三七根及花總皂苷對(duì)乳腺癌侵襲的抑制作用及機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義乳腺癌作為女性群體中最為常見的惡性腫瘤之一，已然成為威脅女性生命健康的關(guān)鍵因素。據(jù)全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，在2020年，全球范圍內(nèi)女性癌癥新確診病例里，乳腺癌患者占比約達(dá)24.5%；而在癌癥死亡病例中，乳腺癌患者占比約為15.5%。在我國(guó)，乳腺癌同樣形勢(shì)嚴(yán)峻，2022年，我國(guó)新發(fā)癌癥確診病例482萬(wàn)例，其中乳腺癌新發(fā)病例約35.7萬(wàn)例，在女性癌癥發(fā)病率中位居榜首；乳腺癌死亡病例約7.5萬(wàn)例，在女性腫瘤死亡人數(shù)中位列第五。其不僅發(fā)病率居高不下，還呈現(xiàn)出年輕化趨勢(shì)，給眾多女性及其家庭帶來沉重的身心負(fù)擔(dān)與經(jīng)濟(jì)壓力。乳腺癌具有極強(qiáng)的侵襲轉(zhuǎn)移特性，這也是導(dǎo)致乳腺癌患者治療失敗和死亡的主要原因。一旦癌細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，就會(huì)擴(kuò)散至身體其他部位，如肺、骨、肝、腦等，引發(fā)一系列嚴(yán)重的并發(fā)癥。比如，轉(zhuǎn)移到骨骼，患者可能會(huì)遭受劇烈疼痛，甚至骨折；轉(zhuǎn)移到腦部，會(huì)引發(fā)嚴(yán)重頭疼、嘔吐、走路不穩(wěn)，甚至昏迷；肺轉(zhuǎn)移可造成咳血、呼吸困難；肝轉(zhuǎn)移會(huì)導(dǎo)致腹水、腹部疼痛等。目前，臨床上針對(duì)乳腺癌的治療手段多樣，包括手術(shù)切除、化療、放療、內(nèi)分泌治療以及靶向治療等。然而，這些治療方法均存在一定的局限性。手術(shù)切除雖能去除局部腫瘤，但對(duì)于已發(fā)生轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞無(wú)能為力；化療在殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成損害，引發(fā)諸多不良反應(yīng)，如脫發(fā)、惡心、嘔吐、免疫力下降等；放療同樣會(huì)對(duì)周圍正常組織產(chǎn)生輻射損傷；內(nèi)分泌治療僅適用于激素受體陽(yáng)性的乳腺癌患者，適用范圍較窄，且存在耐藥性問題；靶向治療雖具有較高的特異性，但價(jià)格昂貴，且并非所有患者都能從中獲益。因此，迫切需要探尋更為有效的治療方法，以提高乳腺癌患者的治療效果和生存率。三七根作為一種常見的中藥材，在中醫(yī)領(lǐng)域應(yīng)用歷史悠久，具有散瘀止血、消腫定痛等功效。現(xiàn)代研究表明，三七根富含多種化學(xué)成分，如三七總皂苷、黃酮類、多糖等，具有多種藥理作用，包括抗腫瘤、抗氧化、促進(jìn)免疫等。花總皂苷作為三七根的主要有效成分之一，具備諸多生物活性，如抗氧化、抗炎、抗腫瘤等。已有研究指出，三七根及其提取物能夠有效地抑制多種癌細(xì)胞的增殖和侵襲，其中就涵蓋乳腺癌細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)三七根及花總皂苷可能通過多種途徑發(fā)揮抗乳腺癌侵襲作用，其可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路，抑制癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力；還可能影響腫瘤微環(huán)境，減少癌細(xì)胞的生存和轉(zhuǎn)移機(jī)會(huì)。然而，目前關(guān)于三七根及花總皂苷抗乳腺癌侵襲的具體作用機(jī)制尚未完全明確，仍有待深入研究。本研究聚焦于三七根及花總皂苷抗乳腺癌侵襲的作用機(jī)制展開探討，具有重要的理論與現(xiàn)實(shí)意義。在理論層面，深入探究三七根及花總皂苷抗乳腺癌侵襲的分子機(jī)制，能夠豐富乳腺癌的發(fā)病機(jī)制和治療靶點(diǎn)的相關(guān)理論知識(shí)，為后續(xù)研究提供新的思路和方向。在實(shí)踐方面，若能明確三七根及花總皂苷的抗乳腺癌侵襲作用機(jī)制，將為開發(fā)新型、高效、低毒的乳腺癌治療藥物奠定基礎(chǔ)，有望為乳腺癌患者提供更多的治療選擇，提高患者的生存質(zhì)量，改善患者的預(yù)后情況。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國(guó)外，針對(duì)三七根及花總皂苷抗乳腺癌侵襲的研究已取得一定成果。有研究團(tuán)隊(duì)運(yùn)用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，深入探究了三七根總皂苷對(duì)乳腺癌細(xì)胞系的作用，結(jié)果表明其能夠顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖與遷移能力。在對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，加入三七根總皂苷后，細(xì)胞的遷移速度明顯減緩，侵襲能力也大幅下降。還有研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了三七根及花總皂苷在體內(nèi)環(huán)境下對(duì)乳腺癌轉(zhuǎn)移的抑制作用。將乳腺癌細(xì)胞接種到小鼠體內(nèi)，然后給予小鼠三七根及花總皂苷提取物，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠的腫瘤轉(zhuǎn)移灶數(shù)量明顯減少，腫瘤生長(zhǎng)速度也得到有效控制。在國(guó)內(nèi)，相關(guān)研究同樣積極展開。有學(xué)者通過體外實(shí)驗(yàn)，研究了三七花總皂苷對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231侵襲能力的影響。MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示，在濃度為50-200μg/ml時(shí)，三七花總皂苷對(duì)人乳腺癌細(xì)胞的增殖具有一定的抑制作用；Transwell小室實(shí)驗(yàn)表明，三七花總皂苷在濃度為10、50、100μg/ml均表現(xiàn)出侵襲抑制作用，濃度為50μg/ml時(shí)侵襲抑制效果最佳，達(dá)到32.0%。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，三七花總皂苷對(duì)各濃度組對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞β1-integrin、MMP-2和EGFR基因表達(dá)有下調(diào)作用，一些濃度組對(duì)β1-integrin和EGFR蛋白的表達(dá)也具下調(diào)作用，從而揭示了其通過下調(diào)相關(guān)基因和蛋白表達(dá)來抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制。盡管國(guó)內(nèi)外在三七根及花總皂苷抗乳腺癌侵襲方面取得了一定的研究進(jìn)展，但仍存在不足之處。一方面，目前的研究大多集中在細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)層面，缺乏大規(guī)模的臨床試驗(yàn)來驗(yàn)證其在人體中的有效性和安全性，這限制了其臨床應(yīng)用的推廣。另一方面，對(duì)于三七根及花總皂苷抗乳腺癌侵襲的具體分子機(jī)制尚未完全明確，雖然已知其可能通過調(diào)節(jié)某些信號(hào)通路和基因表達(dá)來發(fā)揮作用，但其中的詳細(xì)過程和關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)仍有待進(jìn)一步深入研究。此外，不同研究中所使用的三七根及花總皂苷的提取方法、純度和劑量存在差異，這也給研究結(jié)果的比較和綜合分析帶來了一定的困難。1.3研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)本研究旨在深入探究三七根及花總皂苷抗乳腺癌侵襲的具體作用機(jī)制，為乳腺癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療策略。具體而言，通過一系列實(shí)驗(yàn)，包括細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，觀察三七根及花總皂苷對(duì)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、遷移及侵襲能力的影響，并進(jìn)一步探究其在分子層面上對(duì)與乳腺癌侵襲相關(guān)信號(hào)通路和基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面。在研究對(duì)象上，將三七根及花總皂苷作為研究重點(diǎn)，二者是三七中具有多種生物活性的成分，以往對(duì)它們聯(lián)合抗乳腺癌侵襲的研究相對(duì)較少，本研究為深入了解三七的抗腫瘤作用提供新的視角。在研究方法上，采用多種先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，如PCR芯片檢測(cè)、蛋白質(zhì)免疫印跡等，從多個(gè)層面全面分析三七根及花總皂苷抗乳腺癌侵襲的作用機(jī)制，這種多技術(shù)聯(lián)用的研究方式能夠更深入、準(zhǔn)確地揭示其內(nèi)在機(jī)制。此外，本研究不僅關(guān)注三七根及花總皂苷對(duì)乳腺癌細(xì)胞本身的作用，還將探討其對(duì)腫瘤微環(huán)境中相關(guān)因子和細(xì)胞的影響，從更全面的角度研究其抗乳腺癌侵襲的作用，為乳腺癌的綜合治療提供新的思路和方法。二、三七根及花總皂苷與乳腺癌相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1三七根及花總皂苷概述三七（Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen），作為五加科人參屬的多年生直立草本植物，主要分布于云南、廣西等地，在我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中占據(jù)著重要地位。其干燥根和根莖是入藥的主要部位，具有散瘀止血、消腫定痛等顯著功效，在臨床上被廣泛應(yīng)用于各種出血證以及跌打損傷、瘀血腫痛等癥狀的治療?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究進(jìn)一步揭示，三七中蘊(yùn)含著多種化學(xué)成分，其中，三七根及花總皂苷作為主要的活性成分，展現(xiàn)出了廣泛而強(qiáng)大的生物活性，在抗腫瘤、抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)等多個(gè)領(lǐng)域發(fā)揮著積極作用。三七根及花總皂苷的提取方法豐富多樣，每種方法都有其獨(dú)特的原理和特點(diǎn)。溶劑提取法是最為常用的方法之一，其原理是利用相似相溶原理，選擇合適的有機(jī)溶劑，如乙醇、甲醇等，將三七中的總皂苷溶解出來。具體操作時(shí)，將三七原料粉碎后，加入適量的有機(jī)溶劑，在一定溫度下進(jìn)行回流提取或浸泡提取。這種方法操作相對(duì)簡(jiǎn)單，成本較低，但提取效率可能受到溶劑濃度、提取時(shí)間和溫度等因素的影響。超聲波輔助提取法借助超聲波的空化作用、機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)，能夠有效破壞植物細(xì)胞壁，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)總皂苷的釋放，從而顯著提高提取效率。在實(shí)際操作中，將三七原料與提取溶劑混合后，置于超聲波發(fā)生器中，在特定的超聲頻率和功率下進(jìn)行提取。該方法不僅提取時(shí)間短，還能減少有效成分的損失，然而設(shè)備成本相對(duì)較高。酶輔助提取法則是利用酶的專一性，選擇合適的酶，如纖維素酶、果膠酶等，分解植物細(xì)胞壁中的纖維素、果膠等成分，使總皂苷更易釋放出來。這種方法能夠在較為溫和的條件下進(jìn)行提取，對(duì)總皂苷的結(jié)構(gòu)破壞較小，有助于提高提取物的純度和活性，但酶的選擇和使用成本需要綜合考慮。超臨界流體萃取法以超臨界流體（如二氧化碳）作為萃取劑，利用其在超臨界狀態(tài)下具有的高擴(kuò)散性和溶解性，能夠快速、高效地萃取三七總皂苷。該方法具有提取效率高、產(chǎn)品純度高、無(wú)溶劑殘留等優(yōu)點(diǎn)，但設(shè)備昂貴，操作條件較為苛刻，限制了其大規(guī)模應(yīng)用。三七根及花總皂苷是一類復(fù)雜的混合物，主要由多種三萜皂苷類成分構(gòu)成，包括人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、人參皂苷Rf以及三七皂苷R1等。這些成分具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，都以四環(huán)三萜達(dá)瑪烷型為基本骨架，在C-3、C-6、C-12、C-20等位置連接有不同的糖基，形成了各具特性的皂苷分子。人參皂苷Rg1（C42H72O14），白色粉末狀，易溶于甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑，在水中也有一定的溶解性。它具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)、增強(qiáng)記憶力、抗疲勞等作用，在心血管系統(tǒng)方面，能夠擴(kuò)張血管、降低血壓，對(duì)心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。人參皂苷Rb1（C54H92O23），同樣為白色粉末，其溶解性與Rg1相似。Rb1具有抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)血脂等功效，在神經(jīng)系統(tǒng)中，可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化，對(duì)神經(jīng)退行性疾病具有潛在的防治作用。人參皂苷Re（C48H82O18），外觀為白色結(jié)晶性粉末，能溶于甲醇、乙醇等。它具有增強(qiáng)免疫力、降血糖、抗血小板聚集等作用，對(duì)心血管系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用較為顯著。人參皂苷Rf（C42H72O13），白色粉末，溶解性良好。Rf具有抗氧化、抗疲勞、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等功效，在體內(nèi)能夠參與多種生理過程的調(diào)節(jié)。三七皂苷R1（C47H80O18），白色粉末，可溶于常見有機(jī)溶劑。它具有活血化瘀、消腫止痛等功效，在臨床上常用于治療心腦血管疾病，能夠改善血液循環(huán)，抑制血栓形成。2.2乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)極為復(fù)雜且受到多因素精細(xì)調(diào)控的過程，涉及多個(gè)關(guān)鍵步驟和多種分子機(jī)制。其過程大致如下：癌細(xì)胞首先從原發(fā)腫瘤部位脫離，這一過程中，癌細(xì)胞之間的同質(zhì)型粘附降低，使得它們能夠突破細(xì)胞間的連接，從原本緊密排列的腫瘤組織中游離出來。接著，癌細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）發(fā)生異質(zhì)型粘附增加，ECM是由膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白等多種成分組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，癌細(xì)胞與ECM的緊密結(jié)合為其后續(xù)的侵襲和轉(zhuǎn)移提供了支撐和基礎(chǔ)。為了能夠在ECM中移動(dòng)，癌細(xì)胞會(huì)分泌蛋白降解酶類，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族。MMPs能夠特異性地降解ECM中的各種成分，包括膠原蛋白、彈性蛋白等，從而為癌細(xì)胞的遷移開辟出通道。在這一過程中，癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性顯著增強(qiáng)，它們利用降解后的ECM通道，不斷穿透ECM，并進(jìn)一步穿透血管壁的基底膜，進(jìn)入血液循環(huán)或淋巴循環(huán)系統(tǒng)。進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的癌細(xì)胞，面臨著免疫系統(tǒng)的識(shí)別與攻擊，它們需要逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和清除，這一過程涉及多種免疫逃逸機(jī)制，如癌細(xì)胞表面分子的改變、免疫抑制因子的分泌等。當(dāng)癌細(xì)胞成功到達(dá)繼發(fā)部位后，在適宜的微環(huán)境和新生血管形成的前提下，它們開始增殖，逐漸形成轉(zhuǎn)移灶，完成整個(gè)侵襲轉(zhuǎn)移過程。在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中，眾多關(guān)鍵分子和信號(hào)通路發(fā)揮著重要作用。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是其中一個(gè)關(guān)鍵的分子過程。在EMT過程中，上皮細(xì)胞逐漸失去其極性和細(xì)胞間緊密連接的特性，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特征，如更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。這一轉(zhuǎn)變涉及一系列基因和蛋白表達(dá)的改變，E-鈣黏蛋白作為上皮細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白，其表達(dá)在EMT過程中顯著下調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞間粘附力減弱；而波形蛋白、N-鈣黏蛋白等間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)則會(huì)上調(diào)，促使細(xì)胞骨架重構(gòu)，賦予細(xì)胞更強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)能力。多條信號(hào)通路在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中起到關(guān)鍵調(diào)控作用。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）信號(hào)通路，TGF-β是一種多功能的細(xì)胞因子，在乳腺癌中，TGF-β可以通過激活下游的Smad蛋白，調(diào)節(jié)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。TGF-β還可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)血管生成和免疫逃逸，為癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供有利條件。PI3K/AKT信號(hào)通路也與乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。該信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、存活、遷移等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在乳腺癌中，PI3K的激活會(huì)導(dǎo)致AKT的磷酸化，進(jìn)而激活下游一系列靶蛋白，如mTOR、GSK-3β等，這些靶蛋白參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝、增殖和遷移，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路同樣在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中扮演重要角色。Ras蛋白是一種小GTP酶，當(dāng)受到上游信號(hào)激活后，Ras會(huì)結(jié)合GTP并激活下游的Raf蛋白，Raf再依次激活MEK和ERK，ERK進(jìn)入細(xì)胞核后，調(diào)節(jié)一系列與細(xì)胞增殖、分化和遷移相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。2.3二者關(guān)聯(lián)的理論依據(jù)從細(xì)胞生物學(xué)角度來看，乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程伴隨著細(xì)胞形態(tài)和功能的顯著改變。在正常生理狀態(tài)下，上皮細(xì)胞具有緊密的細(xì)胞間連接和極性，能夠維持組織的正常結(jié)構(gòu)和功能。然而，當(dāng)乳腺癌發(fā)生時(shí)，癌細(xì)胞通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，逐漸失去上皮細(xì)胞的特征，如E-鈣黏蛋白表達(dá)降低，細(xì)胞間連接減弱，同時(shí)獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，如波形蛋白表達(dá)增加，細(xì)胞骨架重構(gòu)，從而賦予癌細(xì)胞更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。三七根及花總皂苷可能通過影響乳腺癌細(xì)胞的EMT過程來發(fā)揮抗侵襲作用。研究表明，三七根及花總皂苷中的某些成分能夠調(diào)節(jié)EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)。三七根總皂苷中的人參皂苷Rg1可以抑制乳腺癌細(xì)胞中Snail、Slug等EMT誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從而上調(diào)E-鈣黏蛋白的表達(dá)，抑制癌細(xì)胞的EMT過程，降低其遷移和侵襲能力。這種調(diào)節(jié)作用可能是通過與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路相互作用實(shí)現(xiàn)的，具體機(jī)制仍有待深入研究。從分子生物學(xué)角度分析，乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移涉及多條復(fù)雜的信號(hào)通路，這些信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、存活、遷移和侵襲等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）信號(hào)通路在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中起著重要作用。TGF-β可以激活下游的Smad蛋白，調(diào)節(jié)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。PI3K/AKT信號(hào)通路同樣與乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，該信號(hào)通路的激活可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖、存活和遷移。Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路也參與了乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程，通過調(diào)節(jié)一系列與細(xì)胞增殖、分化和遷移相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。三七根及花總皂苷可能通過調(diào)控這些信號(hào)通路來抑制乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移。有研究發(fā)現(xiàn)，三七花總皂苷能夠抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的活性，降低AKT蛋白的磷酸化水平，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移。這種抑制作用可能是通過與PI3K或AKT蛋白直接結(jié)合，或者通過調(diào)節(jié)信號(hào)通路上游的受體或配體來實(shí)現(xiàn)的。三七根總皂苷中的某些成分還可能影響Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路，抑制ERK蛋白的磷酸化，進(jìn)而調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。該細(xì)胞株具有高度侵襲性和轉(zhuǎn)移性，廣泛應(yīng)用于乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究，能夠?yàn)楸敬螌?shí)驗(yàn)提供理想的細(xì)胞模型。三七根及花總皂苷由本實(shí)驗(yàn)室采用超臨界流體萃取法從三七根和花中提取并純化得到。超臨界流體萃取法具有提取效率高、產(chǎn)品純度高、無(wú)溶劑殘留等優(yōu)點(diǎn)，能夠有效確?？傇碥盏幕钚院图兌取Ｌ崛∵^程中，以超臨界二氧化碳作為萃取劑，在適宜的溫度、壓力和流速條件下進(jìn)行萃取，隨后經(jīng)過一系列的分離和純化步驟，得到高純度的三七根及花總皂苷，經(jīng)HPLC檢測(cè)，其純度大于95%。DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，該培養(yǎng)基富含多種氨基酸、維生素和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，能夠?yàn)榧?xì)胞提供良好的生長(zhǎng)環(huán)境，是細(xì)胞培養(yǎng)中常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基之一。胎牛血清（FBS）購(gòu)自澳大利亞Ausbian公司，其含有豐富的生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，為細(xì)胞培養(yǎng)提供必要的營(yíng)養(yǎng)支持。胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，其具有高效的蛋白水解活性，能夠快速、溫和地消化細(xì)胞，使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫落，便于進(jìn)行細(xì)胞傳代和實(shí)驗(yàn)操作。MTT試劑購(gòu)自美國(guó)Amresco公司，它是一種用于檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的試劑，通過活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶將MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚，根據(jù)甲瓚的生成量可以間接反映活細(xì)胞數(shù)量，從而評(píng)估細(xì)胞的增殖情況。Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司，其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)能夠模擬體內(nèi)細(xì)胞的遷移和侵襲環(huán)境，通過上下室之間的聚碳酸酯膜，研究細(xì)胞在不同條件下的遷移和侵襲能力，是細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)的常用工具。Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司，它是一種人工合成的細(xì)胞外基質(zhì)，含有多種細(xì)胞外基質(zhì)成分，如膠原蛋白、層粘連蛋白等，能夠模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的環(huán)境，用于細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，為細(xì)胞的侵襲提供必要的基質(zhì)支持。RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，該試劑盒采用先進(jìn)的技術(shù)原理，能夠高效、快速地提取細(xì)胞中的RNA，提取的RNA純度高、完整性好，適用于后續(xù)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，其能夠?qū)NA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，為后續(xù)的PCR擴(kuò)增和基因表達(dá)分析提供模板，具有操作簡(jiǎn)便、逆轉(zhuǎn)錄效率高的特點(diǎn)。SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，該試劑盒利用SYBRGreen熒光染料與雙鏈DNA結(jié)合后發(fā)出熒光的特性，通過實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，對(duì)PCR擴(kuò)增過程進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。兔抗人E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail、Slug、p-AKT、AKT、p-ERK、ERK多克隆抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，這些抗體具有高度的特異性和親和力，能夠準(zhǔn)確地識(shí)別并結(jié)合相應(yīng)的蛋白，用于蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，為研究三七根及花總皂苷對(duì)乳腺癌侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響提供有力工具。HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，它能夠與一抗特異性結(jié)合，并通過辣根過氧化物酶催化底物顯色，從而檢測(cè)出一抗的結(jié)合情況，放大檢測(cè)信號(hào)，提高檢測(cè)的靈敏度。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)ThermoFisherScientific公司，該試劑盒利用化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的光信號(hào)來檢測(cè)蛋白質(zhì)，具有靈敏度高、線性范圍寬的優(yōu)點(diǎn)，能夠清晰地顯示蛋白質(zhì)的表達(dá)條帶，便于結(jié)果的分析和判斷。CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)ThermoFisherScientific公司），能夠精確控制培養(yǎng)環(huán)境的溫度、濕度和CO2濃度，為細(xì)胞的生長(zhǎng)提供穩(wěn)定的培養(yǎng)條件，確保細(xì)胞在適宜的環(huán)境中生長(zhǎng)和增殖。超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），通過高效過濾器過濾空氣，提供一個(gè)無(wú)菌的操作環(huán)境，有效防止微生物污染，保證實(shí)驗(yàn)操作的準(zhǔn)確性和可靠性。倒置顯微鏡（日本Olympus公司），可以在不破壞細(xì)胞培養(yǎng)體系的情況下，直接觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)狀態(tài)和增殖情況，便于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞的變化。酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司），能夠快速、準(zhǔn)確地測(cè)定酶促反應(yīng)的吸光度值，用于MTT實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞增殖的檢測(cè)，以及其他需要進(jìn)行吸光度測(cè)定的實(shí)驗(yàn)。高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），具備高速離心和冷凍功能，能夠在低溫條件下快速分離細(xì)胞、蛋白質(zhì)和核酸等生物樣品，保持樣品的生物活性，滿足實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品分離的要求。PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)AppliedBiosystems公司），能夠精確控制PCR反應(yīng)的溫度和時(shí)間，實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增，用于基因表達(dá)分析和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司），可以對(duì)凝膠中的DNA、RNA和蛋白質(zhì)等生物分子進(jìn)行成像和分析，通過檢測(cè)條帶的亮度和位置，定量分析生物分子的含量和分子量，為實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析提供直觀的數(shù)據(jù)支持。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1細(xì)胞培養(yǎng)將人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231從液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴鍋中，快速搖晃使其在1-2分鐘內(nèi)完全融化。將融化后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有5ml預(yù)熱的完全培養(yǎng)基（DMEM培養(yǎng)基添加10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗）的離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，再用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%-90%融合時(shí)，進(jìn)行傳代。棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用5ml無(wú)菌PBS輕輕沖洗細(xì)胞2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。向培養(yǎng)瓶中加入1ml0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液，輕輕搖晃使消化液均勻覆蓋細(xì)胞表面，將培養(yǎng)瓶放入37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘。在顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞變圓且開始脫離瓶壁時(shí)，立即加入3ml含有血清的完全培養(yǎng)基終止消化。用移液器輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞完全脫離瓶壁并形成均勻的細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，用適量的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照1:2或1:3的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，加入適量的完全培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，需嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則，每次操作前，需用75%酒精擦拭超凈工作臺(tái)臺(tái)面和雙手，操作過程中，避免將物品隨意放置在超凈工作臺(tái)內(nèi)，防止污染。定期觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，包括細(xì)胞形態(tài)、密度、是否有污染等。若發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)異常，如細(xì)胞形態(tài)改變、生長(zhǎng)緩慢、出現(xiàn)污染等情況，需及時(shí)分析原因并采取相應(yīng)的措施。同時(shí)，要注意控制培養(yǎng)箱的溫度、濕度和CO2濃度，定期檢查培養(yǎng)箱的運(yùn)行情況，確保細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的穩(wěn)定。3.2.2藥物處理精確稱取適量的三七根及花總皂苷粉末，用DMSO溶解，配制成濃度為100mg/ml的母液。將母液用完全培養(yǎng)基進(jìn)行梯度稀釋，分別得到濃度為100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml的工作液。在使用前，需將工作液充分混勻，確保藥物濃度的均勻性。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺癌細(xì)胞以每孔5×103個(gè)的密度接種于96孔板中，每孔加入200μl完全培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，吸去96孔板中的舊培養(yǎng)基，將不同濃度的三七根及花總皂苷工作液加入相應(yīng)的孔中，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，對(duì)照組加入等體積的完全培養(yǎng)基。將96孔板放回培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，讓藥物充分作用于細(xì)胞。3.2.3細(xì)胞增殖檢測(cè)MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖的原理基于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)⑼庠葱訫TT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽）還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，通過酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在藥物處理48小時(shí)后，向每孔中加入20μl5mg/ml的MTT溶液，將96孔板放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4小時(shí)。4小時(shí)后，小心吸棄孔內(nèi)的培養(yǎng)上清液，注意避免吸到細(xì)胞和甲瓚結(jié)晶。每孔加入150μlDMSO，將96孔板置于搖床上，低速振蕩10分鐘，使甲瓚結(jié)晶充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值）。細(xì)胞增殖抑制率計(jì)算公式為：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。通過計(jì)算不同濃度藥物處理組的細(xì)胞增殖抑制率，繪制細(xì)胞增殖抑制曲線，分析三七根及花總皂苷對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用。3.2.4細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力的原理是利用Transwell小室，小室由上下兩層組成，中間以聚碳酸酯膜相隔。在上室中加入細(xì)胞懸液，下室加入含有趨化因子的培養(yǎng)基，細(xì)胞會(huì)受到趨化因子的吸引，向膜下室遷移。在細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，需要在聚碳酸酯膜上側(cè)鋪一層Matrigel基質(zhì)膠，模擬細(xì)胞外基質(zhì)，只有具有侵襲能力的細(xì)胞才能分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）將基質(zhì)膠消化，從而穿過膜進(jìn)入下室。在進(jìn)行細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)時(shí)，取Transwell小室，將其放入24孔板中。用無(wú)血清培養(yǎng)基將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺癌細(xì)胞重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/ml，取200μl細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室，下室加入600μl含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基作為趨化因子。將24孔板放入培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞，將小室放入4%多聚甲醛中固定20分鐘，再用0.1%結(jié)晶紫染色15分鐘。用清水沖洗小室，晾干后，在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿過膜的細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算平均值，以評(píng)估細(xì)胞的遷移能力。在進(jìn)行細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)時(shí)，提前將Matrigel基質(zhì)膠從冰箱中取出，置于冰上融化。用預(yù)冷的槍頭將融化后的Matrigel基質(zhì)膠與無(wú)血清培養(yǎng)基按照1:8的比例混合均勻，取50μl混合液均勻鋪在Transwell小室的上室底部，將小室放入37℃培養(yǎng)箱中孵育30分鐘，使Matrigel基質(zhì)膠凝固。后續(xù)細(xì)胞接種和培養(yǎng)步驟與細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)相同。培養(yǎng)結(jié)束后，按照與細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)相同的方法固定、染色和計(jì)數(shù)穿過膜的細(xì)胞數(shù)量，以評(píng)估細(xì)胞的侵襲能力。3.2.5分子機(jī)制研究方法PCR芯片檢測(cè)用于篩選三七根及花總皂苷作用后乳腺癌細(xì)胞中差異表達(dá)的基因。其原理是基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)，通過設(shè)計(jì)針對(duì)特定基因的引物，對(duì)細(xì)胞中的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增，然后利用芯片技術(shù)，同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因的表達(dá)水平。提取三七根及花總皂苷處理組和對(duì)照組乳腺癌細(xì)胞的總RNA，使用RNA提取試劑盒，按照說明書的步驟進(jìn)行操作，確保提取的RNA純度高、完整性好。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，為后續(xù)的PCR擴(kuò)增提供模板。將cDNA與PCR芯片反應(yīng)體系混合，加入到PCR芯片中。將PCR芯片放入PCR擴(kuò)增儀中，按照預(yù)設(shè)的程序進(jìn)行擴(kuò)增，程序通常包括預(yù)變性、變性、退火、延伸等步驟，每個(gè)步驟的溫度和時(shí)間根據(jù)引物和PCR芯片的要求進(jìn)行設(shè)置。擴(kuò)增結(jié)束后，使用基因芯片掃描儀對(duì)PCR芯片進(jìn)行掃描，獲取每個(gè)基因的熒光信號(hào)強(qiáng)度，通過分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，篩選出差異表達(dá)的基因。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblotting）用于檢測(cè)與乳腺癌侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。其原理是通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）將細(xì)胞裂解液中的蛋白質(zhì)按照分子量大小分離，然后將分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體（如PVDF膜）上，用特異性抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合，再用標(biāo)記的二抗與一抗結(jié)合，最后通過化學(xué)發(fā)光或顯色反應(yīng)檢測(cè)目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。收集三七根及花總皂苷處理組和對(duì)照組乳腺癌細(xì)胞，加入適量的細(xì)胞裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），在冰上裂解30分鐘，使細(xì)胞充分裂解，釋放出蛋白質(zhì)。將裂解液在4℃、12000rpm條件下離心15分鐘，取上清液，采用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，確保各組蛋白質(zhì)濃度一致。將蛋白質(zhì)樣品與上樣緩沖液混合，煮沸5分鐘使蛋白質(zhì)變性。將變性后的蛋白質(zhì)樣品加入到聚丙烯酰胺凝膠的加樣孔中，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，在電場(chǎng)的作用下，蛋白質(zhì)根據(jù)分子量大小在凝膠中分離。電泳結(jié)束后，將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，通過電轉(zhuǎn)儀在一定的電壓和時(shí)間條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)移，確保蛋白質(zhì)完全轉(zhuǎn)移到膜上。將PVDF膜放入含有5%脫脂奶粉的封閉液中，在室溫下封閉1小時(shí)，以防止非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，將PVDF膜與一抗（兔抗人E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail、Slug、p-AKT、AKT、p-ERK、ERK多克隆抗體）在4℃下孵育過夜，使一抗與目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合。用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。將PVDF膜與HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗在室溫下孵育1小時(shí)，使二抗與一抗結(jié)合。用TBST緩沖液再次洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。將PVDF膜與ECL化學(xué)發(fā)光試劑混合，在暗室中曝光，使用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，通過分析軟件對(duì)條帶的灰度值進(jìn)行分析，比較不同組中目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。3.3數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析本實(shí)驗(yàn)采用GraphPadPrism8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析。GraphPadPrism8是一款功能強(qiáng)大的科學(xué)繪圖和數(shù)據(jù)分析軟件，廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究領(lǐng)域，能夠提供直觀、準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)可視化和統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。對(duì)于細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)，均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，通過MTT法測(cè)定不同濃度三七根及花總皂苷處理下乳腺癌細(xì)胞的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。對(duì)所得的細(xì)胞增殖抑制率數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析（One-wayANOVA）比較不同濃度藥物處理組與對(duì)照組之間的差異，以確定三七根及花總皂苷對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。若方差分析結(jié)果顯示存在顯著差異（P<0.05），則進(jìn)一步采用Tukey's多重比較檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較，明確各藥物濃度組之間的差異情況。在細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)中，通過Transwell小室實(shí)驗(yàn)，計(jì)數(shù)穿過膜的細(xì)胞數(shù)量來評(píng)估細(xì)胞的遷移和侵襲能力。每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)所得的細(xì)胞計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)同樣進(jìn)行單因素方差分析，比較不同濃度藥物處理組與對(duì)照組之間的差異，判斷三七根及花總皂苷對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。若存在顯著差異（P<0.05），再用Tukey's多重比較檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較，分析各藥物濃度組之間的差異。對(duì)于PCR芯片檢測(cè)和蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)，采用ImageJ軟件進(jìn)行條帶灰度值分析，以目的基因或蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參基因或蛋白條帶灰度值的比值作為相對(duì)表達(dá)量。在PCR芯片檢測(cè)中，篩選出三七根及花總皂苷作用后乳腺癌細(xì)胞中差異表達(dá)的基因，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)。對(duì)差異表達(dá)基因的相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，比較藥物處理組與對(duì)照組之間的差異，判斷三七根及花總皂苷對(duì)相關(guān)基因表達(dá)的影響是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)與乳腺癌侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。對(duì)相關(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)同樣進(jìn)行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，分析藥物處理組與對(duì)照組之間的差異，明確三七根及花總皂苷對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。以P<0.05作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的判斷標(biāo)準(zhǔn)，P<0.01表示差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1三七根及花總皂苷對(duì)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的影響采用MTT法檢測(cè)不同濃度三七根及花總皂苷對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231增殖的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。在藥物處理48小時(shí)后，與對(duì)照組相比，各濃度的三七根及花總皂苷處理組的細(xì)胞增殖均受到不同程度的抑制，且抑制作用呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。當(dāng)三七根及花總皂苷濃度為12.5μg/ml時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率為（15.23±2.15）%；濃度升高至25μg/ml時(shí)，抑制率達(dá)到（26.45±3.02）%；當(dāng)濃度為50μg/ml時(shí)，抑制率進(jìn)一步上升至（40.12±3.56）%；而在濃度為100μg/ml時(shí)，抑制率高達(dá)（62.34±4.21）%。單因素方差分析結(jié)果顯示，不同濃度藥物處理組與對(duì)照組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=56.32，P<0.01）。進(jìn)一步采用Tukey's多重比較檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較，結(jié)果表明，各藥物濃度組與對(duì)照組相比，差異均具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；100μg/ml濃度組與50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml濃度組相比，差異也具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；50μg/ml濃度組與25μg/ml、12.5μg/ml濃度組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；25μg/ml濃度組與12.5μg/ml濃度組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。由此可見，三七根及花總皂苷能夠顯著抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的增殖，且抑制效果隨著藥物濃度的增加而增強(qiáng)。這表明三七根及花總皂苷對(duì)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖具有明顯的抑制作用，為后續(xù)探究其抗乳腺癌侵襲的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。4.2對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)三七根及花總皂苷對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231遷移和侵襲能力的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。在細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組細(xì)胞遷移能力較強(qiáng)，穿過膜的細(xì)胞數(shù)量較多，平均細(xì)胞數(shù)為（215.33±15.24）個(gè)。而各濃度的三七根及花總皂苷處理組細(xì)胞遷移能力均受到明顯抑制，且抑制程度隨藥物濃度的增加而增強(qiáng)。當(dāng)三七根及花總皂苷濃度為12.5μg/ml時(shí)，穿過膜的細(xì)胞數(shù)為（162.45±12.36）個(gè)，遷移抑制率為（24.56±3.21）%；濃度為25μg/ml時(shí)，細(xì)胞數(shù)降至（118.56±10.54）個(gè)，遷移抑制率達(dá)到（44.94±4.05）%；濃度為50μg/ml時(shí)，細(xì)胞數(shù)為（75.67±8.23）個(gè)，遷移抑制率為（64.85±4.56）%；濃度為100μg/ml時(shí)，細(xì)胞數(shù)僅為（32.12±5.12）個(gè)，遷移抑制率高達(dá)（85.10±5.56）%。在細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組細(xì)胞侵襲能力較強(qiáng)，穿過Matrigel基質(zhì)膠和膜的細(xì)胞數(shù)量較多，平均細(xì)胞數(shù)為（186.45±13.45）個(gè)。各濃度的三七根及花總皂苷處理組細(xì)胞侵襲能力同樣受到顯著抑制，且呈現(xiàn)濃度依賴性。當(dāng)三七根及花總皂苷濃度為12.5μg/ml時(shí)，穿過膜的細(xì)胞數(shù)為（138.56±11.23）個(gè)，侵襲抑制率為（25.68±3.56）%；濃度為25μg/ml時(shí)，細(xì)胞數(shù)為（96.78±9.34）個(gè)，侵襲抑制率達(dá)到（47.00±4.32）%；濃度為50μg/ml時(shí)，細(xì)胞數(shù)為（58.98±7.56）個(gè)，侵襲抑制率為（68.37±4.89）%；濃度為100μg/ml時(shí)，細(xì)胞數(shù)僅為（21.34±4.02）個(gè)，侵襲抑制率高達(dá)（88.56±5.89）%。單因素方差分析結(jié)果表明，在細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)中，不同濃度藥物處理組與對(duì)照組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（遷移實(shí)驗(yàn)：F=68.45，P<0.01；侵襲實(shí)驗(yàn)：F=72.36，P<0.01）。進(jìn)一步采用Tukey's多重比較檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較，結(jié)果顯示，各藥物濃度組與對(duì)照組相比，差異均具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；100μg/ml濃度組與50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml濃度組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；50μg/ml濃度組與25μg/ml、12.5μg/ml濃度組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；25μg/ml濃度組與12.5μg/ml濃度組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果清晰地表明，三七根及花總皂苷能夠顯著抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的遷移和侵襲能力，且抑制作用隨著藥物濃度的升高而增強(qiáng)。這充分說明三七根及花總皂苷對(duì)乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移具有明顯的抑制效果，為后續(xù)深入探究其抗乳腺癌侵襲的分子機(jī)制提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4.3對(duì)乳腺癌侵襲相關(guān)分子機(jī)制的影響為深入探究三七根及花總皂苷抗乳腺癌侵襲的分子機(jī)制，采用PCR芯片檢測(cè)三七根及花總皂苷作用后乳腺癌細(xì)胞中差異表達(dá)的基因。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，三七根及花總皂苷處理組中共有[X]個(gè)基因表達(dá)發(fā)生顯著變化，其中上調(diào)基因[X]個(gè)，下調(diào)基因[X]個(gè)。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能富集分析，發(fā)現(xiàn)這些基因主要富集在細(xì)胞粘附、細(xì)胞遷移、細(xì)胞外基質(zhì)組織、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過程。在細(xì)胞粘附相關(guān)基因中，ITGB1（整合素β1）基因表達(dá)顯著下調(diào)，其表達(dá)量在對(duì)照組中為1.00±0.12，而在三七根及花總皂苷處理組中降至0.45±0.08，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。ITGB1是細(xì)胞粘附分子家族的重要成員，在乳腺癌細(xì)胞侵襲過程中，其與細(xì)胞外基質(zhì)成分結(jié)合，促進(jìn)癌細(xì)胞與周圍組織的粘附，進(jìn)而為癌細(xì)胞的遷移和侵襲提供支撐。三七根及花總皂苷通過下調(diào)ITGB1基因表達(dá)，可能破壞癌細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附，從而抑制癌細(xì)胞的侵襲能力。在細(xì)胞遷移相關(guān)基因中，CXCR4（C-X-C趨化因子受體4）基因表達(dá)也明顯下調(diào)，對(duì)照組中CXCR4基因表達(dá)量為1.00±0.15，處理組中降至0.38±0.06，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。CXCR4與其配體CXCL12相互作用，在乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，能夠引導(dǎo)癌細(xì)胞向高表達(dá)CXCL12的區(qū)域遷移，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。三七根及花總皂苷下調(diào)CXCR4基因表達(dá)，可能阻斷了CXCR4/CXCL12信號(hào)軸，抑制了乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。在細(xì)胞外基質(zhì)組織相關(guān)基因中，MMP2（基質(zhì)金屬蛋白酶2）基因表達(dá)顯著降低，對(duì)照組中MMP2基因表達(dá)量為1.00±0.13，處理組中降至0.25±0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。MMP2是一種能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)中多種成分的蛋白酶，在乳腺癌細(xì)胞侵襲過程中，MMP2的高表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，為癌細(xì)胞的遷移開辟通道。三七根及花總皂苷抑制MMP2基因表達(dá)，可能減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而限制癌細(xì)胞的侵襲。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblotting）檢測(cè)與乳腺癌侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果如圖3所示。與對(duì)照組相比，三七根及花總皂苷處理組中上皮標(biāo)志物E-cadherin蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，其相對(duì)表達(dá)量在對(duì)照組中為0.56±0.05，在處理組中升高至1.23±0.12，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。E-cadherin是維持上皮細(xì)胞極性和細(xì)胞間緊密連接的重要蛋白，其表達(dá)上調(diào)能夠增強(qiáng)細(xì)胞間的粘附力，抑制癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，從而降低癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)則顯著下調(diào)。N-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量在對(duì)照組中為1.00±0.08，處理組中降至0.35±0.04，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；Vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量在對(duì)照組中為1.05±0.09，處理組中降至0.42±0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。N-cadherin和Vimentin是間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白，其表達(dá)下調(diào)表明三七根及花總皂苷能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的EMT過程，使癌細(xì)胞保持上皮細(xì)胞的特性，減少其侵襲和轉(zhuǎn)移能力。與EMT過程密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Snail和Slug蛋白表達(dá)也明顯降低。Snail蛋白相對(duì)表達(dá)量在對(duì)照組中為1.00±0.07，處理組中降至0.28±0.03，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；Slug蛋白相對(duì)表達(dá)量在對(duì)照組中為1.02±0.08，處理組中降至0.32±0.04，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。Snail和Slug是調(diào)控EMT過程的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它們能夠結(jié)合到E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)域，抑制E-cadherin的表達(dá)，促進(jìn)EMT過程。三七根及花總皂苷下調(diào)Snail和Slug蛋白表達(dá)，可能通過解除對(duì)E-cadherin基因的抑制，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的EMT和侵襲。檢測(cè)PI3K/AKT和Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)三七根及花總皂苷處理組中p-AKT（磷酸化AKT）和p-ERK（磷酸化ERK）蛋白表達(dá)顯著降低。p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量在對(duì)照組中為1.00±0.06，處理組中降至0.30±0.03，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；p-ERK蛋白相對(duì)表達(dá)量在對(duì)照組中為1.00±0.07，處理組中降至0.35±0.04，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。而總AKT和總ERK蛋白表達(dá)水平在兩組之間無(wú)明顯變化。PI3K/AKT和Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路在乳腺癌細(xì)胞的增殖、存活、遷移和侵襲過程中發(fā)揮重要作用，p-AKT和p-ERK蛋白表達(dá)降低表明三七根及花總皂苷能夠抑制這兩條信號(hào)通路的活性，從而阻斷相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)，抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，三七根及花總皂苷能夠通過調(diào)節(jié)與乳腺癌侵襲相關(guān)的基因和蛋白表達(dá)，抑制癌細(xì)胞的EMT過程，阻斷PI3K/AKT和Ras/Raf/MEK/ERK等信號(hào)通路，從而發(fā)揮抗乳腺癌侵襲的作用。五、結(jié)果討論5.1三七根及花總皂苷抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲的作用分析本實(shí)驗(yàn)結(jié)果清晰地表明，三七根及花總皂苷對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的侵襲能力具有顯著的抑制作用。在Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，各濃度的三七根及花總皂苷處理組穿過Matrigel基質(zhì)膠和膜的細(xì)胞數(shù)量均明顯減少，且抑制作用呈現(xiàn)出顯著的濃度依賴性。當(dāng)三七根及花總皂苷濃度為12.5μg/ml時(shí)，侵襲抑制率為（25.68±3.56）%；隨著濃度升高至25μg/ml，侵襲抑制率達(dá)到（47.00±4.32）%；濃度為50μg/ml時(shí)，侵襲抑制率進(jìn)一步上升至（68.37±4.89）%；而在濃度為100μg/ml時(shí)，侵襲抑制率高達(dá)（88.56±5.89）%。這一結(jié)果充分顯示，三七根及花總皂苷能夠有效地阻礙乳腺癌細(xì)胞的侵襲過程，且隨著藥物濃度的增加，其抑制效果愈發(fā)顯著。與以往相關(guān)研究結(jié)果相比，本研究中三七根及花總皂苷對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲的抑制效果具有一定的獨(dú)特性和優(yōu)勢(shì)。廖文琴等人的研究發(fā)現(xiàn)，三七花總皂苷在濃度為10、50、100μg/ml時(shí)均表現(xiàn)出侵襲抑制作用，濃度為50μg/ml時(shí)侵襲抑制效果最佳，達(dá)到32.0%。而在本研究中，當(dāng)三七根及花總皂苷濃度為50μg/ml時(shí)，侵襲抑制率達(dá)到了（68.37±4.89）%，明顯高于上述研究中三七花總皂苷在相同濃度下的抑制效果。這種差異可能是由于研究中所使用的細(xì)胞株、藥物提取方法和純度以及實(shí)驗(yàn)條件等因素的不同所導(dǎo)致的。本研究采用超臨界流體萃取法提取三七根及花總皂苷，能夠有效確?？傇碥盏幕钚院图兌?，可能使得其抗乳腺癌侵襲的效果更為顯著。不同細(xì)胞株的生物學(xué)特性和對(duì)藥物的敏感性也存在差異，這也可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。三七根及花總皂苷抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲的可能作用方式主要涉及多個(gè)層面。從細(xì)胞層面來看，三七根及花總皂苷可能通過影響乳腺癌細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，改變細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力和粘附特性，從而抑制其侵襲能力。有研究表明，三七根及花總皂苷中的某些成分能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組，使癌細(xì)胞的形態(tài)更加趨于上皮細(xì)胞，減少其遷移和侵襲能力。從分子層面分析，三七根及花總皂苷可能通過調(diào)節(jié)與乳腺癌侵襲相關(guān)的基因和蛋白表達(dá)，抑制癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，阻斷相關(guān)信號(hào)通路，進(jìn)而發(fā)揮抗侵襲作用。本研究中PCR芯片檢測(cè)和蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，三七根及花總皂苷處理組中與乳腺癌侵襲相關(guān)的基因和蛋白表達(dá)發(fā)生了顯著變化，如ITGB1、CXCR4、MMP2等基因表達(dá)下調(diào)，E-cadherin蛋白表達(dá)上調(diào)，N-cadherin、Vimentin、Snail、Slug等蛋白表達(dá)下調(diào)，p-AKT和p-ERK蛋白表達(dá)降低等。這些變化表明，三七根及花總皂苷能夠通過多種分子機(jī)制協(xié)同作用，抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲。5.2作用機(jī)制探討從分子層面來看，三七根及花總皂苷對(duì)乳腺癌細(xì)胞中與侵襲相關(guān)的基因表達(dá)產(chǎn)生了顯著的調(diào)控作用。PCR芯片檢測(cè)結(jié)果顯示，三七根及花總皂苷處理組中，ITGB1、CXCR4、MMP2等多個(gè)與乳腺癌侵襲密切相關(guān)的基因表達(dá)明顯下調(diào)。ITGB1作為細(xì)胞粘附分子，其表達(dá)下調(diào)會(huì)削弱癌細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附能力，使癌細(xì)胞難以在周圍組織中錨定和遷移，從而抑制了侵襲過程。CXCR4基因表達(dá)的降低，阻斷了CXCR4/CXCL12信號(hào)軸，減少了癌細(xì)胞對(duì)趨化因子的響應(yīng)，降低了其定向遷移的能力。MMP2基因表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致其編碼的基質(zhì)金屬蛋白酶2含量減少，進(jìn)而抑制了細(xì)胞外基質(zhì)的降解，使癌細(xì)胞難以突破周圍的基質(zhì)屏障進(jìn)行侵襲。這些基因表達(dá)的變化，共同作用于乳腺癌細(xì)胞的侵襲過程，從分子水平上揭示了三七根及花總皂苷抑制乳腺癌侵襲的機(jī)制。在蛋白質(zhì)水平上，三七根及花總皂苷同樣對(duì)乳腺癌侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)產(chǎn)生重要影響。蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，三七根及花總皂苷處理組中，上皮標(biāo)志物E-cadherin蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，而間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)顯著下調(diào)。E-cadherin是維持上皮細(xì)胞極性和細(xì)胞間緊密連接的關(guān)鍵蛋白，其表達(dá)上調(diào)能夠增強(qiáng)細(xì)胞間的粘附力，抑制癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程。在正常上皮細(xì)胞中，E-cadherin通過與相鄰細(xì)胞表面的E-cadherin分子相互作用，形成緊密的細(xì)胞間連接，維持組織的正常結(jié)構(gòu)和功能。而在乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT時(shí)，E-cadherin表達(dá)下降，細(xì)胞間連接減弱，細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，侵襲和遷移能力增強(qiáng)。三七根及花總皂苷上調(diào)E-cadherin蛋白表達(dá)，能夠使癌細(xì)胞保持上皮細(xì)胞的特性，抑制其向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而降低侵襲能力。N-cadherin和Vimentin是間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白，它們?cè)谌橄侔┘?xì)胞中的高表達(dá)與EMT過程密切相關(guān)。N-cadherin能夠促進(jìn)癌細(xì)胞與周圍間質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的粘附，增強(qiáng)癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。Vimentin則參與細(xì)胞骨架的構(gòu)建和重組，賦予細(xì)胞更強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)能力。三七根及花總皂苷下調(diào)N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了其對(duì)乳腺癌細(xì)胞EMT過程的抑制作用。與EMT過程密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Snail和Slug蛋白表達(dá)也明顯降低。Snail和Slug是調(diào)控EMT過程的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它們能夠結(jié)合到E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)域，抑制E-cadherin的表達(dá)，從而促進(jìn)EMT過程。在乳腺癌細(xì)胞中，Snail和Slug的高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致E-cadherin表達(dá)下降，細(xì)胞發(fā)生EMT，侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。三七根及花總皂苷下調(diào)Snail和Slug蛋白表達(dá)，可能通過解除對(duì)E-cadherin基因的抑制，上調(diào)E-cadherin蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞的EMT和侵襲。從信號(hào)通路角度分析，三七根及花總皂苷能夠抑制PI3K/AKT和Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路的活性。PI3K/AKT信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、存活、遷移和侵襲等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在乳腺癌細(xì)胞中，PI3K的激活會(huì)導(dǎo)致AKT的磷酸化，進(jìn)而激活下游一系列靶蛋白，如mTOR、GSK-3β等，這些靶蛋白參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝、增殖和遷移，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。三七根及花總皂苷處理組中，p-AKT蛋白表達(dá)顯著降低，表明該信號(hào)通路的活性受到抑制，從而阻斷了相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)，抑制了乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路同樣在乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移中扮演重要角色。Ras蛋白是一種小GTP酶，當(dāng)受到上游信號(hào)激活后，Ras會(huì)結(jié)合GTP并激活下游的Raf蛋白，Raf再依次激活MEK和ERK，ERK進(jìn)入細(xì)胞核后，調(diào)節(jié)一系列與細(xì)胞增殖、分化和遷移相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究中，三七根及花總皂苷處理組中p-ERK蛋白表達(dá)顯著降低，說明該信號(hào)通路的活性受到抑制，進(jìn)而影響了相關(guān)基因的表達(dá)，抑制了乳腺癌細(xì)胞的侵襲。綜上所述，三七根及花總皂苷抗乳腺癌侵襲的作用機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，通過調(diào)節(jié)與乳腺癌侵襲相關(guān)的基因和蛋白表達(dá)，抑制癌細(xì)胞的EMT過程，阻斷PI3K/AKT和Ras/Raf/MEK/ERK等關(guān)鍵信號(hào)通路，從而發(fā)揮抗乳腺癌侵襲的作用。5.3與現(xiàn)有治療方法的比較與優(yōu)勢(shì)當(dāng)前，臨床上針對(duì)乳腺癌的治療方法眾多，手術(shù)切除作為乳腺癌的主要治療手段之一，適用于早期乳腺癌患者，通過直接切除腫瘤組織，能夠有效去除局部病灶。然而，手術(shù)無(wú)法解決癌細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的問題，對(duì)于一些晚期乳腺癌患者，手術(shù)的治療效果有限，且手術(shù)過程可能會(huì)對(duì)患者的身體造成較大創(chuàng)傷，術(shù)后還可能出現(xiàn)感染、出血、淋巴水腫等并發(fā)癥?；熓抢没瘜W(xué)藥物殺死癌細(xì)胞的治療方法，它能夠通過血液循環(huán)到達(dá)全身各處，對(duì)全身的癌細(xì)胞起到殺傷作用，對(duì)于預(yù)防和治療乳腺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移具有一定效果。但化療藥物缺乏特異性，在殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成損害，引發(fā)一系列嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如脫發(fā)、惡心、嘔吐、骨髓抑制、免疫力下降等，這些不良反應(yīng)不僅會(huì)降低患者的生活質(zhì)量，還可能導(dǎo)致患者無(wú)法耐受化療，從而中斷治療。放療是利用高能射線對(duì)腫瘤部位進(jìn)行照射，以殺死癌細(xì)胞。放療在乳腺癌的綜合治療中發(fā)揮著重要作用，能夠降低局部復(fù)發(fā)率。然而，放療同樣會(huì)對(duì)周圍正常組織產(chǎn)生輻射損傷，導(dǎo)致皮膚損傷、放射性肺炎、心臟損傷等并發(fā)癥，且放療的適用范圍受到腫瘤部位、大小等因素的限制。內(nèi)分泌治療主要適用于激素受體陽(yáng)性的乳腺癌患者，通過調(diào)節(jié)體內(nèi)激素水平，抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。但內(nèi)分泌治療存在耐藥性問題，隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，癌細(xì)胞可能會(huì)對(duì)內(nèi)分泌治療藥物產(chǎn)生耐藥，導(dǎo)致治療效果下降，且內(nèi)分泌治療僅對(duì)特定類型的乳腺癌患者有效，適用范圍相對(duì)較窄。靶向治療是針對(duì)腫瘤細(xì)胞中的特定分子靶點(diǎn)進(jìn)行治療，具有較高的特異性，能夠更精準(zhǔn)地殺傷癌細(xì)胞，減少對(duì)正常細(xì)胞的損傷。然而，靶向治療藥物價(jià)格昂貴，給患者和家庭帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，且并非所有乳腺癌患者都能找到合適的靶向治療靶點(diǎn)，適用人群有限。相比之下，三七根及花總皂苷作為一種天然的植物提取物，具有多方面的潛在優(yōu)勢(shì)。在安全性方面，其不良反應(yīng)相對(duì)較少。傳統(tǒng)的化療藥物和放療手段在治療過程中往往會(huì)給患者帶來諸多痛苦和不良反應(yīng)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。而三七根及花總皂苷是從天然植物中提取，成分相對(duì)溫和，對(duì)正常細(xì)胞的損傷較小，能夠在一定程度上避免或減輕傳統(tǒng)治療方法帶來的不良反應(yīng)，提高患者的生活質(zhì)量。從作用機(jī)制角度分析，三七根及花總皂苷具有多靶點(diǎn)作用的特點(diǎn)。乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移涉及多個(gè)復(fù)雜的分子過程和信號(hào)通路，單一靶點(diǎn)的治療方法往往難以取得理想的治療效果。三七根及花總皂苷能夠通過調(diào)節(jié)與乳腺癌侵襲相關(guān)的多個(gè)基因和蛋白表達(dá)，抑制癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，阻斷PI3K/AKT和Ras/Raf/MEK/ERK等多條關(guān)鍵信號(hào)通路，從多個(gè)層面協(xié)同作用，抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。這種多靶點(diǎn)的作用方式使其在治療乳腺癌時(shí)具有更全面的效果，能夠更有效地抑制腫瘤的發(fā)展。在成本效益方面，三七根及花總皂苷也具有一定的優(yōu)勢(shì)。三七作為一種常見的中藥材，資源相對(duì)豐富，其提取和制備成本相對(duì)較低。與價(jià)格昂貴的靶向治療藥物相比，三七根及花總皂苷在治療乳腺癌時(shí)，能夠?yàn)榛颊咛峁┮环N經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的治療選擇，減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，具有較高的成本效益比。綜上所述，三七根及花總皂苷在抗乳腺癌侵襲方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，有望成為一種潛在的乳腺癌治療藥物或輔助治療手段，為乳腺癌患者提供新的治療選擇，具有廣闊的應(yīng)用前景。5.4研究的局限性與展望本研究在探究三七根及花總皂苷抗乳腺癌侵襲的作用機(jī)制方面取得了一定成果，但仍存在一些局限性。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方面，本研究主要采用了體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，雖然細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛟谝欢ǔ潭壬夏M體內(nèi)環(huán)境，揭示藥物對(duì)細(xì)胞的直接作用機(jī)制，但與體內(nèi)復(fù)雜的生理病理環(huán)境仍存在差異。體內(nèi)環(huán)境中，藥物的代謝、分布以及與機(jī)體免疫系統(tǒng)的相互作用等因素都會(huì)對(duì)藥物的療效產(chǎn)生影響，而這些因素在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中難以完全體現(xiàn)。從樣本數(shù)量來看，本研究在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的樣本數(shù)量相對(duì)有限，這可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和普遍性。在后續(xù)研究中，需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本數(shù)量，進(jìn)行多批次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，以提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信度。本研究?jī)H選用了MDA-MB-231這一種乳腺癌細(xì)胞株進(jìn)行研究，然而不同乳腺癌細(xì)胞株具有不同的生物學(xué)特性和分子特征，對(duì)藥物的敏感性也可能存在差異。因此，未來研究應(yīng)選取多種乳腺癌細(xì)胞株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，全面評(píng)估三七根及花總皂苷對(duì)不同類型乳腺癌細(xì)胞的作用效果。展望未來，首先應(yīng)開展體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，建立乳腺癌動(dòng)物模型，進(jìn)一步驗(yàn)證三七根及花總皂苷在體內(nèi)的抗乳腺癌侵襲作用，深入研究其在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)特性，為臨床應(yīng)用提供更有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。應(yīng)加大樣本量，涵蓋不同類型的乳腺癌患者樣本，進(jìn)行更深入的臨床前研究，評(píng)估其安全性和有效性，為后續(xù)臨床試驗(yàn)的開展奠定基礎(chǔ)。還需進(jìn)一步深入探究三七根及花總皂苷抗乳腺癌侵襲的分子機(jī)制，除了本研究中涉及的基因、蛋白和信號(hào)通路外，還可能存在其他尚未被發(fā)現(xiàn)的作用靶點(diǎn)和機(jī)制。利用蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等多組學(xué)技術(shù)，全面系統(tǒng)地分析三七根及花總皂苷作用后乳腺癌細(xì)胞的分子變化，挖掘潛在的作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路，為深入理解其抗乳腺癌侵襲的機(jī)制提供更全面的視角。結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)，開展聯(lián)合用藥研究，將三七根及花總皂苷與現(xiàn)有的乳腺癌治療方法，如化療、放療、靶向治療等相結(jié)合，探究聯(lián)合治療方案的協(xié)同增效作用，優(yōu)化治療策略，為乳腺癌患者提供更有效的綜合治療方案。六、結(jié)論6.1研究成果總結(jié)本研究通過一系列實(shí)驗(yàn)，深入探究了三七根及花總皂苷抗乳腺癌侵襲的作用及機(jī)制，取得了如下重要成果：三七根及花總皂苷對(duì)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖具有顯著的抑制作用，且抑制效果呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，隨著三七根及花總皂苷濃度的增加，乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的增殖抑制率逐漸升高，當(dāng)濃度達(dá)到100μg/ml時(shí)，抑制率高達(dá)（62.34±4.21）%。三七根及花總皂苷能夠顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，且同樣表現(xiàn)出濃度依賴的特性。在Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)中，各濃度的三七根及花總皂苷處理組細(xì)胞遷移和侵襲能力均受到明顯抑制，隨著藥物濃度的升高，穿過膜的細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，遷移和侵襲抑制率不斷提高。從分子機(jī)制層面來看，三七根及花總皂苷通過調(diào)節(jié)與乳腺癌侵襲相關(guān)的基因和蛋白表達(dá)，抑制癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，阻斷PI3K/AKT和Ras/Raf/MEK/ERK等關(guān)鍵信號(hào)通路，從而發(fā)揮抗乳腺癌侵襲的作用。PCR芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，三七根及花總皂苷處理組中ITGB1、CXCR4、MMP2等與乳腺癌侵襲相關(guān)的基因表達(dá)顯著下調(diào)；蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明，上皮標(biāo)志物E-cadherin蛋白表達(dá)上調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)下調(diào)，與EMT過程密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Snail和Slug蛋白表達(dá)降低，PI3K/AKT和Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路相關(guān)的p-AKT和p-ERK蛋白表達(dá)顯著降低。6.2研究的應(yīng)用價(jià)值與意義本研究成果在乳腺癌治療領(lǐng)域具有顯著的潛在應(yīng)用價(jià)值。從臨床治療角度來看，三七根及花總皂苷為乳腺癌治療提供了新的治療策略和潛在藥物選擇。目前，乳腺癌的治療面臨著諸多挑戰(zhàn)，如傳統(tǒng)治療方法的不良反應(yīng)、耐藥性等問題。而三七根及花總皂苷具有抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的作用，且不良反應(yīng)相對(duì)較少，有望成為一種新型的抗乳腺癌藥物或輔助治療藥物。在未來的臨床應(yīng)用中，可將三七根及花總皂苷與現(xiàn)有的治療方法相結(jié)合，如與化療藥物聯(lián)合使用，可能增強(qiáng)化療藥物的療效，同時(shí)減輕化療藥物的不良反應(yīng)，提高患者的治療效果和生活質(zhì)量。對(duì)于一些無(wú)法耐受傳統(tǒng)治療方法的患者，三七根及花總皂苷可能成為一種有效的替代治療選擇，為他們提供新的治療希望。從藥物研發(fā)角度而言，本研究為開發(fā)新型抗乳腺癌藥物奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。通過深入探究三七根及花總皂苷抗乳腺癌侵襲的作用機(jī)制，明確了其作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)和信號(hào)通路，為后續(xù)的藥物研發(fā)提供了明確的方向?？蒲腥藛T可以基于這些研究結(jié)果，進(jìn)一步優(yōu)化藥物結(jié)構(gòu)，提高藥物的活性和選擇性，開發(fā)出更加高效、低毒的抗乳腺癌藥物。以三七根及花總皂苷為先導(dǎo)化合物，通過化學(xué)修飾等手段，研發(fā)出具有更好藥理活性和藥代動(dòng)力學(xué)特性的新型藥物，有望在乳腺癌治療中發(fā)揮更大的作用。本研究對(duì)中藥抗癌研究的推動(dòng)作用也不容小覷。在傳統(tǒng)中藥領(lǐng)域，三七作為一種重要的中藥材，具有悠久的應(yīng)用歷史，但對(duì)于其在抗癌方面的作用機(jī)制研究相對(duì)有限。本研究深入揭示了三七根及花總皂苷抗乳腺癌侵襲的作用機(jī)制，為進(jìn)一步挖掘三七的抗癌潛力提供了有力的理論支持。這不僅有助于豐富中藥抗癌的理論體系，還能夠拓展中藥在腫瘤治療領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。為其他中藥抗癌研究提供了有益的借鑒和參考，激發(fā)科研人員對(duì)更多中藥抗癌成分和機(jī)制的探索，推動(dòng)中藥抗癌研究的深入發(fā)展。通過本研究，可以鼓勵(lì)更多的科研人員關(guān)注中藥在抗癌領(lǐng)域的應(yīng)用，采用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)和方法，深入研究中藥的抗癌作用機(jī)制，開發(fā)出更多有效的中藥抗癌藥物，為腫瘤患者提供更多的治療選擇。七、參考文獻(xiàn)[1]SungH,FerlayJ,SiegelRL,etal.Globalcancerstatistics2020:GLOBOCANestimatesofincidenceandmortalityworldwidefor36cancersin185countries[J].CA:acancerjournalforclinicians,2021,71(3):209-249.[2]陳萬(wàn)青，徐婷婷，曾紅梅，等.2022年中國(guó)惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析[J].中華腫瘤雜志，2023,45(6):619-629.[3]廖文琴，可燕，蔣嘉燁，等。三七花總皂苷抑制人乳腺癌細(xì)胞侵襲的體外研究[J].上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010,24(5):77-81.[4]LuoS,ZhangL,ChenX,etal.TotalsaponinsfromtherootsofPanaxnotoginsengexertanti-breastcancercellactivityviaactivationofAMP-activatedproteinkinasesignalingpathways[J].Molecularmedicinereports,2014,9(2):437-441.[5]QiZ,WangH,WangJ,etal.AntitumorefficacyofRadixNotoginsengsaponinsagainsthumanbreastcancercells[J].Oncologyletters,2016,11(5):3841-3847.[6]LijuanS,HuijuanX,JiajiaC,etal.PreventiveandtherapeuticeffectsoftotalflavonoidsfromEpimediumintheMCF-7humanbreastcancercelllinemodelofbonemetastasis[J].Molecularmedicinereports,2016,13(6):5327-5335.[2]陳萬(wàn)青，徐婷婷，曾紅梅，等.202