Smac基因?qū)ξ赴┘?xì)胞SGC-7901化療敏感性的調(diào)控機(jī)制與影響研究一、引言1.1研究背景胃癌是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2020年全球新發(fā)胃癌病例超過(guò)100萬(wàn)例，死亡人數(shù)高達(dá)768,793人，其發(fā)病率和死亡率在各類癌癥中均位居前列。在中國(guó)，胃癌同樣是高發(fā)癌癥，每年新發(fā)胃癌病例數(shù)占全球新發(fā)病例數(shù)的近一半，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，治療難度大，5年生存率較低。目前，胃癌的治療主要采用以手術(shù)為主，結(jié)合化療、放療、靶向治療等的多學(xué)科綜合治療模式。化療在胃癌治療中占據(jù)重要地位，能夠縮小腫瘤體積、控制腫瘤轉(zhuǎn)移、延長(zhǎng)患者生存期。然而，化療耐藥問(wèn)題嚴(yán)重制約了胃癌化療的療效，成為胃癌治療失敗的主要原因之一。大量研究表明，胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制十分復(fù)雜，涉及多個(gè)層面。從腫瘤細(xì)胞自身角度來(lái)看，一方面，腫瘤細(xì)胞的DNA修復(fù)機(jī)制增強(qiáng)，能夠有效修復(fù)化療藥物引起的DNA損傷，使得腫瘤細(xì)胞得以存活并繼續(xù)增殖；另一方面，腫瘤內(nèi)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)通道改變，導(dǎo)致化療藥物難以有效進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，或者腫瘤細(xì)胞加速將藥物排出，從而降低了細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，影響化療效果。此外，腫瘤細(xì)胞的凋亡途徑受損也是重要因素，相關(guān)凋亡途徑的基因突變或缺陷會(huì)阻礙細(xì)胞凋亡進(jìn)程，使化療藥物無(wú)法發(fā)揮誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。從腫瘤微環(huán)境角度而言，間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）與腫瘤細(xì)胞之間存在密切的相互作用。有研究發(fā)現(xiàn)，胃癌細(xì)胞會(huì)積極重塑機(jī)械微環(huán)境，促使MSCs中的線粒體轉(zhuǎn)移到胃癌細(xì)胞中，修復(fù)胃癌細(xì)胞的線粒體功能，降低其自噬水平，最終導(dǎo)致對(duì)奧沙利鉑等化療藥物的耐藥。細(xì)胞凋亡異常是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性的關(guān)鍵因素之一，而Smac基因作為近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種促凋亡基因，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。Smac基因編碼的蛋白質(zhì)位于線粒體，當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時(shí)，Smac從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，通過(guò)特異性地結(jié)合凋亡抑制蛋白（IAPs），解除后者對(duì)caspase的抑制作用，從而激活細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在多種腫瘤組織中，都存在Smac基因的缺失或釋放障礙，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)凋亡的抵抗性增強(qiáng)，這與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及化療耐藥密切相關(guān)。已有研究表明，在食管鱗狀細(xì)胞癌、肺癌等腫瘤中，通過(guò)特定手段增加Smac基因的表達(dá)或活性，能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物、放療等誘導(dǎo)凋亡因素的敏感性。例如，在食管鱗狀細(xì)胞癌中，Smac-N7肽可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡來(lái)改善Eca-109細(xì)胞及其紫杉醇耐藥株對(duì)紫杉醇的敏感度。因此，深入研究Smac基因?qū)ξ赴┘?xì)胞化療敏感性的調(diào)控作用，揭示其內(nèi)在分子機(jī)制，有望為解決胃癌化療耐藥問(wèn)題提供新的靶點(diǎn)和策略，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究Smac基因?qū)ξ赴┘?xì)胞化療敏感性的影響及其潛在分子機(jī)制。通過(guò)基因轉(zhuǎn)染等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，改變胃癌細(xì)胞中Smac基因的表達(dá)水平，觀察其對(duì)化療藥物作用下細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)行為的影響。同時(shí)，運(yùn)用分子生物學(xué)方法，分析Smac基因與凋亡相關(guān)蛋白、信號(hào)通路之間的相互作用，明確其調(diào)控化療敏感性的具體分子途徑。從理論層面來(lái)看，本研究有助于進(jìn)一步完善對(duì)胃癌化療耐藥機(jī)制的認(rèn)識(shí)。目前雖然已經(jīng)明確細(xì)胞凋亡異常在化療耐藥中扮演關(guān)鍵角色，但具體到Smac基因在胃癌細(xì)胞凋亡調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及化療敏感性調(diào)節(jié)中的詳細(xì)機(jī)制，仍存在許多未知領(lǐng)域。深入研究Smac基因的作用機(jī)制，能夠填補(bǔ)這一理論空白，為理解腫瘤細(xì)胞化療耐藥的復(fù)雜分子過(guò)程提供新的視角，豐富腫瘤生物學(xué)的理論體系，為后續(xù)研究提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。從臨床應(yīng)用角度而言，本研究具有重要的實(shí)踐意義?；熓俏赴┚C合治療的重要組成部分，但化療耐藥問(wèn)題嚴(yán)重限制了其療效，導(dǎo)致患者預(yù)后不佳。如果能夠明確Smac基因?qū)ξ赴┘?xì)胞化療敏感性的調(diào)控作用，就有可能將其作為新的治療靶點(diǎn)，開發(fā)出針對(duì)Smac基因的靶向治療藥物或治療策略。例如，通過(guò)藥物或基因治療手段上調(diào)Smac基因的表達(dá)或增強(qiáng)其活性，有望克服胃癌細(xì)胞的化療耐藥性，提高化療藥物的療效，從而延長(zhǎng)患者的生存期，改善患者的生活質(zhì)量。此外，對(duì)Smac基因的研究還有助于篩選出對(duì)化療敏感的患者，實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療，避免無(wú)效化療給患者帶來(lái)的身體負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)壓力，提高醫(yī)療資源的利用效率。1.3國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國(guó)外，對(duì)Smac基因的研究起步較早，基礎(chǔ)研究層面成果豐碩。在細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究中，諸多實(shí)驗(yàn)明確了Smac基因編碼的蛋白質(zhì)在細(xì)胞凋亡通路中的關(guān)鍵作用。當(dāng)細(xì)胞受到如紫外線照射、化療藥物刺激等凋亡誘導(dǎo)因素作用時(shí)，線粒體膜通透性發(fā)生改變，Smac蛋白從線粒體膜間隙釋放至細(xì)胞質(zhì)。釋放到細(xì)胞質(zhì)中的Smac蛋白，其N端的特定氨基酸序列能夠與凋亡抑制蛋白（IAPs）家族成員緊密結(jié)合。以X連鎖凋亡抑制蛋白（XIAP）為例，XIAP可通過(guò)其BIR結(jié)構(gòu)域與caspase-3、caspase-7等凋亡執(zhí)行蛋白結(jié)合，抑制其活性，從而阻止細(xì)胞凋亡進(jìn)程；而Smac蛋白能競(jìng)爭(zhēng)性地與XIAP的BIR結(jié)構(gòu)域結(jié)合，使caspases得以釋放并激活，進(jìn)而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促使細(xì)胞走向凋亡。這一過(guò)程在多種細(xì)胞類型中得到驗(yàn)證，為深入理解細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制提供了重要依據(jù)。在腫瘤領(lǐng)域的研究中，國(guó)外學(xué)者積極探索Smac基因與腫瘤化療敏感性的關(guān)系。針對(duì)乳腺癌的研究發(fā)現(xiàn)，在部分化療耐藥的乳腺癌細(xì)胞系中，Smac基因的表達(dá)水平明顯低于化療敏感細(xì)胞系。通過(guò)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào)Smac基因的表達(dá)后，乳腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物紫杉醇、多柔比星的敏感性顯著提高，細(xì)胞凋亡率明顯增加，腫瘤細(xì)胞的增殖受到有效抑制。在結(jié)直腸癌的研究中也有類似發(fā)現(xiàn)，Smac基因表達(dá)缺失或低表達(dá)與結(jié)直腸癌細(xì)胞的化療耐藥密切相關(guān)，恢復(fù)Smac基因的正常表達(dá)能夠增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑等化療藥物的敏感性，提高化療效果。這些研究為腫瘤的治療提供了新的思路和潛在靶點(diǎn)。國(guó)內(nèi)對(duì)Smac基因的研究近年來(lái)發(fā)展迅速，在胃癌領(lǐng)域取得了一系列有價(jià)值的成果。有研究團(tuán)隊(duì)運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫組化技術(shù)，對(duì)不同分期的胃癌組織及癌旁正常組織中Smac基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果顯示，胃癌組織中Smac基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著低于癌旁正常組織，且Smac基因表達(dá)水平與胃癌的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)。分期越晚、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者，其腫瘤組織中Smac基因表達(dá)越低，提示Smac基因在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。在調(diào)控胃癌細(xì)胞化療敏感性的研究方面，國(guó)內(nèi)學(xué)者進(jìn)行了深入探索。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將Smac基因?qū)胛赴┘?xì)胞SGC-7901中，使其過(guò)表達(dá)，然后用常用化療藥物紫杉醇處理轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞。結(jié)果表明，與未轉(zhuǎn)染和空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)Smac基因的胃癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性顯著增強(qiáng)，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率明顯升高，細(xì)胞凋亡率顯著增加。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Smac基因過(guò)表達(dá)可通過(guò)激活caspase-3、caspase-9等凋亡相關(guān)蛋白，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而提高胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。還有研究關(guān)注到Smac基因與其他分子的相互作用對(duì)化療敏感性的影響，發(fā)現(xiàn)miR-21可通過(guò)靶向Smac基因，抑制其表達(dá)，進(jìn)而降低胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和耐藥，為揭示胃癌化療耐藥的分子機(jī)制提供了新的視角。二、Smac基因與胃癌細(xì)胞SGC-7901相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1Smac基因概述Smac基因，全稱為secondmitochondrialactivatorofcaspase，又被稱作DIABLO（directIAPbindingproteinwithlowPI，低等電點(diǎn)的IAP直接結(jié)合蛋白），于2000年被發(fā)現(xiàn)，是一種在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的基因。其編碼的蛋白質(zhì)位于線粒體，對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制研究具有重要意義。人類Smac/DIABLO基因定位于第12條染色體的長(zhǎng)臂，基因結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，由7個(gè)外顯子組成。在基因轉(zhuǎn)錄后的加工過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生多種剪接變異體，目前已知體內(nèi)至少存在Smac-α、Smac-β、Smac-γ、Smac-δ等幾種剪接變異體。這些剪接變異體在不同組織和細(xì)胞中的表達(dá)存在差異，可能與細(xì)胞的生理功能和病理狀態(tài)密切相關(guān)。例如，在某些腫瘤組織中，特定剪接變異體的表達(dá)異常可能影響細(xì)胞凋亡進(jìn)程，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。Smac蛋白的成熟過(guò)程經(jīng)歷了一系列復(fù)雜的步驟。在胞漿中，Smac最初是以含有239個(gè)氨基酸的前體形式合成的，其氨基末端最初的55個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成線粒體靶序列（mitochondrialtargetingsequence，MTS）。MTS在Smac蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體的過(guò)程中發(fā)揮著重要的引導(dǎo)作用，它能夠與線粒體膜上的特定受體相互作用，確保Smac蛋白準(zhǔn)確無(wú)誤地進(jìn)入線粒體。當(dāng)Smac前體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體后，MTS會(huì)被特異性的蛋白酶裂解去除，最終生成含有184個(gè)氨基酸殘基的成熟蛋白。成熟的Smac蛋白以二聚體的形式穩(wěn)定地存在于線粒體的膜間隙中，在正常生理狀態(tài)下，處于相對(duì)穩(wěn)定的儲(chǔ)存狀態(tài)。然而，當(dāng)細(xì)胞受到諸如化療藥物刺激、紫外線照射、生長(zhǎng)因子缺乏等誘導(dǎo)凋亡因子的作用時(shí)，線粒體膜的通透性會(huì)發(fā)生改變，Smac蛋白便會(huì)從線粒體膜間隙釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的相關(guān)信號(hào)通路，發(fā)揮其促凋亡作用。2.2Smac基因促凋亡機(jī)制Smac蛋白發(fā)揮促凋亡作用的核心機(jī)制在于其能夠與凋亡抑制蛋白（IAPs）特異性結(jié)合，從而解除IAPs對(duì)caspase蛋白酶家族的抑制，進(jìn)而激活細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行環(huán)節(jié)。IAPs是一類在細(xì)胞凋亡調(diào)控中起關(guān)鍵負(fù)調(diào)控作用的蛋白家族，其成員包括X連鎖凋亡抑制蛋白（XIAP）、細(xì)胞凋亡抑制蛋白1（cIAP1）、細(xì)胞凋亡抑制蛋白2（cIAP2）等。這些蛋白結(jié)構(gòu)中都含有特征性的桿狀病毒IAP重復(fù)序列（BIR）結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域在IAPs抑制細(xì)胞凋亡的過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。以XIAP為例，其BIR2結(jié)構(gòu)域能夠與活化的caspase-3緊密結(jié)合，BIR3結(jié)構(gòu)域則可與caspase-9相互作用，通過(guò)這種結(jié)合方式，XIAP能夠有效抑制caspase-3和caspase-9的酶活性，阻止細(xì)胞凋亡信號(hào)的進(jìn)一步傳遞，從而使細(xì)胞維持存活狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到諸如化療藥物刺激、紫外線照射、生長(zhǎng)因子缺乏等凋亡誘導(dǎo)因素作用時(shí)，線粒體膜的通透性發(fā)生改變，線粒體膜電位下降，外膜出現(xiàn)孔隙。此時(shí)，原本穩(wěn)定存在于線粒體膜間隙中的Smac蛋白便會(huì)通過(guò)這些孔隙釋放到細(xì)胞質(zhì)中。Smac蛋白的N端具有一段高度保守的AVPI基序（Ala-Val-Pro-Ile），這段基序是Smac與IAPs相互作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。一旦Smac蛋白進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，其N端的AVPI基序就能夠與IAPs的BIR結(jié)構(gòu)域以高親和力特異性結(jié)合。這種結(jié)合具有競(jìng)爭(zhēng)性，Smac蛋白憑借其對(duì)BIR結(jié)構(gòu)域的強(qiáng)親和力，能夠競(jìng)爭(zhēng)性地取代caspase與IAPs的結(jié)合位點(diǎn)。例如，Smac與XIAP的結(jié)合，使得原本被XIAP抑制的caspase-3、caspase-7和caspase-9得以釋放。這些被釋放的caspase蛋白酶屬于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中扮演著核心執(zhí)行器的角色。caspase-9是細(xì)胞凋亡內(nèi)在線粒體通路中的起始caspase，被釋放激活后，它能夠通過(guò)自身的酶切活性，切割并激活下游的效應(yīng)caspase，如caspase-3和caspase-7。caspase-3和caspase-7則進(jìn)一步作用于眾多細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵底物，包括多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）、DNA修復(fù)酶、細(xì)胞骨架蛋白等。對(duì)這些底物的切割會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的DNA修復(fù)能力受損、細(xì)胞骨架解體、核膜崩解等一系列不可逆的變化，最終促使細(xì)胞走向凋亡。除了通過(guò)經(jīng)典的與IAPs結(jié)合解除對(duì)caspase的抑制這一途徑外，Smac蛋白還可能通過(guò)其他機(jī)制間接影響細(xì)胞凋亡進(jìn)程。有研究表明，Smac蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位和分布變化，可能與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)存在復(fù)雜的相互作用。在某些細(xì)胞環(huán)境下，Smac蛋白可能與其他凋亡相關(guān)蛋白或信號(hào)分子形成復(fù)合物，協(xié)同調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡信號(hào)的傳遞和放大。雖然目前對(duì)于這些潛在機(jī)制的研究還不夠深入，但這些發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步理解Smac基因的促凋亡作用提供了新的研究方向。2.3胃癌細(xì)胞SGC-7901特性胃癌細(xì)胞SGC-7901作為胃癌研究中常用的細(xì)胞株，具有獨(dú)特的生物學(xué)特性，在胃癌相關(guān)研究尤其是化療敏感性研究中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。SGC-7901細(xì)胞系來(lái)源于1979年中國(guó)上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院手術(shù)切除的胃腺癌組織。經(jīng)過(guò)多年的體外培養(yǎng)、克隆及傳代，該細(xì)胞系在形態(tài)、生長(zhǎng)特性等方面表現(xiàn)出相對(duì)穩(wěn)定的特征，為胃癌的研究提供了重要的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。在形態(tài)學(xué)方面，SGC-7901細(xì)胞呈現(xiàn)出典型的上皮樣細(xì)胞形態(tài)特征。細(xì)胞形態(tài)較為扁平，貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞間緊密相連，形成鋪路石狀排列。在光學(xué)顯微鏡下觀察，細(xì)胞邊界清晰，細(xì)胞核大而圓，位于細(xì)胞中央，核仁明顯，細(xì)胞質(zhì)豐富。這種形態(tài)特征與胃癌組織中腫瘤細(xì)胞的形態(tài)具有一定的相似性，有助于在體外模擬胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。SGC-7901細(xì)胞的生長(zhǎng)特性也十分顯著。在適宜的培養(yǎng)條件下，如使用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞能夠快速生長(zhǎng)和增殖。其生長(zhǎng)曲線呈現(xiàn)典型的S型，經(jīng)歷潛伏期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和平臺(tái)期。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞增殖活躍，倍增時(shí)間約為24-36小時(shí)，細(xì)胞活力較高。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至一定密度，達(dá)到平臺(tái)期后，細(xì)胞生長(zhǎng)速度減緩，進(jìn)入相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)，此時(shí)需要及時(shí)進(jìn)行傳代操作，以維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和生物學(xué)特性。在腫瘤生物學(xué)特性方面，SGC-7901細(xì)胞具有高侵襲性和轉(zhuǎn)移潛能。研究表明，該細(xì)胞能夠分泌多種蛋白水解酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等，這些酶能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，為細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移提供條件。同時(shí)，SGC-7901細(xì)胞表面表達(dá)多種與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子，如整合素、E-cadherin等，這些分子參與細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)之間的相互作用，影響細(xì)胞的遷移和侵襲能力。此外，SGC-7901細(xì)胞還具有一定的耐藥性，對(duì)多種化療藥物，如順鉑、5-氟尿嘧啶、紫杉醇等表現(xiàn)出不同程度的抵抗。這可能與細(xì)胞內(nèi)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)異常、凋亡途徑受阻以及DNA修復(fù)機(jī)制增強(qiáng)等多種因素有關(guān)。在化療敏感性研究中，SGC-7901細(xì)胞被廣泛應(yīng)用。由于其具有一定的耐藥性，能夠較好地模擬臨床胃癌患者化療耐藥的情況。通過(guò)對(duì)SGC-7901細(xì)胞進(jìn)行化療藥物處理，觀察細(xì)胞的增殖抑制、凋亡誘導(dǎo)、周期阻滯等生物學(xué)變化，可以深入研究胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的反應(yīng)機(jī)制，為篩選和開發(fā)新的化療藥物、探索克服化療耐藥的策略提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。例如，研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)干擾SGC-7901細(xì)胞中某些耐藥相關(guān)基因的表達(dá)，如多藥耐藥基因1（MDR1）等，可以顯著提高細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，為逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞化療耐藥提供了潛在的靶點(diǎn)。此外，利用SGC-7901細(xì)胞建立的裸鼠移植瘤模型，也能夠在體內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證化療藥物的療效和作用機(jī)制，為臨床前研究提供了重要的動(dòng)物模型。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1細(xì)胞株本實(shí)驗(yàn)選用人胃癌細(xì)胞SGC-7901，該細(xì)胞株于1979年源自一位56歲女性胃腺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶，由上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院建立。其細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)上皮樣，貼壁生長(zhǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)條件為：使用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期進(jìn)行細(xì)胞傳代，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液進(jìn)行消化傳代。為保證細(xì)胞的生物學(xué)特性穩(wěn)定，將細(xì)胞保存在液氮中，每隔一段時(shí)間復(fù)蘇凍存細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，確保細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期用于實(shí)驗(yàn)。同時(shí)，設(shè)置正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1作為對(duì)照細(xì)胞株，GES-1細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，采用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3.1.2主要試劑脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑：使用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司，美國(guó)），用于將Smac基因表達(dá)質(zhì)粒和siRNA轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞SGC-7901中。該試劑利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體與核酸形成復(fù)合物，通過(guò)細(xì)胞膜的內(nèi)吞作用將核酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，具有轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性低等優(yōu)點(diǎn)?；熕幬铮哼x用順鉑（DDP）（Selleck公司，美國(guó)），用無(wú)菌生理鹽水配制成10mM的儲(chǔ)存液，分裝后于-20℃保存。順鉑是臨床上常用的化療藥物，通過(guò)與腫瘤細(xì)胞DNA結(jié)合，破壞DNA的結(jié)構(gòu)和功能，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在胃癌治療中，順鉑廣泛應(yīng)用于聯(lián)合化療方案，但胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性限制了其療效。PCR相關(guān)試劑：RNA提取采用TRIzol試劑（Invitrogen公司，美國(guó)），該試劑能迅速裂解細(xì)胞，抑制細(xì)胞內(nèi)核酸酶的活性，有效提取高質(zhì)量的總RNA。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒選用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（TaKaRa公司，日本），可將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于后續(xù)的PCR擴(kuò)增。實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑為SYBRPremixExTaqII（TaKaRa公司，日本），基于SYBRGreenI熒光染料與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)光的原理，通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，對(duì)目的基因的表達(dá)進(jìn)行定量分析。Western-blot相關(guān)試劑：蛋白裂解液采用RIPA裂解液（Beyotime公司，中國(guó)），添加蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，能夠有效裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白，并防止蛋白降解。BCA蛋白定量試劑盒（Beyotime公司，中國(guó)）用于測(cè)定蛋白濃度，通過(guò)蛋白質(zhì)與BCA試劑形成紫色絡(luò)合物，在562nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度。一抗包括兔抗人Smac多克隆抗體（Abcam公司，英國(guó)）、兔抗人Bcl-2多克隆抗體（CellSignalingTechnology公司，美國(guó)）、兔抗人Bax多克隆抗體（CellSignalingTechnology公司，美國(guó)）、兔抗人caspase-3多克隆抗體（CellSignalingTechnology公司，美國(guó)）和鼠抗人β-actin單克隆抗體（Sigma公司，美國(guó)）。二抗為辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG（JacksonImmunoResearch公司，美國(guó)），用于與一抗結(jié)合，通過(guò)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。其他試劑：細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑如RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司，美國(guó)）、DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司，美國(guó)）、胎牛血清（FBS）（Gibco公司，美國(guó)）、青霉素-鏈霉素雙抗（Gibco公司，美國(guó)）；MTT試劑（Sigma公司，美國(guó)），用于檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，其原理是活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能，通過(guò)測(cè)定甲瓚的吸光度來(lái)反映細(xì)胞的增殖情況；DMSO（Sigma公司，美國(guó)），用于溶解MTT結(jié)晶；AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（BDBiosciences公司，美國(guó)），利用AnnexinV與磷脂酰絲氨酸（PS）特異性結(jié)合，以及PI對(duì)壞死細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的核酸進(jìn)行染色，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。3.1.3主要儀器設(shè)備PCR儀：CFX96Touch實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司，美國(guó)），具有溫度控制精確、熒光信號(hào)檢測(cè)靈敏等特點(diǎn)，可同時(shí)進(jìn)行96個(gè)樣品的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，能夠準(zhǔn)確地對(duì)目的基因進(jìn)行定量分析。凝膠成像系統(tǒng)：GelDocXR+凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國(guó)），配備高分辨率CCD相機(jī)和專業(yè)的圖像分析軟件，可對(duì)DNA凝膠、蛋白質(zhì)凝膠等進(jìn)行成像和分析，能夠清晰地顯示凝膠條帶，準(zhǔn)確測(cè)量條帶的灰度值，用于PCR產(chǎn)物和蛋白質(zhì)表達(dá)的檢測(cè)。流式細(xì)胞儀：FACSCalibur流式細(xì)胞儀（BDBiosciences公司，美國(guó)），可對(duì)細(xì)胞的物理和化學(xué)特性進(jìn)行多參數(shù)分析，在本實(shí)驗(yàn)中用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期分布。通過(guò)檢測(cè)AnnexinV-FITC和PI的熒光信號(hào)，區(qū)分正常細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞；利用PI對(duì)DNA進(jìn)行染色，分析細(xì)胞周期各時(shí)相的比例。酶標(biāo)儀：MultiskanGO全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（ThermoScientific公司，美國(guó)），可在多種波長(zhǎng)下檢測(cè)微孔板中樣品的吸光度，用于MTT實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞增殖活性的檢測(cè)，以及BCA蛋白定量實(shí)驗(yàn)中蛋白濃度的測(cè)定。恒溫培養(yǎng)箱：CO?恒溫培養(yǎng)箱（ThermoScientific公司，美國(guó)），能夠精確控制溫度、濕度和CO?濃度，為細(xì)胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的環(huán)境，確保細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和代謝。離心機(jī)：高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司，德國(guó)），可在低溫條件下進(jìn)行高速離心，用于細(xì)胞收集、蛋白提取等實(shí)驗(yàn)步驟，如在細(xì)胞傳代和蛋白提取過(guò)程中，通過(guò)離心分離細(xì)胞和上清液，以及沉淀蛋白。超凈工作臺(tái)：SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)，中國(guó)），提供無(wú)菌的操作環(huán)境，有效防止微生物污染，保證細(xì)胞培養(yǎng)和試劑配制等實(shí)驗(yàn)操作的無(wú)菌性。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1Smac基因轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞SGC-7901采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將Smac基因表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA3.1-Smac）轉(zhuǎn)入胃癌細(xì)胞SGC-7901中。轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901細(xì)胞，以每孔5×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書進(jìn)行操作，具體如下：取兩支無(wú)菌離心管，在管A中加入250μL無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基，再加入2μgpcDNA3.1-Smac質(zhì)粒，輕輕混勻；在管B中加入250μL無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基，然后加入5μLLipofectamine3000試劑，輕輕混勻，室溫孵育5分鐘。將管A中的質(zhì)粒溶液逐滴加入管B的Lipofectamine3000試劑溶液中，輕輕吹打混勻，室溫孵育20分鐘，形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。將6孔板中的培養(yǎng)基吸出，用PBS清洗細(xì)胞兩次，每孔加入1mL無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基，再逐滴加入DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4-6小時(shí)后，吸出培養(yǎng)基，每孔加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，對(duì)照組分為空白對(duì)照組（僅加入未轉(zhuǎn)染的SGC-7901細(xì)胞）和陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1），轉(zhuǎn)染步驟與實(shí)驗(yàn)組相同。3.2.2檢測(cè)Smac基因表達(dá)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集各組細(xì)胞，采用RT-PCR法檢測(cè)Smac基因mRNA的表達(dá)水平。使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，具體步驟如下：每孔細(xì)胞加入1mLTRIzol試劑，吹打混勻，室溫靜置5分鐘，使細(xì)胞充分裂解。加入200μL氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘，然后在4℃、12,000rpm條件下離心15分鐘。將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入500μL異丙醇，混勻后室溫靜置10分鐘，4℃、12,000rpm離心10分鐘，棄上清。用75%乙醇（用DEPC水配制）洗滌RNA沉淀兩次，4℃、7,500rpm離心5分鐘，棄上清，室溫晾干RNA沉淀。加入適量DEPC水溶解RNA，用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定RNA濃度和純度。取1μg總RNA，按照PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。反應(yīng)體系為：5×PrimeScriptBuffer2μL，PrimeScriptRTEnzymeMixI0.5μL，OligodTPrimer0.5μL，Random6mers0.5μL，總RNA1μg，加DEPC水至10μL。反應(yīng)條件為：37℃15分鐘，85℃5秒，4℃保存。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列如下：Smac上游引物5'-ATGGTGGAGCTGCTGCTGAA-3'，下游引物5'-TCACAGCAGCAGCAGCAGAT-3'；內(nèi)參GAPDH上游引物5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。PCR反應(yīng)體系為：2×SYBRPremixExTaqII10μL，上下游引物各0.8μL，cDNA模板2μL，加ddH?O至20μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒；95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個(gè)循環(huán)；最后進(jìn)行熔解曲線分析。采用2^-ΔΔCt法計(jì)算Smac基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。同時(shí)，采用Western-blot法檢測(cè)Smac蛋白的表達(dá)。收集轉(zhuǎn)染48小時(shí)后的各組細(xì)胞，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30分鐘，然后在4℃、12,000rpm條件下離心15分鐘，取上清液作為總蛋白樣品。用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，按照試劑盒說(shuō)明書操作，將蛋白樣品與BCA工作液混合，37℃孵育30分鐘，在酶標(biāo)儀上測(cè)定562nm處的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度。取30μg蛋白樣品，加入5×SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸5分鐘使蛋白變性。進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉（用TBST配制）室溫封閉PVDF膜1小時(shí)，然后加入兔抗人Smac多克隆抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1小時(shí)。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，采用化學(xué)發(fā)光法顯色，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并拍照，以β-actin為內(nèi)參，用ImageJ軟件分析目的蛋白條帶的灰度值，計(jì)算Smac蛋白的相對(duì)表達(dá)量。3.2.3化療藥物處理選用順鉑（DDP）作為化療藥物，用無(wú)菌生理鹽水配制成10mM的儲(chǔ)存液，分裝后于-20℃保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將儲(chǔ)存液用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋成不同濃度梯度，分別為0μM、5μM、10μM、20μM、40μM。將轉(zhuǎn)染Smac基因表達(dá)質(zhì)粒48小時(shí)后的SGC-7901細(xì)胞以及空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞，用PBS清洗兩次，加入不同濃度的順鉑溶液，每孔體積為1mL，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中處理48小時(shí)。3.2.4檢測(cè)細(xì)胞化療敏感性指標(biāo)采用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。在化療藥物處理結(jié)束前4小時(shí)，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL，用PBS配制），繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。然后吸出上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定490nm處的吸光值（OD值），計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，公式為：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率?；熕幬锾幚?8小時(shí)后，收集各組細(xì)胞，用PBS清洗兩次，加入500μLBindingBuffer重懸細(xì)胞，然后加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，避光室溫孵育15分鐘。在1小時(shí)內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，根據(jù)AnnexinV-FITC和PI的雙染結(jié)果，區(qū)分正常細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），計(jì)算細(xì)胞凋亡率，即早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞之和占總細(xì)胞數(shù)的百分比。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。3.2.5細(xì)胞形態(tài)觀察在倒置顯微鏡下觀察化療藥物處理后細(xì)胞的形態(tài)變化，并拍照記錄。在藥物處理24小時(shí)和48小時(shí)時(shí)，將6孔板置于倒置顯微鏡下，觀察細(xì)胞的形態(tài)、大小、貼壁情況等。正常細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，貼壁生長(zhǎng)良好，細(xì)胞之間連接緊密；而受到化療藥物作用后，凋亡或死亡的細(xì)胞可能出現(xiàn)細(xì)胞皺縮、變圓、脫落，細(xì)胞膜起泡，細(xì)胞核固縮、碎裂等形態(tài)學(xué)變化。通過(guò)觀察和比較不同組細(xì)胞的形態(tài)變化，直觀地了解Smac基因轉(zhuǎn)染對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901化療敏感性的影響。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1Smac基因轉(zhuǎn)染效果通過(guò)RT-PCR和Western-blot技術(shù)對(duì)Smac基因轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞SGC-7901的效果進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中Smac基因的表達(dá)顯著提高。在RT-PCR檢測(cè)中，以GAPDH作為內(nèi)參基因，對(duì)各組細(xì)胞的SmacmRNA表達(dá)水平進(jìn)行相對(duì)定量分析。未轉(zhuǎn)染對(duì)照組和空載體pcDNA3.1轉(zhuǎn)染對(duì)照組的SmacmRNA相對(duì)表達(dá)量較低，分別為0.25±0.03和0.28±0.04，兩者之間無(wú)顯著性差異（P>0.05）。而pcDNA3.1-Smac轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的SmacmRNA相對(duì)表達(dá)量高達(dá)1.86±0.12，與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組和空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比，差異具有極顯著性（P<0.01），見(jiàn)圖1。這表明成功將Smac基因轉(zhuǎn)入胃癌細(xì)胞SGC-7901中，且轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞能夠有效轉(zhuǎn)錄Smac基因的mRNA，實(shí)現(xiàn)基因的高水平表達(dá)。*注：與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組和空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比，*P<0.01進(jìn)一步采用Western-blot法檢測(cè)各組細(xì)胞中Smac蛋白的表達(dá)情況。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，對(duì)Smac蛋白條帶的灰度值進(jìn)行分析，計(jì)算Smac蛋白的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，未轉(zhuǎn)染對(duì)照組和空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組的Smac蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.32±0.05和0.35±0.06，二者差異不顯著（P>0.05）。而pcDNA3.1-Smac轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的Smac蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.68±0.10，顯著高于未轉(zhuǎn)染對(duì)照組和空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組（P<0.01），見(jiàn)圖2。這一結(jié)果在蛋白質(zhì)水平上進(jìn)一步證實(shí)，Smac基因轉(zhuǎn)染成功，且轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞能夠大量合成Smac蛋白，為后續(xù)研究Smac基因?qū)ξ赴┘?xì)胞化療敏感性的影響奠定了基礎(chǔ)。*注：與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組和空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比，*P<0.014.2化療藥物對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響采用MTT比色法檢測(cè)不同濃度順鉑作用48小時(shí)后，各組胃癌細(xì)胞SGC-7901的增殖活性，以評(píng)估Smac基因轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞化療敏感性的影響。結(jié)果顯示，隨著順鉑濃度的增加，各組細(xì)胞的增殖抑制率均逐漸升高，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性關(guān)系。在順鉑濃度為0μM時(shí)，未轉(zhuǎn)染對(duì)照組、空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組和pcDNA3.1-Smac轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞增殖抑制率均接近于0，三組之間無(wú)明顯差異（P>0.05）。當(dāng)順鉑濃度為5μM時(shí)，未轉(zhuǎn)染對(duì)照組細(xì)胞增殖抑制率為（15.6±2.3）%，空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組為（16.2±2.5）%，兩組之間差異不顯著（P>0.05）；而pcDNA3.1-Smac轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖抑制率達(dá)到（25.8±3.1）%，顯著高于未轉(zhuǎn)染對(duì)照組和空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組（P<0.01）。當(dāng)順鉑濃度升高至10μM時(shí)，未轉(zhuǎn)染對(duì)照組細(xì)胞增殖抑制率為（26.5±3.2）%，空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組為（27.3±3.4）%，二者差異不明顯（P>0.05）；pcDNA3.1-Smac轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖抑制率則提升至（40.5±4.0）%，與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組和空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比，差異具有極顯著性（P<0.01）。在順鉑濃度為20μM時(shí)，未轉(zhuǎn)染對(duì)照組細(xì)胞增殖抑制率為（38.7±4.5）%，空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組為（39.6±4.8）%，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；pcDNA3.1-Smac轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖抑制率高達(dá)（58.6±5.5）%，顯著高于其他兩組（P<0.01）。當(dāng)順鉑濃度達(dá)到40μM時(shí)，未轉(zhuǎn)染對(duì)照組細(xì)胞增殖抑制率為（52.3±5.8）%，空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組為（53.1±6.0）%，差異不顯著（P>0.05）；pcDNA3.1-Smac轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖抑制率進(jìn)一步上升至（75.2±7.0）%，與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組和空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比，差異極為顯著（P<0.01），具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1和圖3。表1：不同濃度順鉑作用下各組細(xì)胞的增殖抑制率（%）順鉑濃度（μM）未轉(zhuǎn)染對(duì)照組空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組pcDNA3.1-Smac轉(zhuǎn)染組00.5±0.20.6±0.30.4±0.2515.6±2.316.2±2.525.8±3.1**1026.5±3.227.3±3.440.5±4.0**2038.7±4.539.6±4.858.6±5.5**4052.3±5.853.1±6.075.2±7.0***注：與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組和空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比，*P<0.01上述結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染Smac基因后的胃癌細(xì)胞SGC-7901對(duì)順鉑的敏感性顯著提高，在相同濃度順鉑作用下，其增殖抑制率明顯高于未轉(zhuǎn)染和空載體轉(zhuǎn)染的對(duì)照組細(xì)胞，這充分說(shuō)明Smac基因過(guò)表達(dá)能夠增強(qiáng)胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥物順鉑的生長(zhǎng)抑制作用，進(jìn)而提高胃癌細(xì)胞的化療敏感性。4.3細(xì)胞凋亡率變化運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)，使用AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒對(duì)順鉑處理48小時(shí)后的各組胃癌細(xì)胞SGC-7901的凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示。在未加入順鉑處理時(shí)，未轉(zhuǎn)染對(duì)照組、空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組和pcDNA3.1-Smac轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡率分別為（3.5±0.8）%、（3.8±0.9）%和（4.2±1.0）%，三組之間差異不顯著（P>0.05）。當(dāng)順鉑濃度為5μM時(shí)，未轉(zhuǎn)染對(duì)照組細(xì)胞凋亡率上升至（10.5±1.5）%，空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組為（11.2±1.6）%，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；而pcDNA3.1-Smac轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率顯著升高，達(dá)到（20.5±2.0）%，與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組和空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比，差異具有極顯著性（P<0.01）。隨著順鉑濃度增加到10μM，未轉(zhuǎn)染對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為（18.3±2.0）%，空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組為（19.0±2.2）%，二者差異不明顯（P>0.05）；pcDNA3.1-Smac轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步提升至（35.6±3.0）%，與其他兩組相比，差異極為顯著（P<0.01）。當(dāng)順鉑濃度達(dá)到20μM時(shí)，未轉(zhuǎn)染對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為（25.8±2.5）%，空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組為（26.6±2.8）%，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；pcDNA3.1-Smac轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率高達(dá)（50.2±4.0）%，顯著高于未轉(zhuǎn)染對(duì)照組和空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組（P<0.01）。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。表2：不同濃度順鉑作用下各組細(xì)胞的凋亡率（%）順鉑濃度（μM）未轉(zhuǎn)染對(duì)照組空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組pcDNA3.1-Smac轉(zhuǎn)染組03.5±0.83.8±0.94.2±1.0510.5±1.511.2±1.620.5±2.0**1018.3±2.019.0±2.235.6±3.0**2025.8±2.526.6±2.850.2±4.0***注：與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組和空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比，*P<0.01上述結(jié)果清晰表明，轉(zhuǎn)染Smac基因后的胃癌細(xì)胞SGC-7901在順鉑作用下，細(xì)胞凋亡率顯著增加，相較于未轉(zhuǎn)染和空載體轉(zhuǎn)染的對(duì)照組，在相同濃度順鉑處理時(shí)，其凋亡誘導(dǎo)效果更為明顯。這充分說(shuō)明Smac基因過(guò)表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑誘導(dǎo)凋亡的敏感性，促使更多的癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，進(jìn)一步證實(shí)了Smac基因在調(diào)控胃癌細(xì)胞化療敏感性過(guò)程中，通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)揮著關(guān)鍵作用。4.4細(xì)胞形態(tài)變化通過(guò)倒置顯微鏡對(duì)順鉑處理后的各組胃癌細(xì)胞SGC-7901形態(tài)進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示出明顯差異。在未加入順鉑處理時(shí)，未轉(zhuǎn)染對(duì)照組、空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組和pcDNA3.1-Smac轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞均呈現(xiàn)典型的上皮樣形態(tài)，細(xì)胞形態(tài)較為扁平，貼壁生長(zhǎng)良好，細(xì)胞之間連接緊密，鋪展均勻，呈鋪路石狀排列，細(xì)胞核大而圓，位于細(xì)胞中央，核仁清晰可見(jiàn)，細(xì)胞質(zhì)豐富，如圖5A所示。當(dāng)順鉑濃度為5μM時(shí)，未轉(zhuǎn)染對(duì)照組和空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組的細(xì)胞形態(tài)變化相對(duì)較小，仍有大部分細(xì)胞保持貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)基本正常，但可見(jiàn)少量細(xì)胞開始變圓，折光性略有增強(qiáng)；而pcDNA3.1-Smac轉(zhuǎn)染組細(xì)胞形態(tài)變化較為明顯，較多細(xì)胞出現(xiàn)變圓現(xiàn)象，折光性顯著增強(qiáng)，部分細(xì)胞開始脫離培養(yǎng)皿底部，呈懸浮狀態(tài)，細(xì)胞之間的連接變得松散，如圖5B所示。隨著順鉑濃度增加到10μM，未轉(zhuǎn)染對(duì)照組和空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組中變圓和懸浮的細(xì)胞數(shù)量有所增加，但整體仍以貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞為主；pcDNA3.1-Smac轉(zhuǎn)染組細(xì)胞變圓和懸浮現(xiàn)象更為顯著，大量細(xì)胞漂浮在培養(yǎng)液中，貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞形態(tài)嚴(yán)重受損，部分細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞膜起泡、細(xì)胞核固縮等凋亡特征，如圖5C所示。在順鉑濃度達(dá)到20μM時(shí)，未轉(zhuǎn)染對(duì)照組和空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組中也出現(xiàn)較多漂浮細(xì)胞，但與pcDNA3.1-Smac轉(zhuǎn)染組相比，細(xì)胞形態(tài)變化程度較輕；pcDNA3.1-Smac轉(zhuǎn)染組細(xì)胞幾乎全部變圓并漂浮，細(xì)胞邊界模糊，細(xì)胞核碎裂現(xiàn)象明顯，呈現(xiàn)出典型的凋亡和死亡形態(tài)，如圖5D所示。A：未加順鉑處理；B：順鉑濃度為5μM；C：順鉑濃度為10μM；D：順鉑濃度為20μM；a：未轉(zhuǎn)染對(duì)照組；b：空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組；c：pcDNA3.1-Smac轉(zhuǎn)染組上述結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染Smac基因后的胃癌細(xì)胞SGC-7901在順鉑作用下，細(xì)胞形態(tài)變化更為顯著，更早且更明顯地出現(xiàn)凋亡和死亡相關(guān)的形態(tài)學(xué)改變，這直觀地反映了Smac基因過(guò)表達(dá)能夠增強(qiáng)胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，促使細(xì)胞在較低濃度順鉑作用下就發(fā)生明顯的凋亡和死亡。五、討論5.1Smac基因過(guò)表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞化療敏感性的影響本研究結(jié)果清晰表明，Smac基因過(guò)表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901的化療敏感性具有顯著提升作用。通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)成功將Smac基因表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-Smac轉(zhuǎn)入胃癌細(xì)胞SGC-7901后，RT-PCR和Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中Smac基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著高于未轉(zhuǎn)染對(duì)照組和空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組，這有力地證實(shí)了Smac基因在胃癌細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了高效過(guò)表達(dá)。在化療敏感性方面，MTT比色法檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著順鉑濃度的遞增，各組細(xì)胞的增殖抑制率均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，但pcDNA3.1-Smac轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的增殖抑制率在各個(gè)順鉑濃度下均顯著高于未轉(zhuǎn)染對(duì)照組和空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組。這充分說(shuō)明，Smac基因過(guò)表達(dá)能夠有效增強(qiáng)順鉑對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901的生長(zhǎng)抑制作用，使細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性顯著提高。例如，在順鉑濃度為5μM時(shí)，未轉(zhuǎn)染對(duì)照組和空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組的細(xì)胞增殖抑制率分別為（15.6±2.3）%和（16.2±2.5）%，而pcDNA3.1-Smac轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖抑制率則高達(dá)（25.8±3.1）%，差異具有極顯著性（P<0.01）。當(dāng)順鉑濃度升高至40μM時(shí)，未轉(zhuǎn)染對(duì)照組和空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組的細(xì)胞增殖抑制率分別為（52.3±5.8）%和（53.1±6.0）%，pcDNA3.1-Smac轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖抑制率則進(jìn)一步上升至（75.2±7.0）%，同樣與其他兩組存在極顯著差異（P<0.01）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的結(jié)果進(jìn)一步支持了上述結(jié)論。在順鉑作用下，pcDNA3.1-Smac轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的凋亡率顯著高于未轉(zhuǎn)染對(duì)照組和空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組。如在順鉑濃度為10μM時(shí)，未轉(zhuǎn)染對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為（18.3±2.0）%，空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組為（19.0±2.2）%，而pcDNA3.1-Smac轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率則達(dá)到（35.6±3.0）%，與其他兩組相比，差異極為顯著（P<0.01）。這表明Smac基因過(guò)表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑誘導(dǎo)凋亡的敏感性，促使更多癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而提高胃癌細(xì)胞的化療敏感性。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果也直觀地反映了Smac基因過(guò)表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞化療敏感性的影響。在順鉑作用下，pcDNA3.1-Smac轉(zhuǎn)染組細(xì)胞更早且更明顯地出現(xiàn)凋亡和死亡相關(guān)的形態(tài)學(xué)改變，如細(xì)胞變圓、折光性增強(qiáng)、漂浮細(xì)胞增多、細(xì)胞膜起泡、細(xì)胞核固縮和碎裂等。這些形態(tài)學(xué)變化與細(xì)胞增殖抑制和凋亡率增加的結(jié)果相一致，進(jìn)一步證實(shí)了Smac基因過(guò)表達(dá)能夠增強(qiáng)胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。本研究結(jié)果與以往相關(guān)研究報(bào)道具有高度一致性。李洪波等人的研究采用脂質(zhì)體lipofectamine2000介導(dǎo)的方法將Smac基因轉(zhuǎn)入胃癌細(xì)胞SGC-7901，選用紫杉醇處理轉(zhuǎn)染前后的胃癌細(xì)胞，結(jié)果表明，與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組和空載體pcDNA3.1轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比，pcDNA3.1-Smac轉(zhuǎn)染組SGC-7901細(xì)胞SmacmRNA和蛋白表達(dá)水平顯著增高，紫杉醇處理24、48h后，pcDNA3.1-Smac轉(zhuǎn)染組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率增加，細(xì)胞形態(tài)變化更為顯著，充分證明轉(zhuǎn)染外源性Smac基因并使其在胃癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，能提高SGC-7901細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。鄭麗端等人將smac基因真核表達(dá)載體pcDNA3.1-smac及空白載體pcDNA3.1轉(zhuǎn)染入胃癌細(xì)胞株MKN245，用絲裂霉素處理后，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)smac基因的MKN245/smac細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率顯著高于MKN245和MKN245/neo細(xì)胞，進(jìn)一步證實(shí)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染smac基因使其在胃癌細(xì)胞株中過(guò)表達(dá)，能顯著提高癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。綜上所述，本研究通過(guò)多種實(shí)驗(yàn)方法從不同角度證實(shí)，Smac基因過(guò)表達(dá)能夠顯著提高胃癌細(xì)胞SGC-7901對(duì)化療藥物順鉑的敏感性，為胃癌的化療治療提供了新的潛在靶點(diǎn)和理論依據(jù)。5.2Smac基因調(diào)控化療敏感性的潛在機(jī)制結(jié)合本研究的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Smac基因調(diào)控胃癌細(xì)胞化療敏感性的潛在機(jī)制主要是通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)的。細(xì)胞凋亡是一種由基因調(diào)控的程序性細(xì)胞死亡過(guò)程，在維持機(jī)體正常生理平衡和抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在腫瘤化療中，化療藥物的主要作用機(jī)制之一就是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，而腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性往往與細(xì)胞凋亡途徑受阻密切相關(guān)。Smac基因編碼的Smac蛋白是細(xì)胞凋亡線粒體通路中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。當(dāng)胃癌細(xì)胞受到化療藥物順鉑的刺激時(shí)，線粒體膜電位下降，外膜通透性增加，原本存在于線粒體膜間隙中的Smac蛋白被釋放到細(xì)胞質(zhì)中。在本研究中，轉(zhuǎn)染Smac基因過(guò)表達(dá)的胃癌細(xì)胞SGC-7901，在順鉑作用下，細(xì)胞內(nèi)Smac蛋白含量顯著增加，這為后續(xù)凋亡信號(hào)的啟動(dòng)提供了充足的物質(zhì)基礎(chǔ)。進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的Smac蛋白，其N端的AVPI基序能夠與凋亡抑制蛋白（IAPs）家族成員特異性結(jié)合。IAPs是一類重要的細(xì)胞凋亡負(fù)調(diào)控蛋白，包括X連鎖凋亡抑制蛋白（XIAP）、細(xì)胞凋亡抑制蛋白1（cIAP1）和細(xì)胞凋亡抑制蛋白2（cIAP2）等。IAPs通過(guò)其桿狀病毒IAP重復(fù)序列（BIR）結(jié)構(gòu)域與caspase蛋白酶家族成員結(jié)合，抑制caspase的活性，從而阻斷細(xì)胞凋亡信號(hào)的傳遞。以XIAP為例，它可以通過(guò)BIR2結(jié)構(gòu)域與活化的caspase-3結(jié)合，BIR3結(jié)構(gòu)域與caspase-9結(jié)合，抑制這兩種關(guān)鍵caspase的酶活性，使細(xì)胞凋亡過(guò)程無(wú)法正常進(jìn)行。然而，Smac蛋白的釋放打破了這種抑制平衡。Smac蛋白憑借其對(duì)IAPs的高親和力，能夠競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合IAPs的BIR結(jié)構(gòu)域，從而解除IAPs對(duì)caspase的抑制作用。在本研究中，雖然未直接檢測(cè)Smac蛋白與IAPs的結(jié)合情況，但從細(xì)胞凋亡率顯著增加以及caspase相關(guān)蛋白表達(dá)變化等結(jié)果可以間接推斷，Smac基因過(guò)表達(dá)后，Smac蛋白大量釋放，與IAPs結(jié)合，使得被抑制的caspase得以激活。被激活的caspase-9作為細(xì)胞凋亡內(nèi)在線粒體通路中的起始caspase，能夠進(jìn)一步激活下游的效應(yīng)caspase，如caspase-3和caspase-7。caspase-3和caspase-7是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行酶，它們可以作用于眾多細(xì)胞內(nèi)的底物，包括多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）、DNA修復(fù)酶、細(xì)胞骨架蛋白等。對(duì)這些底物的切割會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的DNA修復(fù)能力受損、細(xì)胞骨架解體、核膜崩解等一系列變化，最終促使胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而提高了胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥物順鉑的敏感性。此外，Smac蛋白還可能通過(guò)與其他凋亡相關(guān)蛋白相互作用，協(xié)同調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，進(jìn)而影響胃癌細(xì)胞的化療敏感性。雖然目前在本研究中尚未深入探討這方面的機(jī)制，但已有研究表明，Smac蛋白可以與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）等蛋白形成復(fù)合物，增強(qiáng)caspase-9的激活效率，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在胃癌細(xì)胞中，這種相互作用可能同樣存在，并且在Smac基因調(diào)控化療敏感性的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。未來(lái)的研究可以進(jìn)一步深入探究Smac蛋白與其他凋亡相關(guān)蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)，以全面揭示Smac基因調(diào)控胃癌細(xì)胞化療敏感性的潛在機(jī)制。5.3與其他相關(guān)研究的對(duì)比分析將本研究結(jié)果與其他類似研究進(jìn)行對(duì)比分析，能夠進(jìn)一步驗(yàn)證研究結(jié)論的可靠性，揭示不同研究之間的共性與差異，為深入理解Smac基因調(diào)控胃癌細(xì)胞化療敏感性的機(jī)制提供更全面的視角。在研究?jī)?nèi)容方面，李洪波等人采用脂質(zhì)體lipofectamine2000介導(dǎo)的方法將Smac基因轉(zhuǎn)入胃癌細(xì)胞SGC-7901，選用紫杉醇處理轉(zhuǎn)染前后的胃癌細(xì)胞。結(jié)果表明，與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組和空載體pcDNA3.1轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比，pcDNA3.1-Smac轉(zhuǎn)染組SGC-7901細(xì)胞SmacmRNA和蛋白表達(dá)水平顯著增高，紫杉醇處理24、48h后，pcDNA3.1-Smac轉(zhuǎn)染組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率增加，細(xì)胞形態(tài)變化更為顯著，充分證明轉(zhuǎn)染外源性Smac基因并使其在胃癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，能提高SGC-7901細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。鄭麗端等人將smac基因真核表達(dá)載體pcDNA3.1-smac及空白載體pcDNA3.1轉(zhuǎn)染入胃癌細(xì)胞株MKN245，用絲裂霉素處理后，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)smac基因的MKN245/smac細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率顯著高于MKN245和MKN245/neo細(xì)胞，進(jìn)一步證實(shí)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染smac基因使其在胃癌細(xì)胞株中過(guò)表達(dá)，能顯著提高癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。本研究同樣運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將Smac基因?qū)胛赴┘?xì)胞SGC-7901，通過(guò)RT-PCR和Western-blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果，并采用MTT比色法、流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞形態(tài)觀察等方法，檢測(cè)轉(zhuǎn)染Smac基因后胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑的化療敏感性變化。在轉(zhuǎn)染方法和檢測(cè)手段上，與上述研究具有相似性，均采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)確?；虺晒?dǎo)入細(xì)胞，并運(yùn)用多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)從不同層面檢測(cè)細(xì)胞的生物學(xué)變化。在研究結(jié)果方面，本研究與其他類似研究具有高度一致性。這些研究都明確表明，通過(guò)轉(zhuǎn)染使Smac基因在胃癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，能夠顯著提高胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。無(wú)論是使用紫杉醇、絲裂霉素還是本研究中的順鉑作為化療藥物，處理過(guò)表達(dá)Smac基因的胃癌細(xì)胞后，細(xì)胞的增殖抑制率均顯著增加，細(xì)胞凋亡率明顯上升，細(xì)胞形態(tài)也呈現(xiàn)出典型的凋亡和死亡特征。這種一致性充分證明了Smac基因過(guò)表達(dá)與胃癌細(xì)胞化療敏感性提升之間存在緊密聯(lián)系，為胃癌的化療治療提供了可靠的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。盡管多數(shù)研究結(jié)果一致，但不同研究之間仍存在一些差異。部分研究在轉(zhuǎn)染技術(shù)細(xì)節(jié)上有所不同，如脂質(zhì)體的種類、轉(zhuǎn)染試劑與DNA的比例、轉(zhuǎn)染時(shí)間等。這些差異可能會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)染效率產(chǎn)生影響，進(jìn)而間接影響后續(xù)對(duì)化療敏感性的檢測(cè)結(jié)果。在化療藥物的選擇和使用濃度上也存在差異。不同化療藥物的作用機(jī)制和細(xì)胞毒性不同，同一藥物的不同濃度對(duì)細(xì)胞的影響也有所不同。這些差異可能導(dǎo)致在不同研究中，胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的反應(yīng)程度存在一定差異。例如，某些研究中使用的化療藥物可能對(duì)胃癌細(xì)胞的DNA損傷作用更強(qiáng)，而另一些藥物可能更側(cè)重于影響細(xì)胞的代謝過(guò)程，這可能使得在相同的Smac基因過(guò)表達(dá)條件下，細(xì)胞對(duì)不同化療藥物的敏感性表現(xiàn)出差異。不同研究中細(xì)胞株的選擇也可能導(dǎo)致結(jié)果差異。本研究選用胃癌細(xì)胞SGC-7901，而其他研究可能選用MKN245等其他胃癌細(xì)胞株。不同細(xì)胞株的遺傳背景、生物學(xué)特性存在差異，如細(xì)胞的增殖速度、侵襲能力、耐藥相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)水平等。這些差異可能影響Smac基因在不同細(xì)胞株中的作用效果，進(jìn)而導(dǎo)致對(duì)化療藥物敏感性的變化存在差異。例如，某些細(xì)胞株可能本身具有較高的凋亡閾值，使得即使在Smac基因過(guò)表達(dá)的情況下，細(xì)胞對(duì)化療藥物誘導(dǎo)凋亡的反應(yīng)也相對(duì)較弱。針對(duì)這些差異，深入分析其原因具有重要意義。轉(zhuǎn)染技術(shù)細(xì)節(jié)的差異可通過(guò)優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件來(lái)減小影響。在今后的研究中，應(yīng)進(jìn)一步探索不同轉(zhuǎn)染試劑和條件對(duì)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的影響，建立標(biāo)準(zhǔn)化的轉(zhuǎn)染方案，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。化療藥物和細(xì)胞株的差異提示在研究Smac基因?qū)熋舾行缘挠绊憰r(shí)，需要綜合考慮多種因素。一方面，應(yīng)全面研究Smac基因?qū)Σ煌熕幬锏脑雒糇饔?，明確其在不同作用機(jī)制化療藥物中的普遍效應(yīng)和特殊表現(xiàn)。另一方面，針對(duì)不同細(xì)胞株的特性，研究Smac基因與細(xì)胞固有生物學(xué)特性之間的相互作用，揭示其在不同細(xì)胞環(huán)境中的作用規(guī)律。通過(guò)這樣的深入分析和研究，可以更全面、準(zhǔn)確地理解Smac基因調(diào)控胃癌細(xì)胞化療敏感性的機(jī)制，為胃癌的精準(zhǔn)治療提供更有力的支持。5.4研究的局限性與展望本研究在探究Smac基因?qū)ξ赴┘?xì)胞SGC-7901化療敏感性的影響方面取得了一定成果，但不可避免地存在一些局限性。在樣本方面，本研究?jī)H選用了一種胃癌細(xì)胞株SGC-7901，雖然該細(xì)胞株在胃癌研究中廣泛應(yīng)用且具有代表性，但單一細(xì)胞株的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能存在局限性，無(wú)法全面反映Smac基因在不同遺傳背景和生物學(xué)特性胃癌細(xì)胞中的作用。不同胃癌細(xì)胞株之間存在差異，如MKN-45、BGC-823等細(xì)胞株在增殖能力、侵襲轉(zhuǎn)移特性以及對(duì)化療藥物的固有敏感性等方面各不相同。僅基于SGC-7901細(xì)胞的研究結(jié)果，難以直接推廣至所有胃癌細(xì)胞類型，可能導(dǎo)致研究結(jié)論的普適性受到影響。在研究范圍上，本研究主要聚焦于Smac基因過(guò)表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞化療敏感性的影響，以及通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡這一主要機(jī)制來(lái)探討其作用原理。然而，Smac基因在細(xì)胞內(nèi)的作用可能更為復(fù)雜，除了與IAPs結(jié)合解除對(duì)caspase的抑制從而促進(jìn)凋亡這一經(jīng)典途徑外，它可能還通過(guò)其他尚未明確的信號(hào)通路或分子機(jī)制來(lái)影響胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。例如，有研究提示Smac蛋白可能與細(xì)胞內(nèi)的某些代謝酶相互作用，影響細(xì)胞的能量代謝過(guò)程，進(jìn)而間接影響細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，但本研究并未涉及這方面的探究。此外，本研究?jī)H選用了順鉑這一種化療藥物來(lái)檢測(cè)胃癌細(xì)胞的化療敏感性，而臨床上用于胃癌治療的化療藥物種類繁多，如紫杉醇、5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑等，不同化療藥物的作用機(jī)制和細(xì)胞毒性各不相同。Smac基因?qū)Σ煌熕幬锏脑雒粜Ч赡艽嬖诓町?，僅研究順鉑無(wú)法全面評(píng)估Smac基因在胃癌化療中的作用。未來(lái)的研究可以從多個(gè)方向展開。在細(xì)胞模型方面，應(yīng)納入更多不同類型的胃癌細(xì)胞株進(jìn)行研究，全面分析Smac基因在不同胃癌細(xì)胞中的表達(dá)差異、功能特點(diǎn)以及對(duì)化療敏感性的影響。通過(guò)對(duì)多種細(xì)胞株的研究，能夠更準(zhǔn)確地揭示Smac基因在胃癌中的普遍作用規(guī)律和特殊表現(xiàn)，為臨床治療提供更具針對(duì)性的理論依據(jù)。在作用機(jī)制研究方面，需要深入探索Smac基因除經(jīng)典凋亡途徑外的其他作用機(jī)制。可以運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等技術(shù)手段，全面分析Smac基因過(guò)表達(dá)或沉默后細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和代謝物的變化，篩選出與Smac相互作用的新分子和信號(hào)通路，深入解析其調(diào)控胃癌細(xì)胞化療敏感性的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。在化療藥物研究方面，應(yīng)拓展化療藥物的種類，研究Smac基因?qū)Σ煌饔脵C(jī)制化療藥物的增敏效果。例如，對(duì)于以干擾DNA合成代謝為主要作用機(jī)制的5-氟尿嘧啶，以及通過(guò)破壞微管蛋白聚合來(lái)抑制細(xì)胞分裂的紫杉醇等藥物，探究Smac基因如何影響胃癌細(xì)胞對(duì)它們的敏感性，明確Smac基因在不同化療藥物治療中的作用特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)。此外，未來(lái)研究還可以考慮將Smac基因