HMGB1mRNA和蛋白在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)及臨床意義：基于分子機(jī)制與診療前景的探究一、引言1.1研究背景1.1.1宮頸鱗癌的現(xiàn)狀宮頸鱗癌作為女性生殖系統(tǒng)中最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著全球女性的健康。據(jù)全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，每年約有新發(fā)病例[X]萬(wàn)，死亡病例達(dá)[X]萬(wàn)，其發(fā)病率在女性惡性腫瘤中位居前列。在我國(guó)，宮頸鱗癌同樣是一個(gè)不容忽視的健康問(wèn)題，每年新發(fā)病例約[X]萬(wàn)，占全球發(fā)病總數(shù)的[X]%左右，且發(fā)病呈現(xiàn)出年輕化趨勢(shì)。宮頸鱗癌早期癥狀隱匿，通常無(wú)明顯特異性表現(xiàn)，部分患者可能僅出現(xiàn)接觸性出血、白帶增多等輕微癥狀，容易被忽視。隨著病情進(jìn)展，患者會(huì)出現(xiàn)不規(guī)則陰道流血、陰道排液，且排液常伴有腥臭味，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。當(dāng)癌腫侵犯周?chē)M織和器官時(shí)，會(huì)引發(fā)一系列嚴(yán)重并發(fā)癥，如尿頻、尿急、便秘、下肢腫痛等，甚至導(dǎo)致輸尿管梗阻、腎盂積水，最終發(fā)展為尿毒癥，危及生命。早期診斷和治療對(duì)于改善宮頸鱗癌患者的預(yù)后至關(guān)重要。若能在疾病早期，即原位癌階段被發(fā)現(xiàn)并及時(shí)治療，患者的5年生存率可高達(dá)90%以上。然而，由于早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，此時(shí)5年生存率顯著下降，僅為30%-50%。因此，尋找有效的早期診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，對(duì)于提高宮頸鱗癌患者的生存率和生活質(zhì)量具有重要意義。1.1.2HMGB1的研究進(jìn)展高遷移率族蛋白1（HMGB1）作為一種非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，自1973年在小牛胸腺中首次被發(fā)現(xiàn)并鑒定以來(lái)，其在生物學(xué)領(lǐng)域的研究不斷深入。早期研究主要聚焦于HMGB1在細(xì)胞核內(nèi)的功能，發(fā)現(xiàn)它作為染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)蛋白，對(duì)維持核小體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定以及調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄發(fā)揮著重要作用。隨著研究的逐步拓展，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)HMGB1不僅局限于細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用，在細(xì)胞外也具有廣泛的生物學(xué)活性。1999年，HMGB1被確定為小鼠內(nèi)毒素致死的介質(zhì)，這一發(fā)現(xiàn)開(kāi)啟了HMGB1細(xì)胞外功能研究的新篇章。細(xì)胞外的HMGB1可作為損傷相關(guān)分子模式（DAMP），與多種受體如Toll樣受體4（TLR4）、晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）等結(jié)合，激活下游信號(hào)通路，參與免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞增殖、分化、遷移和凋亡等多種生理病理過(guò)程。在腫瘤研究領(lǐng)域，近年來(lái)大量研究表明，HMGB1在多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后中扮演著關(guān)鍵角色。在結(jié)直腸癌中，研究發(fā)現(xiàn)GSDME介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡會(huì)通過(guò)釋放HMGB1激活ERK1/2通路，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）表達(dá)，誘導(dǎo)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展；在肝內(nèi)膽管癌中，HMGB1和RAGE在已轉(zhuǎn)移的膽管癌患者組織標(biāo)本中高表達(dá)，且HMGB1可促進(jìn)膽管癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程及癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲。然而，目前關(guān)于HMGB1在宮頸鱗癌中的研究仍相對(duì)不足。雖然已有少量研究提示HMGB1可能與宮頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，但對(duì)于其在宮頸鱗癌組織中的具體表達(dá)情況、與臨床病理特征的關(guān)系以及在宮頸鱗癌細(xì)胞生物學(xué)行為中的作用機(jī)制等方面，尚未完全明確。深入研究HMGB1在宮頸鱗癌中的表達(dá)及臨床意義，有望為宮頸鱗癌的早期診斷、預(yù)后評(píng)估和靶向治療提供新的思路和理論依據(jù)。1.2研究目的與意義1.2.1研究目的本研究旨在深入探究HMGB1mRNA和蛋白在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)水平，通過(guò)系統(tǒng)分析其與患者臨床病理特征之間的相關(guān)性，明確HMGB1在宮頸鱗癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用。具體而言，將通過(guò)收集宮頸鱗癌患者的組織標(biāo)本，運(yùn)用先進(jìn)的定量PCR和免疫組化等技術(shù)手段，精確測(cè)定HMGB1mRNA和蛋白的表達(dá)情況。同時(shí)，全面收集患者的年齡、病程、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理信息，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析HMGB1表達(dá)與這些特征的關(guān)聯(lián)。此外，還將構(gòu)建人宮頸癌細(xì)胞株模型，深入研究HMGB1對(duì)宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的影響，為揭示宮頸鱗癌的發(fā)病機(jī)制提供堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。1.2.2研究意義從理論層面來(lái)看，本研究有望揭示HMGB1在宮頸鱗癌發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制，填補(bǔ)該領(lǐng)域在發(fā)病機(jī)制研究方面的部分空白，進(jìn)一步完善宮頸鱗癌的分子生物學(xué)理論體系。通過(guò)深入探究HMGB1與宮頸鱗癌細(xì)胞生物學(xué)行為的關(guān)系，能夠更加深入地理解腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移等過(guò)程，為后續(xù)開(kāi)展相關(guān)研究提供新的思路和方向。在實(shí)踐方面，本研究成果具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。準(zhǔn)確檢測(cè)HMGB1在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)情況，有望為宮頸鱗癌的早期診斷提供一種新的、有效的生物學(xué)標(biāo)志物，提高早期診斷的準(zhǔn)確性，從而實(shí)現(xiàn)疾病的早發(fā)現(xiàn)、早治療，改善患者的預(yù)后。通過(guò)分析HMGB1表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性，可以為醫(yī)生評(píng)估患者的病情嚴(yán)重程度和預(yù)后提供更全面、準(zhǔn)確的信息，有助于制定個(gè)性化的治療方案，提高治療效果。對(duì)HMGB1作用機(jī)制的研究，可能為開(kāi)發(fā)針對(duì)宮頸鱗癌的靶向治療藥物提供新的靶點(diǎn)，開(kāi)拓治療手段，為患者帶來(lái)更多的治療選擇和生存希望，也將為公共衛(wèi)生和臨床醫(yī)學(xué)在宮頸鱗癌防治方面提供強(qiáng)有力的科學(xué)依據(jù)和新的思路。二、HMGB1的生物學(xué)特性2.1HMGB1的結(jié)構(gòu)高遷移率族蛋白1（HMGB1）是一種高度保守的非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，在多種生物過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。人HMGB1由215個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量約為25kDa，其氨基酸序列在不同物種間具有高度保守性，如人和小鼠的HMGB1氨基酸序列同源性高達(dá)99%。HMGB1蛋白主要包含三個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別為兩個(gè)帶正電荷的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，即A-box和B-box，以及一個(gè)帶負(fù)電荷的C末端酸性尾部。A-box由約80個(gè)氨基酸組成，其結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，呈現(xiàn)出獨(dú)特的L形折疊，這種結(jié)構(gòu)賦予A-box與DNA小溝緊密結(jié)合的能力。B-box同樣具有L形結(jié)構(gòu)，由大約85個(gè)氨基酸構(gòu)成，它對(duì)DNA的結(jié)合特異性和親和力與A-box有所不同，但都在維持染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮重要作用。研究表明，A-box和B-box通過(guò)與DNA的結(jié)合，能夠改變DNA的構(gòu)象，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子與DNA的相互作用，從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。C末端酸性尾部則由約30個(gè)連續(xù)的酸性氨基酸組成，呈現(xiàn)出高度的柔性，缺乏明確的二級(jí)結(jié)構(gòu)。這一結(jié)構(gòu)域雖然不直接參與DNA結(jié)合，但在調(diào)節(jié)HMGB1與其他蛋白質(zhì)的相互作用以及HMGB1的細(xì)胞內(nèi)定位和功能發(fā)揮方面起著至關(guān)重要的作用。例如，C末端酸性尾部的磷酸化修飾可以影響HMGB1與染色質(zhì)的結(jié)合能力，進(jìn)而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄活性；在細(xì)胞應(yīng)激條件下，C末端酸性尾部還能介導(dǎo)HMGB1從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)位，使其發(fā)揮細(xì)胞外功能。HMGB1的結(jié)構(gòu)與功能之間存在著緊密的聯(lián)系。其獨(dú)特的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域賦予了它與DNA及染色質(zhì)相關(guān)蛋白相互作用的能力，使其在細(xì)胞核內(nèi)能夠維持核小體的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，防止DNA受到損傷，并參與基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控過(guò)程。而C末端酸性尾部的柔性和可修飾性，則為HMGB1在不同的細(xì)胞生理狀態(tài)下發(fā)揮多樣化的功能提供了基礎(chǔ)，使其能夠響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)變化，調(diào)節(jié)自身的活性和細(xì)胞定位，參與免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)等多種細(xì)胞外生物學(xué)過(guò)程。2.2HMGB1的功能2.2.1在細(xì)胞核內(nèi)的功能在正常生理狀態(tài)下，HMGB1主要定位于細(xì)胞核內(nèi)，發(fā)揮著維持核小體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、調(diào)節(jié)基因表達(dá)以及參與DNA損傷修復(fù)等重要作用。核小體作為染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位，由DNA纏繞在組蛋白八聚體上形成。HMGB1通過(guò)其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)與DNA和組蛋白相互作用，對(duì)維持核小體的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)起著不可或缺的作用。研究表明，HMGB1的A-box和B-box結(jié)構(gòu)域能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合到DNA的小溝區(qū)域，這種結(jié)合方式可以增加DNA與組蛋白之間的親和力，從而促進(jìn)核小體的形成和穩(wěn)定。當(dāng)HMGB1缺失時(shí)，核小體的結(jié)構(gòu)會(huì)變得不穩(wěn)定，容易受到各種因素的影響而發(fā)生解聚，進(jìn)而影響染色質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)和功能。HMGB1在基因表達(dá)調(diào)控過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色。它可以通過(guò)多種方式影響基因轉(zhuǎn)錄，其中一種重要方式是與轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子與DNA啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合能力。例如，在細(xì)胞周期調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，HMGB1能夠與E2F轉(zhuǎn)錄因子家族成員結(jié)合，增強(qiáng)它們與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合活性，從而促進(jìn)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞的增殖和分化。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，HMGB1對(duì)某些關(guān)鍵基因的表達(dá)調(diào)控也至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的過(guò)程中，HMGB1能夠與神經(jīng)分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子如NeuroD1等相互作用，促進(jìn)這些轉(zhuǎn)錄因子與相應(yīng)基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合，激活神經(jīng)分化相關(guān)基因的表達(dá)，推動(dòng)神經(jīng)細(xì)胞的分化和發(fā)育。此外，HMGB1還能夠通過(guò)改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)，間接影響基因表達(dá)。它可以促進(jìn)核小體在DNA上的滑動(dòng)，使原本被核小體包裹的基因啟動(dòng)子區(qū)域暴露出來(lái)，便于轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的組裝，從而促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄。這種對(duì)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)作用在細(xì)胞應(yīng)對(duì)外界刺激和環(huán)境變化時(shí)尤為重要，能夠使細(xì)胞迅速調(diào)整基因表達(dá)譜，以適應(yīng)不同的生理需求。DNA損傷是細(xì)胞面臨的常見(jiàn)威脅之一，如紫外線照射、化學(xué)物質(zhì)損傷、氧化應(yīng)激等都可能導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂、堿基損傷等。HMGB1在DNA損傷修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮著重要的識(shí)別和招募作用。當(dāng)DNA發(fā)生損傷時(shí)，HMGB1能夠迅速識(shí)別損傷位點(diǎn)，并通過(guò)與損傷相關(guān)蛋白如DNA損傷修復(fù)酶、組蛋白修飾酶等相互作用，招募它們到損傷部位，形成DNA損傷修復(fù)復(fù)合物，啟動(dòng)DNA損傷修復(fù)機(jī)制。例如，在DNA雙鏈斷裂修復(fù)過(guò)程中，HMGB1能夠與Ku70/Ku80異二聚體結(jié)合，促進(jìn)DNA依賴(lài)蛋白激酶（DNA-PK）復(fù)合物的組裝，進(jìn)而激活DNA雙鏈斷裂修復(fù)的非同源末端連接（NHEJ）途徑，使斷裂的DNA雙鏈得以修復(fù)。研究還發(fā)現(xiàn)，HMGB1可以通過(guò)調(diào)節(jié)染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)，為DNA損傷修復(fù)提供適宜的微環(huán)境。它能夠促進(jìn)損傷部位染色質(zhì)的松弛，使修復(fù)蛋白更容易接近損傷位點(diǎn)，提高修復(fù)效率。在細(xì)胞受到氧化應(yīng)激導(dǎo)致DNA損傷時(shí)，HMGB1會(huì)被迅速招募到損傷部位，通過(guò)與染色質(zhì)重塑復(fù)合物相互作用，改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)，促進(jìn)DNA修復(fù)酶對(duì)損傷堿基的識(shí)別和修復(fù)，維持基因組的穩(wěn)定性。2.2.2在細(xì)胞外的功能當(dāng)細(xì)胞受到損傷、應(yīng)激或發(fā)生壞死時(shí)，HMGB1會(huì)從細(xì)胞核釋放到細(xì)胞外，作為一種重要的損傷相關(guān)分子模式（DAMP），在細(xì)胞外環(huán)境中發(fā)揮廣泛的生物學(xué)功能，參與免疫反應(yīng)、細(xì)胞生長(zhǎng)和組織再生等多種生理病理過(guò)程。在免疫反應(yīng)中，細(xì)胞外的HMGB1可以與多種免疫細(xì)胞表面的受體結(jié)合，如Toll樣受體4（TLR4）、晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）等，激活下游信號(hào)通路，引發(fā)免疫細(xì)胞的活化和炎癥反應(yīng)。當(dāng)HMGB1與巨噬細(xì)胞表面的TLR4結(jié)合后，會(huì)激活髓樣分化因子88（MyD88）依賴(lài)的信號(hào)通路，進(jìn)而激活核因子-κB（NF-κB），促使巨噬細(xì)胞分泌大量的促炎細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）等，這些細(xì)胞因子可以招募更多的免疫細(xì)胞到炎癥部位，增強(qiáng)機(jī)體的免疫防御能力。在細(xì)菌感染引發(fā)的炎癥反應(yīng)中，壞死細(xì)胞釋放的HMGB1能夠與免疫細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活免疫細(xì)胞，啟動(dòng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，清除病原體。然而，過(guò)度或持續(xù)的HMGB1釋放和炎癥反應(yīng)也可能導(dǎo)致免疫失衡和組織損傷，引發(fā)自身免疫性疾病、敗血癥等病理狀態(tài)。在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中，關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞和免疫細(xì)胞釋放的HMGB1會(huì)持續(xù)激活炎癥信號(hào)通路，導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎癥的慢性化和組織破壞。細(xì)胞外的HMGB1在細(xì)胞生長(zhǎng)和組織再生過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用。它可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移和分化，為組織修復(fù)和再生提供必要的細(xì)胞基礎(chǔ)。在皮膚創(chuàng)傷愈合過(guò)程中，損傷部位的細(xì)胞會(huì)釋放HMGB1，HMGB1與表皮細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移，加速傷口的愈合。研究還發(fā)現(xiàn)，HMGB1可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和血管生成，為組織再生提供充足的血液供應(yīng)。在缺血組織的修復(fù)過(guò)程中，HMGB1能夠刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等血管生成因子，促進(jìn)新生血管的形成，改善組織的血液灌注，促進(jìn)組織的修復(fù)和再生。2.3HMGB1涉及的信號(hào)通路2.3.1TLR4和AGER相關(guān)通路當(dāng)細(xì)胞受到損傷、應(yīng)激或壞死時(shí)，HMGB1會(huì)釋放到細(xì)胞外，與細(xì)胞表面的Toll樣受體4（TLR4）和晚期糖基化終產(chǎn)物受體（AGER，也稱(chēng)為RAGE）等受體結(jié)合，激活下游復(fù)雜的信號(hào)通路，在免疫反應(yīng)、炎癥調(diào)節(jié)以及腫瘤發(fā)生發(fā)展等過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。HMGB1與TLR4的結(jié)合是啟動(dòng)炎癥信號(hào)通路的重要環(huán)節(jié)。TLR4屬于Toll樣受體家族，是一種重要的模式識(shí)別受體，主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面。當(dāng)HMGB1與TLR4結(jié)合后，會(huì)引發(fā)一系列分子間的相互作用，招募髓樣分化因子88（MyD88），形成HMGB1-TLR4-MyD88復(fù)合物。MyD88作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵接頭分子，其結(jié)構(gòu)中包含死亡結(jié)構(gòu)域（DD）和Toll/IL-1受體（TIR）結(jié)構(gòu)域。通過(guò)TIR-TIR相互作用，MyD88與TLR4結(jié)合，同時(shí)利用其DD結(jié)構(gòu)域招募白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶（IRAK）家族成員，如IRAK1、IRAK4等。IRAK4首先被激活，進(jìn)而磷酸化IRAK1，激活后的IRAK1發(fā)生自身磷酸化并與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）結(jié)合。TRAF6是一種E3泛素連接酶，它可以催化自身及下游分子的泛素化修飾，形成多聚泛素鏈。多聚泛素鏈招募轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β激活激酶1（TAK1）及其結(jié)合蛋白TAB1、TAB2等，使TAK1被激活。激活的TAK1一方面可以激活核因子-κB（NF-κB）誘導(dǎo)激酶（NIK），進(jìn)而激活I(lǐng)κB激酶（IKK）復(fù)合物，IKK使IκB蛋白磷酸化，導(dǎo)致IκB降解，釋放出NF-κB，使其進(jìn)入細(xì)胞核，與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)促炎細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）等的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)；另一方面，TAK1還可以激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成員，如細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK，這些激酶進(jìn)一步磷酸化下游轉(zhuǎn)錄因子，如激活蛋白-1（AP-1）等，促進(jìn)炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，從而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。AGER作為HMGB1的另一個(gè)重要受體，在多種細(xì)胞表面廣泛表達(dá)，包括內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等。HMGB1與AGER結(jié)合后，主要通過(guò)激活Ras-Raf-MEK-ERK和PI3K-Akt等信號(hào)通路發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。在Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)通路中，HMGB1與AGER結(jié)合后，使AGER發(fā)生二聚化或寡聚化，招募含有Src同源2（SH2）結(jié)構(gòu)域的生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2（Grb2）和鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子SOS。SOS促進(jìn)Ras蛋白從結(jié)合GDP的無(wú)活性狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)合GTP的活性狀態(tài)，激活的Ras進(jìn)一步招募并激活Raf蛋白。Raf蛋白作為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，磷酸化并激活MEK1/2，MEK1/2再磷酸化并激活ERK1/2。激活的ERK1/2可以進(jìn)入細(xì)胞核，磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、c-Fos等，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、遷移和存活相關(guān)基因的表達(dá)。在PI3K-Akt信號(hào)通路中，HMGB1與AGER結(jié)合后，激活PI3K，PI3K催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3招募并激活A(yù)kt蛋白，Akt通過(guò)磷酸化多種下游底物，如糖原合成酶激酶3β（GSK3β）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）等，調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、生長(zhǎng)、存活和遷移等過(guò)程。Akt還可以通過(guò)抑制凋亡相關(guān)蛋白Bad，促進(jìn)細(xì)胞存活。此外，HMGB1-AGER信號(hào)通路還可以激活干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3），促進(jìn)I型干擾素的產(chǎn)生，參與抗病毒免疫反應(yīng)和腫瘤免疫監(jiān)視。研究表明，在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞釋放的HMGB1與腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞表面的AGER結(jié)合，激活Ras-Raf-MEK-ERK和PI3K-Akt信號(hào)通路，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸能力。2.3.2其他相關(guān)通路除了與TLR4和AGER結(jié)合激活信號(hào)通路外，HMGB1還可以與其他多種受體相互作用，介導(dǎo)不同的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，參與細(xì)胞的多種生理病理過(guò)程。髓細(xì)胞觸發(fā)受體1（TREM1）是一種主要表達(dá)于中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等髓系細(xì)胞表面的免疫球蛋白樣受體。HMGB1與巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞上的TREM1結(jié)合后，能夠通過(guò)激活NF-κB途徑誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，進(jìn)一步放大炎癥反應(yīng)。具體來(lái)說(shuō)，HMGB1與TREM1結(jié)合后，使TREM1發(fā)生磷酸化，招募含有免疫受體酪氨酸激活基序（ITAM）的接頭蛋白DAP12。DAP12的ITAM基序被Src家族激酶磷酸化，招募并激活Syk激酶。激活的Syk激酶通過(guò)一系列磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活NF-κB誘導(dǎo)激酶（NIK），進(jìn)而激活I(lǐng)κB激酶（IKK）復(fù)合物，使IκB蛋白磷酸化降解，釋放NF-κB，促進(jìn)促炎細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6和IL-8等的表達(dá)。在細(xì)菌感染引起的炎癥反應(yīng)中，HMGB1與中性粒細(xì)胞表面的TREM1結(jié)合，激活NF-κB信號(hào)通路，促使中性粒細(xì)胞釋放大量的炎癥介質(zhì)，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，以抵御病原體的入侵。然而，過(guò)度激活的TREM1-HMGB1信號(hào)通路也可能導(dǎo)致炎癥反應(yīng)失控，引發(fā)組織損傷和器官功能障礙。CXC趨化因子受體4（CXCR4）是一種G蛋白偶聯(lián)受體，在多種細(xì)胞類(lèi)型中表達(dá)，包括造血干細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等。HMGB1可以與趨化因子CXCL12形成復(fù)合物，特異性地與CXCR4結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞遷移。當(dāng)HMGB1-CXCL12復(fù)合物與CXCR4結(jié)合后，激活G蛋白，使Gα亞基與Gβγ亞基解離。Gα亞基激活磷脂酶Cβ（PLCβ），催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）水解生成三磷酸肌醇（IP3）和二酰甘油（DAG）。IP3促使細(xì)胞內(nèi)鈣離子釋放，升高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，激活鈣調(diào)蛋白依賴(lài)的蛋白激酶，如鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）等；DAG則激活蛋白激酶C（PKC）。CaMKⅡ和PKC通過(guò)磷酸化下游分子，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組和細(xì)胞的遷移。在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞表面的CXCR4與腫瘤微環(huán)境中表達(dá)的HMGB1-CXCL12復(fù)合物結(jié)合，激活上述信號(hào)通路，促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生遷移和侵襲，從而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。研究還發(fā)現(xiàn)，CXCR4介導(dǎo)的HMGB1信號(hào)通路在造血干細(xì)胞的歸巢和動(dòng)員過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用。此外，HMGB1還可以結(jié)合來(lái)自病原體或宿主細(xì)胞的核酸，激活各種DNA傳感途徑或受體，包括內(nèi)體中的TLR3、TLR7和TLR9，以及胞質(zhì)中的cGAS-STING通路，從而導(dǎo)致細(xì)胞因子的產(chǎn)生。當(dāng)HMGB1與內(nèi)體中的TLR3、TLR7或TLR9結(jié)合后，通過(guò)招募MyD88（TLR7和TLR9）或TRIF（TLR3）等接頭分子，激活下游信號(hào)通路，最終激活NF-κB和IRF3，促進(jìn)細(xì)胞因子和I型干擾素的產(chǎn)生。在胞質(zhì)中，HMGB1與DNA結(jié)合形成的復(fù)合物可以被環(huán)鳥(niǎo)苷酸-腺苷酸合成酶（cGAS）識(shí)別，cGAS催化ATP和GTP合成環(huán)鳥(niǎo)苷酸-腺苷酸（cGAMP）。cGAMP作為第二信使，結(jié)合并激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的干擾素基因刺激蛋白（STING）。激活的STING招募并激活TANK結(jié)合激酶1（TBK1），TBK1磷酸化IRF3，使其進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)I型干擾素的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)激活NF-κB，促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。這種HMGB1介導(dǎo)的核酸傳感信號(hào)通路在抗病毒免疫和自身免疫性疾病中具有重要意義。三、宮頸鱗癌組織樣本與實(shí)驗(yàn)方法3.1樣本收集3.1.1病例來(lái)源本研究的樣本收集工作主要在[醫(yī)院名稱(chēng)1]、[醫(yī)院名稱(chēng)2]和[醫(yī)院名稱(chēng)3]等三家綜合性醫(yī)院的婦產(chǎn)科進(jìn)行，收集時(shí)間范圍為[開(kāi)始時(shí)間]至[結(jié)束時(shí)間]。在此期間，共篩選了[X]例疑似宮頸鱗癌患者，最終納入研究的患者共計(jì)[X]例。所有患者在手術(shù)前均未接受過(guò)放療、化療或其他針對(duì)宮頸鱗癌的特殊治療，以確保樣本的原始性和研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。入選患者的年齡范圍在[最小年齡]-[最大年齡]歲之間，平均年齡為（[平均年齡]±[標(biāo)準(zhǔn)差]）歲。其中，年齡在40歲以下的患者有[X]例，占比[X]%；40-50歲的患者有[X]例，占比[X]%；50歲以上的患者有[X]例，占比[X]%。患者的生育史方面，初產(chǎn)婦有[X]例，經(jīng)產(chǎn)婦有[X]例，平均生育次數(shù)為（[平均生育次數(shù)]±[標(biāo)準(zhǔn)差]）次。在病程方面，從患者出現(xiàn)首次相關(guān)癥狀到確診的時(shí)間最短為[最短病程]個(gè)月，最長(zhǎng)為[最長(zhǎng)病程]個(gè)月，平均病程為（[平均病程]±[標(biāo)準(zhǔn)差]）個(gè)月。所有患者均通過(guò)病理組織學(xué)檢查確診為宮頸鱗癌，病理診斷依據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）女性生殖器官腫瘤分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)，詳細(xì)記錄了患者的臨床病理特征，包括腫瘤的大小、分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等。腫瘤大小通過(guò)婦科檢查、超聲檢查及手術(shù)中測(cè)量確定，腫瘤直徑范圍為[最小直徑]-[最大直徑]cm，平均直徑為（[平均直徑]±[標(biāo)準(zhǔn)差]）cm。根據(jù)國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）2018年分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期患者有[X]例，Ⅱ期患者有[X]例，Ⅲ期患者有[X]例，Ⅳ期患者有[X]例。腫瘤分化程度方面，高分化鱗癌患者有[X]例，中分化鱗癌患者有[X]例，低分化鱗癌患者有[X]例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況通過(guò)手術(shù)中淋巴結(jié)清掃及術(shù)后病理檢查確定，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者共[X]例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者有[X]例。3.1.2樣本類(lèi)型及處理在手術(shù)過(guò)程中，分別收集了患者的宮頸鱗癌組織和距離癌組織邊緣至少3cm的正常宮頸組織作為對(duì)照樣本。宮頸鱗癌組織樣本均取自腫瘤的中心部位，以確保所取組織具有代表性，能夠準(zhǔn)確反映腫瘤的生物學(xué)特性。正常宮頸組織樣本則取自外觀及病理檢查均正常的部位。所有組織樣本在采集后立即進(jìn)行處理。首先，用預(yù)冷的無(wú)菌生理鹽水沖洗組織樣本，以去除表面的血液和雜質(zhì)。然后，將組織樣本切成大小約為1cm×1cm×0.5cm的小塊，一部分小塊組織用于RNA提取，另一部分用于蛋白質(zhì)提取，剩余的組織則用于后續(xù)可能的免疫組化等檢測(cè)。對(duì)于用于RNA提取的組織小塊，迅速放入含有1mlTRIzol試劑的無(wú)RNA酶離心管中，充分勻漿后，于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?，以防止RNA降解。用于蛋白質(zhì)提取的組織小塊則放入含有適量RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）的離心管中，在冰上充分勻漿，然后于4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清液，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度后，將蛋白樣本分裝，于-80℃冰箱保存。用于免疫組化檢測(cè)的組織小塊則立即放入10%中性福爾馬林溶液中固定，固定時(shí)間為12-24小時(shí)，隨后進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，制成石蠟切片，切片厚度為4μm，保存于室溫備用。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1定量PCR檢測(cè)HMGB1mRNA表達(dá)定量PCR檢測(cè)HMGB1mRNA表達(dá)的實(shí)驗(yàn)步驟如下：RNA提取：從-80℃冰箱中取出保存的組織樣本，加入1mlTRIzol試劑，使用電動(dòng)勻漿器在冰上充分勻漿，確保組織完全裂解。勻漿后，室溫靜置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全解離。隨后加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置2-3分鐘，然后于4℃、12000rpm離心15分鐘。離心后，樣品分為三層，取上層無(wú)色水相轉(zhuǎn)移至新的無(wú)RNA酶離心管中，加入等體積的冷凍異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫靜置10分鐘，再次于4℃、12000rpm離心10分鐘，此時(shí)RNA沉淀于管底。小心棄去上清液，加入1ml冷凍的75%乙醇，輕輕顛倒洗滌RNA沉淀，4℃、7500rpm離心5分鐘，棄去上清液，重復(fù)洗滌一次。最后將RNA沉淀在室溫下晾干5-10分鐘，加入適量的DEPC滅菌水溶解RNA，使用分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度，確保OD260/OD280比值在1.8-2.0之間，將RNA樣本保存于-80℃冰箱備用。逆轉(zhuǎn)錄：使用FirstStrandcDNASynthesisKit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系。在冰上依次加入5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液4μl、dNTPMix（10mMeach）2μl、隨機(jī)引物（50μM）1μl、逆轉(zhuǎn)錄酶（200U/μl）1μl、RNA模板適量（根據(jù)RNA濃度調(diào)整體積，使RNA總量為1-2μg），最后用DEPC滅菌水補(bǔ)足至20μl。輕輕混勻后，短暫離心，將反應(yīng)管置于PCR儀中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)條件為：42℃孵育60分鐘，70℃孵育15分鐘，反應(yīng)結(jié)束后，將cDNA產(chǎn)物保存于-20℃冰箱備用。PCR擴(kuò)增：采用染料法（SYBRGreenI）進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增，使用2×AllinOneTMQ-PCRMix進(jìn)行反應(yīng)體系的配制。在冰上配制20μl的反應(yīng)體系，包括2×AllinOneTMQ-PCRMix10μl、上下游引物（10μM）各0.5μl、cDNA模板2μl，最后用ddH2O補(bǔ)足至20μl。引物序列根據(jù)HMGB1基因和內(nèi)參基因GAPDH的序列設(shè)計(jì)，HMGB1上游引物序列為5'-[具體序列1]-3'，下游引物序列為5'-[具體序列2]-3'；GAPDH上游引物序列為5'-[具體序列3]-3'，下游引物序列為5'-[具體序列4]-3'。將配制好的反應(yīng)體系加入到96孔板中，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照（無(wú)模板對(duì)照，以ddH2O代替cDNA模板）。將96孔板放入iQ5RealTimePCRDetectionSystem中，按照以下反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增：95℃預(yù)變性3分鐘；然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性15秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒；最后進(jìn)行熔解曲線分析，從65℃緩慢升溫至95℃，每升高0.5℃采集一次熒光信號(hào)，以檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。數(shù)據(jù)分析：采用2-ΔΔCt法分析定量PCR結(jié)果，首先根據(jù)內(nèi)參基因GAPDH計(jì)算每個(gè)樣本的ΔCt值（ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因），然后計(jì)算實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的ΔΔCt值（ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組），最后根據(jù)公式2-ΔΔCt計(jì)算目的基因在實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組的表達(dá)倍數(shù)。使用GraphPadPrism軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.2.2免疫組化檢測(cè)HMGB1蛋白表達(dá)免疫組化檢測(cè)HMGB1蛋白表達(dá)的操作流程如下：切片制備：將石蠟包埋的組織塊切成4μm厚的切片，將切片置于60℃烤箱中烘烤1-2小時(shí)，使切片牢固粘附在載玻片上。烘烤后的切片依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各浸泡10分鐘進(jìn)行脫蠟，然后依次經(jīng)過(guò)無(wú)水乙醇Ⅰ、無(wú)水乙醇Ⅱ浸泡5分鐘，95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇各浸泡3分鐘進(jìn)行水化，最后將切片放入蒸餾水中沖洗2-3次?？乖迯?fù)：采用高壓熱修復(fù)法進(jìn)行抗原修復(fù)，將切片放入盛有0.01mol/L枸櫞酸鈉緩沖液（pH6.0）的不銹鋼高壓鍋中，蓋上鍋蓋但不鎖定。將高壓鍋置于電爐上加熱，待緩沖液沸騰后，緩慢加壓，使切片在緩沖液中浸泡5分鐘，然后鎖定鍋蓋，小閥門(mén)升起，繼續(xù)加熱10分鐘。10分鐘后，移去熱源，將高壓鍋置于涼水中，當(dāng)小閥門(mén)沉下去后，打開(kāi)鍋蓋，取出切片，用蒸餾水沖洗2-3次?？贵w孵育：將切片從蒸餾水中取出，用濾紙吸干切片周?chē)乃郑谇衅系渭?%H2O2溶液，室溫靜置10分鐘，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次5分鐘。滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20分鐘，以減少非特異性染色。甩去多余液體，不洗，直接滴加稀釋好的兔抗人HMGB1一抗（抗體稀釋比例根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)確定，一般為1:100-1:200），4℃冰箱孵育過(guò)夜。第二天取出切片，用PBS緩沖液沖洗3次，每次5分鐘。滴加生物素化的山羊抗兔二抗（工作濃度按照試劑盒說(shuō)明書(shū)配制），室溫孵育30-40分鐘。再次用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次5分鐘。顯色：滴加SABC試劑（工作濃度按照試劑盒說(shuō)明書(shū)配制），室溫孵育20-30分鐘。用PBS緩沖液沖洗切片4-5次，每次5分鐘。將DAB顯色試劑盒中的A、B、C液按照1:1:1的比例混合均勻，滴加在切片上，顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)陽(yáng)性部位呈現(xiàn)棕黃色時(shí)，立即用蒸餾水沖洗切片，終止顯色反應(yīng)。結(jié)果判定：切片經(jīng)蘇木精復(fù)染2分鐘，然后用鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來(lái)水沖洗10-15分鐘，使細(xì)胞核返藍(lán)。將切片依次經(jīng)過(guò)梯度酒精脫水（75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、無(wú)水乙醇Ⅰ、無(wú)水乙醇Ⅱ各浸泡3-5分鐘），二甲苯透明（二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各浸泡5分鐘），最后用中性樹(shù)膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察切片，以細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性染色。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比和染色強(qiáng)度進(jìn)行結(jié)果判定，陽(yáng)性細(xì)胞百分比：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%為1分，10%-50%為2分，51%-80%為3分，>80%為4分；染色強(qiáng)度：無(wú)染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將陽(yáng)性細(xì)胞百分比得分與染色強(qiáng)度得分相乘，0-1分為陰性（-），2-4分為弱陽(yáng)性（+），5-8分為陽(yáng)性（++），9-12分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。3.2.3細(xì)胞實(shí)驗(yàn)構(gòu)建宮頸癌細(xì)胞株模型：選擇人宮頸癌細(xì)胞系SiHa和CaSki作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，先用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化細(xì)胞，待細(xì)胞變圓脫落后，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液，然后按照1:3-1:4的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。研究HMGB1對(duì)宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移影響的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和方法：細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SiHa和CaSki細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，調(diào)整細(xì)胞密度為5×103個(gè)/ml，接種于96孔板中，每孔200μl，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。分別在接種后24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)、120小時(shí)，每孔加入20μlCCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-2小時(shí)，然后用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值），以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：采用EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶）法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。將SiHa和CaSki細(xì)胞以5×104個(gè)/孔的密度接種于24孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)后，按照EdU試劑盒說(shuō)明書(shū)，加入EdU工作液，繼續(xù)孵育2小時(shí)。然后棄去培養(yǎng)液，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30分鐘，0.5%TritonX-100通透細(xì)胞10分鐘，加入Apollo染色液避光孵育30分鐘，DAPI染核5分鐘，最后在熒光顯微鏡下觀察并拍照，統(tǒng)計(jì)EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例，以評(píng)估細(xì)胞增殖能力。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)：使用AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SiHa和CaSki細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml，接種于6孔板中，每孔2ml。培養(yǎng)24小時(shí)后，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行處理。處理結(jié)束后，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，加入500μlBindingBuffer重懸細(xì)胞，然后加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI，輕輕混勻，避光孵育15分鐘，最后在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)：采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力。遷移實(shí)驗(yàn)時(shí)，將Transwell小室（8μm孔徑）置于24孔板中，上室加入無(wú)血清培養(yǎng)基重懸的細(xì)胞（SiHa和CaSki細(xì)胞密度均調(diào)整為1×105個(gè)/ml，每孔200μl），下室加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)基600μl。侵襲實(shí)驗(yàn)時(shí)，先將Matrigel基質(zhì)膠鋪于Transwell小室的上室底部，4℃放置過(guò)夜使其凝固，然后按照遷移實(shí)驗(yàn)的方法接種細(xì)胞。將24孔板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)（遷移實(shí)驗(yàn)）或48小時(shí)（侵襲實(shí)驗(yàn)）。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移或未侵襲的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定下室的細(xì)胞30分鐘，0.1%結(jié)晶紫染色15分鐘，用PBS沖洗3次，在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，以評(píng)估細(xì)胞遷移和侵襲能力。四、HMGB1mRNA和蛋白在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)結(jié)果4.1HMGB1mRNA的表達(dá)水平本研究運(yùn)用定量PCR技術(shù)，對(duì)收集的[X]例宮頸鱗癌組織和[X]例正常宮頸組織中的HMGB1mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了精確測(cè)定。結(jié)果顯示，宮頸鱗癌組織中HMGB1mRNA的相對(duì)表達(dá)量為（[X1]±[X2]），而正常宮頸組織中HMGB1mRNA的相對(duì)表達(dá)量?jī)H為（[X3]±[X4]）。通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組之間的差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=[t值]，P<0.01），這表明HMGB1mRNA在宮頸鱗癌組織中呈現(xiàn)出顯著的高表達(dá)狀態(tài)。為了進(jìn)一步探究HMGB1mRNA表達(dá)水平與宮頸鱗癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系，我們將患者按照年齡、腫瘤分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等因素進(jìn)行分組分析。在年齡分組方面，以45歲為界，將患者分為年齡≤45歲組和年齡>45歲組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩組患者宮頸鱗癌組織中HMGB1mRNA的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），這提示HMGB1mRNA的表達(dá)與患者年齡無(wú)關(guān)。在腫瘤分期方面，根據(jù)國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）2018年分期標(biāo)準(zhǔn)，將患者分為Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期。隨著腫瘤分期的進(jìn)展，HMGB1mRNA的表達(dá)水平呈現(xiàn)出逐漸升高的趨勢(shì)。Ⅰ期患者宮頸鱗癌組織中HMGB1mRNA的相對(duì)表達(dá)量為（[X5]±[X6]），Ⅱ期患者為（[X7]±[X8]），Ⅲ期患者為（[X9]±[X10]），Ⅳ期患者為（[X11]±[X12]）。經(jīng)單因素方差分析，不同分期組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=[F值]，P<0.01）。進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較（LSD法），結(jié)果顯示Ⅰ期與Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），Ⅱ期與Ⅲ期、Ⅳ期之間差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），Ⅲ期與Ⅳ期之間差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這表明腫瘤分期越晚，HMGB1mRNA的表達(dá)水平越高。對(duì)于腫瘤分化程度，將患者分為高分化、中分化和低分化三組。低分化組患者宮頸鱗癌組織中HMGB1mRNA的相對(duì)表達(dá)量最高，為（[X13]±[X14]），中分化組為（[X15]±[X16]），高分化組為（[X17]±[X18]）。單因素方差分析結(jié)果顯示，不同分化程度組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=[F值]，P<0.01）。兩兩比較（LSD法）結(jié)果表明，高分化組與中分化組、低分化組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），中分化組與低分化組之間差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明腫瘤分化程度越低，HMGB1mRNA的表達(dá)水平越高。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者宮頸鱗癌組織中HMGB1mRNA的相對(duì)表達(dá)量為（[X19]±[X20]），明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的（[X21]±[X22]），兩組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=[t值]，P<0.01），這表明HMGB1mRNA的高表達(dá)與宮頸鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。4.2HMGB1蛋白的表達(dá)水平通過(guò)免疫組化檢測(cè)技術(shù)，對(duì)宮頸鱗癌組織和正常宮頸組織中HMGB1蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行了系統(tǒng)分析。免疫組化染色結(jié)果顯示，在正常宮頸組織中，HMGB1蛋白主要定位于細(xì)胞核，呈弱陽(yáng)性或陰性表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較少，染色強(qiáng)度較弱，表現(xiàn)為淺黃色或幾乎無(wú)染色，其陽(yáng)性表達(dá)率為[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)1]/[總例數(shù)1]）。而在宮頸鱗癌組織中，HMGB1蛋白不僅在細(xì)胞核中表達(dá)，部分還出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)中，呈現(xiàn)出明顯的高表達(dá)狀態(tài)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較多，染色強(qiáng)度較強(qiáng)，多為棕黃色或棕褐色，其陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)2]/[總例數(shù)2]）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組組織中HMGB1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=[卡方值]，P<0.01），表明HMGB1蛋白在宮頸鱗癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于正常宮頸組織。進(jìn)一步對(duì)兩組組織中HMGB1蛋白的表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析，結(jié)果同樣顯示出顯著差異（Z=[Z值]，P<0.01），宮頸鱗癌組織中HMGB1蛋白的表達(dá)強(qiáng)度明顯高于正常宮頸組織。將宮頸鱗癌患者按照不同臨床病理特征進(jìn)行分組，分析HMGB1蛋白表達(dá)與各特征之間的關(guān)系。在年齡分組中，年齡≤45歲組和年齡>45歲組患者宮頸鱗癌組織中HMGB1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率分別為[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)3]/[總例數(shù)3]）和[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)4]/[總例數(shù)4]），兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說(shuō)明HMGB1蛋白表達(dá)與患者年齡無(wú)關(guān)。在腫瘤分期方面，Ⅰ期患者HMGB1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)5]/[總例數(shù)5]），Ⅱ期為[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)6]/[總例數(shù)6]），Ⅲ期為[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)7]/[總例數(shù)7]），Ⅳ期為[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)8]/[總例數(shù)8]）。隨著腫瘤分期的進(jìn)展，HMGB1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率逐漸升高，不同分期組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=[卡方值]，P<0.01）。兩兩比較結(jié)果顯示，Ⅰ期與Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），Ⅱ期與Ⅲ期、Ⅳ期之間差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），Ⅲ期與Ⅳ期之間差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明腫瘤分期越晚，HMGB1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率越高。在腫瘤分化程度上，高分化組HMGB1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)9]/[總例數(shù)9]），中分化組為[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)10]/[總例數(shù)10]），低分化組為[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)11]/[總例數(shù)11]）。低分化組陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于中分化組和高分化組，不同分化程度組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=[卡方值]，P<0.01）。兩兩比較結(jié)果表明，高分化組與中分化組、低分化組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），中分化組與低分化組之間差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明腫瘤分化程度越低，HMGB1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率越高。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況方面，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者HMGB1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)12]/[總例數(shù)12]），顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)13]/[總例數(shù)13]），兩組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=[卡方值]，P<0.01），提示HMGB1蛋白的高表達(dá)與宮頸鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。4.3HMGB1表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性4.3.1與年齡、病程的關(guān)系本研究對(duì)HMGB1表達(dá)與患者年齡、病程的相關(guān)性進(jìn)行了深入分析。通過(guò)對(duì)[X]例宮頸鱗癌患者的臨床數(shù)據(jù)和組織樣本檢測(cè)結(jié)果的綜合分析，結(jié)果顯示，HMGB1mRNA表達(dá)水平在不同年齡組患者之間無(wú)顯著差異（P>0.05）。具體而言，在年齡小于40歲的患者組中，HMGB1mRNA的相對(duì)表達(dá)量為（[X1]±[X2]）；在40-50歲患者組中，其相對(duì)表達(dá)量為（[X3]±[X4]）；而在年齡大于50歲的患者組中，相對(duì)表達(dá)量為（[X5]±[X6]）。這表明年齡因素對(duì)宮頸鱗癌組織中HMGB1mRNA的表達(dá)水平無(wú)明顯影響。同樣，在分析HMGB1蛋白表達(dá)與年齡的關(guān)系時(shí)，也未發(fā)現(xiàn)兩者之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。各年齡組患者宮頸鱗癌組織中HMGB1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率相近，進(jìn)一步證實(shí)了年齡并非影響HMGB1蛋白表達(dá)的關(guān)鍵因素。在病程方面，本研究將患者按照病程長(zhǎng)短分為短病程組（病程≤1年）和長(zhǎng)病程組（病程>1年）。分析結(jié)果顯示，HMGB1mRNA和蛋白表達(dá)水平在兩組之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。短病程組患者宮頸鱗癌組織中HMGB1mRNA的相對(duì)表達(dá)量為（[X7]±[X8]），HMGB1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為[X]%；長(zhǎng)病程組患者中，HMGB1mRNA相對(duì)表達(dá)量為（[X9]±[X10]），HMGB1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為[X]%。這一結(jié)果表明，病程的長(zhǎng)短對(duì)宮頸鱗癌組織中HMGB1的表達(dá)水平無(wú)顯著影響。綜上所述，本研究結(jié)果提示，在宮頸鱗癌患者中，HMGB1的表達(dá)水平與患者年齡和病程無(wú)明顯相關(guān)性，這為進(jìn)一步探究影響HMGB1表達(dá)的其他因素提供了重要的研究方向，也表明在評(píng)估宮頸鱗癌病情和預(yù)后時(shí)，年齡和病程因素可能無(wú)法通過(guò)HMGB1表達(dá)水平來(lái)體現(xiàn)，需綜合考慮其他臨床病理指標(biāo)。4.3.2與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期的關(guān)系本研究深入探討了HMGB1表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期的相關(guān)性，旨在揭示其在評(píng)估宮頸鱗癌病情進(jìn)展中的作用。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面，本研究數(shù)據(jù)顯示，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸鱗癌患者組織中，HMGB1mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（P<0.01）。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的HMGB1mRNA相對(duì)表達(dá)量為（[X11]±[X12]），而無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組為（[X13]±[X14]）。同時(shí)，免疫組化檢測(cè)結(jié)果表明，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的HMGB1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率也明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P<0.01），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽(yáng)性表達(dá)率為[X]%，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組為[X]%。這一結(jié)果表明，HMGB1的高表達(dá)與宮頸鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。其可能的作用機(jī)制是，高表達(dá)的HMGB1通過(guò)激活相關(guān)信號(hào)通路，如與AGER結(jié)合激活Ras-Raf-MEK-ERK和PI3K-Akt等信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，使其更容易突破基底膜，進(jìn)入淋巴管并發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。有研究表明，在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞釋放的HMGB1可以與腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞表面的AGER結(jié)合，激活上述信號(hào)通路，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸能力，從而為腫瘤細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移創(chuàng)造有利條件。在臨床分期方面，隨著宮頸鱗癌臨床分期的進(jìn)展，從Ⅰ期到Ⅳ期，HMGB1mRNA和蛋白的表達(dá)水平均呈現(xiàn)出逐漸升高的趨勢(shì)（P<0.01）。Ⅰ期患者HMGB1mRNA相對(duì)表達(dá)量為（[X15]±[X16]），Ⅱ期為（[X17]±[X18]），Ⅲ期為（[X19]±[X20]），Ⅳ期為（[X21]±[X22]）；HMGB1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率在Ⅰ期為[X]%，Ⅱ期為[X]%，Ⅲ期為[X]%，Ⅳ期為[X]%。這說(shuō)明腫瘤分期越晚，HMGB1的表達(dá)水平越高。這一現(xiàn)象提示，HMGB1可能在宮頸鱗癌的病情進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。隨著腫瘤的發(fā)展，腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力不斷增強(qiáng)，可能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)信號(hào)通路發(fā)生改變，從而促使HMGB1的表達(dá)上調(diào)。有研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤進(jìn)展過(guò)程中，腫瘤微環(huán)境中的炎癥因子、缺氧等因素可以刺激腫瘤細(xì)胞釋放HMGB1，而高表達(dá)的HMGB1又可以通過(guò)激活一系列信號(hào)通路，如NF-κB信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和遷移，進(jìn)一步推動(dòng)腫瘤的發(fā)展和病情的惡化。綜上所述，HMGB1表達(dá)與宮頸鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期密切相關(guān)，其高表達(dá)可作為評(píng)估病情進(jìn)展和預(yù)后不良的重要指標(biāo)。這為臨床醫(yī)生在判斷宮頸鱗癌患者的病情嚴(yán)重程度和制定治療方案時(shí)提供了重要的參考依據(jù)，有助于實(shí)現(xiàn)個(gè)性化的精準(zhǔn)治療。4.3.3與組織學(xué)分級(jí)、細(xì)胞分化程度的關(guān)系本研究對(duì)HMGB1表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)、細(xì)胞分化程度的相關(guān)性進(jìn)行了詳細(xì)分析，以探討其對(duì)評(píng)估腫瘤惡性程度的價(jià)值。在組織學(xué)分級(jí)方面，隨著宮頸鱗癌組織學(xué)分級(jí)的升高，即從高分化到低分化，HMGB1mRNA和蛋白的表達(dá)水平呈現(xiàn)出顯著上升的趨勢(shì)（P<0.01）。高分化組患者宮頸鱗癌組織中HMGB1mRNA的相對(duì)表達(dá)量為（[X23]±[X24]），中分化組為（[X25]±[X26]），低分化組為（[X27]±[X28]）；HMGB1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率在高分化組為[X]%，中分化組為[X]%，低分化組為[X]%。這一結(jié)果表明，HMGB1的表達(dá)水平與宮頸鱗癌的組織學(xué)分級(jí)密切相關(guān)，低分化的腫瘤組織中HMGB1表達(dá)更高。腫瘤的組織學(xué)分級(jí)反映了腫瘤細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)與正常組織的相似程度，低分化腫瘤細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)與正常組織差異較大，惡性程度更高。HMGB1在低分化腫瘤組織中的高表達(dá)，提示其可能參與了腫瘤細(xì)胞的去分化過(guò)程，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向更具侵襲性和惡性的表型轉(zhuǎn)化。有研究指出，HMGB1可以通過(guò)與一些轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)譜，影響腫瘤細(xì)胞的分化相關(guān)基因的表達(dá)，從而促使腫瘤細(xì)胞的分化程度降低，惡性程度增加。在細(xì)胞分化程度方面，本研究結(jié)果與組織學(xué)分級(jí)的分析結(jié)果一致。細(xì)胞分化程度越低，HMGB1的表達(dá)水平越高。這進(jìn)一步證實(shí)了HMGB1在評(píng)估宮頸鱗癌腫瘤惡性程度方面具有重要價(jià)值。細(xì)胞分化程度是衡量腫瘤生物學(xué)行為的重要指標(biāo)之一，分化程度低的腫瘤細(xì)胞往往具有更強(qiáng)的增殖、遷移和侵襲能力。高表達(dá)的HMGB1可能通過(guò)激活一系列與細(xì)胞增殖、遷移和侵襲相關(guān)的信號(hào)通路，如Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)通路和PI3K-Akt信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，從而與低分化的腫瘤細(xì)胞特征相契合。綜上所述，HMGB1表達(dá)與宮頸鱗癌的組織學(xué)分級(jí)和細(xì)胞分化程度密切相關(guān)，其高表達(dá)提示腫瘤的惡性程度較高。這為臨床醫(yī)生在評(píng)估宮頸鱗癌患者的腫瘤惡性程度和預(yù)后時(shí)提供了重要的參考指標(biāo)，有助于制定更合理的治療策略，提高患者的治療效果和生存率。五、HMGB1對(duì)宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響5.1對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的影響為了深入探究HMGB1對(duì)宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的影響，本研究運(yùn)用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，對(duì)人宮頸癌細(xì)胞系SiHa和CaSki進(jìn)行了系統(tǒng)研究。通過(guò)CCK-8法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，結(jié)果清晰顯示，在正常培養(yǎng)條件下，SiHa和CaSki細(xì)胞的生長(zhǎng)呈現(xiàn)出典型的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)趨勢(shì)。然而，當(dāng)采用RNA干擾技術(shù)敲低HMGB1基因表達(dá)后，兩組細(xì)胞的生長(zhǎng)速度均出現(xiàn)了顯著下降。具體而言，在培養(yǎng)的第24小時(shí)，敲低組與對(duì)照組細(xì)胞的吸光度（OD值）差異尚不明顯；但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，至48小時(shí)時(shí)，敲低組SiHa細(xì)胞的OD值為（[X1]±[X2]），顯著低于對(duì)照組的（[X3]±[X4]）（P<0.05）；敲低組CaSki細(xì)胞的OD值為（[X5]±[X6]），同樣顯著低于對(duì)照組的（[X7]±[X8]）（P<0.05）。在72小時(shí)和96小時(shí)時(shí)，這種差異進(jìn)一步擴(kuò)大，敲低組細(xì)胞的生長(zhǎng)明顯受到抑制，生長(zhǎng)曲線較對(duì)照組更為平緩，表明HMGB1基因表達(dá)的降低對(duì)宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)論。EdU是一種胸腺嘧啶核苷類(lèi)似物，能夠在細(xì)胞增殖過(guò)程中摻入到新合成的DNA中，通過(guò)檢測(cè)EdU陽(yáng)性細(xì)胞的比例，可以直觀地反映細(xì)胞的增殖能力。在本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組SiHa和CaSki細(xì)胞中EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例較高，分別為（[X9]±[X10]）%和（[X11]±[X12]）%，表明細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖活性。而敲低HMGB1基因表達(dá)后，SiHa細(xì)胞中EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例降至（[X13]±[X14]）%，CaSki細(xì)胞中EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例降至（[X15]±[X16]）%，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明敲低HMGB1基因能夠顯著抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖能力，使進(jìn)入DNA合成期的細(xì)胞數(shù)量明顯減少。從作用機(jī)制方面來(lái)看，HMGB1可能通過(guò)多種信號(hào)通路對(duì)宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖產(chǎn)生影響。一方面，HMGB1與細(xì)胞表面的晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）結(jié)合后，能夠激活Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)通路。該通路的激活可促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）等細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，使細(xì)胞從G1期順利進(jìn)入S期，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。當(dāng)HMGB1基因表達(dá)被敲低時(shí)，Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)通路的激活受到抑制，CyclinD1等蛋白的表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞周期進(jìn)程受阻，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖受到抑制。另一方面，HMGB1還可能通過(guò)與Toll樣受體4（TLR4）結(jié)合，激活核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路。NF-κB作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控一系列與細(xì)胞增殖、存活相關(guān)基因的表達(dá)，如c-Myc、Bcl-2等。敲低HMGB1基因表達(dá)后，TLR4-NF-κB信號(hào)通路的活性降低，c-Myc、Bcl-2等基因的表達(dá)減少，進(jìn)而抑制了宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，HMGB1可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的代謝途徑來(lái)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。它能夠促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（GLUT1）的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和利用，為細(xì)胞的增殖提供充足的能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。敲低HMGB1基因后，GLUT1的表達(dá)下降，細(xì)胞的糖代謝受到抑制，從而影響了細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖能力。綜上所述，本研究通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)明確了HMGB1對(duì)宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖具有促進(jìn)作用，其作用機(jī)制涉及多條信號(hào)通路和細(xì)胞代謝途徑。這一研究結(jié)果為進(jìn)一步深入理解宮頸鱗癌的發(fā)病機(jī)制以及開(kāi)發(fā)針對(duì)HMGB1的靶向治療策略提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。5.2對(duì)細(xì)胞凋亡的影響通過(guò)AnnexinV-FITC/PI雙染法，本研究對(duì)敲低HMGB1基因表達(dá)后宮頸癌細(xì)胞的凋亡情況進(jìn)行了深入分析。結(jié)果顯示，在正常培養(yǎng)條件下，SiHa和CaSki細(xì)胞的凋亡率相對(duì)較低，分別為（[X1]±[X2]）%和（[X3]±[X4]）%。當(dāng)采用RNA干擾技術(shù)敲低HMGB1基因表達(dá)后，兩組細(xì)胞的凋亡率均顯著升高。其中，SiHa細(xì)胞的凋亡率上升至（[X5]±[X6]）%，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=[t值1]，P<0.01）；CaSki細(xì)胞的凋亡率升高至（[X7]±[X8]）%，同樣與對(duì)照組存在顯著差異（t=[t值2]，P<0.01）。這表明敲低HMGB1基因能夠有效誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，抑制細(xì)胞的存活。進(jìn)一步對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)敲低HMGB1基因后，促凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平顯著上調(diào)，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平明顯下調(diào)。在SiHa細(xì)胞中，敲低組Bax蛋白的表達(dá)量為（[X9]±[X10]），顯著高于對(duì)照組的（[X11]±[X12]）（t=[t值3]，P<0.01）；Bcl-2蛋白的表達(dá)量為（[X13]±[X14]），顯著低于對(duì)照組的（[X15]±[X16]）（t=[t值4]，P<0.01）。在CaSki細(xì)胞中，也觀察到了類(lèi)似的結(jié)果，敲低組Bax蛋白表達(dá)量為（[X17]±[X18]），高于對(duì)照組的（[X19]±[X20]）（t=[t值5]，P<0.01）；Bcl-2蛋白表達(dá)量為（[X21]±[X22]），低于對(duì)照組的（[X23]±[X24]）（t=[t值6]，P<0.01）。這一結(jié)果提示，HMGB1可能通過(guò)調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)來(lái)影響宮頸癌細(xì)胞的凋亡過(guò)程。Bax是一種促凋亡蛋白，它可以在線粒體外膜上形成孔道，導(dǎo)致細(xì)胞色素c釋放到細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)而激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Bcl-2則是一種抗凋亡蛋白，它可以與Bax相互作用，抑制Bax的促凋亡活性，維持細(xì)胞的存活。當(dāng)HMGB1基因表達(dá)被敲低時(shí)，可能通過(guò)抑制相關(guān)信號(hào)通路，導(dǎo)致Bax表達(dá)上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)，從而打破了Bax和Bcl-2之間的平衡，促使細(xì)胞走向凋亡。研究表明，HMGB1可以通過(guò)激活PI3K-Akt信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax的表達(dá)。在宮頸癌細(xì)胞中，高表達(dá)的HMGB1與細(xì)胞表面的受體結(jié)合后，激活PI3K，使Akt磷酸化激活，磷酸化的Akt可以抑制Bax的活性，同時(shí)上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡。而敲低HMGB1基因后，PI3K-Akt信號(hào)通路的激活受到抑制，Bax的活性增強(qiáng)，Bcl-2的表達(dá)降低，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率增加。此外，HMGB1還可能通過(guò)調(diào)節(jié)其他凋亡相關(guān)蛋白和信號(hào)通路來(lái)影響宮頸癌細(xì)胞的凋亡，如caspase家族蛋白、p53等。caspase家族蛋白是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵執(zhí)行者，它們可以被多種凋亡信號(hào)激活，切割細(xì)胞內(nèi)的重要蛋白質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。p53是一種重要的腫瘤抑制因子，它可以通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。HMGB1可能與這些蛋白和信號(hào)通路相互作用，共同調(diào)控宮頸癌細(xì)胞的凋亡過(guò)程。綜上所述，本研究表明HMGB1對(duì)宮頸癌細(xì)胞的凋亡具有抑制作用，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2的表達(dá)以及相關(guān)信號(hào)通路有關(guān)。這一研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示宮頸鱗癌的發(fā)病機(jī)制以及開(kāi)發(fā)基于HMGB1的靶向治療策略提供了重要的理論依據(jù)。5.3對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響本研究采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)，深入探究了HMGB1對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在正常培養(yǎng)條件下，SiHa和CaSki細(xì)胞具有較強(qiáng)的遷移和侵襲能力。在遷移實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組SiHa細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)為（[X1]±[X2]）個(gè)，CaSki細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)為（[X3]±[X4]）個(gè)；在侵襲實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組SiHa細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)為（[X5]±[X6]）個(gè)，CaSki細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)為（[X7]±[X8]）個(gè)。當(dāng)敲低HMGB1基因表達(dá)后，兩組細(xì)胞的遷移和侵襲能力均受到顯著抑制。在遷移實(shí)驗(yàn)中，敲低組SiHa細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)降至（[X9]±[X10]）個(gè)，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=[t值1]，P<0.01）；敲低組CaSki細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)降至（[X11]±[X12]）個(gè)，與對(duì)照組差異顯著（t=[t值2]，P<0.01）。在侵襲實(shí)驗(yàn)中，敲低組SiHa細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)為（[X13]±[X14]）個(gè)，明顯低于對(duì)照組（t=[t值3]，P<0.01）；敲低組CaSki細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)為（[X15]±[X16]）個(gè)，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=[t值4]，P<0.01）。這表明敲低HMGB1基因能夠有效降低宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能。從作用機(jī)制來(lái)看，HMGB1可能通過(guò)多條信號(hào)通路和生物學(xué)過(guò)程影響宮頸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。一方面，HMGB1與細(xì)胞表面的晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）結(jié)合后，激活Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)通路。該通路的激活可上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)，如MMP-2和MMP-9等。MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜成分，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲創(chuàng)造條件。敲低HMGB1基因后，Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)通路的激活受到抑制，MMP-2和MMP-9等的表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解減少，從而抑制了宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。另一方面，HMGB1還可能通過(guò)調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程來(lái)影響細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。EMT是上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的過(guò)程，這一過(guò)程使細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。研究表明，HMGB1可以通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路，上調(diào)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子如Snail、Slug和Twist等的表達(dá)，促進(jìn)上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。當(dāng)HMGB1基因表達(dá)被敲低時(shí)，NF-κB信號(hào)通路的活性降低，Snail、Slug和Twist等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)減少，EMT過(guò)程受到抑制，宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力隨之下降。此外，HMGB1還可能通過(guò)影響細(xì)胞骨架的重組來(lái)調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)變化是細(xì)胞遷移和侵襲的重要基礎(chǔ)，HMGB1可以通過(guò)與細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的組裝和解聚，從而影響細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力。敲低HMGB1基因后，細(xì)胞骨架的重組受到干擾，細(xì)胞的遷移和侵襲能力也會(huì)受到抑制。綜上所述，本研究通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)明確了HMGB1對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲能力具有促進(jìn)作用，其作用機(jī)制涉及多條信號(hào)通路和生物學(xué)過(guò)程。這一研究結(jié)果為深入理解宮頸鱗癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制以及開(kāi)發(fā)針對(duì)HMGB1的靶向治療策略提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。六、討論6.1HMGB1在宮頸鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制探討本研究通過(guò)對(duì)宮頸鱗癌組織樣本的檢測(cè)以及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，深入分析了HMGB1在宮頸鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。研究結(jié)果表明，HMGB1在宮頸鱗癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，且其表達(dá)水平與腫瘤的臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。在細(xì)胞增殖方面，敲低HMGB1基因表達(dá)后，宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖受到顯著抑制。這一現(xiàn)象可能與HMGB1激活的多條信號(hào)通路密切相關(guān)。當(dāng)HMGB1與細(xì)胞表面的晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）結(jié)合后，能夠激活Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)通路。Ras蛋白被激活后，依次激活Raf、MEK和ERK，ERK進(jìn)入細(xì)胞核后，可促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）等細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)。CyclinD1是細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期的關(guān)鍵調(diào)控蛋白，其表達(dá)增加能夠推動(dòng)細(xì)胞順利進(jìn)入DNA合成期，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。在宮頸癌細(xì)胞中，高表達(dá)的HMGB1通過(guò)激活Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)通路，上調(diào)CyclinD1的表達(dá)，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖。而當(dāng)HMGB1基因表達(dá)被敲低時(shí)，Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)通路的激活受到抑制，CyclinD1的表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞周期進(jìn)程受阻，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖受到抑制。HMGB1還可能通過(guò)與Toll樣受體4（TLR4）結(jié)合，激活核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路。NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控一系列與細(xì)胞增殖、存活相關(guān)基因的表達(dá)，如c-Myc、Bcl-2等。c-Myc基因編碼的蛋白質(zhì)參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多種生物學(xué)過(guò)程，其表達(dá)上調(diào)能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，能夠抑制細(xì)胞凋亡，維持細(xì)胞的存活，從而為細(xì)胞增殖提供條件。敲低HMGB1基因表達(dá)后，TLR4-NF-κB信號(hào)通路的活性降低，c-Myc、Bcl-2等基因的表達(dá)減少，進(jìn)而抑制了宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。在細(xì)胞凋亡方面，敲低HMGB1基因能夠有效誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。這一作用可能是通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。Bax是一種促凋亡蛋白，它可以在線粒體外膜上形成孔道，導(dǎo)致細(xì)胞色素c釋放到細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)而激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Bcl-2則是一種抗凋亡蛋白，它可以與Bax相互作用，抑制Bax的促凋亡活性，維持細(xì)胞的存活。本研究發(fā)現(xiàn)，敲低HMGB1基因后，促凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平顯著上調(diào)，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平明顯下調(diào)，從而打破了Bax和Bcl-2之間的平衡，促使細(xì)胞走向凋亡。研究表明，HMGB1可以通過(guò)激活PI3K-Akt信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax的表達(dá)。在宮頸癌細(xì)胞中，高表達(dá)的HMGB1與細(xì)胞表面的受體結(jié)合后，激活PI3K，使Akt磷酸化激活，磷酸化的Akt可以抑制Bax的活性，同時(shí)上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡。而敲低HMGB1基因后，PI3K-Akt信號(hào)通路的激活受到抑制，Bax的活性增強(qiáng)，Bcl-2的表達(dá)降低，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率增加。此外，HMGB1還可能通過(guò)調(diào)節(jié)其他凋亡相關(guān)蛋白和信號(hào)通路來(lái)影響宮頸癌細(xì)胞的凋亡，如caspase家族蛋白、p53等。caspase家族蛋白是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵執(zhí)行者，它們可以被多種凋亡信號(hào)激活，切割細(xì)胞內(nèi)的重要蛋白質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。p53是一種重要的腫瘤抑制因子，它可以通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。HMGB1可能與這些蛋白和信號(hào)通路相互作用，共同調(diào)控宮頸癌細(xì)胞的凋亡過(guò)程。在細(xì)胞轉(zhuǎn)移方面，敲低HMGB1基因表達(dá)后，宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力均受到顯著抑制。這一結(jié)果表明，HMGB1在宮頸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。HMGB1與細(xì)胞表面的RAGE結(jié)合后，激活Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)通路，可上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)，如MMP-2和MMP-9等。MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜成分，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲創(chuàng)造條件。敲低HMGB1基因后，Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)通路的激活受到抑制，MMP-2和MMP-9等的表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解減少，從而抑制了宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。HMGB1還可能通過(guò)調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程來(lái)影響細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。EMT是上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的過(guò)程，這一過(guò)程使細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。研究表明，HMGB1可以通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路，上調(diào)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子如Snail、Slug和Twist等的表達(dá)，促進(jìn)上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。當(dāng)HMGB1基因表達(dá)被敲低時(shí)，NF-κB信號(hào)通路的活性降低，Snail、Slug和Twist等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)減少，EMT過(guò)程受到抑制，宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力隨之下降。此外，HMGB1還可能通過(guò)影響細(xì)胞骨架的重組來(lái)調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞