于能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，使重組質粒容易進入受體

細胞,B項正確;真核細胞和細菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活,因此,PCR反應緩沖溶液

中一般要加Mg2+,C項錯誤;促進植物原生質體融合的方法有電融合法、高Ca2+—高pH融

合法等,D項正確。

9.答案（1）只有能利用竣甲基纖維素鈉的微生物才能生長繁殖菌落產生的纖維素酶的

活性和量

⑵耐高溫的DNA聚合酶

⑶基因表達載體的構建限制酶、DNA連接酶

⑷繁殖能力強、生理結構和遺傳物質簡單、對環(huán)境因素敏感、容易進行遺傳操作等能

吸收周圍環(huán)境中DNA分子

（5）降解時的溫度不同、降解時的pH不同

解析由圖可知，①②是利用選擇培養(yǎng)基篩選出高產纖維素酶菌株X,③是提取菌株X基因

組DNA,④為基因工程操作程序中“目的基因的篩選和獲取”，⑤為“基因表達載體的構

建”，⑥為“將目的基因導入受體細胞”，⑦為從培養(yǎng)體系中分離得到重組酶。（1）選擇培養(yǎng)基

只允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長。在以竣甲基纖維素

鈉為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基中，只有能利用竣甲基纖維素鈉的微生物才能生長繁殖。剛果

紅能與培養(yǎng)基中的纖維素形成紅色復合物，使得含有纖維素的培養(yǎng)基呈現(xiàn)紅色。當纖維素

被纖維素酶分解后，剛果紅與纖維素的復合物就無法形成，培養(yǎng)基中就會出現(xiàn)以纖維素分

解菌為中心的透明圈。這個透明圈的大小直接反映了纖維素分解菌分解纖維素的能力。

透明圈越大，說明纖維素分解菌分解纖維素的能力越強,即菌落產生的纖維素酶的活性強、

量多。（2）擴增目的基因片段在PCR儀中進行，因此需要耐高溫的DNA聚合酶。（3）根據圖

示中酶基因與質粒載體經過過程⑤構成重組質粒，推導出過程⑤為基因表達載體的構建,

該過程需要限制酶和DNA連接酶。（4）大腸桿菌作為受體細胞的優(yōu)點是繁殖能力強、生

理結構和遺傳物質簡單、對環(huán)境因素敏感、容易進行遺傳操作等。先用Ca2+處理細胞,

使其處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，然后再將重組的基因表達載體導

入其中。（5）不同酶的最適溫度、最適pH不同，當溫度和pH改變時，酶促反應速率也會受

到影響。

10.答案（1）脫氧核甘酸耐高溫的DNA聚合DNA聚合酶只能催化單個脫氧核昔酸連

接到已有的脫氧核昔酸鏈的3,端5'

CCATGG

（2）DNA連接酶標記基因

（3）Ca2+使其處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)繁殖速度快、目的蛋白

易獲得、可大量生產

解析（1）①②過程均合成DNA鏈，故需要的原料均為脫氧核昔酸，③過程是體外合成DNA,

需用高溫解旋，需要的酶是耐高溫的DNA聚合酶，該過程需要添加引物的原因是DNA聚

合酶只能催化單個脫氧核甘酸連接到已有的脫氧核甘酸鏈的3,端。若HA蛋白基因轉錄

的方向為從左向右,則與圖乙質粒連接時，應將HA蛋白基因的左側連接在質粒的啟動子

一側，右側連接在質粒的終止子一側，引物與模板鏈的3,端結合，故應在引物1的5,端加上

CCATGG堿基序列。

（2）HA蛋白基因經限制酶切割后,與圖乙質粒經DNA連接酶連接形成重組質粒，作為基因

表達載體，重組質粒上還應含有標記基因。

⑶大腸桿菌屬于微生物，若用大腸桿菌生產HA蛋白疫苗，則將目的基因導入大腸桿菌時

需用Ca2+對其進行處理，目的是使其處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，利

用大腸桿菌生產疫苗的優(yōu)點有繁殖速度快、目的蛋白易獲得、可大量生產。

11.D解析研磨液有利于DNA的溶解，更換為蒸儲水,DNA提取的效率會降低,A項正

確;DNA不溶于酒精，但細胞中的某些蛋白質溶于酒精，所以利用DNA和蛋白質在酒精中

的溶解度差異，可初步分離DNA,B項正確;DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同,

它能溶于2mol/L的NaCl溶液，可利用該原理對DNA進行粗提取,C項正確;在沸水浴的條

件下,DNA遇二苯胺試劑會呈現(xiàn)藍色，故二苯胺試劑可用于鑒定DNA,但不能檢測溶液中

是否含有蛋白質雜質,D項錯誤。

12.C解析粗提取的DNA溶于2mol/L的NaCl溶液中，因為在該濃度的溶液中DNA的

溶解度較高，二苯胺可用于鑒定DNA,但需要沸水浴加熱,A項錯誤;加入洗滌劑的目的是瓦

解細胞膜,不是細胞壁,B項錯誤;向溶解DNA的濃鹽溶液中加蒸儲水會降低DNA的溶解

度進而使DNA析出,C項正確;析出DNA時，玻璃棒應該沿同一個方向攪拌，防止DNA被

破壞,D項錯誤。

13.BC解析引物是一段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸,轉錄的

方向由引物的5響3,進行，引物與模板鏈的3,端開始一段堿基互補配對,不能是

3iATTTGAAGTCCCA-5：A項錯誤;PCR的過程為高溫變性、低溫復性、中溫延伸,變性需

要的溫度最高，變性使DNA解聚為單鏈,B項正確;復制n輪后,DNA分子有2〃個，新