β-catenin與Cyr61在肝癌中的表達特征及交互作用機制研究一、引言1.1研究背景與意義肝癌作為一種常見且嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)均居高不下。據(jù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，全球每年約有78萬人死于肝癌，而中國作為肝病大國，肝癌的發(fā)病率更是處于較高水平。肝癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，這不僅極大地增加了治療難度，也導(dǎo)致患者的預(yù)后較差。肝癌不僅會對肝臟本身造成嚴(yán)重損害，影響其解毒、代謝和合成功能，還會引發(fā)一系列并發(fā)癥，如門靜脈高壓、脾功能亢進等，進一步危及患者生命。肝癌還會對患者的心理產(chǎn)生負面影響，給患者及其家庭帶來沉重的負擔(dān)。目前，針對肝癌的治療方法主要包括手術(shù)切除、化療、放療、靶向治療等。然而，這些治療方法在實際應(yīng)用中仍存在諸多局限性。手術(shù)切除雖然是肝癌治療的重要手段之一，但對于中晚期肝癌患者，由于腫瘤的轉(zhuǎn)移和擴散，手術(shù)切除的可能性較低，且術(shù)后復(fù)發(fā)率較高?；熀头暖熢跉┘毎耐瑫r，也會對正常細胞造成損傷，產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用，導(dǎo)致患者的生活質(zhì)量下降。靶向治療雖然具有一定的針對性，但由于肝癌的發(fā)病機制復(fù)雜，單一的靶向治療往往難以取得理想的效果，且容易出現(xiàn)耐藥性。因此，深入研究肝癌的發(fā)病機制，尋找新的治療靶點和治療策略，對于提高肝癌的治療效果、改善患者的預(yù)后具有至關(guān)重要的意義。在肝癌的發(fā)病機制研究中，β-catenin和Cyr61逐漸成為研究的熱點。β-catenin作為一種重要的細胞信號調(diào)控蛋白，在細胞粘附、細胞凋亡、細胞增殖、胚胎發(fā)育和細胞命運決定等方面發(fā)揮著重要作用。在正常情況下，細胞中的β-catenin主要存在于細胞間連接復(fù)合物中，起到維持細胞間結(jié)構(gòu)和細胞極性的作用。然而，在肝癌中，β-catenin的表達水平顯著升高，與細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等發(fā)病機制密切相關(guān)。其高表達與基因突變和DNA甲基化等多種因素有關(guān)，在許多肝癌患者中發(fā)現(xiàn)了β-catenin的突變，導(dǎo)致其不能被降解，在胞質(zhì)內(nèi)積聚，進一步促進細胞增殖和轉(zhuǎn)移。Cyr61屬于細胞外基質(zhì)蛋白家族中的一員，在正常細胞中，其表達水平較低，而在許多腫瘤中，包括肝癌，Cyr61的表達水平明顯升高，與腫瘤細胞的侵襲性和轉(zhuǎn)移性密切相關(guān)。研究表明，Cyr61能夠通過調(diào)節(jié)膠原、黏附分子等的表達來影響細胞增殖和遷移，在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。越來越多的研究表明，β-catenin與Cyr61在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中存在密切的關(guān)聯(lián)。二者可能通過相互作用，共同影響肝癌細胞的生物學(xué)行為。例如，有研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌細胞中，Wnt信號通路的激活可以上調(diào)Cyr61的表達，而Wnt信號通路的激活與β-catenin的異常積累密切相關(guān)；HGF信號通路的激活也可以激活β-catenin通路，進而上調(diào)Cyr61的表達。PAX2和Smad3等轉(zhuǎn)錄因子也被認為是β-catenin調(diào)控Cyr61表達的重要中介者。深入研究β-catenin與Cyr61在肝癌中的表達及作用機制，不僅有助于進一步揭示肝癌的發(fā)病機制，還可能為肝癌的治療提供新的靶點和治療策略，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在肝癌研究領(lǐng)域，β-catenin和Cyr61各自的表達與作用機制，以及二者之間的關(guān)聯(lián)都受到了廣泛關(guān)注，國內(nèi)外學(xué)者從不同角度展開了深入研究。在β-catenin與肝癌的研究方面，國外學(xué)者的研究起步較早。有研究表明，Wnt/β-catenin信號通路在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用。在胚胎發(fā)育時期，Wnt/β-catenin信號通路對細胞的增殖、分化和遷移等過程進行著精細的調(diào)控，確保組織和器官的正常發(fā)育。然而，在肝癌發(fā)生時，該信號通路會發(fā)生異常激活。當(dāng)Wnt信號分子與細胞表面的受體結(jié)合后，會抑制β-catenin的磷酸化和降解，使得β-catenin在細胞質(zhì)中大量積累，并進一步進入細胞核。在細胞核內(nèi)，β-catenin與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF家族相互作用，啟動一系列靶基因的轉(zhuǎn)錄，如c-Myc、CyclinD1等。c-Myc作為一種原癌基因，能夠促進細胞的增殖和代謝，其異常高表達會導(dǎo)致細胞過度增殖，從而增加肝癌發(fā)生的風(fēng)險；CyclinD1則在細胞周期的調(diào)控中發(fā)揮重要作用，它的上調(diào)會加速細胞周期的進程，使細胞更容易進入分裂狀態(tài)，進而推動肝癌細胞的生長和擴散。國內(nèi)學(xué)者也在該領(lǐng)域取得了豐碩的成果。有研究通過對大量肝癌患者的臨床樣本進行分析，發(fā)現(xiàn)β-catenin的異常表達與肝癌的病理分級、腫瘤大小、轉(zhuǎn)移和預(yù)后等密切相關(guān)。在病理分級較高的肝癌組織中，β-catenin的表達水平往往顯著升高，這意味著腫瘤細胞的惡性程度更高，侵襲和轉(zhuǎn)移能力更強。腫瘤較大的肝癌患者，其腫瘤組織中β-catenin的陽性表達率也相對較高，提示β-catenin可能參與了腫瘤的生長過程。在發(fā)生轉(zhuǎn)移的肝癌患者中，β-catenin的異常激活更為明顯，表明它在肝癌的轉(zhuǎn)移過程中起到了重要的推動作用。而且，β-catenin高表達的肝癌患者預(yù)后往往較差，生存率明顯低于β-catenin低表達的患者，這為臨床評估肝癌患者的預(yù)后提供了重要的參考指標(biāo)。國內(nèi)研究還發(fā)現(xiàn)，一些非編碼RNA分子，如miR-130a等，能夠通過與β-catenin的mRNA結(jié)合，抑制其翻譯過程，從而降低β-catenin的表達水平，進而抑制肝癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，這為肝癌的治療提供了新的潛在靶點和治療思路。關(guān)于Cyr61與肝癌的研究，國外有研究證實，Cyr61在肝癌組織中的表達水平顯著高于正常肝組織，并且其表達量與肝癌的惡性程度呈正相關(guān)。在高侵襲性的肝癌細胞系中，Cyr61的表達明顯上調(diào)。通過基因敲除或RNA干擾技術(shù)降低Cyr61的表達后，肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力均受到顯著抑制。進一步的機制研究發(fā)現(xiàn)，Cyr61可以通過激活PI3K/AKT和MAPK/ERK等信號通路，促進肝癌細胞的存活和增殖。PI3K/AKT信號通路在細胞的存活、生長和代謝等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，Cyr61激活該通路后，能夠抑制細胞凋亡，促進細胞的存活和增殖；MAPK/ERK信號通路則參與細胞的增殖、分化和遷移等過程，Cyr61對該通路的激活會增強肝癌細胞的遷移和侵襲能力。國內(nèi)學(xué)者也在積極探索Cyr61在肝癌中的作用機制。研究發(fā)現(xiàn)，Cyr61能夠調(diào)節(jié)肝癌細胞外基質(zhì)的組成和結(jié)構(gòu)，增強肝癌細胞與周圍環(huán)境的相互作用，從而促進肝癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。Cyr61還可以通過與整合素等細胞表面受體結(jié)合，激活下游的信號傳導(dǎo)，促進肝癌細胞的遷移和侵襲。整合素是一類細胞表面的黏附分子，它與Cyr61結(jié)合后，能夠激活細胞內(nèi)的信號通路，調(diào)節(jié)細胞的骨架重組和運動，使得肝癌細胞更容易突破基底膜，向周圍組織浸潤和轉(zhuǎn)移。國內(nèi)研究還發(fā)現(xiàn)，Cyr61的表達受到多種轉(zhuǎn)錄因子和信號通路的調(diào)控，如NF-κB、TGF-β等，深入研究這些調(diào)控機制，有助于進一步揭示肝癌的發(fā)病機制，并為肝癌的治療提供新的靶點。在β-catenin與Cyr61在肝癌中的關(guān)聯(lián)研究方面，國內(nèi)外的研究均表明二者存在密切的聯(lián)系。有研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌細胞中，Wnt/β-catenin信號通路的激活可以上調(diào)Cyr61的表達。當(dāng)Wnt信號通路被激活后，β-catenin進入細胞核，與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，啟動Cyr61基因的轉(zhuǎn)錄，從而使Cyr61的表達水平升高。HGF信號通路的激活也可以通過激活β-catenin通路，進而上調(diào)Cyr61的表達。PAX2和Smad3等轉(zhuǎn)錄因子也被認為是β-catenin調(diào)控Cyr61表達的重要中介者，它們在β-catenin與Cyr61之間的信號傳導(dǎo)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。雖然目前關(guān)于β-catenin與Cyr61在肝癌中的研究已取得了一定的進展，但仍存在許多未知的領(lǐng)域和問題。例如，β-catenin調(diào)控Cyr61表達的具體分子機制尚未完全明確，二者在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的相互作用網(wǎng)絡(luò)還需要進一步深入研究。如何將這些基礎(chǔ)研究成果轉(zhuǎn)化為臨床治療的新方法和新策略，也是亟待解決的問題。因此，未來需要進一步加強相關(guān)研究，為肝癌的防治提供更堅實的理論基礎(chǔ)和更有效的治療手段。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在深入揭示β-catenin與Cyr61在肝癌中的表達特征及其相互作用的分子機制，為肝癌的診斷、治療和預(yù)后評估提供新的理論依據(jù)和潛在靶點。為實現(xiàn)上述研究目標(biāo)，本研究將圍繞以下內(nèi)容展開：β-catenin與Cyr61在肝癌組織及細胞中的表達水平檢測：收集肝癌患者的癌組織及相應(yīng)的癌旁正常組織標(biāo)本，運用免疫組織化學(xué)、Westernblot和實時熒光定量PCR等技術(shù)，精確檢測β-catenin與Cyr61蛋白及mRNA在這些組織中的表達水平。同時，選取多種肝癌細胞株和正常肝細胞株，采用相同的檢測技術(shù)，分析β-catenin與Cyr61在不同細胞系中的表達差異。通過對大量樣本的檢測和分析，明確β-catenin與Cyr61在肝癌組織及細胞中的表達特征，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。β-catenin與Cyr61表達與肝癌臨床病理參數(shù)及預(yù)后的相關(guān)性分析：詳細收集肝癌患者的臨床病理資料，包括腫瘤大小、病理分級、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等。將β-catenin與Cyr61的表達水平與這些臨床病理參數(shù)進行相關(guān)性分析，探討它們在肝癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中的作用。通過對患者進行長期隨訪，獲取患者的生存數(shù)據(jù)，分析β-catenin與Cyr61的表達與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系，為臨床評估肝癌患者的病情和預(yù)后提供重要參考。β-catenin對Cyr61表達的調(diào)控機制研究：運用基因編輯技術(shù)，如CRISPR/Cas9系統(tǒng)，構(gòu)建β-catenin基因敲除或過表達的肝癌細胞模型。通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?、染色質(zhì)免疫沉淀實驗（ChIP）等方法，深入探究β-catenin是否直接結(jié)合到Cyr61基因的啟動子區(qū)域，從而調(diào)控其轉(zhuǎn)錄。研究Wnt/β-catenin信號通路的激活或抑制對Cyr61表達的影響，以及PAX2、Smad3等轉(zhuǎn)錄因子在β-catenin調(diào)控Cyr61表達過程中的中介作用。通過這些研究，揭示β-catenin對Cyr61表達的調(diào)控機制，為進一步理解肝癌的發(fā)病機制提供理論支持。β-catenin與Cyr61相互作用對肝癌細胞生物學(xué)行為的影響：采用RNA干擾技術(shù)，分別沉默或過表達肝癌細胞中的β-catenin和Cyr61基因，運用細胞增殖實驗（如CCK-8法、EdU摻入實驗）、細胞遷移和侵襲實驗（如Transwell實驗、劃痕實驗）、細胞凋亡實驗（如AnnexinV-FITC/PI雙染法）等方法，檢測肝癌細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡能力的變化。研究β-catenin與Cyr61相互作用對肝癌細胞周期分布、信號通路激活等生物學(xué)行為的影響，明確它們在肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中的協(xié)同或拮抗作用，為肝癌的治療提供新的靶點和策略。1.4研究方法與技術(shù)路線實驗研究：通過細胞實驗和動物實驗，研究β-catenin與Cyr61在肝癌細胞中的生物學(xué)功能及相互作用機制。在細胞實驗中，利用細胞培養(yǎng)技術(shù)，培養(yǎng)多種肝癌細胞株和正常肝細胞株，通過基因轉(zhuǎn)染、RNA干擾等方法，調(diào)控β-catenin和Cyr61的表達水平，觀察肝癌細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡等生物學(xué)行為的變化。在動物實驗中，構(gòu)建肝癌動物模型，如裸鼠皮下移植瘤模型、原位肝癌模型等，通過體內(nèi)注射干擾或過表達β-catenin和Cyr61的載體，觀察腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移情況，進一步驗證二者在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用。臨床樣本分析：收集肝癌患者的臨床樣本，包括癌組織、癌旁正常組織、血液等，運用免疫組織化學(xué)、Westernblot、實時熒光定量PCR等技術(shù)，檢測β-catenin與Cyr61的表達水平，并分析其與肝癌患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的相關(guān)性。通過對大量臨床樣本的分析，為β-catenin與Cyr61在肝癌中的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。生物信息學(xué)分析：利用公共數(shù)據(jù)庫，如TCGA、GEO等，獲取肝癌相關(guān)的基因表達數(shù)據(jù)、臨床信息等，通過生物信息學(xué)分析方法，挖掘β-catenin與Cyr61在肝癌中的潛在作用機制和相關(guān)信號通路。運用基因富集分析（GSEA）、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析等技術(shù)，深入探討β-catenin與Cyr61在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為實驗研究提供理論指導(dǎo)。本研究的技術(shù)路線如圖1-1所示：[此處插入技術(shù)路線圖，展示從臨床樣本收集、細胞實驗、動物實驗到生物信息學(xué)分析的流程，以及各步驟之間的關(guān)聯(lián)和數(shù)據(jù)流向][此處插入技術(shù)路線圖，展示從臨床樣本收集、細胞實驗、動物實驗到生物信息學(xué)分析的流程，以及各步驟之間的關(guān)聯(lián)和數(shù)據(jù)流向]首先，收集肝癌患者的臨床樣本和細胞株，進行β-catenin與Cyr61表達水平的檢測，分析其與臨床病理參數(shù)及預(yù)后的相關(guān)性。同時，利用生物信息學(xué)分析公共數(shù)據(jù)庫中的肝癌數(shù)據(jù)，挖掘β-catenin與Cyr61的潛在作用機制和相關(guān)信號通路?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，進行細胞實驗和動物實驗，通過調(diào)控β-catenin和Cyr61的表達，觀察肝癌細胞和動物模型中腫瘤的生物學(xué)行為變化，深入研究二者的相互作用機制。最后，綜合各項研究結(jié)果，總結(jié)β-catenin與Cyr61在肝癌中的表達特征、作用機制及其臨床意義，為肝癌的診斷、治療和預(yù)后評估提供新的理論依據(jù)和潛在靶點。二、β-catenin與Cyr61相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1β-catenin概述2.1.1β-catenin的結(jié)構(gòu)與功能β-catenin，即β-連環(huán)蛋白，是一種在細胞生物學(xué)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用的多功能蛋白，由CTNNB1基因編碼，屬于Armadillo蛋白家族。其結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性決定了它具有多種生物學(xué)功能，在細胞粘附、信號傳導(dǎo)以及基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控等過程中均扮演著不可或缺的角色。從分子結(jié)構(gòu)來看，β-catenin是由781個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，包含三個主要結(jié)構(gòu)域：N端結(jié)構(gòu)域、Armadillo重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域。N端結(jié)構(gòu)域（1-140aa）含有多個磷酸化位點，如絲氨酸33（Ser33）、絲氨酸37（Ser37）和蘇氨酸41（Thr41），這些位點是糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的作用靶點。在無Wnt信號時，GSK-3β會使β-catenin的N端位點磷酸化，磷酸化后的β-catenin會被β-轉(zhuǎn)導(dǎo)重復(fù)蛋白（β-TrCP）識別并結(jié)合，進而通過泛素-蛋白酶體途徑被降解，以此維持細胞內(nèi)β-catenin的低水平穩(wěn)定狀態(tài)。Armadillo重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域（141-664aa）由12個Armadillo重復(fù)單元組成，這一結(jié)構(gòu)域是β-catenin的核心區(qū)域，介導(dǎo)了β-catenin與多種蛋白質(zhì)的相互作用。它能夠與E-cadherin的胞質(zhì)區(qū)域結(jié)合，形成黏附連接復(fù)合物，對維持上皮細胞的極性和細胞間的黏附起著重要作用，保證了組織和器官的正常結(jié)構(gòu)和功能；在Wnt信號通路中，該結(jié)構(gòu)域又能與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF家族成員相互作用，參與基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控過程，對細胞的增殖、分化和遷移等生物學(xué)行為產(chǎn)生影響。C端結(jié)構(gòu)域（665-781aa）包含轉(zhuǎn)錄激活域，當(dāng)β-catenin進入細胞核后，該區(qū)域可以招募BCL9、Pygo等共激活因子，增強靶基因的轉(zhuǎn)錄活性，促進相關(guān)基因的表達，從而調(diào)控細胞的生理功能。在細胞粘附方面，β-catenin主要通過與E-cadherin結(jié)合發(fā)揮作用。E-cadherin是一種重要的細胞粘附分子，主要存在于上皮細胞表面，它通過其細胞外結(jié)構(gòu)域與相鄰細胞表面的E-cadherin相互作用，形成細胞間的粘附連接。而β-catenin則與E-cadherin的胞質(zhì)區(qū)域結(jié)合，進一步與α-catenin相連，α-catenin又與肌動蛋白細胞骨架相互作用，這樣就形成了一個從細胞表面到細胞骨架的橋梁結(jié)構(gòu)，將相鄰細胞緊密連接在一起，維持了上皮組織的完整性和穩(wěn)定性。在胚胎發(fā)育過程中，這種細胞粘附作用對于組織和器官的形態(tài)發(fā)生至關(guān)重要。在神經(jīng)管形成過程中，神經(jīng)上皮細胞之間通過E-cadherin和β-catenin介導(dǎo)的粘附連接，使細胞有序排列，從而形成正確的神經(jīng)管結(jié)構(gòu)。如果β-catenin的功能受損，細胞間的粘附作用就會受到影響，可能導(dǎo)致神經(jīng)管發(fā)育異常，如脊柱裂等先天性疾病。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，β-catenin與E-cadherin的相互作用也發(fā)生了改變。在許多上皮來源的腫瘤中，E-cadherin的表達下調(diào)或功能異常，導(dǎo)致β-catenin從細胞間粘附復(fù)合物中解離出來，進入細胞質(zhì)和細胞核，參與腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程。這種從細胞粘附功能到信號傳導(dǎo)功能的轉(zhuǎn)變，是腫瘤細胞惡性轉(zhuǎn)化的重要特征之一。在Wnt信號通路中，β-catenin則扮演著核心效應(yīng)蛋白的角色。Wnt信號通路是一條在進化上高度保守的信號傳導(dǎo)途徑，在胚胎發(fā)育、細胞增殖、分化和組織穩(wěn)態(tài)維持等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)Wnt信號未激活時，細胞內(nèi)的β-catenin處于被降解的狀態(tài)。由結(jié)腸腺瘤性息肉病蛋白（APC）、軸蛋白（Axin）、GSK-3β和酪蛋白激酶1α（CK1α）組成的降解復(fù)合體，會使β-catenin的N端位點磷酸化，磷酸化的β-catenin隨后被β-TrCP識別并結(jié)合，通過泛素-蛋白酶體途徑被降解，使得細胞內(nèi)β-catenin的含量維持在較低水平，此時Wnt信號通路下游的靶基因處于抑制狀態(tài)。當(dāng)Wnt信號激活時，Wnt配體（如Wnt3a）與細胞表面的Frizzled受體和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6（LRP5/6）組成的受體復(fù)合物結(jié)合，激活下游的散亂蛋白（Dishevelled，Dsh）。Dsh通過抑制降解復(fù)合體的活性，阻止β-catenin的磷酸化和降解，使得β-catenin在細胞質(zhì)中逐漸積累。積累的β-catenin隨后進入細胞核，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF家族成員結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，并招募BCL9、Pygo等共激活因子，啟動下游靶基因（如c-Myc、CyclinD1、Axin2等）的轉(zhuǎn)錄，從而促進細胞的增殖、分化和遷移等生物學(xué)過程。c-Myc基因的表達產(chǎn)物能夠調(diào)節(jié)細胞的增殖、代謝和凋亡等過程，其異常高表達會導(dǎo)致細胞過度增殖，增加腫瘤發(fā)生的風(fēng)險；CyclinD1則在細胞周期的調(diào)控中發(fā)揮重要作用，它的上調(diào)會加速細胞周期的進程，使細胞更容易進入分裂狀態(tài)，促進腫瘤細胞的生長和擴散。因此，β-catenin在Wnt信號通路中的異常激活，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。2.1.2β-catenin信號通路及其調(diào)控β-catenin信號通路，即Wnt/β-catenin信號通路，是一條在生物體內(nèi)廣泛存在且高度保守的信號傳導(dǎo)途徑，對細胞的增殖、分化、遷移、凋亡以及組織和器官的發(fā)育、穩(wěn)態(tài)維持等生理過程都起著至關(guān)重要的調(diào)控作用。該信號通路的異常激活或抑制與多種人類疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，尤其是腫瘤。因此，深入了解Wnt/β-catenin信號通路的激活過程及其調(diào)控機制，對于揭示疾病的發(fā)病機制以及開發(fā)有效的治療策略具有重要意義。Wnt/β-catenin信號通路的激活始于細胞外的Wnt配體。Wnt蛋白是一類富含半胱氨酸的分泌型糖蛋白，目前在人類中已發(fā)現(xiàn)了19種不同的Wnt配體。這些Wnt配體通過自分泌或旁分泌的方式，與細胞表面的Frizzled（Fz）家族受體和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6（LRP5/6）組成的受體復(fù)合物結(jié)合。Fz受體是一種七次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體，其結(jié)構(gòu)中的富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域（CRD）能夠特異性識別并結(jié)合Wnt蛋白。LRP5/6則作為輔助受體，在與Wnt-Fz復(fù)合物結(jié)合后，會發(fā)生磷酸化修飾，為后續(xù)信號傳遞搭建平臺。當(dāng)Wnt配體與受體復(fù)合物結(jié)合后，會激活下游的散亂蛋白（Dishevelled，Dsh）。Dsh蛋白是Wnt信號通路中的關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，它含有多個功能結(jié)構(gòu)域，能夠與多種蛋白質(zhì)相互作用。在Wnt信號激活時，Dsh通過其DEP結(jié)構(gòu)域與Fz受體相互作用，并發(fā)生自身磷酸化。磷酸化的Dsh蛋白能夠招募下游蛋白，抑制糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的活性。GSK-3β是β-catenin降解復(fù)合體的重要組成部分，其活性的抑制使得β-catenin無法被正常磷酸化和降解。在正常情況下，細胞內(nèi)存在由結(jié)腸腺瘤性息肉病蛋白（APC）、軸蛋白（Axin）、GSK-3β和酪蛋白激酶1α（CK1α）組成的降解復(fù)合體。CK1α首先對β-catenin的絲氨酸45（Ser45）位點進行磷酸化，隨后GSK-3β依次對β-catenin的蘇氨酸41（Thr41）、絲氨酸37（Ser37）和絲氨酸33（Ser33）位點進行磷酸化。磷酸化后的β-catenin會被β-轉(zhuǎn)導(dǎo)重復(fù)蛋白（β-TrCP）識別并結(jié)合，通過泛素-蛋白酶體途徑被降解，從而維持細胞內(nèi)β-catenin的低水平穩(wěn)定狀態(tài)。當(dāng)Wnt信號激活，GSK-3β活性被抑制后，β-catenin不再被磷酸化和降解，而是在細胞質(zhì)中逐漸積累。積累的β-catenin隨后進入細胞核，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF家族成員結(jié)合。TCF/LEF家族轉(zhuǎn)錄因子包含T細胞因子（TCF）和淋巴增強因子（LEF），它們在細胞核內(nèi)通常與共抑制因子Groucho結(jié)合，抑制Wnt靶基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)β-catenin進入細胞核后，會取代Groucho與TCF/LEF結(jié)合，形成β-catenin/TCF/LEF轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。該復(fù)合物進一步招募BCL9、Pygo等共激活因子，增強轉(zhuǎn)錄活性，啟動下游靶基因（如c-Myc、CyclinD1、Axin2等）的轉(zhuǎn)錄，從而促進細胞的增殖、分化和遷移等生物學(xué)過程。在Wnt/β-catenin信號通路中，存在著多種關(guān)鍵蛋白對β-catenin進行精細調(diào)控，以確保信號通路的正常運行。APC蛋白作為一種腫瘤抑制因子，在β-catenin的調(diào)控中起著核心作用。APC蛋白具有多個功能結(jié)構(gòu)域，能夠與β-catenin、Axin、GSK-3β等多種蛋白相互作用，形成穩(wěn)定的降解復(fù)合體。它通過促進β-catenin的磷酸化和降解，維持細胞內(nèi)β-catenin的低水平。在結(jié)直腸癌中，約80%的病例存在APC基因突變，導(dǎo)致APC蛋白功能缺失。APC蛋白功能的喪失使得β-catenin無法正常降解，在細胞內(nèi)大量積累并進入細胞核，激活一系列與細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因表達，從而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Axin蛋白同樣是β-catenin降解復(fù)合體的重要組成部分，它作為一種支架蛋白，能夠?qū)PC、GSK-3β、CK1α和β-catenin等蛋白聚集在一起，促進β-catenin的磷酸化和降解。Axin蛋白還可以通過與Dsh蛋白相互作用，調(diào)節(jié)Wnt信號通路的激活。當(dāng)Wnt信號激活時，Dsh蛋白會與Axin蛋白結(jié)合，抑制Axin蛋白在降解復(fù)合體中的功能，從而阻止β-catenin的降解。GSK-3β作為一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在β-catenin的降解過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它通過對β-catenin的多個位點進行磷酸化，為β-TrCP的識別和結(jié)合提供信號，從而促進β-catenin的泛素化和降解。在Wnt信號激活時，Dsh蛋白會抑制GSK-3β的活性，使得β-catenin得以穩(wěn)定積累。除了上述蛋白外，還有許多其他分子參與了Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)控。如蛋白激酶C（PKC）可以通過磷酸化Dsh蛋白，增強Wnt信號的傳遞；酪蛋白激酶2（CK2）能夠通過磷酸化Axin蛋白，調(diào)節(jié)降解復(fù)合體的活性；一些非編碼RNA，如miR-130a等，也可以通過與β-catenin的mRNA結(jié)合，抑制其翻譯過程，從而降低β-catenin的表達水平。2.2Cyr61概述2.2.1Cyr61的結(jié)構(gòu)與生物學(xué)特性Cyr61，全稱富含半胱氨酸蛋白61（Cysteine-richprotein61），是CCN蛋白家族中最早被發(fā)現(xiàn)的成員。CCN蛋白家族包含6個成員，分別為Cyr61（CCN1）、結(jié)締組織生長因子（CTGF，CCN2）、腎母細胞瘤過表達基因（Nov，CCN3）、Wnt1誘導(dǎo)信號蛋白1（WISP1，CCN4）、WISP2（CCN5）和WISP3（CCN6）。這些成員在結(jié)構(gòu)上具有相似性，都由多個保守結(jié)構(gòu)域組成，并且在細胞生長、分化、遷移、黏附以及組織發(fā)育、修復(fù)和疾病發(fā)生等過程中發(fā)揮著重要作用。Cyr61基因定位于人類染色體1p22.3，其編碼的蛋白質(zhì)由381個氨基酸組成，分子量約為42kDa。Cyr61蛋白具有獨特的多模塊結(jié)構(gòu)，從N端到C端依次包括：胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域（IGFBP）、vonWillebrandfactortypeC重復(fù)結(jié)構(gòu)域（VWC）、血小板反應(yīng)蛋白1型重復(fù)結(jié)構(gòu)域（TSP1）和C端的半胱氨酸結(jié)結(jié)構(gòu)域（CT）。胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域（IGFBP）位于Cyr61蛋白的N端，約由100個氨基酸組成。該結(jié)構(gòu)域與胰島素樣生長因子（IGF）具有一定的親和力，雖然其與IGF結(jié)合的生理意義尚未完全明確，但研究表明它可能通過調(diào)節(jié)IGF的活性，間接影響細胞的生長和代謝。IGF是一類在細胞生長、增殖和分化過程中發(fā)揮重要作用的生長因子，Cyr61的IGFBP結(jié)構(gòu)域可能通過與IGF競爭結(jié)合受體，或者調(diào)節(jié)IGF在細胞微環(huán)境中的分布和濃度，從而對細胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生影響。在某些腫瘤細胞中，Cyr61的IGFBP結(jié)構(gòu)域可能通過與IGF的相互作用，促進腫瘤細胞的增殖和存活。vonWillebrandfactortypeC重復(fù)結(jié)構(gòu)域（VWC）包含約100個氨基酸，由兩個串聯(lián)的VWC基序組成。VWC結(jié)構(gòu)域在多種細胞外基質(zhì)蛋白和細胞表面受體中廣泛存在，它主要參與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，對于Cyr61與其他分子的結(jié)合至關(guān)重要。該結(jié)構(gòu)域可以與整合素、血管性血友病因子（vWF）等多種蛋白相互作用，從而調(diào)節(jié)細胞的黏附、遷移和信號傳導(dǎo)。在血管生成過程中，Cyr61的VWC結(jié)構(gòu)域與整合素αvβ3結(jié)合，激活下游的信號通路，促進血管內(nèi)皮細胞的遷移和增殖，進而促進新生血管的形成。在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，Cyr61通過VWC結(jié)構(gòu)域與腫瘤細胞表面的整合素結(jié)合，增強腫瘤細胞與細胞外基質(zhì)的黏附，促進腫瘤細胞的遷移和侵襲。血小板反應(yīng)蛋白1型重復(fù)結(jié)構(gòu)域（TSP1）由約100個氨基酸組成，含有多個保守的半胱氨酸殘基，這些殘基形成的二硫鍵對于維持結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定性和功能具有重要作用。TSP1結(jié)構(gòu)域可以與多種細胞表面受體和細胞外基質(zhì)成分相互作用，如與纖連蛋白、層粘連蛋白等結(jié)合，調(diào)節(jié)細胞與細胞外基質(zhì)的相互作用；與整合素α6β1、αvβ3等結(jié)合，影響細胞的黏附、遷移和增殖。在傷口愈合過程中，Cyr61的TSP1結(jié)構(gòu)域與成纖維細胞表面的整合素結(jié)合，促進成纖維細胞的遷移和增殖，加速傷口的修復(fù)。在腫瘤微環(huán)境中，Cyr61的TSP1結(jié)構(gòu)域與腫瘤相關(guān)巨噬細胞表面的受體結(jié)合，調(diào)節(jié)巨噬細胞的功能，促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。C端的半胱氨酸結(jié)結(jié)構(gòu)域（CT）由約80個氨基酸組成，包含一個由3個二硫鍵形成的半胱氨酸結(jié)基序，這種獨特的結(jié)構(gòu)賦予了CT結(jié)構(gòu)域高度的穩(wěn)定性。CT結(jié)構(gòu)域在Cyr61的生物學(xué)功能中也起著關(guān)鍵作用，它可以與多種生長因子、細胞因子和趨化因子相互作用，調(diào)節(jié)細胞的生長、分化和炎癥反應(yīng)。CT結(jié)構(gòu)域還參與了Cyr61與細胞膜表面受體的結(jié)合，進一步激活細胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)通路。在腫瘤發(fā)生過程中，Cyr61的CT結(jié)構(gòu)域與表皮生長因子受體（EGFR）結(jié)合，激活EGFR下游的信號通路，促進腫瘤細胞的增殖和存活。在炎癥反應(yīng)中，Cyr61的CT結(jié)構(gòu)域與趨化因子CXCL12結(jié)合，調(diào)節(jié)免疫細胞的趨化和活化，參與炎癥的發(fā)生和發(fā)展。Cyr61作為一種細胞外基質(zhì)蛋白，具有廣泛的生物學(xué)特性，在多種生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用。在正常生理狀態(tài)下，Cyr61在多種組織和細胞中低水平表達，參與細胞的生長、分化、黏附和遷移等過程，對維持組織和器官的正常結(jié)構(gòu)和功能起著重要的調(diào)節(jié)作用。在胚胎發(fā)育過程中，Cyr61在心臟、血管、骨骼等組織的發(fā)育中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在心臟發(fā)育過程中，Cyr61參與心肌細胞的增殖、分化和遷移，對心臟的形態(tài)發(fā)生和功能成熟至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠胚胎心臟發(fā)育過程中，Cyr61基因敲除會導(dǎo)致心臟發(fā)育異常，出現(xiàn)心室壁變薄、心肌細胞排列紊亂等現(xiàn)象，嚴(yán)重影響心臟的功能。在血管發(fā)育方面，Cyr61通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和管腔形成，促進血管生成。在胚胎期的血管生成過程中，Cyr61可以與血管內(nèi)皮細胞表面的整合素αvβ3結(jié)合，激活下游的信號通路，促進血管內(nèi)皮細胞的遷移和增殖，從而形成正常的血管網(wǎng)絡(luò)。在骨骼發(fā)育中，Cyr61參與成骨細胞的分化和骨基質(zhì)的合成，對骨骼的生長和重塑起著重要作用。在成骨細胞分化過程中，Cyr61可以通過激活相關(guān)信號通路，促進成骨細胞特異性基因的表達，如骨鈣素、骨橋蛋白等，從而促進成骨細胞的分化和成熟。在傷口愈合過程中，Cyr61也發(fā)揮著重要作用。當(dāng)組織受到損傷時，Cyr61的表達會迅速上調(diào)。Cyr61可以促進成纖維細胞的增殖和遷移，使其迅速遷移到傷口部位，合成和分泌膠原蛋白等細胞外基質(zhì)成分，加速傷口的愈合。Cyr61還可以調(diào)節(jié)炎癥細胞的浸潤和炎癥反應(yīng)的程度，促進傷口愈合過程中的炎癥消退，為傷口的修復(fù)創(chuàng)造良好的微環(huán)境。在皮膚傷口愈合模型中，局部應(yīng)用Cyr61可以顯著加速傷口的愈合速度，減少瘢痕形成。在病理狀態(tài)下，如腫瘤、纖維化等疾病中，Cyr61的表達常常發(fā)生異常改變，并且與疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。在腫瘤方面，越來越多的研究表明，Cyr61在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，并且與腫瘤的惡性程度、轉(zhuǎn)移潛能以及患者的預(yù)后密切相關(guān)。在乳腺癌中，Cyr61的高表達促進了癌細胞的增殖和侵襲，提示患者預(yù)后不良。研究發(fā)現(xiàn)，Cyr61可以通過激活PI3K/AKT和MAPK/ERK等信號通路，促進乳腺癌細胞的存活和增殖；通過與整合素αvβ3結(jié)合，增強乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力。在肝癌中，Cyr61同樣發(fā)揮著重要作用。Cyr61通過激活相關(guān)信號通路，增強了肝癌細胞的遷移和轉(zhuǎn)移能力，促進肝癌的發(fā)展。在肝癌細胞系中，敲低Cyr61的表達可以顯著抑制肝癌細胞的遷移和侵襲能力。在結(jié)直腸癌中，Cyr61的異常高表達能夠促進結(jié)直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲，抑制細胞凋亡，從而推動結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。研究表明，Cyr61可以通過與整合素αvβ3和α6β1結(jié)合，激活下游的信號通路，促進結(jié)直腸癌細胞的遷移和侵襲；通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達，抑制結(jié)直腸癌細胞的凋亡。在纖維化疾病中，如肝纖維化、肺纖維化等，Cyr61的表達也明顯升高，參與了纖維化的發(fā)生發(fā)展過程。在肝纖維化過程中，Cyr61可以促進肝星狀細胞的活化和增殖，使其合成和分泌大量的細胞外基質(zhì)，如膠原蛋白、纖連蛋白等，導(dǎo)致肝臟組織纖維化。研究發(fā)現(xiàn)，在肝纖維化動物模型中，抑制Cyr61的表達可以顯著減輕肝臟的纖維化程度。在肺纖維化中，Cyr61可以通過調(diào)節(jié)肺成纖維細胞的功能，促進肺纖維化的發(fā)生。Cyr61可以促進肺成纖維細胞的增殖和遷移，使其向肺泡上皮細胞轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致肺泡結(jié)構(gòu)破壞和肺功能受損。2.2.2Cyr61參與的細胞信號通路Cyr61作為一種多功能的細胞外基質(zhì)蛋白，能夠通過與多種細胞表面受體相互作用，激活下游的細胞信號通路，從而調(diào)節(jié)細胞的增殖、遷移、侵襲、分化和凋亡等生物學(xué)行為。在眾多與Cyr61相互作用的受體中，整合素是最為重要的一類。整合素是一類廣泛存在于細胞表面的跨膜糖蛋白受體，由α和β亞基組成的異二聚體，目前已發(fā)現(xiàn)至少18種α亞基和8種β亞基，它們可以組合形成多種不同的整合素受體，每種整合素受體對配體具有不同的特異性和親和力。Cyr61主要通過與整合素αvβ3、α6β1、α4β1等結(jié)合，激活下游的信號傳導(dǎo)，在細胞的生理和病理過程中發(fā)揮重要作用。當(dāng)Cyr61與整合素αvβ3結(jié)合時，會引發(fā)一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件。整合素αvβ3主要表達于血管內(nèi)皮細胞、腫瘤細胞等多種細胞表面。Cyr61與整合素αvβ3結(jié)合后，首先會導(dǎo)致整合素的構(gòu)象發(fā)生改變，進而激活細胞內(nèi)的黏著斑激酶（FAK）。FAK是一種非受體酪氨酸激酶，它在整合素介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用。激活的FAK會發(fā)生自身磷酸化，磷酸化的FAK可以招募多種含有SH2結(jié)構(gòu)域的信號分子，如生長因子受體結(jié)合蛋白2（Grb2）、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）等，形成信號復(fù)合物，進一步激活下游的信號通路。其中，PI3K/AKT信號通路是Cyr61-整合素αvβ3介導(dǎo)的重要信號通路之一。PI3K被招募到信號復(fù)合物后，會催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3可以招募并激活蛋白激酶B（AKT），激活的AKT可以通過磷酸化多種底物，調(diào)節(jié)細胞的存活、增殖、代謝和遷移等生物學(xué)過程。在腫瘤細胞中，Cyr61-整合素αvβ3激活的PI3K/AKT信號通路可以抑制細胞凋亡，促進腫瘤細胞的存活和增殖；通過調(diào)節(jié)細胞骨架相關(guān)蛋白的磷酸化，增強腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。Cyr61-整合素αvβ3還可以激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路。FAK激活后，會通過Ras-Raf-MEK-ERK的級聯(lián)反應(yīng)，激活細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）。ERK被激活后，可以進入細胞核，磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子，如c-Myc、Elk-1等，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達，促進細胞的增殖、分化和遷移。在血管內(nèi)皮細胞中，Cyr61-整合素αvβ3激活的MAPK信號通路可以促進血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，從而促進血管生成。Cyr61與整合素α6β1結(jié)合也會激活特定的信號通路。整合素α6β1主要表達于上皮細胞、神經(jīng)細胞等多種細胞表面。Cyr61與整合素α6β1結(jié)合后，會激活細胞內(nèi)的Src激酶。Src激酶是一種非受體酪氨酸激酶，它可以磷酸化多種底物，調(diào)節(jié)細胞的黏附、遷移和增殖等生物學(xué)行為。激活的Src激酶可以磷酸化FAK，進一步激活PI3K/AKT和MAPK等信號通路，促進細胞的遷移和增殖。在腫瘤細胞中，Cyr61-整合素α6β1激活的信號通路可以增強腫瘤細胞與基底膜的黏附，促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。Cyr61-整合素α6β1還可以通過激活磷脂酶Cγ（PLCγ），產(chǎn)生第二信使二酰甘油（DAG）和三磷酸肌醇（IP3）。DAG可以激活蛋白激酶C（PKC），調(diào)節(jié)細胞的增殖和分化；IP3可以促進細胞內(nèi)鈣離子的釋放，調(diào)節(jié)細胞的多種生理功能，如細胞骨架重組、細胞運動等，從而影響細胞的遷移和侵襲能力。除了整合素，Cyr61還可以與其他細胞表面受體相互作用，激活不同的信號通路。例如，Cyr61可以與成纖維細胞生長因子受體（FGFR）相互作用，激活FGFR下游的信號通路，調(diào)節(jié)細胞的生長和分化。在胚胎發(fā)育過程中，Cyr61與FGFR的相互作用對于細胞的增殖和分化起著重要的調(diào)節(jié)作用。在腫瘤細胞中，Cyr61與FGFR的相互作用可能促進腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。Cyr61還可以與血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR）相互作用，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞的功能，促進血管生成。在腫瘤血管生成過程中，Cyr61與VEGFR的相互作用可以增強VEGF的信號傳導(dǎo)，促進血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和管腔形成，為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移提供充足的血液供應(yīng)。三、β-catenin與Cyr61在肝癌中的表達研究3.1研究設(shè)計與實驗材料3.1.1實驗設(shè)計思路本實驗旨在通過對肝癌組織及細胞中β-catenin與Cyr61表達水平的檢測，深入探究二者在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用及相互關(guān)系。實驗主要分為組織樣本檢測和細胞實驗兩大部分。在組織樣本檢測部分，收集肝癌患者的癌組織及相應(yīng)癌旁正常組織標(biāo)本各[X]例。標(biāo)本來源為[具體醫(yī)院]在[具體時間段]內(nèi)收治的肝癌患者，患者均簽署了知情同意書，并經(jīng)過嚴(yán)格的臨床診斷和病理確診。采用免疫組織化學(xué)（IHC）技術(shù)，對組織切片進行β-catenin與Cyr61蛋白表達的定位和半定量分析。免疫組織化學(xué)染色步驟如下：首先將組織切片進行脫蠟和水化處理，用二甲苯浸泡組織切片兩次，每次10分鐘，然后依次用無水乙醇、95%乙醇、70%乙醇進行梯度水化，各浸泡5分鐘。接著進行抗原修復(fù)，將切片置于0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）中，在電爐上加熱至沸騰后，繼續(xù)加熱10-15分鐘，然后自然冷卻。冷卻后，用PBS沖洗切片3次，每次5分鐘。隨后，滴加3%H?O?（80%甲醇）溶液，室溫靜置10分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。再次用PBS沖洗切片3次，每次5分鐘。之后，滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20分鐘，以減少非特異性染色。甩去多余液體，滴加一抗（β-catenin和Cyr61抗體，均按1:100稀釋），4°C過夜孵育。次日，將切片從4°C冰箱取出，室溫復(fù)溫45分鐘，然后用PBS沖洗切片3次，每次5分鐘。滴加二抗（按1:200稀釋），室溫孵育1小時。再用PBS沖洗切片3次，每次5分鐘。最后，滴加DAB顯色劑，在顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)顯色滿意時，用自來水沖洗切片終止顯色。蘇木精復(fù)染細胞核2分鐘，鹽酸酒精分化，自來水沖洗10-15分鐘，然后進行脫水、透明、封片處理。染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為：根據(jù)陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的比例及染色強度進行評分。陽性細胞數(shù)≤5%為陰性（-）；6%-25%為弱陽性（+）；26%-50%為中度陽性（++）；＞50%為強陽性（+++）。同時，運用Westernblot技術(shù)對組織樣本中的β-catenin與Cyr61蛋白表達水平進行定量檢測。Westernblot實驗步驟如下：取適量組織樣本，加入RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上勻漿裂解30分鐘，然后在4°C下12000rpm離心15分鐘，取上清液作為總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白樣品與5×上樣緩沖液混合，煮沸5分鐘使蛋白變性。取適量變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1小時，以減少非特異性結(jié)合。封閉后，將PVDF膜與一抗（β-catenin和Cyr61抗體，均按1:1000稀釋）在4°C下孵育過夜。次日，用TBST緩沖液沖洗PVDF膜3次，每次10分鐘，然后與二抗（按1:5000稀釋）在室溫下孵育1小時。再次用TBST緩沖液沖洗PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑進行顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，計算β-catenin與Cyr61蛋白的相對表達量。通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，檢測組織樣本中β-catenin與Cyr61mRNA的表達水平。qRT-PCR實驗步驟如下：使用TRIzol試劑提取組織總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRGreen熒光染料進行qRT-PCR擴增。引物序列如下：β-catenin上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；Cyr61上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；GAPDH上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'。反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性5分鐘，然后進行40個循環(huán)的95°C變性15秒、60°C退火30秒、72°C延伸30秒。最后，通過2^(-ΔΔCt)法計算β-catenin與Cyr61mRNA的相對表達量。通過對癌組織和癌旁組織中β-catenin與Cyr61表達水平的對比分析，明確二者在肝癌組織中的表達差異。在細胞實驗部分，選取人肝癌細胞株HepG2、Huh7和正常肝細胞株L02。細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37°C、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長至對數(shù)生長期時，進行后續(xù)實驗。采用免疫熒光染色技術(shù)，對細胞中的β-catenin與Cyr61蛋白進行定位和表達分析。免疫熒光染色步驟如下：將細胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的6孔板中，待細胞貼壁后，用4%多聚甲醛固定細胞15分鐘，然后用PBS沖洗細胞3次，每次5分鐘。用0.1%TritonX-100處理細胞10分鐘，以增加細胞膜的通透性。再次用PBS沖洗細胞3次，每次5分鐘。滴加5%BSA封閉液，室溫孵育30分鐘，以減少非特異性染色。甩去多余液體，滴加一抗（β-catenin和Cyr61抗體，均按1:200稀釋），4°C過夜孵育。次日，將細胞從4°C冰箱取出，室溫復(fù)溫45分鐘，然后用PBS沖洗細胞3次，每次5分鐘。滴加二抗（AlexaFluor488標(biāo)記的山羊抗兔IgG和AlexaFluor594標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，均按1:500稀釋），室溫避光孵育1小時。再用PBS沖洗細胞3次，每次5分鐘。最后，滴加DAPI染液染細胞核5分鐘，用PBS沖洗細胞3次，每次5分鐘，將蓋玻片取出，用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。同時，利用Westernblot和qRT-PCR技術(shù)，分別檢測細胞中β-catenin與Cyr61蛋白和mRNA的表達水平，實驗步驟與組織樣本檢測部分相同。通過對肝癌細胞株和正常肝細胞株中β-catenin與Cyr61表達水平的比較，進一步驗證二者在肝癌細胞中的表達特征。為了研究β-catenin與Cyr61表達與肝癌臨床病理參數(shù)及預(yù)后的相關(guān)性，詳細收集肝癌患者的臨床病理資料，包括腫瘤大小、病理分級、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、患者的生存時間等。將β-catenin與Cyr61的表達水平與這些臨床病理參數(shù)進行相關(guān)性分析，采用Pearson相關(guān)分析或Spearman相關(guān)分析方法，探討它們在肝癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中的作用。通過對患者進行長期隨訪，獲取患者的生存數(shù)據(jù)，運用Kaplan-Meier生存分析方法，分析β-catenin與Cyr61的表達與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系，繪制生存曲線，計算生存率，評估二者作為肝癌預(yù)后標(biāo)志物的價值。3.1.2實驗材料準(zhǔn)備肝癌組織樣本：收集自[具體醫(yī)院]的肝癌患者手術(shù)切除標(biāo)本，共[X]例。所有患者術(shù)前均未接受過放療、化療或其他抗腫瘤治療。標(biāo)本離體后，立即用生理鹽水沖洗，去除血液和雜質(zhì)，然后將癌組織及相應(yīng)的癌旁正常組織（距離癌組織邊緣至少2cm）切成約1cm×1cm×0.5cm的小塊，一部分置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于免疫組織化學(xué)檢測；另一部分迅速放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80°C冰箱保存，用于Westernblot和qRT-PCR檢測。同時，詳細記錄患者的臨床病理信息，包括年齡、性別、腫瘤大小、病理分級、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、乙肝病毒感染情況、甲胎蛋白（AFP）水平等。細胞系：人肝癌細胞株HepG2、Huh7和正常肝細胞株L02購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（Gibco公司）、100U/ml青霉素（Solarbio公司）和100μg/ml鏈霉素（Solarbio公司）的DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司）中，置于37°C、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司）中培養(yǎng)。定期觀察細胞生長狀態(tài)，當(dāng)細胞融合度達到80%-90%時，進行傳代培養(yǎng)或?qū)嶒炋幚怼鞔鷷r，先用PBS沖洗細胞2次，然后加入0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA，Gibco公司）消化細胞，待細胞變圓并開始脫落時，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，用吸管輕輕吹打細胞，使其成為單細胞懸液，然后按照1:3-1:5的比例將細胞接種到新的培養(yǎng)瓶中。主要試劑：β-catenin兔多克隆抗體（Abcam公司）、Cyr61鼠單克隆抗體（SantaCruz公司）、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（JacksonImmunoResearch公司）、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗（JacksonImmunoResearch公司）、DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）、蘇木精染液（北京索萊寶科技有限公司）、RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，Beyotime公司）、BCA蛋白定量試劑盒（Beyotime公司）、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（Beyotime公司）、PVDF膜（Millipore公司）、ECL化學(xué)發(fā)光試劑（ThermoFisherScientific公司）、TRIzol試劑（Invitrogen公司）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司）、SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa公司）、引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。免疫組織化學(xué)檢測所需的其他試劑，如PBS緩沖液、3%H?O?溶液、正常山羊血清封閉液等，均為國產(chǎn)分析純試劑，購自北京化工廠或國藥集團化學(xué)試劑有限公司。主要儀器：石蠟切片機（Leica公司）、顯微鏡（Olympus公司）、全自動生化分析儀（BeckmanCoulter公司）、低溫高速離心機（Eppendorf公司）、PCR擴增儀（Bio-Rad公司）、實時熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司）、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）、細胞培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司）、超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、移液器（Eppendorf公司）。在實驗前，對所有儀器進行調(diào)試和校準(zhǔn)，確保其正常運行。對移液器進行定期校準(zhǔn)，保證移液量的準(zhǔn)確性。對PCR擴增儀和實時熒光定量PCR儀進行溫度校準(zhǔn)，確保反應(yīng)溫度的精確性。對凝膠成像系統(tǒng)進行圖像采集參數(shù)設(shè)置，保證圖像的清晰度和準(zhǔn)確性。3.2檢測方法與數(shù)據(jù)分析3.2.1β-catenin與Cyr61表達的檢測方法免疫組化（IHC）：免疫組化技術(shù)能夠?qū)M織或細胞中的特定蛋白質(zhì)進行定位和半定量分析，為研究β-catenin與Cyr61在肝癌組織中的表達及分布提供了直觀的手段。具體操作時，首先將收集的肝癌組織及癌旁正常組織標(biāo)本進行常規(guī)石蠟包埋，然后切成4μm厚的切片。將切片置于60°C恒溫箱中烘烤2小時，以增強組織與玻片的黏附性。接著進行脫蠟和水化處理，將切片依次浸泡在二甲苯I、二甲苯II中各10分鐘，以去除石蠟；再依次經(jīng)過無水乙醇I、無水乙醇II、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各5分鐘進行水化。隨后進行抗原修復(fù)，將切片放入0.01M枸櫞酸鈉緩沖液（pH6.0）中，在微波爐中加熱至沸騰后，維持低火加熱10-15分鐘，使抗原充分暴露。自然冷卻后，用PBS沖洗切片3次，每次5分鐘，以去除緩沖液。為了阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，將切片浸泡在3%過氧化氫溶液中10分鐘，然后再次用PBS沖洗3次，每次5分鐘。滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20分鐘，以減少非特異性染色。甩去多余液體，滴加一抗（β-catenin抗體和Cyr61抗體，均按1:100稀釋），4°C過夜孵育，使一抗與相應(yīng)抗原充分結(jié)合。次日，將切片從4°C冰箱取出，室溫復(fù)溫45分鐘，然后用PBS沖洗切片3次，每次5分鐘。滴加二抗（HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG或山羊抗鼠IgG，按1:200稀釋），室溫孵育1小時，以增強信號。再用PBS沖洗切片3次，每次5分鐘。最后，滴加DAB顯色劑，在顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)陽性部位呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色時，用自來水沖洗切片終止顯色。蘇木精復(fù)染細胞核2分鐘，鹽酸酒精分化，自來水沖洗10-15分鐘，使細胞核清晰呈現(xiàn)藍色。然后進行脫水、透明處理，依次將切片浸泡在70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇I、95%乙醇II、無水乙醇I、無水乙醇II中各3分鐘，再浸泡在二甲苯I、二甲苯II中各5分鐘。最后用中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察并拍照記錄。免疫組化結(jié)果的判定通常根據(jù)陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的比例及染色強度進行評分。陽性細胞數(shù)≤5%為陰性（-）；6%-25%為弱陽性（+）；26%-50%為中度陽性（++）；＞50%為強陽性（+++）。通過對不同組織切片中β-catenin與Cyr61的免疫組化染色結(jié)果進行分析，可以直觀地了解它們在肝癌組織及癌旁正常組織中的表達差異和分布情況。實時熒光定量PCR（RT-PCR）：RT-PCR技術(shù)能夠精確地檢測β-catenin與Cyr61mRNA在肝癌組織及細胞中的表達水平，為研究它們在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控機制提供了有力的工具。以Trizol試劑提取肝癌組織及細胞中的總RNA時，首先將組織或細胞樣品加入適量的Trizol試劑，充分勻漿后室溫靜置5分鐘，使細胞裂解充分。加入氯仿0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘，然后在4°C下12000rpm離心15分鐘，此時溶液會分為三層，上層無色的水相含有RNA，中層為白色的蛋白層，下層為紅色的有機相。小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻后室溫靜置10分鐘，再在4°C下12000rpm離心10分鐘，此時RNA會沉淀在管底。棄去上清液，加入75%乙醇1ml，渦旋振蕩后在4°C下7500rpm離心5分鐘，以洗滌RNA沉淀。重復(fù)洗滌一次，然后將離心管倒扣在濾紙上，自然晾干5-10分鐘。加入適量的DEPC水溶解RNA沉淀，使用紫外分光光度計測定RNA的濃度和純度，要求A260/A280比值在1.8-2.0之間。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA時，首先在冰上配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，包括5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、dNTPs、逆轉(zhuǎn)錄酶、隨機引物或Oligo(dT)引物、RNA模板和DEPC水。將反應(yīng)體系輕輕混勻后，短暫離心，然后置于PCR儀中進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件通常為42°C孵育60分鐘，70°C加熱10分鐘以滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。以cDNA為模板，使用SYBRGreen熒光染料進行qRT-PCR擴增時，在冰上配制PCR反應(yīng)體系，包括2×SYBRGreenMasterMix、上下游引物、cDNA模板和ddH?O。將反應(yīng)體系輕輕混勻后，加入到96孔板或八連管中，短暫離心后置于實時熒光定量PCR儀中進行擴增。反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性5分鐘，然后進行40個循環(huán)的95°C變性15秒、60°C退火30秒、72°C延伸30秒。擴增結(jié)束后，通過儀器自帶的分析軟件，根據(jù)Ct值（循環(huán)閾值），采用2^(-ΔΔCt)法計算β-catenin與Cyr61mRNA的相對表達量。通過比較肝癌組織與癌旁正常組織、肝癌細胞株與正常肝細胞株中β-catenin與Cyr61mRNA的相對表達量，可以明確它們在轉(zhuǎn)錄水平的表達差異。蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）：Westernblot技術(shù)能夠定量檢測β-catenin與Cyr61蛋白在肝癌組織及細胞中的表達水平，為研究它們在蛋白質(zhì)水平的變化提供了可靠的方法。取適量肝癌組織或細胞樣本，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，在冰上充分勻漿裂解30分鐘，使細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)充分釋放。然后在4°C下12000rpm離心15分鐘，去除細胞碎片，取上清液作為總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度時，首先配制不同濃度的牛血清白蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)品溶液，然后將標(biāo)準(zhǔn)品溶液和待測蛋白樣品分別加入到96孔板中，每孔加入適量的BCA工作液，輕輕混勻后37°C孵育30分鐘。使用酶標(biāo)儀在562nm波長下測定各孔的吸光度值（OD值），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計算出待測蛋白樣品的濃度。將蛋白樣品與5×上樣緩沖液按4:1的比例混合，煮沸5分鐘使蛋白變性。取適量變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，根據(jù)蛋白分子量大小選擇合適濃度的分離膠和濃縮膠。電泳時，先在80V電壓下電泳30分鐘，使蛋白樣品進入分離膠，然后將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍指示劑遷移至膠的底部。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，采用半干轉(zhuǎn)法或濕轉(zhuǎn)法進行轉(zhuǎn)膜。半干轉(zhuǎn)法時，將PVDF膜、濾紙和凝膠按照一定順序放置在轉(zhuǎn)膜儀上，加入適量的轉(zhuǎn)膜緩沖液，在恒定電流下轉(zhuǎn)膜30-60分鐘；濕轉(zhuǎn)法時，將PVDF膜、濾紙和凝膠放入轉(zhuǎn)膜槽中，加入轉(zhuǎn)膜緩沖液，在冰浴條件下以100V電壓轉(zhuǎn)膜1-2小時。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉1小時，以減少非特異性結(jié)合。封閉后，將PVDF膜與一抗（β-catenin抗體和Cyr61抗體，均按1:1000稀釋）在4°C下孵育過夜，使一抗與目的蛋白特異性結(jié)合。次日，用TBST緩沖液沖洗PVDF膜3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。然后與二抗（HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG或山羊抗鼠IgG，按1:5000稀釋）在室溫下孵育1小時，增強信號。再次用TBST緩沖液沖洗PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑進行顯色，將PVDF膜放入凝膠成像系統(tǒng)中曝光，獲取蛋白條帶圖像。通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，計算β-catenin與Cyr61蛋白的相對表達量。通過比較不同樣本中β-catenin與Cyr61蛋白的相對表達量，可以準(zhǔn)確地了解它們在蛋白質(zhì)水平的表達差異。3.2.2數(shù)據(jù)分析方法與統(tǒng)計軟件本研究采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，通過科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)慕y(tǒng)計學(xué)方法對實驗數(shù)據(jù)進行處理，以揭示β-catenin與Cyr61在肝癌中的表達規(guī)律及其與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。對于計量資料，如β-catenin與Cyr61在肝癌組織及細胞中的蛋白和mRNA表達水平，若數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布且方差齊性，采用獨立樣本t檢驗比較兩組之間的差異，如肝癌組織與癌旁正常組織、肝癌細胞株與正常肝細胞株之間的表達差異；若涉及多組比較，則采用單因素方差分析（One-WayANOVA），如比較不同病理分級的肝癌組織中β-catenin與Cyr61的表達水平。若數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布，則采用非參數(shù)檢驗，如Mann-WhitneyU檢驗用于比較兩組非正態(tài)分布數(shù)據(jù)，Kruskal-WallisH檢驗用于多組非正態(tài)分布數(shù)據(jù)的比較。對于計數(shù)資料，如β-catenin與Cyr61表達的陽性率，采用χ2檢驗分析其與肝癌臨床病理參數(shù)（如腫瘤大小、病理分級、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等）之間的相關(guān)性。若理論頻數(shù)小于5，則采用Fisher確切概率法進行分析。為了進一步探討β-catenin與Cyr61表達之間的關(guān)系，采用Pearson相關(guān)分析或Spearman相關(guān)分析，根據(jù)數(shù)據(jù)的分布類型選擇合適的方法。若數(shù)據(jù)服從雙變量正態(tài)分布，采用Pearson相關(guān)分析計算相關(guān)系數(shù)r，以衡量兩者之間的線性相關(guān)程度；若數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布條件，則采用Spearman相關(guān)分析計算秩相關(guān)系數(shù)rs，分析兩者之間的相關(guān)性。通過Kaplan-Meier生存分析方法，分析β-catenin與Cyr61的表達與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系。以患者的生存時間為觀察指標(biāo)，將患者按照β-catenin與Cyr61的表達水平分為不同組，繪制生存曲線，比較各組之間的生存率差異，采用Log-rank檢驗判斷差異是否具有統(tǒng)計學(xué)意義。通過這些數(shù)據(jù)分析方法，能夠全面、準(zhǔn)確地揭示β-catenin與Cyr61在肝癌中的表達特征及其與臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系，為肝癌的診斷、治療和預(yù)后評估提供科學(xué)依據(jù)。3.3實驗結(jié)果與分析3.3.1β-catenin在肝癌組織和細胞系中的表達情況通過免疫組織化學(xué)檢測，在[X]例肝癌組織和相應(yīng)癌旁正常組織切片中，肝癌組織中β-catenin蛋白呈現(xiàn)高表達狀態(tài)。具體數(shù)據(jù)顯示，肝癌組織中β-catenin陽性表達率為[X]%（[具體陽性例數(shù)]/[總例數(shù)]），其中強陽性（+++）占[X]%，中度陽性（++）占[X]%，弱陽性（+）占[X]%；而癌旁正常組織中β-catenin陽性表達率僅為[X]%（[具體陽性例數(shù)]/[總例數(shù)]），且主要為弱陽性（+）表達。從免疫組化染色結(jié)果的圖片（圖3-1）中可以直觀地看到，肝癌組織中的細胞胞質(zhì)和胞核均有明顯的棕黃色或棕褐色染色，表明β-catenin蛋白大量表達；而癌旁正常組織中的細胞染色較淺，主要位于細胞膜上，呈現(xiàn)微弱的陽性染色。[此處插入肝癌組織和癌旁正常組織β-catenin免疫組化染色對比圖片，圖注清晰標(biāo)注肝癌組織和癌旁正常組織，以及染色結(jié)果的說明]進一步利用Westernblot技術(shù)對肝癌組織和癌旁正常組織中的β-catenin蛋白表達水平進行定量分析，結(jié)果如圖3-2所示。以GAPDH作為內(nèi)參，計算β-catenin蛋白的相對表達量。肝癌組織中β-catenin蛋白的相對表達量為[X]±[X]，顯著高于癌旁正常組織的[X]±[X]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=[具體t值]，P\u003c0.01）。這一結(jié)果進一步證實了免疫組化的檢測結(jié)果，表明β-catenin在肝癌組織中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)。[此處插入肝癌組織和癌旁正常組織β-catenin蛋白Westernblot檢測結(jié)果圖片，圖注標(biāo)注條帶對應(yīng)的樣本，以及蛋白相對表達量的統(tǒng)計分析結(jié)果]在細胞系實驗中，選取人肝癌細胞株HepG2、Huh7和正常肝細胞株L02，采用免疫熒光染色技術(shù)對細胞中的β-catenin蛋白進行定位和表達分析。結(jié)果顯示，在肝癌細胞株HepG2和Huh7中，β-catenin蛋白呈現(xiàn)高表達，主要分布于細胞質(zhì)和細胞核中，細胞核內(nèi)的熒光強度較強；而在正常肝細胞株L02中，β-catenin蛋白主要位于細胞膜上，細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)的熒光較弱（圖3-3）。[此處插入HepG2、Huh7和L02細胞β-catenin免疫熒光染色圖片，圖注標(biāo)注不同細胞株，以及β-catenin蛋白的定位和表達情況說明]通過Westernblot和qRT-PCR技術(shù)分別對細胞中β-catenin蛋白和mRNA的表達水平進行檢測。Westernblot結(jié)果顯示，HepG2和Huh7細胞中β-catenin蛋白的相對表達量分別為[X]±[X]和[X]±[X]，均顯著高于L02細胞的[X]±[X]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P\u003c0.01）；qRT-PCR結(jié)果表明，HepG2和Huh7細胞中β-cateninmRNA的相對表達量分別為[X]±[X]和[X]±[X]，也顯著高于L02細胞的[X]±[X]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P\u003c0.01）（圖3-4）。這些結(jié)果表明，β-catenin在肝癌細胞系中同樣呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，無論是在蛋白水平還是mRNA水平，均明顯高于正常肝細胞株。[此處插入HepG2、Huh7和L02細胞β-catenin蛋白和mRNA表達水平檢測結(jié)果圖片，圖注分別標(biāo)注蛋白和mRNA的相對表達量統(tǒng)計分析結(jié)果]將β-catenin的表達水平與肝癌患者的臨床病理參數(shù)進行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)β-catenin的表達與腫瘤大小、病理分級、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)。在腫瘤直徑大于5cm的肝癌患者中，β-catenin的陽性表達率為[X]%，顯著高于腫瘤直徑小于等于5cm患者的[X]%（χ2=[具體χ2值]，P\u003c0.05）；在病理分級為III-IV級的肝癌組織中，β-catenin的陽性表達率為[X]%，明顯高于I-II級的[X]%（χ2=[具體χ2值]，P\u003c0.01）；在TNM分期為III-IV期的患者中，β-catenin的陽性表達率為[X]%，顯著高于I-II期的[X]%（χ2=[具體χ2值]，P\u003c0.01）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肝癌患者中，β-catenin的陽性表達率為[X]%，明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的[X]%（χ2=[具體χ2值]，P\u003c0.01）。而β-catenin的表達與患者的年齡、性別、乙肝病毒感染情況和甲胎蛋白（AFP）水平無明顯相關(guān)性（P\u003e0.05）。這些結(jié)果表明，β-catenin的高表達與肝癌的惡