演講人：日期:原代肝細(xì)胞提取CATALOGUE目錄01實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備02肝組織分離03細(xì)胞純化處理04細(xì)胞活性檢測(cè)05細(xì)胞培養(yǎng)條件06質(zhì)量控制應(yīng)用01實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇標(biāo)準(zhǔn)健康狀況評(píng)估選擇無(wú)傳染性疾病、肝功能正常且未接受過(guò)藥物處理的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，確保肝臟組織處于最佳生理狀態(tài)。需通過(guò)血清生化檢測(cè)和病理學(xué)檢查排除潛在健康問(wèn)題。年齡與體重匹配優(yōu)先選用發(fā)育成熟、體重穩(wěn)定的個(gè)體，避免因年齡差異導(dǎo)致肝細(xì)胞代謝活性不一致。通常要求體重波動(dòng)范圍不超過(guò)群體平均值的10%。遺傳背景控制采用近交系或明確遺傳背景的動(dòng)物品系，減少個(gè)體間基因差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可重復(fù)性。手術(shù)器械消毒流程高壓蒸汽滅菌處理所有金屬手術(shù)器械需在121℃、103kPa條件下滅菌20分鐘，確保殺滅芽孢在內(nèi)的所有微生物。器械包應(yīng)使用滅菌指示帶驗(yàn)證滅菌效果?；瘜W(xué)消毒劑浸泡對(duì)于不耐高溫的器械，采用2%戊二醛溶液浸泡10小時(shí)以上，使用前需用無(wú)菌生理鹽水反復(fù)沖洗殘留消毒劑。無(wú)菌操作臺(tái)預(yù)處理手術(shù)前30分鐘開(kāi)啟超凈臺(tái)紫外燈照射，并用75%乙醇擦拭臺(tái)面及器械托盤(pán)，建立無(wú)菌操作環(huán)境。灌注緩沖液配制要求營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)補(bǔ)充包含葡萄糖（5-10mM）、HEPES緩沖系統(tǒng)（10-25mM）及必需氨基酸，維持細(xì)胞在灌注過(guò)程中的能量代謝需求。膠原酶活性?xún)?yōu)化添加IV型膠原酶（0.05%-0.1%）和透明質(zhì)酸酶（0.005%），酶溶液需經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾除菌，臨用前配制以保證酶活性。電解質(zhì)平衡設(shè)計(jì)緩沖液需含有NaCl、KCl、CaCl2等成分，維持與血漿相似的滲透壓（290-310mOsm/L）和pH值（7.2-7.4），避免細(xì)胞滲透壓損傷。02肝組織分離原位灌注技術(shù)要點(diǎn)灌注液配制與溫度控制門(mén)靜脈插管操作規(guī)范灌注速率與壓力調(diào)節(jié)需使用預(yù)冷的無(wú)菌緩沖液（如HBSS或PBS）配制灌注液，并嚴(yán)格維持溫度在適宜范圍，以避免細(xì)胞損傷。灌注液中需添加抗凝劑（如肝素）和膠原酶，以促進(jìn)血管通暢和組織消化。灌注過(guò)程中需控制流速和壓力，避免因流速過(guò)快導(dǎo)致血管破裂或流速過(guò)慢影響消化效率。通常采用蠕動(dòng)泵精確調(diào)節(jié)，確保灌注均勻覆蓋肝組織。插管需在無(wú)菌條件下進(jìn)行，導(dǎo)管插入深度應(yīng)適中，避免穿透血管壁。插管后需固定牢固，防止灌注過(guò)程中脫落或移位。酶消化法操作步驟膠原酶選擇與濃度優(yōu)化根據(jù)肝組織特性選擇合適類(lèi)型的膠原酶（如IV型或V型），并通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳濃度，以平衡消化效率與細(xì)胞存活率。消化時(shí)間需嚴(yán)格控制，避免過(guò)度消化導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷。終止消化與細(xì)胞收集消化完成后立即加入含血清的培養(yǎng)基終止反應(yīng)，通過(guò)低速離心分離細(xì)胞懸液。上清液需經(jīng)濾網(wǎng)過(guò)濾（如100μm孔徑）以去除未消化完全的纖維組織。組織碎塊預(yù)處理將肝組織剪切成均勻的小塊（約1-2mm3），以增大酶接觸面積。碎塊需用緩沖液反復(fù)沖洗，去除血液和雜質(zhì)，減少消化過(guò)程中的干擾因素。所有器械（如剪刀、鑷子）需高溫高壓滅菌，操作過(guò)程中避免用力擠壓組織，以防機(jī)械損傷導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂或內(nèi)容物泄漏。機(jī)械分離法注意事項(xiàng)器械滅菌與操作輕柔使用等滲緩沖液（如PBS）維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓穩(wěn)定，防止細(xì)胞腫脹或皺縮。緩沖液中可添加EDTA等螯合劑以減少細(xì)胞間黏附。緩沖液選擇與滲透壓平衡離心速度和時(shí)間需根據(jù)細(xì)胞大小和密度調(diào)整，通常采用低速離心（如50-100g）以保留完整肝細(xì)胞，棄去紅細(xì)胞和碎片。離心后需輕柔重懸細(xì)胞，避免反復(fù)吹打?qū)е聶C(jī)械損傷。離心參數(shù)優(yōu)化03細(xì)胞純化處理低速離心參數(shù)設(shè)置轉(zhuǎn)速控制范圍離心機(jī)轉(zhuǎn)速通常設(shè)置在50-200g之間，具體數(shù)值需根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型和培養(yǎng)基粘度調(diào)整，避免過(guò)高轉(zhuǎn)速導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷或聚集現(xiàn)象。離心時(shí)間優(yōu)化低速離心持續(xù)時(shí)間建議控制在5-10分鐘，過(guò)短可能導(dǎo)致細(xì)胞沉淀不充分，過(guò)長(zhǎng)則增加細(xì)胞受壓風(fēng)險(xiǎn)。溫度與緩沖液選擇全程需在4℃低溫環(huán)境下操作，并使用含EDTA的PBS緩沖液防止細(xì)胞黏連，維持細(xì)胞活性穩(wěn)定。密度梯度離心方法Percoll介質(zhì)配制采用等滲Percoll溶液（密度1.07-1.12g/mL）建立連續(xù)梯度，通過(guò)預(yù)冷超速離心形成穩(wěn)定分層結(jié)構(gòu)。界面細(xì)胞收集策略離心后選取25%-50%密度區(qū)間的乳白色細(xì)胞環(huán)，用無(wú)菌巴氏管精準(zhǔn)吸取目標(biāo)細(xì)胞群體。細(xì)胞懸液加載技術(shù)將消化后的肝細(xì)胞懸液緩慢疊加于梯度介質(zhì)上層，保持液面分層清晰，避免渦流混合影響分離效果。差速貼壁分離流程基質(zhì)包被處理培養(yǎng)皿預(yù)先用Ⅰ型膠原蛋白（濃度50μg/cm2）包被，促進(jìn)肝細(xì)胞特異性貼附而抑制成纖維細(xì)胞粘附。動(dòng)態(tài)時(shí)間控制首次貼壁時(shí)間嚴(yán)格控制在30-45分鐘，及時(shí)移除未貼壁細(xì)胞后更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。酶解終止標(biāo)準(zhǔn)當(dāng)貼壁細(xì)胞形成80%匯合度時(shí)，采用0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液進(jìn)行選擇性解離，鏡下監(jiān)測(cè)細(xì)胞形態(tài)變化作為終止依據(jù)。04細(xì)胞活性檢測(cè)臺(tái)盼藍(lán)染色判定標(biāo)準(zhǔn)染色原理與操作規(guī)范誤差控制要點(diǎn)計(jì)數(shù)區(qū)域選擇標(biāo)準(zhǔn)臺(tái)盼藍(lán)染料通過(guò)穿透破損細(xì)胞膜與胞內(nèi)蛋白結(jié)合顯色，活細(xì)胞因膜完整性拒染。操作時(shí)需將細(xì)胞懸液與0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液按1:1比例混合，靜置3分鐘后立即鏡檢，避免長(zhǎng)時(shí)間染色導(dǎo)致假陽(yáng)性。需在10倍物鏡下系統(tǒng)計(jì)數(shù)血球計(jì)數(shù)板四個(gè)角落大方格（每個(gè)含16個(gè)小格）內(nèi)的細(xì)胞，活細(xì)胞呈透明狀，死細(xì)胞呈藍(lán)色。重復(fù)計(jì)數(shù)三次取平均值，活率＞85%方符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。需排除細(xì)胞團(tuán)塊干擾，對(duì)聚集細(xì)胞應(yīng)輕柔吹打分散；染色時(shí)間超過(guò)5分鐘需重新制片；檢測(cè)環(huán)境溫度需維持在25±2℃，低溫會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞膜抗染能力導(dǎo)致結(jié)果偏差。使用前需用乙醇-乙醚混合液清潔血球計(jì)數(shù)板及蓋玻片，鏡檢確認(rèn)計(jì)數(shù)網(wǎng)格無(wú)劃痕。蓋玻片覆蓋后需出現(xiàn)牛頓環(huán)，保證計(jì)數(shù)室高度精確為0.1mm。每批次實(shí)驗(yàn)需用標(biāo)準(zhǔn)微球進(jìn)行計(jì)數(shù)驗(yàn)證，誤差控制在±5%以?xún)?nèi)。細(xì)胞計(jì)數(shù)規(guī)范操作計(jì)數(shù)板校準(zhǔn)流程消化終止后需用含10%FBS的培養(yǎng)基中和胰酶，400g離心5分鐘獲取細(xì)胞沉淀。重懸時(shí)采用巴氏吸管反復(fù)吹打30次至單細(xì)胞懸液，靜置2分鐘后取中層液體計(jì)數(shù)，避免氣泡影響體積測(cè)量。細(xì)胞懸液制備要求細(xì)胞密度(個(gè)/mL)=四大格細(xì)胞總數(shù)÷4×10?×稀釋倍數(shù)。需記錄原代細(xì)胞提取時(shí)間、傳代代數(shù)、計(jì)數(shù)溫度濕度等參數(shù)，建立完整的細(xì)胞溯源檔案。計(jì)算公式與記錄規(guī)范接種后每2小時(shí)在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，記錄偽足伸展情況。采用Calcein-AM熒光染色，在488nm激發(fā)光下定量檢測(cè)貼壁細(xì)胞比例，要求6小時(shí)內(nèi)貼壁率＞70%為合格。貼壁效率評(píng)估方法動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)方案針對(duì)原代肝細(xì)胞特性，需提前用Ⅰ型膠原（50μg/cm2）包被培養(yǎng)皿，37℃固化2小時(shí)后PBS沖洗。對(duì)比實(shí)驗(yàn)表明膠原涂層可使貼壁效率提升40%以上，尤其適用于肝硬化患者來(lái)源的脆弱細(xì)胞?；|(zhì)涂層優(yōu)化采用ImageProPlus軟件分析接種24小時(shí)后的細(xì)胞鋪展面積，計(jì)算貼壁指數(shù)（細(xì)胞實(shí)際投影面積/理論最大鋪展面積）。優(yōu)質(zhì)原代肝細(xì)胞應(yīng)達(dá)到0.65-0.8的貼壁指數(shù)，且細(xì)胞間形成穩(wěn)定的連接復(fù)合體。量化評(píng)估體系05細(xì)胞培養(yǎng)條件專(zhuān)用培養(yǎng)基配方需補(bǔ)充10%胎牛血清（FBS）、1%胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒（ITS）、20ng/mL表皮生長(zhǎng)因子（EGF）及10^-7M地塞米松，以促進(jìn)肝細(xì)胞貼壁和增殖。添加生長(zhǎng)因子與激素

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常規(guī)加入100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素，必要時(shí)可添加0.1%Primocin以預(yù)防支原體污染?？股嘏c抗污染成分采用Williams'E培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)，因其含有肝細(xì)胞生長(zhǎng)所需的特定氨基酸、維生素和無(wú)機(jī)鹽，適合維持肝細(xì)胞功能表達(dá)?；A(chǔ)培養(yǎng)基選擇添加1mMN-乙酰半胱氨酸（NAC）作為抗氧化劑，并采用HEPES緩沖液（10mM）維持pH穩(wěn)定性，防止代謝產(chǎn)物積累導(dǎo)致的細(xì)胞損傷?？寡趸瘎┡c緩沖體系使用Ⅰ型鼠尾膠原（50μg/cm2）進(jìn)行預(yù)處理，形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)以模擬肝細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境，增強(qiáng)細(xì)胞極性分化。膠原蛋白包被培養(yǎng)皿需經(jīng)氧等離子處理或使用細(xì)胞培養(yǎng)專(zhuān)用多聚賴(lài)氨酸涂層，使接觸角降至20°以下，確保細(xì)胞均勻貼壁分布。表面親水性處理對(duì)于原代肝細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)，建議采用Matrigel（8-10mg/mL）與膠原混合包被，比例為3:1，可顯著提高白蛋白合成和CYP450酶活性?；|(zhì)膠動(dòng)態(tài)包被010302培養(yǎng)器皿包被要求包被后需進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)（<0.1EU/mL）和細(xì)胞相容性測(cè)試，避免批次差異影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。無(wú)菌驗(yàn)證與質(zhì)量控制04氣體環(huán)境控制參數(shù)氧分壓精確調(diào)控維持5%O?的低氧環(huán)境（三氣培養(yǎng)箱），模擬肝門(mén)靜脈生理氧分壓，可降低氧化應(yīng)激并延長(zhǎng)細(xì)胞存活周期至14天以上。CO?濃度平衡標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置為5%CO?，配合培養(yǎng)基中26mMNaHCO?緩沖系統(tǒng)，確保pH穩(wěn)定在7.2-7.4范圍內(nèi)，波動(dòng)幅度不超過(guò)0.2。濕度補(bǔ)償機(jī)制培養(yǎng)箱濕度需保持95%以上，配合皿內(nèi)200μL覆蓋礦物油層，防止培養(yǎng)基蒸發(fā)導(dǎo)致的滲透壓改變（目標(biāo)值290-310mOsm/kg）。實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)與報(bào)警安裝多參數(shù)傳感器連續(xù)記錄O?/CO?濃度、溫度和濕度，偏差超過(guò)設(shè)定值5%時(shí)觸發(fā)聲光報(bào)警并自動(dòng)啟動(dòng)氣體補(bǔ)償。06質(zhì)量控制應(yīng)用形態(tài)學(xué)鑒定標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞形態(tài)完整性評(píng)估通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞輪廓是否清晰，胞質(zhì)是否均勻，核質(zhì)比例是否正常，確保無(wú)明顯空泡或顆粒狀變性。雙核細(xì)胞比例分析健康肝細(xì)胞常存在雙核現(xiàn)象，需統(tǒng)計(jì)雙核細(xì)胞占比（通常為5%-15%），過(guò)高或過(guò)低均可能提示提取損傷或培養(yǎng)異常。貼壁特性檢測(cè)原代肝細(xì)胞應(yīng)具備典型的上皮樣貼壁生長(zhǎng)特性，可通過(guò)觀察細(xì)胞在培養(yǎng)皿中的鋪展?fàn)顟B(tài)和偽足形成能力進(jìn)行驗(yàn)證。功能標(biāo)志物檢測(cè)項(xiàng)白蛋白分泌能力檢測(cè)通過(guò)ELISA或放射免疫法測(cè)定培養(yǎng)上清液中白蛋白含量，評(píng)估肝細(xì)胞合成功能，正常值范圍需符合實(shí)驗(yàn)室基準(zhǔn)數(shù)據(jù)。尿素循環(huán)酶活性分析檢測(cè)CPS1（氨甲酰磷酸合成酶1）或OTC（鳥(niǎo)氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶）活性，反映肝細(xì)胞氨代謝能力，活性下降提示功能受損。細(xì)胞色素P450酶系表達(dá)采用qPCR或Westernblot檢測(cè)CYP3A4、CYP2E1等亞型表達(dá)水