一文讀懂蛋白表達蛋白表達是生命科學領(lǐng)域基礎(chǔ)且關(guān)鍵的技術(shù)之一，尤其在重組蛋白生產(chǎn)中扮演著核心角色。科研人員在進行蛋白表達時，需從蛋白表達載體設(shè)計入手，結(jié)合適宜的蛋白表達系統(tǒng)，通過蛋白表達優(yōu)化提升產(chǎn)量與活性，最終采用科學的蛋白純化方法獲得高質(zhì)量蛋白。一、重組蛋白生產(chǎn)中的關(guān)鍵步驟在實驗室中，重組蛋白生產(chǎn)主要包含以下幾個環(huán)節(jié)：1.目標基因克隆與載體構(gòu)建選擇合適的載體是高效蛋白表達的第一步?？蒲腥藛T常用的表達載體一般包含強啟動子（如T7、CMV）、多克隆位點和標簽序列（如His標簽、GST標簽），方便蛋白的后期純化?？寺r需確保插入的基因序列無突變，并進行密碼子優(yōu)化以適配表達宿主的翻譯偏好，最大化表達水平。2.選擇合適的蛋白表達系統(tǒng)蛋白表達系統(tǒng)的選擇極其關(guān)鍵。大腸桿菌系統(tǒng)適合表達簡單、無復(fù)雜修飾的小分子蛋白，且速度快、成本低，但對復(fù)雜折疊和糖基化蛋白效果有限。酵母系統(tǒng)則提供一定程度的翻譯后修飾，適合中等復(fù)雜度蛋白。昆蟲細胞和哺乳動物細胞表達系統(tǒng)適合復(fù)雜蛋白和需要完整翻譯后修飾的蛋白，雖然成本和時間較高，但產(chǎn)物質(zhì)量更貼近天然狀態(tài)。3.蛋白表達優(yōu)化科研中，蛋白表達量的提升是反復(fù)優(yōu)化的過程。包括調(diào)整誘導劑（如IPTG）濃度、溫度、表達時間和培養(yǎng)基成分。一般來說，降低培養(yǎng)溫度（如從37℃降至16-25℃）能改善蛋白折疊，減少包涵體形成。對表達量不高的蛋白，可以嘗試不同的啟動子強度和標簽位置（N端或C端），以優(yōu)化翻譯效率和蛋白穩(wěn)定性。4.蛋白提取及溶解蛋白表達后，如何高效提取和溶解蛋白也是挑戰(zhàn)。大腸桿菌中表達的蛋白常見包涵體現(xiàn)象，需要使用尿素或硫脲等變性劑溶解后再進行復(fù)性。對于可溶性蛋白，溫和的細胞破碎方法（如超聲、酶解）配合緩沖液使用，能保持蛋白活性和穩(wěn)定性。蛋白表達系統(tǒng)深度解析大腸桿菌表達系統(tǒng)優(yōu)勢：成本低、培養(yǎng)速度快、操作簡便，適合大量表達。

劣勢：無法進行復(fù)雜翻譯后修飾，易形成包涵體。

應(yīng)用建議：適合結(jié)構(gòu)域表達、酶活性蛋白、疫苗抗原的初步篩選。酵母表達系統(tǒng)（如畢赤酵母）優(yōu)勢：可進行簡單糖基化，表達環(huán)境相對簡單。

劣勢：糖基化模式與哺乳動物有所不同，可能影響蛋白活性。

應(yīng)用建議：適合中小分子蛋白、酶類和疫苗蛋白的表達。昆蟲細胞表達系統(tǒng)（Baculovirus）優(yōu)勢：能表達復(fù)雜蛋白、進行較為完整的糖基化和其他翻譯后修飾。

劣勢：成本高，表達周期較長。

應(yīng)用建議：適合結(jié)構(gòu)復(fù)雜、需要功能性折疊的哺乳動物蛋白。哺乳動物細胞表達系統(tǒng)（CHO、HEK293）優(yōu)勢：翻譯后修飾最接近人體蛋白，適合生產(chǎn)臨床用生物制品。

劣勢：培養(yǎng)周期長，成本高，操作復(fù)雜。

應(yīng)用建議：抗體、融合蛋白、生物藥物研發(fā)與生產(chǎn)的首選。三、蛋白表達載體設(shè)計與表達優(yōu)化蛋白表達載體是表達調(diào)控的核心模塊。載體設(shè)計需結(jié)合目標蛋白的結(jié)構(gòu)特性，合理選擇融合標簽的類型及其在蛋白上的位置。N端或C端標簽不同，可能影響蛋白的折疊和活性。標簽的可切除設(shè)計同樣關(guān)鍵，方便后續(xù)獲得天然蛋白。蛋白表達優(yōu)化涵蓋多個層面：誘導劑濃度與時間：降低IPTG濃度、延長誘導時間能減輕細胞壓力，減少包涵體形成，增加可溶性蛋白產(chǎn)量。培養(yǎng)溫度調(diào)控：低溫表達（16℃–25℃）有助于蛋白正確折疊，提升活性。培養(yǎng)基配方和共表達伴侶蛋白：優(yōu)化營養(yǎng)成分，輔助蛋白折疊，提高產(chǎn)量和質(zhì)量?，F(xiàn)代實驗常采用多因素設(shè)計（DOE）策略，系統(tǒng)篩選不同參數(shù)組合，快速找到最佳表達條件，顯著提升重組蛋白生產(chǎn)效率。四、蛋白純化方法及應(yīng)用蛋白純化是獲取功能性蛋白的必經(jīng)步驟。融合標簽為純化提供了便捷手段，親和層析（如鎳柱純化His標簽蛋白）因高效且簡便而廣受歡迎。GST和MBP標簽則因其提升溶解性的能力，適合難表達蛋白的純化。離子交換層析根據(jù)蛋白電荷差異進行分離，可有效去除雜質(zhì)，提高純度。凝膠過濾層析則按分子大小進行分離，常用于緩沖液交換和去除聚集體，