II

DB21/T3692—2023

藍莓常見品種鑒定技術規(guī)程

SSR分子標記法

1范圍

本文件規(guī)定了利用簡單重復序列（Simplesequencerepeats，SSR）分子標記法對12個常見藍莓品種，

進行鑒定過程中樣品準備、DNA提取、DNA質量檢測、PCR擴增、PCR產物檢測等方面的技術要求。

本文件適用于SSR分子標記技術構建12個常見藍莓品種DNA指紋圖譜過程中DNA分子數(shù)據(jù)采集和

鑒別。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

LY/T2426棗品種鑒定技術規(guī)程SSR分子標記法

3術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

3.1

聚合酶鏈式反應PCRpolymerasechainreaction

聚合酶鏈反應（polymerasechainreaction，PCR)，是以DNA為模板，在DNA聚合酶、引物、dNTP

的共同作用下使目標片段擴增并用于檢測分析。

3.2

SSR標記simplesequencerpeatsmarker

由幾個核苷酸（一般為1~6個）為重復單位組成的長達幾十個核苷酸的串聯(lián)重復序列。

3.3

核心引物coreprimers

擴增產物具有高度的穩(wěn)定性和一致性，并具有較強的鑒別能力，可以用于進行12個藍莓常見品種比

對的人工合成引物。

3.4

SSR指紋圖譜SSRfingerprint

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利用SSR核心引物，對不同的藍莓品種進行PCR擴增，根據(jù)不同品種在DNA水平上的差異，利用聚

丙烯酰胺凝膠電泳技術，獲得的具有差異片段的成像圖，并通過引物結合字母標記法對不同的藍莓品種

進行特異性標記。

4試驗準備

4.1儀器與試劑

儀器與試劑詳見附錄A。

4.2溶液配制

溶液配制方法詳見附錄B，其中試劑配制所用水應符合GB/T6682規(guī)定的一級水的要求，其中銀染、

顯色溶液的配制可以使用符合三級水的要求。

4.3核心引物

核心引物信息詳見附錄C。

5操作程序

5.1樣品準備

選取藍莓新鮮葉片，-20℃運輸，-80℃進行長期保存。

5.2DNA提取

對于采集的新鮮嫩葉，使用試劑盒（TIANGEN）進行DNA提取。操作步驟如下：

a)處理材料：取植物新鮮葉片20mg，加入液氮充分碾磨后轉移至1.5mL離心管中，加入400μL

緩沖液（LP2）和6μLRNaseA(10mg/mL)，漩渦震蕩1min，室溫放置10min；

b)加入130μL緩沖液（LP2），充分混勻，漩渦震蕩1min；

c)12,000rpm(~13,400×g)離心5min，將上清液移至新的離心管中；

d)加入1.5倍體積的緩沖液（LP3）（例如500μL的上清液加750μL緩沖液（LP3）），立即充

分振蕩混勻15s。此時會出現(xiàn)絮狀沉淀；

e)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱（CB3）中（吸附柱放入收集管中），12,000

rpm(~13,400×g)離心30s，倒掉廢液，吸附柱（CB3）放入收集管中；

f)向吸附柱（CB3）中加入600μL漂洗液（PW）（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），12,000

rpm(~13,400×g)離心30s，倒掉廢液，吸附柱（CB3）放入收集管中；

g)重復操作步驟f；

h)將吸附柱（CB3）放回收集管中，12,000rpm(~13,400×g)離心2min，倒掉廢液。將吸附柱（CB3）

置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；

i)將吸附柱(CB3)轉入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50μL-200μL洗脫緩

沖液（TE），室溫放置2min-5min，12,000rpm(~13,400×g)離心2min，將溶液收集到離心

管中，以待檢測。

5.3DNA質量檢測

5.3.1瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA

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取1μL提取的DNA原液，在100V的電壓下，用0.8%的瓊脂糖凝膠進行電泳20min左右，取出凝膠，

在紫外凝膠成像系統(tǒng)上觀察電泳條帶應單一、無拖尾。

5.3.2鑒定DNA的濃度和質量

吸取1.5μL提取的DNA原液，通過NanoDrop檢測DNA濃度和是否有RNA、蛋白質或酚污染，純凈

樣品DNAOD260/OD280的比值應在1.7-1.9之間。

5.4PCR擴增

5.4.1反應體系

SSR的反應體系：正反向引物（10μmol/L）各1μL、2×TaqPCRMasterMix8μL、模板100ng、

添加滅菌超純水至20μL。所使用的SSR引物根據(jù)已公布的藍莓品種Drapper基因組自主研發(fā)獲得。

5.4.2反應程序

94℃預變性10min，94℃變性40s，退火70s（具體退火溫度根據(jù)引物來定，詳見附錄C），72℃

延伸2min，35個循環(huán)，72℃延伸10min。

5.5PCR產物檢測

擴增產物用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測，通過掃描儀進行拍照，用人工讀帶和字母數(shù)字結合

的方法進行分析。

5.5.1凝膠制備

將洗凈晾干的玻璃板用水平灌膠的方式組裝玻璃板，鐵夾固定，取8mL5×TBE，16mL30%丙

烯酰胺，15mL去離子水于燒杯中，加入0.28mL的10%APS，14μL的TEMED(每100mL聚丙烯酰胺加

35μLTEMED)（參考LY/T2426的方法進行凝膠制備），混勻灌入板中，插入梳子，等待聚合，拔出梳

子，吸取多余的水，裝板。

5.5.2點樣

用微量移液器取3μL-5μL（具體數(shù)值依據(jù)點樣孔大小確定）PCR產物加入樣品槽，每加一個樣品后，

在電泳液中吸打清洗移液器兩次，最后加入marker用于區(qū)分不同大小的條帶。

5.5.3電泳

加樣完畢后，加入電極緩沖液，上槽電極緩沖液要沒過矮玻璃板，下槽電極緩沖液要沒過玻璃板下

方邊緣，將電源線正極接下槽，負極接上槽。電壓為120V，根據(jù)指示劑位置調整時間，電泳到樣品與

marker到達膠板的末端處時停止電泳，電泳時間約為2h。

5.5.4銀染顯色

a)玻璃板的分離：電泳結束之后，小心地將長、短玻璃分開；

b)固定膠：將粘在一起的聚丙烯酰胺的長玻璃板放入塑料淺盤中，加入固定液，將玻璃板在搖

床上緩慢搖動20min或至電泳示蹤液消失。凝膠可在固定液中靜止過夜；

c)染色：將凝膠浸入染色液中并在搖床上緩慢搖動20min；

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d)顯色反應：將凝膠浸入蒸餾水中，清洗兩次，每次10s，然后取出，瀝干水分，立即放入盛有

預冷顯色液的塑料盤中，并于搖床上緩慢搖動持續(xù)顯色，直至全部條帶出現(xiàn)；

e)洗膠：用蒸餾水漂洗凝膠兩次，每次2min；

f)干膠：通過熱對流或室溫放置，使膠變干，然后在淺色的背景下掃描照相。

5.5.5成像

銀染結果于凝膠成像儀上進行觀察拍照。

6品種鑒定

6.1指紋圖譜的構建

在選取的12個常見藍莓品種中，對4對核心引物SSR1007、SSR1153、SSR1183、SSR160在12個藍

莓品種中的擴增結果進行記錄，擴增結果見附錄E。每對引物只分析目標條帶附近的擴增位點，按照電

泳圖中從上到下依次命名為A、B、C、D等，將其整理為數(shù)字指紋圖譜，圖譜見附錄F。

6.2品種鑒定

將需要進行品種鑒定的材料根據(jù)操作程序進行樣品準備、DNA提取、DNA質量檢測、PCR擴增與

PCR產物檢測，將統(tǒng)計得到的條帶情況與前期構建的指紋圖譜進行比對，得到與指紋圖譜中一致的品種，

認定為“疑似相同品種”，結合田間表型鑒定，對于需要鑒定的材料進行品種鑒定，并出具鑒定報告，

鑒定報告見附錄G。

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附錄A

（規(guī)范性）

儀器設備與化學試劑

A.1儀器設備

高壓滅菌鍋（105℃～136℃，最大工作壓力0.22MPa）；凝膠自動掃描儀（400百萬像素）；高

速冷凍離心機（最大離心力不小于15000g）；PCR擴增儀（0℃～100℃）；多功能酶標儀；恒溫水

浴鍋（室溫～99℃）；電子天平（最小顯示0.0001g）；電泳儀；垂直電泳槽（樣品通量1.0mm厚）；

磁力攪拌器（0r/min～2500r/min，室溫～100℃）；酸度計（-2.00～20.000pH）；微量移液器（2μL、

10μL、100μL、200μL、500μL和1000μL）。

A.2化學試劑

TIANGEN新型植物基因組DNA試劑盒、液氮、無水乙醇、瓊脂糖、GoldView染料、6×loading

buffer、冰乙酸、瓊脂糖、2000bpDNALadder、100bpDNALadder、2*TaqPCRMasterMix、乙二胺

四乙酸（EDTA）、三羥基甲基氨甲烷（Tris）、丙烯酰胺、亞甲雙丙烯酰胺、四甲基乙二胺（TEMED）、

過硫酸銨（APS）、硝酸銀（AgNO3）、氫氧化鈉（NaOH）、37%甲醛、SSR引物、滅菌超純水。除特

殊說明外，所用試劑均為分析純試劑。

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附錄B

（規(guī)范性）

溶液配制

B.1配制1mol/LNaOH

稱取4gNaOH，加水定容至100mL。

B.2配制1mol/LTris-HCl（pH8.0）溶液

稱取121.1gTris，濃鹽酸調至pH8.0，加水定容至1L，高壓滅菌備用。

B.3配制0.5mol/LEDTA（pH8.0）溶液

稱取186.1gEDTA-Na2，800mL水，1mol/LNaOH調至pH8.0，加水定容至1L后高壓滅菌備用。

B.4配制1×TE（Tris-EDTAbuffersolution）

取1mL1mol/LTris-HCl（pH8.0），0.2mL0.5mol/LEDTA（pH8.0），加水定容至100mL。

B.5聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑

B.5.1配制70%乙醇

取700mL無水乙醇，加水定容至1L。

B.5.2配制5×TBE緩沖液

分別稱取54g三羥基氨基甲烷，27.5g硼酸，加入800mL水加熱溶解，再加入0.5mol/LEDTA（pH8.0）

溶液20mL，加水定容至1L。

B.5.3配制1×TBE緩沖液

取100mL10×TBE，加水定容至1L。

B.5.4配制10%過硫酸銨

稱取0.5g過硫酸銨溶于5mL水中。

B.5.5配制12%聚丙烯酰胺凝膠溶液（40mL）

分別取30%丙烯酰胺16mL、5×TBE8mL、10%過硫酸銨0.28mL、TEMED0.014mL、加水15mL、

4℃條件下保存。

B.5.6配制染色液

1L的蒸餾水中加入3g的硝酸銀和5mL的冰乙酸、100mL無水乙醇。

B.5.7配制顯色液

1L的超純水中加30g的NaOH，冰浴冷卻，使用前加入5mL的37%甲醛。

B.5.8配制固定/終止液

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將5mL的冰乙酸和100mL的無水乙醇加入到500mL蒸餾水中，定容至1L。

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附錄C

（規(guī)范性）

核心引物信息

本文件中PCR反應體系中規(guī)定使用的引物，用于12個常見藍莓品種的鑒定，引物信息見表C.1。

表C.14對SSR核心引物信息

編號引物名稱引物序列(5'→3')退火溫度℃

F：CCACCTTCGGTGGTCTCCC

1SSR16057

R：TGGCAGCAGTTGAGGGAACA

F：TCTCCCTTCTCTCTCTGCACG

2SSR100758

R：ACTGTGTTTGTACTTCCGCCCT

F:TGCTTTCCCATTGACCTGCC

3SSR115356

R:AGGACGAGATTTGCCCAGCA

F：TGGACTCATGTCACTGTACCCA

4SSR118356

R：TGGCCCACATTGATGTGATGTTT

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附錄D

（資料性）

擴增圖譜

本文件中通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后獲得的譜帶擴增情況見圖D.1

圖D.1引物SSR1007、SSR1183、SSR160、SSR1153在12個藍莓主栽品種中的擴增圖譜

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附錄E

（資料性）

指紋圖譜

本文件通過引物結合字母標記法獲得的指紋圖譜情況見表E.1。

表E.112個藍莓主栽品種的SSR數(shù)字指紋圖譜

序號名稱DNA指紋圖譜

1杜克（Duke）1A2-3A4-

2德雷帕（Draper）1A2-3-4A

3休倫（Huron）1B2A3B4B

4自由（Liberty）1C2B3C4-

5藍絲帶（BlueRibbon）