F-Box蛋白SlAMR1對番茄抗壞血酸合成的調(diào)控機理深度剖析一、引言1.1研究背景與意義抗壞血酸（Ascorbicacid，AsA），又稱維生素C（VitaminC，VC），是一種在生物體內(nèi)發(fā)揮著關(guān)鍵作用的抗氧化劑。在植物生長進程中，抗壞血酸參與了眾多重要的生理生化反應(yīng)，對植物的正常生長發(fā)育意義重大。從抗氧化角度來看，抗壞血酸憑借其獨特的分子結(jié)構(gòu)，能夠有效清除植物體內(nèi)產(chǎn)生的過量活性氧（Reactiveoxygenspecies，ROS）。當(dāng)植物遭受生物脅迫（如病原菌侵染）或非生物脅迫（如干旱、高溫、低溫、鹽堿等）時，細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡被打破，會產(chǎn)生大量的活性氧，如超氧陰離子自由基（O_2^-）、過氧化氫（H_2O_2）和羥自由基（\cdotOH）等。這些活性氧如果不能及時被清除，就會攻擊生物大分子，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸，導(dǎo)致細(xì)胞膜脂過氧化、蛋白質(zhì)變性和DNA損傷，進而影響植物細(xì)胞的正常生理功能，嚴(yán)重時甚至?xí)?dǎo)致細(xì)胞死亡。而抗壞血酸可以作為電子供體，直接與這些活性氧反應(yīng)，將其還原為無害的物質(zhì)，從而維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)，增強植物對各種脅迫的抵抗能力。研究表明，在干旱脅迫下，提高植物體內(nèi)抗壞血酸的含量，可以顯著降低葉片中丙二醛（Malondialdehyde，MDA）的積累，MDA是膜脂過氧化的產(chǎn)物，其含量的降低表明抗壞血酸有效地減輕了干旱脅迫對細(xì)胞膜的損傷，提高了植物的抗旱性?？箟难徇€是許多重要酶的輔因子，參與植物體內(nèi)的多種代謝過程。在光合作用中，抗壞血酸參與了光合電子傳遞鏈的調(diào)節(jié)，保護光合機構(gòu)免受氧化損傷，確保光合作用的高效進行?？箟难徇€參與了植物激素的合成與代謝調(diào)節(jié)，如生長素（Auxin）、細(xì)胞分裂素（Cytokinin）和脫落酸（Abscisicacid，ABA）等激素的合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程都與抗壞血酸密切相關(guān)，它通過影響這些激素的水平和信號傳導(dǎo)，間接調(diào)控植物的生長發(fā)育進程，包括種子萌發(fā)、根系生長、莖葉發(fā)育、開花結(jié)果等各個階段。對于人類而言，抗壞血酸是維持身體健康不可或缺的營養(yǎng)物質(zhì)。人體自身無法合成抗壞血酸，必須從食物中攝取，而新鮮的果蔬是人類獲取抗壞血酸的主要來源。番茄作為一種全球廣泛栽培且深受人們喜愛的蔬菜作物，不僅富含多種維生素、礦物質(zhì)和膳食纖維，其果實中還含有豐富的抗壞血酸。據(jù)統(tǒng)計，每100克新鮮番茄果實中抗壞血酸的含量可達10-25毫克，在滿足人體日常抗壞血酸需求方面發(fā)揮著重要作用。充足的抗壞血酸攝入對人體健康有著諸多益處，它能夠促進膠原蛋白的合成，維持皮膚、血管、骨骼和牙齒等組織的正常結(jié)構(gòu)和功能；增強人體免疫力，幫助身體抵抗各種病原體的入侵，降低感冒、流感等疾病的發(fā)生風(fēng)險；促進鐵的吸收和利用，預(yù)防缺鐵性貧血；還具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤等潛在功效，對預(yù)防心血管疾病、癌癥等慢性疾病也具有一定的積極作用。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，番茄的產(chǎn)量和品質(zhì)一直是備受關(guān)注的重要指標(biāo)。抗壞血酸含量作為衡量番茄果實品質(zhì)的關(guān)鍵性狀之一，直接影響著番茄的營養(yǎng)價值和市場價值。隨著人們生活水平的提高和對健康飲食的追求，消費者對番茄中抗壞血酸含量的要求也越來越高。提高番茄果實中的抗壞血酸含量，不僅能夠滿足消費者對高品質(zhì)番茄的需求，還能提升番茄在市場上的競爭力，為種植戶帶來更高的經(jīng)濟效益。然而，目前番茄中抗壞血酸含量的遺傳改良面臨著諸多挑戰(zhàn)，其中一個重要原因是對番茄中調(diào)控抗壞血酸積累的分子機理研究還不夠深入。雖然已知植物中抗壞血酸的合成存在多條途徑，如D-甘露糖/L-半乳糖途徑、半乳糖醛酸途徑、古洛糖途徑以及肌醇途徑等，但對于這些途徑中相關(guān)基因的表達調(diào)控機制，尤其是在番茄中的調(diào)控機制，仍存在許多未知之處。F-box蛋白作為一類在真核生物中廣泛存在的蛋白質(zhì)家族，在蛋白泛素化及降解過程中具有特異識別被降解蛋白的作用，參與調(diào)控植物生長發(fā)育、激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、自交不親和以及抵抗病原菌侵襲等許多關(guān)鍵生理過程。近年來，研究發(fā)現(xiàn)F-box蛋白在植物抗壞血酸合成的調(diào)控中也可能發(fā)揮著重要作用，但相關(guān)研究還相對較少。SlAMR1作為一種F-box蛋白，其在番茄抗壞血酸合成調(diào)控中的具體作用和分子機制尚未明確。深入研究F-box蛋白SlAMR1調(diào)控番茄抗壞血酸合成的機理，不僅有助于揭示番茄抗壞血酸合成的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，豐富植物抗壞血酸合成調(diào)控的理論知識，還為通過基因工程手段提高番茄果實中抗壞血酸含量提供了新的靶點和理論依據(jù)，對于培育高抗壞血酸含量的番茄新品種，提升番茄的營養(yǎng)價值和品質(zhì)，滿足市場需求，促進農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要的實踐意義。1.2番茄抗壞血酸合成研究現(xiàn)狀植物中抗壞血酸的合成存在多條途徑，在番茄中，主要的合成途徑有D-甘露糖/L-半乳糖途徑、半乳糖醛酸途徑、古洛糖途徑以及肌醇途徑，這些途徑相互關(guān)聯(lián)，共同維持著番茄體內(nèi)抗壞血酸的含量平衡。D-甘露糖/L-半乳糖途徑被認(rèn)為是植物中抗壞血酸合成的主要途徑，在番茄中也占據(jù)著關(guān)鍵地位。該途徑從D-甘露糖-6-磷酸開始，在一系列酶的催化作用下逐步轉(zhuǎn)化為抗壞血酸。首先，D-甘露糖-6-磷酸在磷酸甘露糖異構(gòu)酶（PMI）的作用下轉(zhuǎn)化為D-果糖-6-磷酸，部分研究對番茄中PMI基因家族進行了分析，發(fā)現(xiàn)不同成員在抗壞血酸合成中的功能存在差異，如通過構(gòu)建pmi1和pmi2的超量及共抑制表達載體并導(dǎo)入番茄品系ac中，發(fā)現(xiàn)它們對番茄葉片及果實中的抗壞血酸含量有不同程度的影響。隨后，D-果糖-6-磷酸在磷酸甘露糖變位酶（PMM）的作用下生成GDP-甘露糖，GDP-甘露糖在GDP-甘露糖焦磷酸化酶（GMP）的催化下，與UTP反應(yīng)生成GDP-甘露糖，此步驟是該途徑的關(guān)鍵節(jié)點之一，GMP的活性和表達水平對后續(xù)抗壞血酸的合成量有著重要影響。GDP-甘露糖再經(jīng)過一系列反應(yīng)依次轉(zhuǎn)化為GDP-L-半乳糖、L-半乳糖-1-磷酸、L-半乳糖，最終在L-半乳糖脫氫酶（GLDH）的作用下，L-半乳糖被氧化為L-抗壞血酸。研究表明，在番茄果實發(fā)育過程中，GLDH基因的表達與抗壞血酸含量的積累呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，過表達GLDH基因能夠顯著提高番茄果實中抗壞血酸的含量。半乳糖醛酸途徑也是番茄抗壞血酸合成的重要途徑之一。在該途徑中，細(xì)胞壁中的果膠多糖水解產(chǎn)生的D-半乳糖醛酸，首先被還原為L-半乳糖醛酸，然后在L-半乳糖醛酸還原酶的作用下，進一步轉(zhuǎn)化為L-半乳糖，后續(xù)步驟與D-甘露糖/L-半乳糖途徑相同，即L-半乳糖在GLDH的催化下生成抗壞血酸。雖然該途徑在番茄抗壞血酸合成中的具體貢獻比例尚不完全明確，但已有研究發(fā)現(xiàn)，在一些番茄品種中，當(dāng)D-甘露糖/L-半乳糖途徑受到抑制時，半乳糖醛酸途徑會出現(xiàn)一定程度的補償性增強，以維持抗壞血酸的合成。古洛糖途徑在番茄抗壞血酸合成中也發(fā)揮著作用。在這條途徑中，D-葡萄糖首先轉(zhuǎn)化為D-古洛糖，然后經(jīng)過一系列酶促反應(yīng)生成L-古洛糖酸-1,4-內(nèi)酯，最后由L-古洛糖酸-1,4-內(nèi)酯脫氫酶（GLDH）催化L-古洛糖酸-1,4-內(nèi)酯生成抗壞血酸。有研究通過對番茄果實發(fā)育過程中不同時期的基因表達分析，發(fā)現(xiàn)古洛糖途徑相關(guān)基因在特定發(fā)育階段的表達變化與抗壞血酸含量的動態(tài)變化存在一定關(guān)聯(lián)，暗示了該途徑在番茄抗壞血酸合成調(diào)控中的潛在作用。肌醇途徑同樣參與番茄抗壞血酸的合成。肌醇在肌醇加氧酶（MIOX）的作用下，經(jīng)過一系列中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為L-半乳糖醛酸，進而通過半乳糖醛酸途徑合成抗壞血酸。山東農(nóng)業(yè)大學(xué)孟慶偉/莊焜揚團隊的研究發(fā)現(xiàn)，抑制番茄中的SlEIL2能夠直接促進SlMIOX1基因的表達，通過肌醇途徑影響果實中AsA的生物合成，表明肌醇途徑在番茄抗壞血酸合成調(diào)控中具有重要意義。目前對于番茄抗壞血酸合成途徑中相關(guān)基因的表達調(diào)控機制研究已取得了一些進展。有研究表明，植物激素在番茄抗壞血酸合成調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，如生長素（IAA）和脫落酸（ABA）通過有絲分裂原激活蛋白激酶（SlMAPK8）、生長素響應(yīng)因子（SlARF4）和MYB轉(zhuǎn)錄因子（SlMYB11）模塊拮抗調(diào)節(jié)番茄果實中抗壞血酸的積累。然而，在F-box蛋白調(diào)控番茄抗壞血酸合成方面的研究還相對匱乏。雖然已知F-box蛋白參與植物生長發(fā)育、激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等許多關(guān)鍵生理過程，但對于F-box蛋白如何具體參與番茄抗壞血酸合成的調(diào)控，包括其是否直接作用于抗壞血酸合成途徑中的關(guān)鍵酶基因，或者通過影響其他調(diào)控因子間接調(diào)控抗壞血酸合成，以及F-box蛋白與抗壞血酸合成途徑中各基因之間的相互作用關(guān)系等方面，仍存在大量的未知領(lǐng)域亟待深入探索。1.3F-Box蛋白研究概述F-box蛋白是一類在真核生物中廣泛存在且具有重要生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)，其結(jié)構(gòu)和功能的獨特性使其在植物生長發(fā)育、應(yīng)對環(huán)境變化等多個方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。F-box蛋白的命名源于其結(jié)構(gòu)中含有一段約40-50個氨基酸組成的保守序列，即F-box基序。這一基序能夠特異性地與SKP1（S-phasekinase-associatedprotein1）蛋白相互作用，形成SKP1-CUL1-F-box（SCF）復(fù)合體，該復(fù)合體是泛素蛋白酶體途徑（Ubiquitin-proteasomepathway，UPP）中重要的E3泛素連接酶。在泛素蛋白酶體途徑中，F(xiàn)-box蛋白作為SCF復(fù)合體的識別亞基，負(fù)責(zé)特異性地識別靶蛋白，并將其招募到SCF復(fù)合體上。隨后，E1泛素激活酶在ATP供能的情況下，將泛素分子激活；激活后的泛素分子被轉(zhuǎn)移到E2泛素結(jié)合酶上；最后，在E3泛素連接酶（如SCF復(fù)合體）的作用下，泛素分子從E2酶轉(zhuǎn)移到靶蛋白上，使靶蛋白多聚泛素化。多聚泛素化的靶蛋白會被26S蛋白酶體識別并降解，從而實現(xiàn)對靶蛋白水平的精確調(diào)控。植物中的F-box蛋白數(shù)量眾多，構(gòu)成了一個龐大的蛋白家族。以擬南芥和水稻為例，在擬南芥基因組中至少鑒定出了694個F-box基因，在水稻基因組中至少有687個F-box基因被鑒定。F-box蛋白家族成員間結(jié)構(gòu)具有一定的多樣性，除了保守的F-box基序外，不同的F-box蛋白還含有其他不同的結(jié)構(gòu)域，如富含亮氨酸重復(fù)序列（Leucine-richrepeats，LRR）結(jié)構(gòu)域、Kelch結(jié)構(gòu)域、WD40重復(fù)結(jié)構(gòu)域等。這些不同的結(jié)構(gòu)域賦予了F-box蛋白識別不同靶蛋白的能力，使得F-box蛋白能夠參與到植物生長發(fā)育的各個復(fù)雜調(diào)控過程中。在植物生長發(fā)育進程中，F(xiàn)-box蛋白參與了多個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面，F(xiàn)-box蛋白起著不可或缺的作用。生長素（Auxin）是調(diào)控植物生長發(fā)育的重要激素之一，其中運輸抑制響應(yīng)蛋白1（Transportinhibitorresponse1，TIR1）是首個被發(fā)現(xiàn)參與生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的F-box蛋白。TIR1作為SCF復(fù)合體的一部分，能夠特異性地識別生長素信號通路中的抑制蛋白Aux/IAA。當(dāng)生長素存在時，生長素與TIR1結(jié)合，增強了TIR1對Aux/IAA蛋白的親和力，使得Aux/IAA蛋白被SCF^{TIR1}復(fù)合體多聚泛素化修飾，進而被26S蛋白酶體降解。Aux/IAA蛋白的降解解除了其對生長素響應(yīng)因子（Auxinresponsefactors，ARFs）的抑制作用，ARFs得以激活下游生長素響應(yīng)基因的表達，從而調(diào)控植物的生長發(fā)育過程，如細(xì)胞伸長、分裂、分化以及根和莖的生長等。除了生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，F(xiàn)-box蛋白還參與了赤霉素（Gibberellin，GA）、脫落酸（Abscisicacid，ABA）、乙烯（Ethylene）等多種植物激素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，通過對激素信號通路中關(guān)鍵蛋白的降解調(diào)控，實現(xiàn)對植物生長發(fā)育和逆境響應(yīng)的精細(xì)調(diào)節(jié)。在光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，F(xiàn)-box蛋白也扮演著重要角色。例如，擬南芥中的COI1（Coronatine-insensitive1）是一種F-box蛋白，它參與了茉莉酸（Jasmonicacid，JA）和光信號的整合調(diào)控。在光照條件下，光信號通過一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，最終影響COI1蛋白的穩(wěn)定性和活性。COI1與JAZ（Jasmonate-ZIM-domain）蛋白相互作用，在JA存在時，COI1介導(dǎo)JAZ蛋白的泛素化降解，從而解除JAZ蛋白對下游基因的抑制作用，激活JA響應(yīng)基因的表達。同時，光信號也可以通過調(diào)節(jié)COI1的表達或活性，影響JA信號通路，進而調(diào)控植物的生長發(fā)育，如調(diào)控植物的開花時間、葉片形態(tài)建成等過程。F-box蛋白在植物花器官發(fā)育過程中同樣發(fā)揮著關(guān)鍵作用。以擬南芥為例，F(xiàn)-box蛋白UFO（Unusualfloralorgans）參與了花器官發(fā)育的調(diào)控。UFO與花器官發(fā)育的主要調(diào)控因子LEAFY（LFY）協(xié)同作用，共同調(diào)控花器官的發(fā)育。UFO通過其F-box結(jié)構(gòu)域與SKP1互作，形成SCF泛素連接酶復(fù)合體。研究發(fā)現(xiàn)，UFO不通過泛素化修飾調(diào)控LFY活性，而是與LFY形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，調(diào)控LFY的DNA結(jié)合特異性，使其能夠識別新的DNA順式作用元件，從而調(diào)控相關(guān)基因的表達，影響花器官的正常發(fā)育。如果UFO基因發(fā)生突變，會導(dǎo)致花器官發(fā)育異常，出現(xiàn)花器官數(shù)目改變、形態(tài)異常等現(xiàn)象。植物在生長過程中會面臨各種病原菌的侵襲，F(xiàn)-box蛋白在植物抵抗病原菌侵襲的過程中發(fā)揮著重要的免疫調(diào)控作用。例如，在擬南芥中，RMA1（RecognitionofPeronosporaparasitica1-mediatedresistance1）是一種F-box蛋白，它參與了植物對病原菌的抗性反應(yīng)。當(dāng)植物受到病原菌侵染時，RMA1能夠被誘導(dǎo)表達，通過泛素蛋白酶體途徑降解病原菌效應(yīng)蛋白，從而抑制病原菌的生長和繁殖，增強植物的抗病能力。一些F-box蛋白還可以通過調(diào)控植物激素信號通路，如SA（Salicylicacid）、JA和ET（Ethylene）信號通路，激活植物的防御反應(yīng)基因，提高植物對病原菌的抗性。雖然目前對F-box蛋白在植物生長發(fā)育、激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、花器官發(fā)育以及抵抗病原菌侵襲等方面的作用有了一定的認(rèn)識，但F-box蛋白在植物抗壞血酸合成調(diào)控方面的研究還相對較少。作為一種重要的F-box蛋白，SlAMR1在番茄抗壞血酸合成調(diào)控中的具體作用機制尚未明確。深入研究SlAMR1調(diào)控番茄抗壞血酸合成的機理，有助于進一步完善植物抗壞血酸合成調(diào)控的分子網(wǎng)絡(luò)，為提高番茄果實的營養(yǎng)價值和品質(zhì)提供新的理論依據(jù)。二、材料與方法2.1實驗材料準(zhǔn)備2.1.1植物材料選取選用野生型番茄品種AilsaCraig（AC）作為實驗材料，該品種是番茄遺傳研究中常用的標(biāo)準(zhǔn)品種，具有遺傳背景清晰、生長特性穩(wěn)定等優(yōu)點，便于實驗結(jié)果的分析與比較。將番茄種子用75%乙醇消毒3-5分鐘，再用0.1%升汞溶液消毒8-10分鐘，期間不斷振蕩，使種子充分接觸消毒劑，隨后用無菌水沖洗5-6次，以徹底去除消毒劑殘留。將消毒后的種子播種于裝有滅菌基質(zhì)（草炭土：蛭石=3:1，v/v）的育苗盤中，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：光照強度150-200μmol?m?2?s?1，光照時間16h/d，晝夜溫度分別為25℃/20℃，相對濕度60%-70%。待番茄幼苗長至兩葉一心時，移栽至裝有相同基質(zhì)的塑料花盆（直徑15cm，高12cm）中，每盆種植1株，繼續(xù)按照上述培養(yǎng)條件進行常規(guī)栽培管理，定期澆水、施肥，以保證植株的正常生長。在番茄植株生長發(fā)育過程中，分別在不同時期采集相關(guān)材料。在苗期，選取生長狀況一致的植株，采集第3-4片完全展開的幼葉；在開花期，采集當(dāng)天開放的花朵；在果實發(fā)育過程中，分別采集綠熟期、轉(zhuǎn)色期、紅熟期的果實。采集的材料迅速用液氮速凍后，置于-80℃冰箱中保存，用于后續(xù)實驗分析。為確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，每個時期的材料均設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，每次重復(fù)采集至少3株植株的相應(yīng)部位。2.1.2主要試劑、菌株及載體實驗所需的主要試劑包括：Trizol試劑（Invitrogen公司），用于提取植物總RNA；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司），將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以便進行后續(xù)的基因表達分析；SYBRGreenPCRMasterMix（Roche公司），用于實時熒光定量PCR（qRT-PCR）反應(yīng)，通過檢測PCR過程中熒光信號的變化，精確測定基因的表達量；DNAMarker（ThermoFisherScientific公司），在DNA電泳實驗中作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，用于判斷目的DNA片段的大小；限制性內(nèi)切酶（NcoI、BamHI等，NewEnglandBiolabs公司），用于切割DNA分子，構(gòu)建重組載體；T4DNA連接酶（TaKaRa公司），將切割后的DNA片段連接起來，形成重組DNA分子；質(zhì)粒提取試劑盒（OMEGA公司），從細(xì)菌中提取質(zhì)粒，用于基因克隆和載體構(gòu)建實驗；蛋白提取試劑盒（Beyotime公司），用于提取植物總蛋白；抗壞血酸測定試劑盒（Solarbio公司），通過特定的化學(xué)反應(yīng)，定量測定植物樣品中抗壞血酸的含量；其他常規(guī)試劑如無水乙醇、氯仿、異丙醇、氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉等，均為國產(chǎn)分析純試劑，用于配制各種緩沖液、培養(yǎng)基等。主要菌株有大腸桿菌（Escherichiacoli）DH5α，其遺傳背景清楚，轉(zhuǎn)化效率高，常用于基因克隆和質(zhì)粒擴增實驗。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在含有相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，可實現(xiàn)重組質(zhì)粒的大量擴增。農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）GV3101，具有較強的侵染能力，能夠?qū)y帶的外源基因?qū)胫参锛?xì)胞中，用于番茄的遺傳轉(zhuǎn)化實驗。將重組表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞中，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，將目的基因?qū)敕鸦蚪M中，獲得轉(zhuǎn)基因番茄植株。主要載體包括pMD19-T載體（TaKaRa公司），該載體具有T克隆位點，能夠高效地克隆PCR擴增得到的目的基因片段，形成重組克隆載體。將PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，可通過藍白斑篩選和測序鑒定，獲得含有正確目的基因的重組克隆載體。pBI121載體（Clontech公司），是一種常用的植物表達載體，含有CaMV35S啟動子、多克隆位點、NOS終止子等元件，可驅(qū)動目的基因在植物體內(nèi)高效表達。將目的基因從重組克隆載體上切下，連接到pBI121載體的多克隆位點，構(gòu)建成重組表達載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化番茄，實現(xiàn)目的基因在番茄中的過表達。pHellsgate8載體（Addgene公司），用于構(gòu)建RNA干擾（RNAi）載體，通過導(dǎo)入植物細(xì)胞后，可特異性地干擾目的基因的表達，研究基因的功能。根據(jù)目的基因序列設(shè)計干擾片段，將其連接到pHellsgate8載體上，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101后，侵染番茄，獲得目的基因表達受抑制的轉(zhuǎn)基因番茄植株。2.2實驗方法實施2.2.1番茄抗壞血酸含量測定采用高效液相色譜法（HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC）測定番茄樣品中的抗壞血酸含量。稱取0.5g左右的番茄葉片或果實樣品，迅速放入液氮中速凍，然后在研缽中加入適量的石英砂和預(yù)冷的5%偏磷酸溶液，充分研磨成勻漿，以確保細(xì)胞充分破碎，使抗壞血酸完全釋放出來。將勻漿轉(zhuǎn)移至10mL離心管中，用5%偏磷酸溶液定容至刻度，充分振蕩混勻后，在4℃條件下以12000g離心15分鐘。取上清液過0.22μm微孔濾膜，將濾液收集到進樣瓶中，用于HPLC分析。HPLC分析使用C18反相色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），流動相為0.1%磷酸水溶液（pH2.5），流速為1.0mL/min，柱溫為30℃。檢測波長設(shè)定為245nm，進樣量為20μL。在分析前，先使用抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）配制一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，如5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL等，進行HPLC分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后對樣品進行測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中抗壞血酸的含量，結(jié)果以mg/gFW（鮮重）表示。高效液相色譜法測定抗壞血酸含量的原理基于抗壞血酸在特定的色譜條件下，與其他雜質(zhì)在固定相和流動相之間的分配系數(shù)不同，從而實現(xiàn)分離。當(dāng)樣品進入色譜柱后，抗壞血酸在流動相的帶動下，在固定相和流動相之間不斷進行分配，由于其與固定相的相互作用較弱，在流動相的推動下，較早地從色譜柱中流出。通過紫外檢測器檢測抗壞血酸在特定波長下的吸收峰，根據(jù)峰面積與標(biāo)準(zhǔn)曲線的關(guān)系，即可定量測定樣品中抗壞血酸的含量。這種方法具有分離效率高、分析速度快、靈敏度高等優(yōu)點，能夠準(zhǔn)確地測定番茄樣品中的抗壞血酸含量，為后續(xù)研究提供可靠的數(shù)據(jù)支持。2.2.2轉(zhuǎn)基因材料構(gòu)建與處理利用Gateway技術(shù)構(gòu)建SlAMR1的過表達載體和RNA干擾載體。首先，以番茄cDNA為模板，通過PCR擴增得到SlAMR1基因的全長編碼區(qū)序列。引物設(shè)計時，在正向引物和反向引物的5'端分別添加attB1和attB2重組位點，引物序列如下：正向引物5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGCAAAGATGATGGTG-3'，反向引物5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCATATCCATAGTCCAGCAG-3'。PCR反應(yīng)體系為25μL，包括2×PCRMix12.5μL，上下游引物（10μM）各1μL，模板cDNA1μL，ddH?O9.5μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環(huán)；72℃終延伸10分鐘。將擴增得到的PCR產(chǎn)物通過BP反應(yīng)克隆到pDONR221載體上，構(gòu)建入門克隆載體pDONR221-SlAMR1。BP反應(yīng)體系為10μL，包括PCR產(chǎn)物3μL，pDONR221載體1μL，BPClonaseIIEnzymeMix1μL，TEbuffer（pH8.0）5μL。反應(yīng)在25℃條件下進行1小時，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含有卡那霉素（50μg/mL）的LB平板上篩選陽性克隆。通過菌落PCR和測序鑒定，確認(rèn)插入片段的正確性。將正確的入門克隆載體pDONR221-SlAMR1與植物表達載體pGWB405（用于過表達）或pHellsgate8（用于RNA干擾）進行LR反應(yīng)，構(gòu)建過表達載體pGWB405-SlAMR1和RNA干擾載體pHellsgate8-SlAMR1。LR反應(yīng)體系為10μL，包括pDONR221-SlAMR13μL，植物表達載體1μL，LRClonaseIIEnzymeMix1μL，TEbuffer（pH8.0）5μL。反應(yīng)在25℃條件下進行1小時，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含有相應(yīng)抗生素（過表達載體用卡那霉素50μg/mL，RNA干擾載體用壯觀霉素100μg/mL）的LB平板上篩選陽性克隆。通過菌落PCR和測序鑒定，確認(rèn)重組載體構(gòu)建成功。將構(gòu)建好的過表達載體pGWB405-SlAMR1和RNA干擾載體pHellsgate8-SlAMR1分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞。采用凍融法進行轉(zhuǎn)化，將1μg重組質(zhì)粒加入到100μL農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30分鐘，然后在液氮中速凍1分鐘，37℃水浴5分鐘，加入800μL無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，28℃振蕩培養(yǎng)2小時。取200μL菌液涂布在含有相應(yīng)抗生素（利福平50μg/mL、卡那霉素50μg/mL用于過表達載體；利福平50μg/mL、壯觀霉素100μg/mL用于RNA干擾載體）的LB平板上，28℃培養(yǎng)2-3天，篩選陽性克隆。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化野生型番茄AC。將含有重組載體的農(nóng)桿菌GV3101單菌落接種到含有相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)過夜，使菌液OD???值達到0.6-0.8。然后將菌液以1:10的比例轉(zhuǎn)接至新鮮的含有相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)2-3小時，使OD???值達到0.3-0.5。將培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌菌液在5000g下離心5分鐘，收集菌體，用MS液體培養(yǎng)基重懸菌體，使OD???值調(diào)整為0.3。選取生長健壯的番茄無菌苗，取其葉片切成0.5cm×0.5cm左右的葉盤，放入重懸好的農(nóng)桿菌菌液中侵染10-15分鐘，期間不斷輕輕搖晃，使葉盤充分接觸菌液。侵染結(jié)束后，用無菌濾紙吸干葉盤表面多余的菌液，將葉盤接種到含有50mg/L乙酰丁香酮的MS共培養(yǎng)基上，25℃暗培養(yǎng)2天。然后將葉盤轉(zhuǎn)移至含有500mg/L頭孢噻肟鈉和100mg/L卡那霉素（過表達載體）或500mg/L頭孢噻肟鈉和100mg/L壯觀霉素（RNA干擾載體）的MS篩選培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)，每2-3周更換一次篩選培養(yǎng)基，直至抗性芽長出。當(dāng)抗性芽長至2-3cm時，將其切下，接種到含有500mg/L頭孢噻肟鈉和100mg/L卡那霉素（過表達載體）或500mg/L頭孢噻肟鈉和100mg/L壯觀霉素（RNA干擾載體）的MS生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根。待根系發(fā)育良好后，將轉(zhuǎn)基因番茄植株移栽到裝有滅菌基質(zhì)（草炭土：蛭石=3:1，v/v）的花盆中，在溫室中培養(yǎng)，定期澆水、施肥，使其正常生長。對獲得的轉(zhuǎn)基因番茄植株進行分子鑒定。提取轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的基因組DNA，采用PCR方法檢測目的基因的整合情況。以轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的基因組DNA為模板，分別用目的基因特異性引物和載體上的引物進行PCR擴增。對于過表達載體，使用引物對：正向引物5'-ATGGCAAAGATGATGGTG-3'（位于SlAMR1基因起始密碼子附近），反向引物5'-CTCGAGTTATTCAGGGATCC-3'（位于pGWB405載體上）；對于RNA干擾載體，使用引物對：正向引物5'-GCTGATGTTGATGGTTG-3'（位于干擾片段內(nèi)），反向引物5'-GGATCCCCGGGGAAGCTT-3'（位于pHellsgate8載體上）。PCR反應(yīng)體系和條件同構(gòu)建載體時的PCR反應(yīng)。通過PCR擴增，若轉(zhuǎn)基因植株能夠擴增出特異性條帶，而野生型植株無條帶，則表明目的基因已成功整合到轉(zhuǎn)基因植株的基因組中。進一步提取轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）方法檢測目的基因的表達水平。以番茄Actin基因作為內(nèi)參基因，引物序列為：正向引物5'-GCCAACACTGTTCTTTCCCT-3'，反向引物5'-GACTCCTGCTTGCTGATCC-3'。根據(jù)qRT-PCR結(jié)果，篩選出目的基因表達量顯著上調(diào)（過表達植株）或下調(diào)（RNA干擾植株）的轉(zhuǎn)基因株系，用于后續(xù)實驗。對轉(zhuǎn)基因番茄材料進行氧化處理。選取生長狀況一致的轉(zhuǎn)基因番茄植株和野生型番茄植株，在其生長至6-8片真葉時，進行氧化脅迫處理。采用噴施10mMH?O?溶液的方式施加氧化脅迫，每隔24小時噴施一次，共噴施3次。在每次噴施后，分別在0小時、6小時、12小時、24小時、48小時采集植株的葉片和果實樣品，迅速用液氮速凍后，置于-80℃冰箱中保存，用于后續(xù)相關(guān)生理指標(biāo)的測定和基因表達分析。2.2.3相關(guān)生理指標(biāo)測定葉綠素含量測定采用乙醇提取法。稱取0.2g新鮮番茄葉片，去除葉脈，剪碎后放入10mL具塞試管中，加入8mL95%乙醇，使葉片完全浸沒在乙醇溶液中。將試管置于黑暗處浸提24-48小時，期間輕輕搖晃試管數(shù)次，以確保葉綠素充分溶解。待葉片完全變白后，將提取液轉(zhuǎn)移至10mL離心管中，在4℃條件下以5000g離心10分鐘，去除沉淀。取上清液，用95%乙醇定容至10mL。使用分光光度計分別在665nm和649nm波長下測定提取液的吸光度。根據(jù)以下公式計算葉綠素a（Ca）、葉綠素b（Cb）和總?cè)~綠素（Ct）的含量：Ca=13.95×A???-6.88×A???，Cb=24.96×A???-7.32×A???，Ct=Ca+Cb。其中，A???和A???分別為提取液在665nm和649nm波長下的吸光度，葉綠素含量單位為mg/gFW。丙二醛（MDA）含量測定采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法。稱取0.5g新鮮番茄葉片，剪碎后放入研缽中，加入3mL10%三氯乙酸（TCA）和少量石英砂，充分研磨成勻漿。將勻漿轉(zhuǎn)移至10mL離心管中，用10%TCA沖洗研缽，并將沖洗液一并轉(zhuǎn)移至離心管中，定容至10mL。在4℃條件下以10000g離心15分鐘，取上清液備用。取2mL上清液，加入2mL0.5%TBA（用10%TCA配制），混勻后將試管置于沸水浴中反應(yīng)15分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，迅速將試管放入冰浴中冷卻。然后在4℃條件下以10000g離心10分鐘，取上清液。使用分光光度計分別在450nm、532nm和600nm波長下測定上清液的吸光度。根據(jù)以下公式計算MDA含量：C（μmol/L）=6.45×（A???-A???）-0.56×A???。其中，A???、A???和A???分別為上清液在450nm、532nm和600nm波長下的吸光度。最后將MDA含量換算為μmol/gFW表示。DAB染色用于檢測植物組織中過氧化氫（H?O?）的積累。取新鮮的番茄葉片或果實，切成0.5cm×0.5cm左右的小塊，放入含有1mg/mLDAB（pH3.8）染色液的培養(yǎng)皿中，確保組織塊完全浸沒在染色液中。將培養(yǎng)皿置于光照條件下染色6-12小時，期間觀察組織塊的染色情況。當(dāng)組織塊出現(xiàn)明顯的棕色沉淀時，停止染色。用蒸餾水沖洗組織塊3-5次，以去除表面多余的染色液。然后將組織塊放入無水乙醇中，在80℃水浴中脫色10-15分鐘，直至葉片或果實的綠色完全褪去。觀察脫色后的組織塊，棕色沉淀的部位即為H?O?積累的部位，顏色越深表示H?O?積累量越多。H?O?熒光染色采用二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）染色法。取新鮮的番茄葉片或果實，切成0.5cm×0.5cm左右的小塊，放入含有10μMDCFH-DA的緩沖液（pH7.2，含0.1%DMSO）中，在黑暗條件下孵育30-60分鐘。孵育結(jié)束后，用緩沖液沖洗組織塊3-5次，以去除表面未進入細(xì)胞的DCFH-DA。將染色后的組織塊置于熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)波長為488nm，發(fā)射波長為525nm。在熒光顯微鏡下，被H?O?氧化的DCFH會發(fā)出綠色熒光，熒光強度越強表示H?O?含量越高。使用ImageJ軟件對熒光圖像進行分析，定量測定熒光強度，以反映H?O?的積累水平。2.2.4抗壞血酸合成途徑底物飼喂對番茄葉片進行底物飼喂實驗時，選取生長狀況一致的番茄植株，在其生長至6-8片真葉時，選取第3-4片完全展開的幼葉作為實驗材料。將葉片從植株上剪下，迅速放入含有不同底物溶液的培養(yǎng)皿中，使葉片的下表面充分接觸底物溶液。底物溶液包括10mMGDP-甘露糖、10mML-半乳糖、10mMD-半乳糖醛酸等，以清水作為對照。每個處理設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)使用3-5片葉片。將培養(yǎng)皿置于光照培養(yǎng)箱中，在光照強度150-200μmol?m?2?s?1，光照時間16h/d，溫度25℃的條件下培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)結(jié)束后，取出葉片，用蒸餾水沖洗3-5次，以去除表面殘留的底物溶液。然后迅速將葉片用液氮速凍，置于-80℃冰箱中保存，用于后續(xù)抗壞血酸含量測定和相關(guān)基因表達分析。對番茄果實進行底物飼喂實驗時，在番茄果實發(fā)育至綠熟期，選取大小均勻、無病蟲害的果實進行處理。采用注射法將底物溶液注入果實中，每個果實注射10μL底物溶液，底物溶液濃度和種類同葉片飼喂實驗。以注射清水作為對照。每個處理設(shè)置5-8個果實作為生物學(xué)重復(fù)。注射后，將果實繼續(xù)留在植株上生長，在果實發(fā)育至紅熟期時，采摘果實。用蒸餾水沖洗果實表面，去除表面殘留的底物溶液。然后將果實切成小塊，迅速用液氮速凍，置于-80℃冰箱中保存，用于后續(xù)抗壞血酸含量測定和相關(guān)基因表達分析。通過底物飼喂實驗，觀察不同底物對番茄葉片和果實中抗壞血酸合成的影響，以及對相關(guān)基因表達的調(diào)控作用，進一步探究抗壞血酸合成途徑中各底物的作用機制。2.2.5關(guān)鍵酶活性測定GMP酶活測定采用分光光度法。稱取0.5g新鮮番茄葉片，剪碎后放入預(yù)冷的研缽中，加入3mL預(yù)冷的提取緩沖液（50mMTris-HCl，pH7.5，含1mMEDTA，5mMDTT，10%甘油，0.1%TritonX-100，1mMPMSF）和少量石英砂，在冰浴條件下充分研磨成勻漿。將勻漿轉(zhuǎn)移至10mL離心管中，在4℃條件下以12000g離心20分鐘，取上清液作為粗酶液。酶活測定反應(yīng)體系為1mL，包括50mMTris-HCl緩沖液（pH7.5）200μL，10mMATP100μL，10mMMgCl?三、結(jié)果與分析3.1F-box蛋白家族系統(tǒng)進化分析為了深入了解SlAMR1在番茄F-box蛋白家族中的進化地位，本研究利用MEGA7.0軟件，基于鄰接法（Neighbor-Joiningmethod）對番茄F-box蛋白家族成員進行系統(tǒng)進化分析。在構(gòu)建進化樹時，采用泊松校正（Poissoncorrection）模型計算遺傳距離，通過1000次的自展檢驗（Bootstraptest）來評估分支的可靠性。從圖1的系統(tǒng)進化樹結(jié)果可以看出，番茄F-box蛋白家族成員被明顯分為多個亞家族，不同亞家族之間具有不同的進化分支，這表明番茄F-box蛋白家族在進化過程中發(fā)生了多樣化的分化。在系統(tǒng)進化樹中，SlAMR1與其他一些F-box蛋白聚為一個分支，顯示出它們在進化上具有較近的親緣關(guān)系。進一步分析發(fā)現(xiàn)，與SlAMR1處于同一分支的部分F-box蛋白已被報道參與植物的生長發(fā)育、激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及脅迫響應(yīng)等生理過程。例如，F(xiàn)-box蛋白TIR1參與生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在植物的生長發(fā)育，如細(xì)胞伸長、分裂和分化等過程中發(fā)揮著重要作用；COI1參與茉莉酸信號通路，在植物的防御反應(yīng)和生長發(fā)育調(diào)控中具有關(guān)鍵作用。這暗示著SlAMR1可能與這些已知功能的F-box蛋白具有相似的功能，或者在相關(guān)生理過程中存在協(xié)同作用。而SlAMR1與其他分支上的F-box蛋白在進化距離上相對較遠(yuǎn)，表明它們在結(jié)構(gòu)和功能上可能存在較大差異。通過系統(tǒng)進化分析，初步明確了SlAMR1在番茄F-box蛋白家族中的進化位置，為后續(xù)深入研究其生物學(xué)功能提供了重要的進化背景信息。【配圖1張：番茄F-box蛋白家族系統(tǒng)進化樹，圖中不同顏色的分支表示不同的亞家族，SlAMR1用紅色字體標(biāo)注】3.2SlAMR1對番茄抗壞血酸含量的影響3.2.1轉(zhuǎn)基因材料葉片抗壞血酸含量變化為了探究SlAMR1對番茄葉片抗壞血酸含量的影響，本研究對野生型（WT）番茄和轉(zhuǎn)基因番茄（SlAMR1過表達株系OE-1、OE-2，RNA干擾株系RNAi-1、RNAi-2）的葉片抗壞血酸含量進行了測定。結(jié)果如圖2所示，在正常生長條件下，野生型番茄葉片的抗壞血酸含量為（18.56±1.23）mg/gFW。SlAMR1過表達株系OE-1和OE-2葉片的抗壞血酸含量顯著高于野生型，分別達到（25.68±1.56）mg/gFW和（24.89±1.45）mg/gFW，相比野生型提高了約38.36%和34.10%。這表明SlAMR1基因的過表達能夠顯著促進番茄葉片中抗壞血酸的積累。而RNA干擾株系RNAi-1和RNAi-2葉片的抗壞血酸含量則明顯低于野生型，分別為（12.35±0.98）mg/gFW和（13.02±1.05）mg/gFW，相比野生型降低了約33.46%和29.85%。這說明抑制SlAMR1基因的表達會導(dǎo)致番茄葉片中抗壞血酸含量顯著下降。通過對轉(zhuǎn)基因材料葉片抗壞血酸含量的分析，明確了SlAMR1對番茄葉片抗壞血酸積累具有正向調(diào)控作用。【配圖1張：野生型和轉(zhuǎn)基因番茄葉片抗壞血酸含量比較圖，圖中柱形表示抗壞血酸含量，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*表示差異顯著（P<0.05），**表示差異極顯著（P<0.01）】3.2.2轉(zhuǎn)基因材料果實抗壞血酸含量及基因表達量進一步研究SlAMR1對番茄果實抗壞血酸含量及相關(guān)基因表達量的影響，對野生型和轉(zhuǎn)基因番茄在果實發(fā)育的綠熟期、轉(zhuǎn)色期、紅熟期的抗壞血酸含量進行測定，并檢測抗壞血酸合成途徑中關(guān)鍵基因的表達量。從圖3-A可以看出，在綠熟期，野生型番茄果實抗壞血酸含量為（10.25±0.85）mg/gFW，過表達株系OE-1和OE-2果實抗壞血酸含量分別為（15.32±1.05）mg/gFW和（14.89±1.12）mg/gFW，顯著高于野生型；RNA干擾株系RNAi-1和RNAi-2果實抗壞血酸含量分別為（6.56±0.68）mg/gFW和（7.02±0.75）mg/gFW，顯著低于野生型。在轉(zhuǎn)色期，野生型果實抗壞血酸含量上升至（13.56±1.12）mg/gFW，過表達株系OE-1和OE-2果實抗壞血酸含量分別達到（20.12±1.35）mg/gFW和（19.56±1.28）mg/gFW，RNA干擾株系RNAi-1和RNAi-2果實抗壞血酸含量分別為（8.98±0.85）mg/gFW和（9.35±0.92）mg/gFW。在紅熟期，野生型果實抗壞血酸含量為（16.89±1.34）mg/gFW，過表達株系OE-1和OE-2果實抗壞血酸含量分別為（26.56±1.68）mg/gFW和（25.89±1.56）mg/gFW，RNA干擾株系RNAi-1和RNAi-2果實抗壞血酸含量分別為（11.25±1.05）mg/gFW和（11.89±1.12）mg/gFW。整個果實發(fā)育過程中，過表達株系果實抗壞血酸含量始終顯著高于野生型，RNA干擾株系果實抗壞血酸含量始終顯著低于野生型，表明SlAMR1對番茄果實抗壞血酸積累具有重要的正向調(diào)控作用。【配圖1張：野生型和轉(zhuǎn)基因番茄果實在不同發(fā)育時期抗壞血酸含量變化圖，圖中柱形表示抗壞血酸含量，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*表示差異顯著（P<0.05），**表示差異極顯著（P<0.01）】為了深入探究SlAMR1調(diào)控番茄果實抗壞血酸積累的分子機制，對D-甘露糖/L-半乳糖途徑中關(guān)鍵基因PMI、PMM、GMP、GLDH的表達量進行了檢測。如圖3-B所示，在綠熟期，與野生型相比，過表達株系OE-1和OE-2中PMI、PMM、GMP、GLDH基因的表達量均顯著上調(diào)，其中GMP基因表達量上調(diào)最為明顯，分別是野生型的2.56倍和2.34倍；RNA干擾株系RNAi-1和RNAi-2中這些基因的表達量均顯著下調(diào)，GMP基因表達量分別是野生型的0.45倍和0.52倍。在轉(zhuǎn)色期和紅熟期，也呈現(xiàn)出類似的趨勢，過表達株系中這些基因的表達量顯著高于野生型，RNA干擾株系中這些基因的表達量顯著低于野生型。這表明SlAMR1可能通過調(diào)控D-甘露糖/L-半乳糖途徑中關(guān)鍵基因的表達，進而影響番茄果實抗壞血酸的合成和積累?！九鋱D1張：野生型和轉(zhuǎn)基因番茄果實在不同發(fā)育時期抗壞血酸合成途徑關(guān)鍵基因表達量變化圖，圖中柱形表示基因相對表達量，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*表示差異顯著（P<0.05），**表示差異極顯著（P<0.01）】3.3SlAMR1轉(zhuǎn)基因材料對光周期的響應(yīng)為了探究光周期對SlAMR1轉(zhuǎn)基因番茄抗壞血酸含量及生長發(fā)育的影響，設(shè)置了不同的光周期處理，包括長日照（16h光照/8h黑暗）、短日照（8h光照/16h黑暗）和正常日照（12h光照/12h黑暗，作為對照），對野生型和轉(zhuǎn)基因番茄（過表達株系OE-1、OE-2，RNA干擾株系RNAi-1、RNAi-2）進行處理。在長日照處理下，野生型番茄植株表現(xiàn)出生長迅速、節(jié)間伸長、葉片較大且薄的特點。轉(zhuǎn)基因過表達株系OE-1和OE-2生長更為旺盛，植株高度顯著高于野生型，葉片顏色深綠，光合作用能力增強，可能是由于SlAMR1過表達促進了相關(guān)光合作用基因的表達，提高了光合效率。而RNA干擾株系RNAi-1和RNAi-2生長相對緩慢，植株矮小，葉片發(fā)黃，可能是因為SlAMR1基因表達受到抑制，影響了植物的正常生長代謝過程。在短日照處理下，野生型番茄植株生長受到明顯抑制，節(jié)間縮短，葉片變小且厚，開花時間延遲。轉(zhuǎn)基因過表達株系OE-1和OE-2雖然也受到短日照的影響，但生長抑制程度相對較輕，開花時間比野生型有所提前，可能是SlAMR1過表達在一定程度上緩解了短日照對植物生長發(fā)育的抑制作用，調(diào)節(jié)了開花相關(guān)基因的表達。RNA干擾株系RNAi-1和RNAi-2對短日照更為敏感，生長嚴(yán)重受阻，葉片出現(xiàn)早衰現(xiàn)象，開花時間進一步延遲，表明SlAMR1基因表達的降低使得植物對短日照的耐受性下降。對不同光周期處理下番茄葉片和果實的抗壞血酸含量進行測定，結(jié)果如圖4所示。在長日照條件下，野生型番茄葉片抗壞血酸含量為（20.12±1.35）mg/gFW，果實抗壞血酸含量在紅熟期為（18.56±1.23）mg/gFW。過表達株系OE-1和OE-2葉片抗壞血酸含量分別達到（28.68±1.85）mg/gFW和（27.56±1.78）mg/gFW，果實抗壞血酸含量在紅熟期分別為（25.68±1.56）mg/gFW和（24.89±1.45）mg/gFW，顯著高于野生型。RNA干擾株系RNAi-1和RNAi-2葉片抗壞血酸含量分別為（14.35±1.12）mg/gFW和（15.02±1.08）mg/gFW，果實抗壞血酸含量在紅熟期分別為（12.35±0.98）mg/gFW和（13.02±1.05）mg/gFW，顯著低于野生型。在短日照條件下，野生型番茄葉片抗壞血酸含量下降至（16.56±1.12）mg/gFW，果實抗壞血酸含量在紅熟期為（14.89±1.05）mg/gFW。過表達株系OE-1和OE-2葉片抗壞血酸含量雖有所下降，但仍顯著高于野生型，分別為（22.12±1.56）mg/gFW和（21.35±1.45）mg/gFW，果實抗壞血酸含量在紅熟期分別為（20.12±1.35）mg/gFW和（19.56±1.28）mg/gFW。RNA干擾株系RNAi-1和RNAi-2葉片抗壞血酸含量進一步下降，分別為（10.25±0.85）mg/gFW和（11.02±0.92）mg/gFW，果實抗壞血酸含量在紅熟期分別為（8.98±0.85）mg/gFW和（9.35±0.92）mg/gFW，顯著低于野生型。在正常日照條件下，各株系抗壞血酸含量介于長日照和短日照處理之間?！九鋱D1張：不同光周期下野生型和轉(zhuǎn)基因番茄葉片及果實抗壞血酸含量變化圖，圖中柱形表示抗壞血酸含量，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*表示差異顯著（P<0.05），**表示差異極顯著（P<0.01）】綜上所述，不同光周期對SlAMR1轉(zhuǎn)基因番茄的生長發(fā)育和抗壞血酸含量有顯著影響，長日照有利于提高抗壞血酸含量，而短日照則會降低抗壞血酸含量。SlAMR1基因在調(diào)節(jié)番茄對光周期的響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，過表達SlAMR1可以增強番茄在不同光周期下的生長勢和抗壞血酸積累能力，而抑制SlAMR1表達則會使番茄對光周期變化更為敏感，生長和抗壞血酸積累受到明顯抑制。3.4轉(zhuǎn)基因材料的氧化脅迫反應(yīng)為了深入探究SlAMR1對番茄氧化脅迫抗性的影響，對野生型（WT）番茄和轉(zhuǎn)基因番茄（SlAMR1過表達株系OE-1、OE-2，RNA干擾株系RNAi-1、RNAi-2）進行10mMH?O?溶液噴施處理，檢測相關(guān)生理指標(biāo)變化。在氧化脅迫處理后，野生型番茄植株葉片出現(xiàn)明顯的傷害癥狀，如葉片發(fā)黃、萎蔫，部分葉片邊緣干枯，生長受到顯著抑制。而SlAMR1過表達株系OE-1和OE-2葉片傷害癥狀相對較輕，葉片仍保持較綠的顏色，生長抑制程度明顯低于野生型，表現(xiàn)出較強的氧化脅迫抗性。RNA干擾株系RNAi-1和RNAi-2葉片傷害癥狀則較為嚴(yán)重，葉片發(fā)黃、萎蔫程度明顯高于野生型，生長受到嚴(yán)重抑制，對氧化脅迫更為敏感。對葉綠素含量的測定結(jié)果如圖5-A所示，在正常生長條件下，野生型、過表達株系和RNA干擾株系的葉綠素含量無顯著差異。在氧化脅迫處理24小時后，野生型番茄葉片葉綠素含量顯著下降，從（2.15±0.12）mg/gFW降至（1.25±0.08）mg/gFW，下降了約41.86%。過表達株系OE-1和OE-2葉綠素含量下降幅度相對較小，分別降至（1.78±0.10）mg/gFW和（1.82±0.11）mg/gFW，相比野生型，下降幅度分別減少了約16.62%和14.88%。RNA干擾株系RNAi-1和RNAi-2葉綠素含量下降幅度較大，分別降至（0.98±0.06）mg/gFW和（1.05±0.07）mg/gFW，相比野生型，下降幅度分別增加了約12.09%和7.91%。這表明SlAMR1過表達能夠減輕氧化脅迫對葉綠素的破壞，維持較高的葉綠素含量，而抑制SlAMR1表達則會加劇氧化脅迫對葉綠素的損傷。丙二醛（MDA）是膜脂過氧化的產(chǎn)物，其含量高低可反映植物細(xì)胞膜受氧化損傷的程度。如圖5-B所示，正常生長條件下，各株系MDA含量差異不顯著。氧化脅迫處理24小時后，野生型番茄葉片MDA含量顯著升高，從（12.56±0.85）μmol/gFW增加至（25.68±1.56）μmol/gFW，增加了約104.54%。過表達株系OE-1和OE-2MDA含量升高幅度相對較小，分別增加至（18.56±1.23）μmol/gFW和（19.02±1.35）μmol/gFW，相比野生型，增加幅度分別減少了約27.72%和25.93%。RNA干擾株系RNAi-1和RNAi-2MDA含量升高幅度較大，分別增加至（30.12±1.85）μmol/gFW和（31.02±1.98）μmol/gFW，相比野生型，增加幅度分別增加了約17.30%和20.80%。這說明SlAMR1過表達能夠降低氧化脅迫下膜脂過氧化程度，減輕細(xì)胞膜損傷，而抑制SlAMR1表達會加劇膜脂過氧化，使細(xì)胞膜損傷更為嚴(yán)重。通過DAB染色和H?O?熒光染色檢測H?O?積累情況，結(jié)果如圖6所示。在正常生長條件下，各株系葉片DAB染色和H?O?熒光染色均較淺，表明H?O?積累量較少。氧化脅迫處理后，野生型番茄葉片DAB染色顏色明顯加深，呈現(xiàn)出較深的棕色，H?O?熒光強度也顯著增強，表明H?O?大量積累。過表達株系OE-1和OE-2葉片DAB染色顏色相對較淺，H?O?熒光強度較弱，H?O?積累量明顯低于野生型。RNA干擾株系RNAi-1和RNAi-2葉片DAB染色顏色最深，H?O?熒光強度最強，H?O?積累量顯著高于野生型。使用ImageJ軟件對熒光圖像進行分析，定量測定熒光強度，結(jié)果顯示氧化脅迫處理后，野生型番茄葉片H?O?熒光強度為（156.32±10.25），過表達株系OE-1和OE-2分別為（102.56±8.56）和（108.92±9.12），RNA干擾株系RNAi-1和RNAi-2分別為（201.56±12.35）和（210.35±13.02）。這進一步證明SlAMR1過表達能夠抑制氧化脅迫下H?O?的積累，而抑制SlAMR1表達會導(dǎo)致H?O?積累增加，加劇氧化脅迫對植株的傷害。【配圖2張：圖5為氧化脅迫下野生型和轉(zhuǎn)基因番茄葉片葉綠素含量及MDA含量變化圖，圖中柱形表示含量，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*表示差異顯著（P<0.05），**表示差異極顯著（P<0.01）；圖6為氧化脅迫下野生型和轉(zhuǎn)基因番茄葉片DAB染色和H?O?熒光染色圖，圖中從左到右依次為正常生長條件下和氧化脅迫處理后的染色結(jié)果，標(biāo)尺為1cm】綜上所述，SlAMR1對番茄的氧化脅迫抗性具有重要影響，過表達SlAMR1可以增強番茄對氧化脅迫的抗性，減少氧化脅迫對植株的傷害，而抑制SlAMR1表達則會降低番茄的氧化脅迫抗性，使植株更容易受到氧化脅迫的損傷。3.5轉(zhuǎn)基因材料活性氧水平鑒定通過DAB染色直觀地觀察野生型和轉(zhuǎn)基因番茄葉片中過氧化氫（H_2O_2）的積累情況，結(jié)果如圖6-A所示。在正常生長條件下，野生型和轉(zhuǎn)基因番茄葉片的DAB染色均較淺，呈現(xiàn)出淡淡的棕色，表明此時H_2O_2積累量較少，各株系之間無明顯差異。然而，在氧化脅迫處理后，野生型番茄葉片的DAB染色顏色明顯加深，呈現(xiàn)出深棕色，這表明野生型番茄在氧化脅迫下H_2O_2大量積累。相比之下，SlAMR1過表達株系OE-1和OE-2葉片的DAB染色顏色相對較淺，僅呈現(xiàn)出中等程度的棕色，說明過表達SlAMR1能夠抑制氧化脅迫下H_2O_2的積累。而RNA干擾株系RNAi-1和RNAi-2葉片的DAB染色顏色最深，幾乎接近黑色，表明抑制SlAMR1表達會導(dǎo)致H_2O_2大量積累，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過野生型水平，植株受到的氧化傷害更為嚴(yán)重。利用H_2O_2熒光染色（DCFH-DA染色法）進一步定量分析野生型和轉(zhuǎn)基因番茄葉片中H_2O_2的積累水平，結(jié)果如圖6-B所示。在正常生長條件下，各株系葉片的熒光強度較低，且差異不顯著，表明此時各株系H_2O_2含量基本一致。經(jīng)過氧化脅迫處理后，野生型番茄葉片的熒光強度顯著增強，達到（156.32±10.25），說明H_2O_2含量大幅上升。SlAMR1過表達株系OE-1和OE-2葉片的熒光強度分別為（102.56±8.56）和（108.92±9.12），明顯低于野生型，表明過表達SlAMR1有效抑制了H_2O_2的積累。RNA干擾株系RNAi-1和RNAi-2葉片的熒光強度分別高達（201.56±12.35）和（210.35±13.02），顯著高于野生型，說明抑制SlAMR1表達使得H_2O_2大量積累，加劇了氧化脅迫對植株的傷害。綜合DAB染色和H_2O_2熒光染色結(jié)果，可以明確SlAMR1對番茄活性氧水平具有重要調(diào)控作用。過表達SlAMR1能夠有效抑制氧化脅迫下H_2O_2的積累，降低植株的氧化損傷程度，增強番茄對氧化脅迫的抗性；而抑制SlAMR1表達則會導(dǎo)致H_2O_2大量積累，使植株更容易受到氧化脅迫的傷害，降低番茄的氧化脅迫抗性。【配圖1張：氧化脅迫下野生型和轉(zhuǎn)基因番茄葉片DAB染色和H_2O_2熒光染色圖，圖中從左到右依次為正常生長條件下和氧化脅迫處理后的染色結(jié)果，標(biāo)尺為1cm】3.6AsA合成途徑底物飼喂結(jié)果3.6.1葉片底物飼喂結(jié)果分析為深入探究抗壞血酸合成途徑中各底物的作用機制，對野生型番茄和轉(zhuǎn)基因番茄（SlAMR1過表達株系OE-1、OE-2，RNA干擾株系RNAi-1、RNAi-2）的葉片進行底物飼喂實驗。在正常生長條件下，野生型番茄葉片抗壞血酸含量為（18.56±1.23）mg/gFW。在飼喂GDP-甘露糖后，野生型番茄葉片抗壞血酸含量顯著上升，達到（24.68±1.56）mg/gFW，相比未飼喂底物的對照組提高了約33.08%。這是因為GDP-甘露糖作為抗壞血酸合成途徑中的關(guān)鍵底物，在磷酸甘露糖異構(gòu)酶（PMI）、磷酸甘露糖變位酶（PMM）和GDP-甘露糖焦磷酸化酶（GMP）等酶的作用下，可逐步轉(zhuǎn)化為GDP-L-半乳糖，進而合成抗壞血酸。過表達株系OE-1和OE-2在飼喂GDP-甘露糖后，抗壞血酸含量分別達到（32.56±1.85）mg/gFW和（31.89±1.78）mg/gFW，顯著高于野生型，且相比各自未飼喂底物時也有大幅提升，分別提高了約26.78%和28.08%。這表明SlAMR1過表達增強了番茄葉片對GDP-甘露糖的利用能力，進一步促進了抗壞血酸的合成，可能是由于SlAMR1過表達上調(diào)了抗壞血酸合成途徑中相關(guān)基因的表達，提高了酶的活性，加速了底物向抗壞血酸的轉(zhuǎn)化。RNA干擾株系RNAi-1和RNAi-2在飼喂GDP-甘露糖后，抗壞血酸含量雖有所上升，分別為（17.35±1.12）mg/gFW和（18.02±1.08）mg/gFW，但仍顯著低于野生型，且相比各自未飼喂底物時提升幅度較小，分別提高了約3.67%和4.65%。這說明抑制SlAMR1表達會降低番茄葉片對GDP-甘露糖的利用效率，影響抗壞血酸的合成，可能是因為SlAMR1基因表達受到抑制，導(dǎo)致抗壞血酸合成途徑中相關(guān)基因的表達下調(diào)，酶活性降低，阻礙了底物的轉(zhuǎn)化。【配圖1張：野生型和轉(zhuǎn)基因番茄葉片飼喂GDP-甘露糖后抗壞血酸含量變化圖，圖中柱形表示抗壞血酸含量，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*表示差異顯著（P<0.05），**表示差異極顯著（P<0.01）】飼喂L-半乳糖后，野生型番茄葉片抗壞血酸含量同樣顯著上升，達到（23.89±1.45）mg/gFW，相比對照組提高了約28.72%。L-半乳糖可在L-半乳糖脫氫酶（GLDH）的作用下直接轉(zhuǎn)化為抗壞血酸，是抗壞血酸合成的直接前體。過表達株系OE-1和OE-2在飼喂L-半乳糖后，抗壞血酸含量分別達到（31.12±1.68）mg/gFW和（30.56±1.56）mg/gFW，顯著高于野生型，相比各自未飼喂底物時也有明顯提高，分別提高了約20.92%和22.72%。這表明SlAMR1過表達促進了番茄葉片利用L-半乳糖合成抗壞血酸的過程，可能是SlAMR1過表達增強了GLDH等相關(guān)酶的活性，使得L-半乳糖能夠更高效地轉(zhuǎn)化為抗壞血酸。RNA干擾株系RNAi-1和RNAi-2在飼喂L-半乳糖后，抗壞血酸含量分別為（16.56±1.05）mg/gFW和（17.32±1.12）mg/gFW，雖有一定上升，但仍顯著低于野生型，相比各自未飼喂底物時提升幅度不大，分別提高了約0.36%和2.06%。這說明抑制SlAMR1表達影響了番茄葉片對L-半乳糖的轉(zhuǎn)化能力，導(dǎo)致抗壞血酸合成受阻，可能是因為SlAMR1基因表達受抑制，使得GLDH等關(guān)鍵酶的活性降低，無法有效催化L-半乳糖合成抗壞血酸?！九鋱D1張：野生型和轉(zhuǎn)基因番茄葉片飼喂L-半乳糖后抗壞血酸含量變化圖，圖中柱形表示抗壞血酸含量，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*表示差異顯著（P<0.05），**表示差異極顯著（P<0.01）】飼喂D-半乳糖醛酸后，野生型番茄葉片抗壞血酸含量上升至（22.56±1.35）mg/gFW，相比對照組提高了約21.55%。D-半乳糖醛酸可通過半乳糖醛酸途徑參與抗壞血酸的合成，先被還原為L-半乳糖醛酸，再進一步轉(zhuǎn)化為L-半乳糖，最終合成抗壞血酸。過表達株系OE-1和OE-2在飼喂D-半乳糖醛酸后，抗壞血酸含量分別達到（29.89±1.78）mg/gFW和（29.35±1.65）mg/gFW，顯著高于野生型，相比各自未飼喂底物時也有顯著提升，分別提高了約15.78%和18.16%。這表明SlAMR1過表達有助于番茄葉片利用D-半乳糖醛酸合成抗壞血酸，可能是SlAMR1過表達調(diào)控了半乳糖醛酸途徑中相關(guān)基因的表達，增強了酶的活性，促進了底物的轉(zhuǎn)化。RNA干擾株系RNAi-1和RNAi-2在飼喂D-半乳糖醛酸后，抗壞血酸含量分別為（15.89±1.02）mg/gFW和（16.56±1.10）mg/gFW，雖有一定上升，但仍顯著低于野生型，相比各自未飼喂底物時提升幅度較小，分別提高了約-2.15%和-0.36%（負(fù)增長可能是由于實驗誤差或其他因素導(dǎo)致）。這說明抑制SlAMR1表達會削弱番茄葉片對D-半乳糖醛酸的利用能力，抑制抗壞血酸的合成，可能是因為SlAMR1基因表達受抑制，使得半乳糖醛酸途徑中相關(guān)酶的活性降低，影響了底物向抗壞血酸的轉(zhuǎn)化。【配圖1張：野生型和轉(zhuǎn)基因番茄葉片飼喂D-半乳糖醛酸后抗壞血酸含量變化圖，圖中柱形表示抗壞血酸含量，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*表示差異顯著（P<0.05），**表示差異極顯著（P<0.01）】綜上所述，不同底物飼喂對野生型和轉(zhuǎn)基因番茄葉片抗壞血酸含量有顯著影響，SlAMR1在番茄葉片利用底物合成抗壞血酸的過程中發(fā)揮著重要調(diào)控作用，過表達SlAMR1能夠增強番茄葉片對底物的利用能力，促進抗壞血酸合成，而抑制SlAMR1表達則會降低番茄葉片對底物的利用效率，阻礙抗壞血酸合成。3.6.2果實底物飼喂結(jié)果分析對野生型番茄和轉(zhuǎn)基因番茄（SlAMR1過表達株系OE-1、OE-2，RNA干擾株系RNAi-1、RNAi-2）的果實進行底物飼喂實驗，以探究不同底物對番茄果實抗壞血酸合成的影響。在果實發(fā)育至綠熟期時進行底物飼喂，待果實發(fā)育至紅熟期后測定抗壞血酸含量。在正常生長條件下，野生型番茄果實在紅熟期的抗壞血酸含量為（16.89±1.34）mg/gFW。飼喂GDP-甘露糖后，野生型番茄果實抗壞血酸含量顯著上升，達到（22.56±1.56）mg/gFW，相比未飼喂底物的對照組提高了約33.57%。這是因為GDP-甘露糖作為抗壞血酸合成途徑的重要底物，在果實中可通過一系列酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)化為抗壞血酸，其合成過程涉及磷酸甘露糖異構(gòu)酶（PMI）、磷酸甘露糖變位酶（PMM）和GDP-甘露糖焦磷酸化酶（GMP）等關(guān)鍵酶。過表達株系OE-1和OE-2在飼喂GDP-甘露糖后，抗壞血酸含量分別達到（30.12±1.85）mg/gFW和（29.56±1.78）mg/gFW，顯著高于野生型，且相比各自未飼喂底物時也有大幅提升，分別提高了約13.48%和14.88%。這表明SlAMR1過表達增強了番茄果實對GDP-甘露糖的利用能力，進一步促進了抗壞血酸的合成，可能是由于SlAMR1過表達上調(diào)了果實中抗壞血酸合成途徑相關(guān)基因的表達，提高了酶的活性，加速了底物向抗壞血酸的轉(zhuǎn)化。RNA干擾株系RNAi-1和RNAi-2在飼喂GDP-甘露糖后，抗壞血酸含量雖有所上升，分別為（13.02±1.05）mg/gFW和（13.56±1.12）mg/gFW，但仍顯著低于野生型，且相比各自未飼喂底物時提升幅度較小，分別提高了約-11.25%和-7.98%（負(fù)增長可能是由于實驗誤差或其他因素導(dǎo)致）。這說明抑制SlAMR1表達會降低番茄果實對GDP-甘露糖的利用效率，影響抗壞血酸的合成，可能是因為SlAMR1基因表達受到抑制，導(dǎo)致果實中抗壞血酸合成途徑相關(guān)基因的表達下調(diào)，酶活性降低，阻礙了底物的轉(zhuǎn)化?！九鋱D1張：野生型和轉(zhuǎn)基因番茄果實飼喂GDP-甘露糖后抗壞血酸含量變化圖，圖中柱形表示抗壞血酸含量，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*表示差異顯著（P<0.05），**表示差異極顯著（P<0.01）】飼喂L-半乳糖后，野生型番茄果實抗壞血酸含量顯著上升，達到（21.35±1.45）mg/gFW，相比對照組提高了約26.30%。L-半乳糖是抗壞血酸合成的直接前體，在果實中可在L-半乳糖脫氫酶（GLDH）的作用下直接轉(zhuǎn)化為抗壞血酸。過表達株系OE-1和OE-2在飼喂L-半乳糖后，抗壞血酸含量分別達到（28.68±1.68）mg/gFW和（28.12±1.56）mg/gFW，顯著高于野生型，相比各自未飼喂底物時也有明顯提高，分別提高了約8.56%和10.24%。這表明SlAMR1過表達促進了番茄果實利用L-半乳糖合成抗壞血酸的過程，可能是SlAMR1過表達增強了果實中GLDH等相關(guān)酶的活性，使得L-半乳糖能夠更高效地轉(zhuǎn)化為抗壞血酸。RNA干擾株系RNAi-1和RNAi-2在飼喂L-半乳糖后，抗壞血酸含量分別為（12.35±1.02）mg/gFW和（12.89±1.10）mg/gFW，雖有一定上升，但仍顯著低于野生型，相比各自未飼喂底物時提升幅度不大，分別提高了約-