偽狂犬病病毒gE基因于大腸桿菌中的表達及應(yīng)用研究一、引言1.1研究背景與意義偽狂犬?。≒seudorabies，PR）是由偽狂犬病毒（Pseudorabiesvirus，PRV）引起的一種急性、烈性、高致死性傳染病，嚴(yán)重影響著全球養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。豬作為PRV的唯一自然宿主，感染后會出現(xiàn)多種癥狀，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。妊娠母豬感染后，常發(fā)生大面積流產(chǎn)，產(chǎn)出死胎和木乃伊胎，且以產(chǎn)死胎為主，還會出現(xiàn)不發(fā)情、返情增加、屢配不孕等情況，這極大地影響了母豬的繁殖性能，降低了豬場的仔豬出生率，增加了養(yǎng)殖成本。新生仔豬感染PRV后，死亡率極高，15日齡內(nèi)仔豬死亡率可達100%，主要表現(xiàn)為嘔吐、腹瀉、呼吸困難，部分還會出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，這不僅導(dǎo)致仔豬大量死亡，還會影響整個豬群的健康和生長發(fā)育。斷奶仔豬發(fā)病死亡率在10-20%，發(fā)病率為20%-40%，常表現(xiàn)出觀星等神經(jīng)癥狀、拉稀、嘔吐等，使得仔豬生長緩慢，飼料轉(zhuǎn)化率降低，增加了養(yǎng)殖周期和成本。育肥豬感染后，會出現(xiàn)慢性呼吸道癥狀、增重遲緩、飼料報酬降低、上市時間推遲等問題，降低了養(yǎng)殖效益。公豬感染后則會出現(xiàn)不育、睪丸腫脹、萎縮等癥狀，失去種用能力，影響豬場的配種計劃和種群質(zhì)量。2011年以來，我國許多免疫豬場相繼大規(guī)模爆發(fā)了疑似偽狂犬病，造成妊娠母豬流產(chǎn)和初生乳豬死亡，并迅速蔓延至全國，給養(yǎng)豬業(yè)造成了慘重經(jīng)濟損失。此次流行主要是因為偽狂犬毒株發(fā)生變異，毒力增強，新毒株與傳統(tǒng)毒株基因組序列同源性存在差異。而傳統(tǒng)的疫苗對變異毒株不能提供完全保護，這使得偽狂犬病的防控面臨更大的挑戰(zhàn)。偽狂犬病毒糖蛋白E（GlycoproteinE，gE）基因在病毒的致病性和免疫原性方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。gE基因是偽狂犬病病毒的一個與毒力相關(guān)的增殖非必需基因，它的缺失會進一步降低缺失株的毒力而并不阻止缺失株在細胞上的增殖。在野毒感染的豬血清中可以檢測到針對gE的抗體，且gE抗體可在感染后1-2周內(nèi)出現(xiàn)，并可持續(xù)至少7個月。因此，gE蛋白可作為主要的診斷抗原，在偽狂犬根除計劃中發(fā)揮重要作用。通過檢測豬血清中g(shù)E抗體的存在，可以有效區(qū)分野毒感染和疫苗免疫，為偽狂犬病的防控和凈化提供重要依據(jù)。在眾多的表達系統(tǒng)中，大腸桿菌表達系統(tǒng)以其獨特的優(yōu)勢成為生產(chǎn)重組蛋白的常用選擇。大腸桿菌表達系統(tǒng)具有遺傳背景清楚的特點，其基因組信息豐富，研究人員對其基因功能和調(diào)控機制有深入的了解，這使得在進行基因操作時更加準(zhǔn)確和高效。它繁殖速度極快，在適宜的條件下，短時間內(nèi)就能大量增殖，能夠快速獲得大量的表達產(chǎn)物。成本低廉，其培養(yǎng)條件簡單，培養(yǎng)基價格相對較低，不需要復(fù)雜的培養(yǎng)設(shè)備和環(huán)境，大大降低了生產(chǎn)成本，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。表達量高，能夠?qū)崿F(xiàn)高水平的目標(biāo)蛋白表達，滿足大量制備診斷抗原的需求。表達產(chǎn)物容易純化，通過簡單的離心、過濾等操作，結(jié)合合適的純化方法，就能獲得高純度的目標(biāo)蛋白。穩(wěn)定性好，在培養(yǎng)過程中不易發(fā)生變異，能夠保證表達產(chǎn)物的一致性和穩(wěn)定性?？刮廴灸芰姡瑢ε囵B(yǎng)環(huán)境的要求相對較低，不易受到雜菌的污染。適用范圍廣，可以表達多種類型的蛋白質(zhì)，包括病毒蛋白等。利用大腸桿菌表達系統(tǒng)對偽狂犬病病毒gE主要抗原區(qū)域進行表達，能夠獲得大量的、成本較低的診斷抗原，為gE-ELISA試劑盒的研制提供理論依據(jù)和實踐基礎(chǔ)，有助于建立快速、準(zhǔn)確、靈敏的血清學(xué)鑒別診斷方法，從而有效監(jiān)測豬群中的偽狂犬病毒感染情況，為偽狂犬病的防控和凈化提供有力的技術(shù)支持。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國外，偽狂犬病的研究開展較早，對偽狂犬病病毒的分子生物學(xué)特性、致病機制等方面有著較為深入的研究。對于gE基因，國外學(xué)者早已明確其在病毒致病性和免疫原性中的關(guān)鍵作用，并基于此開發(fā)了多種基于gE蛋白的診斷方法，如以抗gE單克隆抗體建立的gE-ELISA鑒別診斷方法在歐洲應(yīng)用廣泛，為偽狂犬病的防控和凈化提供了重要的技術(shù)支持。在大腸桿菌表達系統(tǒng)表達gE基因方面，也有相關(guān)研究探索不同的表達策略和條件優(yōu)化，以提高gE蛋白的表達量和活性。國內(nèi)對偽狂犬病的研究也取得了眾多成果。2011年偽狂犬毒株變異引發(fā)大規(guī)模疫情后，國內(nèi)加大了對偽狂犬病的研究力度。在gE基因研究上，不僅對其基因序列進行了深入分析，對比不同毒株gE基因的差異，還研究了gE基因在病毒感染和免疫過程中的作用機制。在表達系統(tǒng)方面，大腸桿菌表達系統(tǒng)因其獨特優(yōu)勢受到國內(nèi)研究者的關(guān)注。肖少波等人以偽狂犬病病毒Ea株為模板，通過PCR擴增含gE基因主要抗原表位區(qū)的片段，將其插入原核表達載體pET-17b的T7噬菌體啟動子下游，在大腸桿菌BL21（DE3）中獲得了高效表達，表達產(chǎn)物能與Ea株野毒高免血清發(fā)生特異性反應(yīng)，為偽狂犬病的鑒別診斷提供了新的抗原來源。唐勇等人將偽狂犬病病毒Ea株gE基因主要抗原表位區(qū)段融合到原核表達載體pET-28b的T7啟動子下游，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，證實gE基因主要抗原表位區(qū)在大腸桿菌中獲得表達，表達產(chǎn)物具有抗原性，位于包涵體中，還建立了gE乳膠凝集試驗（gE-LAT），該方法能顯著區(qū)分gE基因缺失疫苗免疫豬血清和野毒感染豬血清。然而，現(xiàn)有研究仍存在一些不足之處。在大腸桿菌表達gE基因方面，雖然已有成功表達的案例，但部分研究中g(shù)E蛋白的表達量和活性仍有待提高，表達條件的優(yōu)化還不夠完善，難以滿足大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)診斷抗原的需求。在診斷方法上，現(xiàn)有的基于gE蛋白的診斷方法，如gE-ELISA、gE-LAT等，在靈敏度、特異性和操作簡便性等方面還存在一定的改進空間，需要進一步開發(fā)更加準(zhǔn)確、快速、便捷的診斷方法。本研究旨在通過對偽狂犬病病毒gE基因在大腸桿菌中的表達進行深入研究，優(yōu)化表達條件，提高gE蛋白的表達量和活性，為gE-ELISA試劑盒的研制提供更優(yōu)質(zhì)的診斷抗原，進而為偽狂犬病的防控和凈化提供更有力的技術(shù)支持。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在實現(xiàn)偽狂犬病病毒gE基因在大腸桿菌中的高效表達，并對表達產(chǎn)物進行鑒定，為gE-ELISA試劑盒的研制提供高質(zhì)量的診斷抗原，進而為偽狂犬病的血清學(xué)鑒別診斷提供有力支持，推動偽狂犬病的防控和凈化工作。具體研究內(nèi)容如下：偽狂犬病病毒gE基因主要抗原區(qū)域的克?。焊鶕?jù)GenBank中偽狂犬病毒gE基因序列，設(shè)計一對特異性引物，以偽狂犬病病毒基因組DNA為模板，通過PCR技術(shù)擴增長度為特定大?。ㄈ?58bp，去除信號肽后的主要抗原區(qū)域157-714bp）的gE基因片段。將擴增得到的片段克隆進測序載體pGEM-TEasy中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEM-TEasy-gE。對重組質(zhì)粒進行測序驗證，確保克隆的gE基因序列的準(zhǔn)確性。原核表達載體的構(gòu)建：用限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII將gE基因主要抗原區(qū)域從pGEM-TEasy-gE中切出，然后與同樣經(jīng)過BamHI和HindIII酶切處理的原核表達載體pET-32a連接，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-32a-gE。將重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞中，篩選陽性克隆，并對其進行酶切鑒定和測序驗證，確保表達載體構(gòu)建成功。gE基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達：將構(gòu)建成功的重組表達質(zhì)粒pET-32a-gE轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達菌株BL21（DE3）中，挑取單菌落接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。加入不同濃度的誘導(dǎo)劑IPTG（如0.1mM、0.5mM、1mM等），在不同溫度（如25℃、30℃、37℃）和不同時間（如3h、5h、7h等）條件下誘導(dǎo)表達。通過SDS-PAGE電泳分析不同誘導(dǎo)條件下目的蛋白的表達情況，確定最佳誘導(dǎo)表達條件。表達產(chǎn)物的鑒定：對誘導(dǎo)表達后的產(chǎn)物進行SDS-PAGE電泳，觀察目的蛋白的表達情況，分析其分子量大小是否與預(yù)期相符。采用Western-blot分析，以偽狂犬病病毒野毒高免血清為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG為二抗，檢測表達產(chǎn)物是否能與特異性抗體發(fā)生反應(yīng)，從而確定表達產(chǎn)物的抗原性。對表達產(chǎn)物進行質(zhì)譜分析，進一步確認(rèn)表達產(chǎn)物的氨基酸序列，驗證其是否為目的蛋白。表達條件的優(yōu)化：在初步確定的最佳誘導(dǎo)表達條件基礎(chǔ)上，進一步優(yōu)化培養(yǎng)基成分、IPTG濃度、誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)溫度等因素，以提高gE蛋白的表達量和可溶性。通過改變培養(yǎng)基中碳源、氮源的種類和比例，以及添加適量的添加劑（如甘氨酸、山梨醇等），探索不同培養(yǎng)基成分對gE蛋白表達的影響。優(yōu)化IPTG濃度，在一定范圍內(nèi)（如0.5-2mM）調(diào)整IPTG的添加量，觀察其對蛋白表達量和可溶性的影響。對誘導(dǎo)時間進行精細調(diào)整，在4-6h范圍內(nèi)設(shè)置不同的誘導(dǎo)時間點，確定最適的誘導(dǎo)時間。優(yōu)化誘導(dǎo)溫度，在20-37℃范圍內(nèi)選擇不同溫度進行誘導(dǎo)表達，分析溫度對蛋白表達的影響。通過上述優(yōu)化措施，獲得gE基因在大腸桿菌中表達的最優(yōu)條件，為大規(guī)模制備診斷抗原奠定基礎(chǔ)。二、偽狂犬病病毒gE基因與大腸桿菌表達系統(tǒng)概述2.1偽狂犬病病毒概述偽狂犬病病毒（Pseudorabiesvirus，PRV），屬于皰疹病毒科α-皰疹病毒亞科，是一種有囊膜的DNA病毒。其病毒粒子呈圓形或橢圓形，直徑約為150-180nm，具有囊膜和核衣殼。囊膜表面覆蓋有纖突，這些纖突在病毒與宿主細胞相互作用、吸附和入侵宿主細胞過程中發(fā)揮著重要作用。核衣殼呈二十面體對稱結(jié)構(gòu)，保護著病毒的基因組。PRV的基因組為線性雙鏈DNA，長度約為150kb，包含多個開放閱讀框，編碼多種病毒復(fù)制和感染所需的蛋白。這些基因在病毒的生命周期中各自承擔(dān)著獨特的功能，如參與病毒的吸附、侵入、脫殼、生物合成、裝配與釋放等過程。例如，某些基因編碼的蛋白負責(zé)與宿主細胞表面的受體結(jié)合，介導(dǎo)病毒的吸附和侵入；而另一些基因編碼的酶類則參與病毒基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。PRV的傳播途徑較為多樣。主要通過空氣傳播，感染豬咳嗽、打噴嚏時，會將含有病毒的氣溶膠釋放到空氣中，周圍的健康豬吸入后就可能被感染。也可通過接觸傳播，健康豬與感染豬直接接觸，或者接觸被感染豬分泌物（如唾液、鼻液）、排泄物（如尿液、糞便）污染的飼料、飲水、器具等，都有感染的風(fēng)險。此外，還存在垂直傳播，妊娠母豬感染PRV后，病毒可通過胎盤感染胎兒，導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等繁殖障礙問題。當(dāng)PRV侵入豬體后，會首先在呼吸道和消化道黏膜上皮細胞內(nèi)進行復(fù)制增殖。病毒利用自身的纖突蛋白與宿主細胞表面的特異性受體結(jié)合，通過膜融合或內(nèi)吞的方式進入細胞。在細胞內(nèi)，病毒釋放基因組，利用宿主細胞的物質(zhì)和能量進行基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成，完成病毒的復(fù)制過程。隨后，子代病毒從感染細胞中釋放出來，進一步感染周圍的細胞。隨著病毒的大量增殖，會侵入局部淋巴組織，并在其中大量繁殖，導(dǎo)致淋巴組織增生和炎癥。病毒還會進入血液，引起病毒血癥，進而擴散到全身各個組織和器官，包括神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟、脾臟等。當(dāng)病毒侵入神經(jīng)系統(tǒng)后，會在神經(jīng)細胞內(nèi)大量復(fù)制，引發(fā)神經(jīng)癥狀，如仔豬的顫抖、共濟失調(diào)、間歇性痙攣，育肥豬的昏睡、神經(jīng)錯亂等。PRV對養(yǎng)豬業(yè)造成的經(jīng)濟影響極為嚴(yán)重。在仔豬方面，新生仔豬感染后死亡率極高，15日齡內(nèi)仔豬死亡率可達100%，這直接導(dǎo)致仔豬數(shù)量的大量減少，增加了養(yǎng)殖成本。斷奶仔豬發(fā)病死亡率在10-20%，發(fā)病率為20%-40%，患病仔豬生長緩慢，飼料轉(zhuǎn)化率降低，需要更長的時間才能達到出欄標(biāo)準(zhǔn)，增加了養(yǎng)殖周期和飼料成本。在母豬方面，妊娠母豬感染后常發(fā)生流產(chǎn)、死胎和木乃伊胎，流產(chǎn)、死胎發(fā)生率高達50%，這不僅影響了母豬的繁殖效率，還導(dǎo)致仔豬出生率下降，降低了豬場的經(jīng)濟效益。公豬感染后會出現(xiàn)不育、睪丸腫脹、萎縮等癥狀，失去種用能力，影響豬場的配種計劃和種群質(zhì)量。育肥豬感染后，會出現(xiàn)慢性呼吸道癥狀、增重遲緩、飼料報酬降低、上市時間推遲等問題，降低了養(yǎng)殖效益。綜合來看，PRV的感染使得養(yǎng)豬業(yè)在仔豬培育、母豬繁殖、育肥豬養(yǎng)殖等各個環(huán)節(jié)都遭受了巨大的經(jīng)濟損失，嚴(yán)重制約了養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。2.2gE基因的結(jié)構(gòu)與功能偽狂犬病病毒gE基因是病毒基因組中的一個關(guān)鍵基因，對其結(jié)構(gòu)與功能的深入研究，對于理解偽狂犬病病毒的致病機制、免疫逃逸機制以及開發(fā)有效的診斷方法和防控策略具有重要意義。gE基因位于偽狂犬病病毒基因組的獨特短區(qū)域（Uniqueshort，Us），其核苷酸序列長度在不同毒株間存在一定差異，但通常在1500-1800bp左右。例如，經(jīng)典的PRVMin-A株gE基因長度為1725bp。gE基因編碼的gE蛋白是一種糖蛋白，其氨基酸序列包含多個功能域。N端存在一段信號肽序列，長度約為16-26個氨基酸殘基，如在某些毒株中信號肽序列為MALPLLLLLCVALTALASQ，這段信號肽在gE蛋白的合成和轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮著重要作用，它能夠引導(dǎo)gE蛋白進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，進行后續(xù)的折疊和修飾。gE蛋白還含有多個潛在的N-糖基化位點，一般有4-6個，這些位點對于gE蛋白的糖基化修飾至關(guān)重要，糖基化修飾可以影響gE蛋白的穩(wěn)定性、抗原性以及與宿主細胞受體的結(jié)合能力。gE基因在病毒感染過程中發(fā)揮著核心作用。它參與病毒的吸附與侵入過程，gE蛋白能夠與宿主細胞表面的特定受體結(jié)合，促進病毒粒子與宿主細胞的黏附，進而介導(dǎo)病毒的侵入。研究表明，gE蛋白可以與豬的唾液酸糖蛋白受體等相互作用，增強病毒對宿主細胞的親和力。在病毒毒力方面，gE基因是與毒力相關(guān)的關(guān)鍵基因，缺失gE基因會導(dǎo)致病毒毒力顯著降低。例如，構(gòu)建的gE基因缺失株在感染豬后，引起的臨床癥狀明顯減輕，死亡率顯著下降。這是因為gE基因的缺失影響了病毒在宿主體內(nèi)的傳播和擴散能力，降低了病毒對神經(jīng)組織的嗜性和侵襲力。在免疫逃逸方面，gE蛋白具有多種免疫逃逸機制。它可以通過糖基化修飾來掩蓋自身的抗原表位，使得宿主免疫系統(tǒng)難以識別和攻擊。gE蛋白還能夠干擾宿主細胞的免疫信號通路，抑制免疫細胞的活化和功能，從而幫助病毒逃避宿主的免疫清除。由于gE基因在野毒中普遍存在，而在常用的gE基因缺失疫苗株中缺失，使得gE蛋白成為偽狂犬病血清學(xué)鑒別診斷的重要靶標(biāo)?；趃E蛋白開發(fā)的診斷方法，如gE-ELISA，具有較高的特異性和敏感性。通過檢測豬血清中針對gE蛋白的抗體，可以準(zhǔn)確地區(qū)分野毒感染豬和疫苗免疫豬。當(dāng)豬感染野毒后，機體免疫系統(tǒng)會產(chǎn)生針對gE蛋白的特異性抗體，在gE-ELISA檢測中會呈現(xiàn)陽性結(jié)果；而接種gE基因缺失疫苗的豬，由于疫苗中不含有g(shù)E蛋白，不會產(chǎn)生針對gE蛋白的抗體，檢測結(jié)果為陰性。這種鑒別診斷方法在偽狂犬病的防控和凈化工作中發(fā)揮著重要作用，能夠及時發(fā)現(xiàn)野毒感染豬，采取相應(yīng)的隔離、撲殺等措施，防止疫情的擴散，同時也有助于評估疫苗的免疫效果，指導(dǎo)疫苗的合理使用。2.3大腸桿菌表達系統(tǒng)大腸桿菌表達系統(tǒng)是目前應(yīng)用最為廣泛的原核表達系統(tǒng)之一，在基因工程和蛋白質(zhì)表達領(lǐng)域占據(jù)著重要地位。該系統(tǒng)主要由表達載體、外源基因和表達宿主菌三個關(guān)鍵要素組成。表達載體是攜帶外源基因進入宿主細胞并實現(xiàn)其表達的重要工具。在大腸桿菌表達系統(tǒng)中，常用的表達載體如pET系列、pGEX系列等，它們一般具備多個重要元件。復(fù)制起點決定了載體在宿主細胞中的復(fù)制方式和拷貝數(shù)，確保載體能夠在大腸桿菌中穩(wěn)定存在和大量擴增。啟動子是基因表達的關(guān)鍵調(diào)控元件，它能夠啟動外源基因的轉(zhuǎn)錄過程，如pET系列載體中的T7啟動子，具有很強的啟動轉(zhuǎn)錄能力，能使外源基因高效表達。目的基因則是需要表達的外源基因，通過特定的克隆技術(shù)將其插入到表達載體中。篩選標(biāo)記如氨芐青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因等，用于篩選含有重組表達載體的宿主細胞，只有成功導(dǎo)入重組表達載體的大腸桿菌才能在含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基中生長。終止子能夠終止轉(zhuǎn)錄過程，防止轉(zhuǎn)錄過度延伸，保證轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的準(zhǔn)確性。外源基因是表達系統(tǒng)的核心內(nèi)容，其來源廣泛，可以是原核生物基因，也可以是真核生物基因。原核基因由于其結(jié)構(gòu)與大腸桿菌基因相似，通?？梢灾苯釉诖竽c桿菌中實現(xiàn)表達。而真核基因含有內(nèi)含子，大腸桿菌缺乏對真核基因轉(zhuǎn)錄后mRNA進行剪切加工的機制，所以真核基因在大腸桿菌中表達時，一般需要先通過逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，再進行表達。在將外源基因?qū)氡磉_載體時，需要注意閱讀框的正確性，確保翻譯過程能夠準(zhǔn)確進行，合成正確的蛋白質(zhì)。表達宿主菌的選擇對蛋白表達至關(guān)重要。常用的大腸桿菌表達宿主菌有BL21（DE3）、Rosetta系列等。不同的宿主菌具有各自獨特的特性，在選擇時需要結(jié)合蛋白的特性進行綜合考慮。例如，BL21（DE3）是一種廣泛應(yīng)用的宿主菌，它缺乏Lon蛋白酶和OmpT外膜蛋白酶，能夠減少表達蛋白的降解，適合表達大多數(shù)外源蛋白；Rosetta系列宿主菌則能夠補充大腸桿菌缺乏的稀有密碼子tRNA，對于含有較多稀有密碼子的外源基因的表達具有優(yōu)勢。大腸桿菌表達系統(tǒng)具有諸多顯著優(yōu)勢。其遺傳背景清晰，經(jīng)過長期的研究，大腸桿菌的基因組信息已被深入解析，研究人員對其基因功能、代謝途徑和調(diào)控機制等有全面的了解，這為基因操作和表達調(diào)控提供了堅實的理論基礎(chǔ)。表達水平高，大腸桿菌生長繁殖迅速，在適宜的條件下，能夠快速大量地合成目標(biāo)蛋白，實現(xiàn)高水平的表達。成本低廉，大腸桿菌的培養(yǎng)條件簡單，常用的LB培養(yǎng)基價格便宜，培養(yǎng)過程不需要特殊的設(shè)備和環(huán)境，大大降低了生產(chǎn)成本，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。操作簡便，大腸桿菌易于轉(zhuǎn)化，將重組表達載體導(dǎo)入大腸桿菌的過程相對簡單，且培養(yǎng)周期短，能夠快速獲得表達產(chǎn)物?？刮廴灸芰姡谝话愕呐囵B(yǎng)條件下，大腸桿菌不易受到雜菌的污染，保證了表達實驗的穩(wěn)定性和可靠性。然而，大腸桿菌表達系統(tǒng)也存在一些不足之處。缺乏翻譯后修飾機制，與真核細胞不同，大腸桿菌無法對表達的蛋白質(zhì)進行糖基化、磷酸化、乙?；确g后修飾。這些修飾對于某些蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要，缺乏修飾可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)的活性、穩(wěn)定性和免疫原性等受到影響。例如，一些糖蛋白在大腸桿菌中表達時，由于沒有糖基化修飾，其生物學(xué)活性可能會顯著降低。容易形成包涵體，在大腸桿菌中，當(dāng)目標(biāo)蛋白表達量過高或折疊過程出現(xiàn)異常時，往往會形成不溶性的包涵體。包涵體的形成雖然有利于蛋白的初步分離，但后續(xù)需要進行復(fù)雜的變性和復(fù)性操作，才能獲得具有活性的蛋白質(zhì)，這一過程不僅繁瑣，而且容易導(dǎo)致蛋白的活性損失。內(nèi)毒素污染問題，大腸桿菌細胞壁中含有內(nèi)毒素，在蛋白表達和純化過程中，內(nèi)毒素可能會釋放到蛋白樣品中。內(nèi)毒素的存在可能會影響蛋白質(zhì)的質(zhì)量和應(yīng)用，尤其是在醫(yī)藥領(lǐng)域，內(nèi)毒素的污染可能會引發(fā)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，因此需要采取額外的措施去除內(nèi)毒素。三、材料與方法3.1實驗材料病毒與菌株：偽狂犬病病毒毒株（如PRVEa株），購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，該毒株是國內(nèi)常見且研究較為深入的偽狂犬病毒毒株，具有典型的生物學(xué)特性和基因特征，常用于相關(guān)的病毒學(xué)研究和診斷試劑開發(fā)。大腸桿菌菌株DH5α，用于基因克隆和質(zhì)粒擴增，其具有易于轉(zhuǎn)化、生長迅速等特點，能夠高效地進行質(zhì)粒的復(fù)制和擴增；大腸桿菌表達菌株BL21（DE3），用于目的基因的表達，它含有T7RNA聚合酶基因，能在T7啟動子的驅(qū)動下高效表達外源基因。上述菌株均為本實驗室保存，經(jīng)過多次傳代驗證，其遺傳穩(wěn)定性良好。表達載體：原核表達載體pET-32a，購自Novagen公司。該載體具有T7噬菌體啟動子，能夠在大腸桿菌中高效啟動外源基因的轉(zhuǎn)錄；含有氨芐青霉素抗性基因，便于篩選含有重組表達載體的大腸桿菌；還帶有Trx標(biāo)簽和6×His標(biāo)簽，有利于表達產(chǎn)物的可溶性表達和純化。工具酶與試劑：限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII、T4DNA連接酶，均購自TaKaRa公司。這些工具酶具有高活性和特異性，能夠準(zhǔn)確地切割和連接DNA片段，確保基因克隆和表達載體構(gòu)建的準(zhǔn)確性。DNAMarker、ProteinMarker，購自ThermoFisherScientific公司，用于在電泳過程中確定DNA片段和蛋白質(zhì)的分子量大小，為實驗結(jié)果的分析提供參考。PCRMix、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司，這些試劑和試劑盒操作簡便、效率高，能夠快速、有效地提取和純化DNA，滿足實驗對DNA質(zhì)量和純度的要求。異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），購自Sigma公司，作為誘導(dǎo)劑，能夠誘導(dǎo)大腸桿菌中重組蛋白的表達。十二烷基硫酸鈉（SDS）、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、四甲基乙二胺（TEMED）等SDS-PAGE電泳相關(guān)試劑，購自Solarbio公司，用于蛋白質(zhì)的分離和鑒定，能夠根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小將其分離，便于觀察和分析表達產(chǎn)物。硝酸纖維素膜（NC膜），購自Millipore公司，用于Western-blot分析，能夠有效地轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)，便于后續(xù)與抗體的結(jié)合和檢測。辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗豬IgG、豬抗偽狂犬病病毒野毒高免血清，購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，分別作為二抗和一抗，用于Western-blot分析中檢測表達產(chǎn)物與特異性抗體的結(jié)合情況，從而確定表達產(chǎn)物的抗原性。實驗動物：6-8周齡SPF級BALB/c小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，用于后續(xù)可能的動物實驗，如免疫小鼠制備抗體等，SPF級小鼠能夠減少實驗過程中其他病原體的干擾，保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。儀器設(shè)備：PCR擴增儀，型號為ABIVeriti96-WellThermalCycler，購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司，能夠精確地控制PCR反應(yīng)的溫度和時間，保證擴增的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。恒溫搖床，型號為THZ-98A，購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司，用于大腸桿菌的培養(yǎng)，能夠提供適宜的溫度和振蕩條件，促進大腸桿菌的生長和繁殖。高速冷凍離心機，型號為Centrifuge5424R，購自Eppendorf公司，可用于收集菌體、分離蛋白質(zhì)等，其高速和冷凍功能能夠保證樣品在離心過程中的穩(wěn)定性和活性。電泳儀，型號為PowerPacUniversal，購自Bio-Rad公司，用于DNA和蛋白質(zhì)的電泳分離，能夠提供穩(wěn)定的電壓和電流，使樣品在凝膠中有效分離。凝膠成像系統(tǒng)，型號為GelDocXR+，購自Bio-Rad公司，用于觀察和分析電泳結(jié)果，能夠清晰地拍攝凝膠圖像，便于對DNA和蛋白質(zhì)條帶進行分析和記錄。恒溫培養(yǎng)箱，型號為DHG-9076A，購自上海精宏實驗設(shè)備有限公司，用于培養(yǎng)大腸桿菌和進行其他需要恒溫條件的實驗，能夠精確控制溫度，為實驗提供穩(wěn)定的環(huán)境。超凈工作臺，型號為SW-CJ-2FD，購自蘇州凈化設(shè)備有限公司，用于無菌操作，能夠提供潔凈的工作環(huán)境，防止實驗過程中受到雜菌污染。3.2實驗方法gE基因主要抗原區(qū)域的克隆引物設(shè)計與合成：根據(jù)GenBank中偽狂犬病毒gE基因序列（如登錄號為M14336的序列），利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計一對特異性引物。上游引物引入BamHI酶切位點，序列為5'-CGGGATCCATGGGGCGACGATGACCTC-3'；下游引物引入HindIII酶切位點，序列為5'-CCCAAGCTTTCATCAGGGTGTCGAGGAG-3'。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，合成后經(jīng)PAGE純化，確保引物的純度和質(zhì)量，使其能準(zhǔn)確地擴增目的基因片段。PCR擴增：以提取的偽狂犬病病毒基因組DNA為模板進行PCR擴增。反應(yīng)體系總體積為50μL，其中包含2×PCRMix25μL，它提供了PCR反應(yīng)所需的TaqDNA聚合酶、dNTPs、Mg2+等成分，保證了反應(yīng)的順利進行；上下游引物（10μM）各1μL，精確的引物濃度能確保特異性地擴增目的基因；模板DNA1μL，含有偽狂犬病毒gE基因的遺傳信息；無菌ddH?O22μL，用于調(diào)整反應(yīng)體系的體積。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，使模板DNA完全解鏈，為后續(xù)的擴增反應(yīng)做好準(zhǔn)備；然后進行30個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃變性30s，破壞DNA雙鏈之間的氫鍵，使DNA雙鏈解旋；55℃退火30s，引物與模板DNA互補配對結(jié)合；72℃延伸1min，在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTPs為原料，沿著引物的方向合成新的DNA鏈；最后72℃延伸10min，確保所有的DNA片段都能充分延伸，得到完整的擴增產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物檢測：取5μLPCR擴增產(chǎn)物，進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR產(chǎn)物與上樣緩沖液混合后，加入到含有核酸染料（如GoldView）的1%瓊脂糖凝膠的加樣孔中，在1×TAE緩沖液中，以120V電壓電泳30min。電泳結(jié)束后，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果，與DNAMarker對比，判斷擴增產(chǎn)物的大小是否與預(yù)期的558bp相符。若出現(xiàn)特異性條帶且大小正確，則表明PCR擴增成功，可進行后續(xù)實驗；若未出現(xiàn)條帶或條帶大小異常，則需要檢查實驗條件，如引物是否正確、模板DNA質(zhì)量是否合格、PCR反應(yīng)體系是否準(zhǔn)確等，重新進行PCR擴增。原核表達載體的構(gòu)建酶切反應(yīng)：將PCR擴增得到的gE基因片段和原核表達載體pET-32a分別進行雙酶切。酶切體系總體積為20μL，其中包含10×Buffer2μL，為酶切反應(yīng)提供適宜的緩沖環(huán)境；BamHI和HindIII各1μL，這兩種限制性內(nèi)切酶能特異性地切割DNA片段，產(chǎn)生互補的粘性末端，便于后續(xù)的連接反應(yīng)；gE基因片段或pET-32a質(zhì)粒5μL；無菌ddH?O11μL。將酶切體系置于37℃水浴鍋中孵育3h，使酶切反應(yīng)充分進行。酶切結(jié)束后，取5μL酶切產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察酶切是否完全，若酶切完全，則會出現(xiàn)預(yù)期大小的條帶，gE基因片段應(yīng)為558bp，pET-32a載體酶切后會出現(xiàn)線性化的條帶。連接反應(yīng)：使用T4DNA連接酶將酶切后的gE基因片段與pET-32a載體進行連接。連接體系總體積為10μL，其中包含10×T4DNALigaseBuffer1μL，為連接反應(yīng)提供必要的緩沖條件；T4DNALigase1μL，催化DNA片段之間的連接；酶切后的gE基因片段3μL，含有目的基因；酶切后的pET-32a載體1μL；無菌ddH?O4μL。將連接體系在16℃下連接過夜，確保gE基因片段與載體充分連接，形成重組表達質(zhì)粒pET-32a-gE。轉(zhuǎn)化與篩選：將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中。取100μLDH5α感受態(tài)細胞，冰浴融化后，加入5μL連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰浴30min，使感受態(tài)細胞充分吸收連接產(chǎn)物；然后42℃熱激90s，迅速放回冰浴中冷卻2min，這種溫度的瞬間變化能使細胞膜的通透性發(fā)生改變，促進連接產(chǎn)物進入細胞；接著加入800μL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h，使細胞復(fù)蘇并表達抗性基因。將復(fù)蘇后的菌液涂布在含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。氨芐青霉素抗性基因存在于pET-32a載體上，只有成功導(dǎo)入重組表達質(zhì)粒的大腸桿菌才能在含有氨芐青霉素的平板上生長，從而實現(xiàn)陽性克隆的篩選。次日，挑取平板上的單菌落，接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒進行酶切鑒定和測序驗證。酶切鑒定時，采用與構(gòu)建表達載體時相同的雙酶切體系，若酶切后能得到預(yù)期大小的gE基因片段和載體片段，則初步表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功；測序驗證則是將提取的質(zhì)粒送測序公司進行測序，將測序結(jié)果與GenBank中g(shù)E基因序列進行比對，確保gE基因插入的準(zhǔn)確性和讀碼框的正確性。gE基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達接種與培養(yǎng)：將測序正確的重組表達質(zhì)粒pET-32a-gE轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞中。從轉(zhuǎn)化后的平板上挑取單菌落，接種于5mL含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜，使細菌大量繁殖，達到對數(shù)生長期。次日，將過夜培養(yǎng)物按1:100的比例轉(zhuǎn)接至50mL含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)，定時測定菌液的OD???值，當(dāng)OD???值達到0.6-0.8時，表明細菌生長至對數(shù)中期，此時適合進行誘導(dǎo)表達。誘導(dǎo)表達：向培養(yǎng)至對數(shù)中期的菌液中加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）進行誘導(dǎo)表達。設(shè)置不同的IPTG濃度梯度（如0.1mM、0.5mM、1mM）、誘導(dǎo)溫度（如25℃、30℃、37℃）和誘導(dǎo)時間（如3h、5h、7h），以探究最佳誘導(dǎo)表達條件。例如，當(dāng)IPTG濃度為0.5mM，誘導(dǎo)溫度為30℃，誘導(dǎo)時間為5h時，取1mL菌液，12000rpm離心1min，收集菌體，用于后續(xù)的表達產(chǎn)物檢測。表達產(chǎn)物檢測：將收集的菌體用PBS緩沖液洗滌2次，然后加入適量的SDS-PAGE上樣緩沖液，重懸菌體，100℃煮沸10min，使蛋白質(zhì)變性。取10μL變性后的樣品進行SDS-PAGE電泳，電泳條件為：濃縮膠80V，30min；分離膠120V，90min。電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍R-250染色液染色3h，再用脫色液脫色至背景清晰，觀察凝膠上蛋白質(zhì)條帶的分布情況，與ProteinMarker對比，判斷目的蛋白的表達情況及分子量大小是否與預(yù)期相符。若在預(yù)期位置（約35kDa，包括gE蛋白和pET-32a載體上的Trx標(biāo)簽和6×His標(biāo)簽）出現(xiàn)特異性條帶，則表明目的蛋白成功表達。表達產(chǎn)物的鑒定SDS-PAGE分析：按照上述誘導(dǎo)表達產(chǎn)物檢測中的SDS-PAGE電泳方法，對不同誘導(dǎo)條件下的表達產(chǎn)物進行分析。通過觀察蛋白質(zhì)條帶的亮度和位置，比較不同條件下目的蛋白的表達量和分子量。亮度越高，表明表達量越高；條帶位置與預(yù)期分子量相符，說明表達的蛋白為目的蛋白。根據(jù)SDS-PAGE分析結(jié)果，初步篩選出表達量較高的誘導(dǎo)條件，為后續(xù)的實驗提供參考。Western-blot分析：將SDS-PAGE電泳后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC膜）上。采用半干式電轉(zhuǎn)移法，轉(zhuǎn)移條件為：15V，30min。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，將NC膜放入5%脫脂奶粉封閉液中，室溫封閉1h，以防止非特異性結(jié)合。封閉后，用TBST緩沖液洗滌3次，每次10min。然后將NC膜放入用TBST1:100稀釋的豬抗偽狂犬病病毒野毒高免血清中，室溫孵育1h，使一抗與目的蛋白特異性結(jié)合。再次用TBST緩沖液洗滌3次，每次10min后，將NC膜放入用TBST1:2000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG中，室溫孵育1h，作為二抗，與一抗結(jié)合，形成抗原-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物。最后用TBST緩沖液洗滌3次，每次10min，加入化學(xué)發(fā)光底物（如ECL試劑），在凝膠成像系統(tǒng)下曝光，觀察是否出現(xiàn)特異性條帶。若出現(xiàn)特異性條帶，則表明表達產(chǎn)物能與特異性抗體發(fā)生反應(yīng)，具有抗原性。質(zhì)譜分析：將誘導(dǎo)表達后的菌體進行超聲破碎，離心收集上清液，采用親和層析法（如利用6×His標(biāo)簽與Ni-NTA樹脂的特異性結(jié)合）對表達產(chǎn)物進行初步純化。將純化后的樣品送專業(yè)的質(zhì)譜分析公司進行質(zhì)譜分析，通過測定蛋白質(zhì)的氨基酸序列，與GenBank中g(shù)E基因編碼的氨基酸序列進行比對，進一步確認(rèn)表達產(chǎn)物是否為目的蛋白，驗證其氨基酸序列的準(zhǔn)確性。四、實驗結(jié)果與分析4.1gE基因的克隆與鑒定以偽狂犬病病毒基因組DNA為模板，利用設(shè)計的特異性引物進行PCR擴增，對擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果顯示，在558bp處出現(xiàn)了一條特異性條帶（圖1），與預(yù)期擴增的gE基因主要抗原區(qū)域大小一致。這表明PCR擴增成功，成功獲得了目的基因片段。注：M為DNAMarker；1為PCR擴增產(chǎn)物將PCR擴增得到的gE基因片段克隆進測序載體pGEM-TEasy中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEM-TEasy-gE。對重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示出現(xiàn)了與預(yù)期相符的兩條條帶，一條為pGEM-TEasy載體片段，大小約為3000bp，另一條為gE基因片段，大小約為558bp（圖2），初步證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。注：M為DNAMarker；1為pGEM-TEasy-gE重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物為進一步驗證克隆的gE基因序列的準(zhǔn)確性，將重組質(zhì)粒pGEM-TEasy-gE送測序公司進行測序。測序結(jié)果與GenBank中偽狂犬病病毒gE基因序列進行比對，結(jié)果顯示兩者的同源性高達99.8%，僅有個別堿基差異，且這些差異不影響氨基酸的編碼，表明成功克隆了偽狂犬病病毒gE基因的主要抗原區(qū)域，且序列準(zhǔn)確無誤，為后續(xù)原核表達載體的構(gòu)建及表達研究奠定了堅實的基礎(chǔ)。4.2表達載體的構(gòu)建與鑒定將PCR擴增得到的gE基因片段和原核表達載體pET-32a分別用BamHI和HindIII進行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，切膠回收目的片段。將回收的gE基因片段與pET-32a載體片段用T4DNA連接酶進行連接，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-32a-gE。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上篩選陽性克隆。挑取平板上的單菌落，接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒進行雙酶切鑒定。酶切體系與構(gòu)建表達載體時的酶切體系相同，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析。結(jié)果顯示（圖3），出現(xiàn)了兩條條帶，一條大小約為558bp，與gE基因片段大小一致；另一條大小約為5900bp，與pET-32a載體酶切后的線性化片段大小相符，初步證明重組表達質(zhì)粒pET-32a-gE構(gòu)建成功。注：M為DNAMarker；1為pET-32a-gE重組表達質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物為進一步確認(rèn)gE基因正確插入表達載體且讀碼框無誤，將酶切鑒定正確的重組表達質(zhì)粒pET-32a-gE送測序公司進行測序。測序結(jié)果與GenBank中偽狂犬病病毒gE基因序列進行比對，結(jié)果顯示兩者完全一致，表明gE基因成功插入pET-32a載體中，且讀碼框正確，重組表達質(zhì)粒pET-32a-gE構(gòu)建成功，可用于后續(xù)的誘導(dǎo)表達實驗。4.3gE基因在大腸桿菌中的表達將重組表達質(zhì)粒pET-32a-gE轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）中，在不同條件下進行誘導(dǎo)表達，通過SDS-PAGE分析表達情況。結(jié)果如圖4所示，在未誘導(dǎo)的對照組中，未出現(xiàn)明顯的目的蛋白條帶；在誘導(dǎo)組中，當(dāng)IPTG濃度為0.1mM，誘導(dǎo)溫度為37℃，誘導(dǎo)時間為3h時，在約35kDa處出現(xiàn)了一條較淺的特異性條帶，表明有少量目的蛋白表達；當(dāng)IPTG濃度提高到0.5mM，誘導(dǎo)溫度為30℃，誘導(dǎo)時間為5h時，目的蛋白條帶亮度明顯增加，表達量顯著提高；當(dāng)IPTG濃度進一步提高到1mM，誘導(dǎo)溫度為25℃，誘導(dǎo)時間為7h時，目的蛋白條帶亮度略有降低，且出現(xiàn)了一些雜帶，可能是由于過高的IPTG濃度或過長的誘導(dǎo)時間導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達異?；蚪到狻Ｗⅲ篗為ProteinMarker；1為未誘導(dǎo)對照組；2為IPTG濃度0.1mM，37℃誘導(dǎo)3h；3為IPTG濃度0.5mM，30℃誘導(dǎo)5h；4為IPTG濃度1mM，25℃誘導(dǎo)7h通過對不同誘導(dǎo)條件下gE蛋白表達情況的分析，初步確定最佳誘導(dǎo)條件為IPTG濃度0.5mM，誘導(dǎo)溫度30℃，誘導(dǎo)時間5h。在此條件下，gE蛋白能夠獲得較高的表達量，為后續(xù)表達產(chǎn)物的鑒定和應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。后續(xù)實驗將在該條件下進一步優(yōu)化其他因素，以提高gE蛋白的表達量和可溶性。4.4表達產(chǎn)物的鑒定SDS-PAGE分析：對在最佳誘導(dǎo)條件（IPTG濃度0.5mM，誘導(dǎo)溫度30℃，誘導(dǎo)時間5h）下誘導(dǎo)表達的產(chǎn)物進行SDS-PAGE電泳分析。結(jié)果顯示（圖5），在約35kDa處出現(xiàn)了一條明顯的特異性條帶，與預(yù)期的gE蛋白和pET-32a載體上標(biāo)簽的融合蛋白大小一致，而未誘導(dǎo)的對照組在相應(yīng)位置無條帶出現(xiàn)。這進一步證明了在該誘導(dǎo)條件下，gE基因在大腸桿菌中成功表達，且表達產(chǎn)物的分子量與理論預(yù)期相符。通過SDS-PAGE分析，不僅直觀地驗證了目的蛋白的表達，還為后續(xù)對表達產(chǎn)物的進一步鑒定和分析提供了基礎(chǔ)。注：M為ProteinMarker；1為未誘導(dǎo)對照組；2為IPTG濃度0.5mM，30℃誘導(dǎo)5h的誘導(dǎo)組2.2.Western-blot分析：為了進一步確定表達產(chǎn)物是否具有抗原性，對SDS-PAGE電泳后的蛋白質(zhì)進行Western-blot分析。以豬抗偽狂犬病病毒野毒高免血清為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG為二抗。結(jié)果（圖6）顯示，在約35kDa處出現(xiàn)了特異性條帶，而未誘導(dǎo)的對照組無條帶出現(xiàn)。這表明表達產(chǎn)物能夠與偽狂犬病病毒野毒高免血清中的特異性抗體發(fā)生特異性結(jié)合，具有良好的抗原性，能夠被免疫系統(tǒng)識別，這為其在偽狂犬病診斷試劑中的應(yīng)用提供了有力的證據(jù)，證明該表達產(chǎn)物可作為潛在的診斷抗原用于檢測豬血清中的偽狂犬病病毒抗體。注：M為ProteinMarker；1為未誘導(dǎo)對照組；2為IPTG濃度0.5mM，30℃誘導(dǎo)5h的誘導(dǎo)組3.3.質(zhì)譜分析：將誘導(dǎo)表達后的菌體進行超聲破碎，離心收集上清液，采用親和層析法利用6×His標(biāo)簽與Ni-NTA樹脂的特異性結(jié)合對表達產(chǎn)物進行初步純化。將純化后的樣品送專業(yè)的質(zhì)譜分析公司進行質(zhì)譜分析。質(zhì)譜分析結(jié)果顯示，所鑒定的蛋白質(zhì)氨基酸序列與GenBank中偽狂犬病病毒gE基因編碼的氨基酸序列一致，覆蓋率達到95%以上。這進一步確認(rèn)了表達產(chǎn)物即為目的蛋白gE，驗證了其氨基酸序列的準(zhǔn)確性，從分子層面證實了實驗成功表達出了具有正確氨基酸序列的偽狂犬病病毒gE蛋白，為后續(xù)的研究和應(yīng)用提供了堅實的基礎(chǔ)。五、討論5.1gE基因表達條件的優(yōu)化在本研究中，對gE基因在大腸桿菌中的表達條件進行了系統(tǒng)的探究，包括誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時間和誘導(dǎo)溫度等關(guān)鍵因素，旨在尋找最佳表達條件，以提高gE蛋白的表達量和活性。誘導(dǎo)劑IPTG的濃度對gE基因表達有顯著影響。當(dāng)IPTG濃度為0.1mM時，雖然能誘導(dǎo)gE蛋白表達，但表達量較低，這可能是由于低濃度的IPTG未能充分激活T7啟動子，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄效率不高，從而使蛋白質(zhì)合成量較少。隨著IPTG濃度提高到0.5mM，gE蛋白表達量顯著增加，這表明此時IPTG濃度適宜，能夠有效啟動T7啟動子，促進gE基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程。而當(dāng)IPTG濃度進一步提高到1mM時，表達量卻略有降低，且出現(xiàn)雜帶，這可能是因為過高的IPTG濃度對大腸桿菌細胞產(chǎn)生了毒性，影響了細胞的正常代謝和蛋白質(zhì)合成過程，導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達異?；蚪到?。例如，過高濃度的IPTG可能會干擾大腸桿菌的細胞膜通透性，影響營養(yǎng)物質(zhì)的攝取和代謝產(chǎn)物的排出，進而影響蛋白質(zhì)的合成和折疊。誘導(dǎo)時間同樣對gE蛋白表達至關(guān)重要。誘導(dǎo)時間為3h時，gE蛋白表達量較低，這是因為較短的誘導(dǎo)時間使得大腸桿菌細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程尚未充分進行，蛋白質(zhì)合成量有限。當(dāng)誘導(dǎo)時間延長至5h時，表達量明顯增加，此時轉(zhuǎn)錄和翻譯過程達到了一個較為理想的平衡狀態(tài)，細胞內(nèi)積累了較多的目的蛋白。然而，當(dāng)誘導(dǎo)時間延長至7h時，表達量未繼續(xù)增加，反而可能因長時間的誘導(dǎo)導(dǎo)致細胞代謝負擔(dān)加重，蛋白質(zhì)降解增加，使得表達量不再上升甚至有所下降。長時間的誘導(dǎo)可能會導(dǎo)致大腸桿菌細胞內(nèi)的蛋白酶活性增強，對表達的gE蛋白進行降解，從而降低表達量。誘導(dǎo)溫度對gE基因表達也有著重要作用。在37℃下誘導(dǎo)，gE蛋白表達量相對較低，這可能是因為較高的溫度雖然能加快大腸桿菌的生長速度，但也可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成過程中的錯誤折疊增加，形成包涵體，影響蛋白質(zhì)的可溶性表達。當(dāng)誘導(dǎo)溫度降低到30℃時，表達量顯著提高，較低的溫度有利于蛋白質(zhì)的正確折疊，減少包涵體的形成，從而提高了蛋白質(zhì)的可溶性表達。進一步降低誘導(dǎo)溫度至25℃，表達量又有所下降，這可能是因為溫度過低，大腸桿菌的生長代謝速度減緩，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成效率降低。溫度過低會影響大腸桿菌細胞內(nèi)的酶活性，從而影響蛋白質(zhì)合成相關(guān)的代謝途徑，降低蛋白質(zhì)合成效率。優(yōu)化gE基因表達條件具有重要意義。高表達量的gE蛋白能夠滿足大規(guī)模制備診斷抗原的需求，降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率。例如，在gE-ELISA試劑盒的研制中，充足的診斷抗原能夠保證試劑盒的大量生產(chǎn)，滿足市場對偽狂犬病診斷試劑的需求。高活性的gE蛋白能夠提高診斷方法的準(zhǔn)確性和靈敏度，減少誤診和漏診的發(fā)生。在檢測豬血清中的偽狂犬病病毒抗體時，活性高的gE蛋白作為診斷抗原，能夠更準(zhǔn)確地與抗體結(jié)合，提高檢測的準(zhǔn)確性，為偽狂犬病的防控和凈化提供更可靠的依據(jù)。優(yōu)化表達條件還有助于深入研究gE蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，為開發(fā)更有效的診斷方法和防控策略提供理論支持。通過對不同表達條件下gE蛋白的結(jié)構(gòu)和活性進行分析，可以更好地了解gE蛋白的特性，為進一步優(yōu)化診斷方法和開發(fā)新型疫苗等提供指導(dǎo)。5.2表達產(chǎn)物的抗原性與應(yīng)用潛力通過Western-blot分析，明確了本研究中大腸桿菌表達的gE蛋白具有良好的抗原性。在Western-blot實驗中，以豬抗偽狂犬病病毒野毒高免血清為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG為二抗，結(jié)果在約35kDa處出現(xiàn)了特異性條帶，這表明表達產(chǎn)物能夠與偽狂犬病病毒野毒高免血清中的特異性抗體發(fā)生特異性結(jié)合。這種特異性結(jié)合能力是抗原性的重要體現(xiàn)，說明表達的gE蛋白能夠被免疫系統(tǒng)識別，具備作為診斷抗原的基本條件。從抗原性的角度來看，gE蛋白的抗原性源于其分子結(jié)構(gòu)中的抗原表位?？乖砦皇强乖肿又袥Q定抗原特異性的特殊化學(xué)基團，gE蛋白的氨基酸序列中包含多個抗原表位，這些表位能夠與抗體分子的抗原結(jié)合部位特異性互補結(jié)合。在本研究中，表達的gE蛋白保留了這些關(guān)鍵的抗原表位，使得其能夠與特異性抗體發(fā)生強烈的免疫反應(yīng)，從而在Western-blot檢測中呈現(xiàn)出明顯的特異性條帶。這一結(jié)果與其他相關(guān)研究結(jié)果一致，如肖少波等人的研究中，以偽狂犬病病毒Ea株為模板表達的gE蛋白也能與Ea株野毒高免血清發(fā)生特異性反應(yīng)，進一步證實了本研究中g(shù)E蛋白抗原性的可靠性。基于表達產(chǎn)物良好的抗原性，其在偽狂犬病血清學(xué)檢測中具有廣闊的應(yīng)用前景。在實際應(yīng)用中，以表達的gE蛋白作為診斷抗原，可用于開發(fā)gE-ELISA試劑盒。在gE-ELISA檢測中，將表達的gE蛋白包被在酶標(biāo)板上，當(dāng)加入待檢豬血清時，如果血清中含有針對gE蛋白的抗體，這些抗體就會與包被的gE蛋白結(jié)合。然后加入酶標(biāo)記的二抗，二抗會與結(jié)合在gE蛋白上的抗體結(jié)合，形成抗原-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物。最后加入底物，在酶的催化作用下，底物發(fā)生顯色反應(yīng)，通過檢測吸光值的大小，就可以判斷豬血清中是否含有g(shù)E抗體，從而區(qū)分野毒感染豬和疫苗免疫豬。這種檢測方法具有較高的特異性和敏感性，能夠準(zhǔn)確地檢測出豬血清中的偽狂犬病病毒感染情況。與傳統(tǒng)的診斷方法相比，如病毒分離鑒定，gE-ELISA試劑盒檢測速度快，能夠在短時間內(nèi)得到檢測結(jié)果，大大提高了檢測效率；操作簡便，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員，便于在基層養(yǎng)殖場和獸醫(yī)實驗室推廣應(yīng)用。在豬群的日常監(jiān)測中，使用gE-ELISA試劑盒可以定期對豬血清進行檢測，及時發(fā)現(xiàn)潛在的感染豬，采取相應(yīng)的防控措施，防止疫情的擴散。在疫苗免疫效果評估中，通過檢測免疫豬血清中的gE抗體，可以判斷疫苗是否起到了免疫保護作用，為疫苗的合理使用提供依據(jù)。此外，表達的gE蛋白還可用于其他血清學(xué)檢測方法的開發(fā)，如乳膠凝集試驗（gE-LAT）。在gE-LAT中，將gE蛋白致敏乳膠顆粒，當(dāng)與待檢豬血清混合時，如果血清中含有g(shù)E抗體，抗體就會與致敏乳膠顆粒上的gE蛋白結(jié)合，導(dǎo)致乳膠顆粒發(fā)生凝集反應(yīng)，通過觀察凝集現(xiàn)象即可判斷血清中是否含有g(shù)E抗體。gE-LAT具有操作簡單、快速的優(yōu)點，不需要特殊的儀器設(shè)備，可在現(xiàn)場進行檢測，適合在基層養(yǎng)殖場進行快速篩查。唐勇等人利用gE基因主要抗原表位區(qū)的原核表達產(chǎn)物建立的gE-LAT，不僅能顯著區(qū)分gE基因缺失疫苗免疫豬血清和野毒感染豬血清，而且具有簡便、快速等優(yōu)點，這為表達的gE蛋白在乳膠凝集試驗中的應(yīng)用提供了成功的范例。5.3研究結(jié)果的局限性與展望盡管本研究成功實現(xiàn)了偽狂犬病病毒gE基因在大腸桿菌中的表達，并對表達產(chǎn)物進行了鑒定，但仍存在一些局限性。在表達系統(tǒng)選擇方面，大腸桿菌表達系統(tǒng)雖然具有諸多優(yōu)勢，但缺乏真核細胞的翻譯后修飾機制，這可能導(dǎo)致表達的gE蛋白與天然gE蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上存在一定差異。例如，天然gE蛋白可能存在糖基化修飾，而大腸桿菌表達的gE蛋白沒有糖基化，這可能影響其抗原性和免疫原性。在表達產(chǎn)物純化方面，雖然利用6×His標(biāo)簽與Ni-NTA樹脂的特異性結(jié)合進行了親和層析純化，但純化過程中可能存在雜蛋白殘留，影響gE蛋白的純度和質(zhì)量。在應(yīng)用驗證方面，本研究僅通過Western-blot分析驗證了表達產(chǎn)物的抗原性，尚未將其應(yīng)用于實際的gE-ELISA試劑盒的研制和臨床樣本檢測，其在實際應(yīng)用中的效果和穩(wěn)定性還需要進一步驗證。針對這些局限性，未來研究可以從以下幾個方向展開。在表達系統(tǒng)優(yōu)化方面，可以嘗試對大腸桿菌進行基因工程改造，使其具備一定的翻譯后修飾能力。例如，通過導(dǎo)入相關(guān)的修飾酶基因，使大腸桿菌能夠?qū)Ρ磉_的gE蛋白進行糖基化修飾，從而提高其與天然gE蛋白的相似性。還可以探索其他表達系統(tǒng)，如酵母表達系統(tǒng)、昆蟲細胞表達系統(tǒng)等，這些表達系統(tǒng)具有真核細胞的翻譯后修飾機制，可能更適合表達具有天然活性的gE蛋白。在表達產(chǎn)物純化方面，可以進一步優(yōu)化純化工藝，結(jié)合多種純化方法，如離子交換層析、凝膠過濾層析等，提高gE蛋白的純度。同時，加強對純化過程中雜蛋白殘留的檢測和控制，確保獲得高純度的gE蛋白。在應(yīng)用驗證方面，將表達的gE蛋白應(yīng)用于gE-ELISA試劑盒的研制，對大量臨床樣本進行檢測，評估其在實際應(yīng)用中的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性。與現(xiàn)有的診斷方法進行對比，進一步優(yōu)化試劑盒的性能，使其能夠更準(zhǔn)確、快速地檢測豬血清中的偽