Fas信號在肺癌生長進程中的促癌作用及機制深度剖析一、引言1.1研究背景與意義肺癌，作為全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率均居首位的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。根據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)，當(dāng)年全球新增肺癌病例約220萬例，占所有癌癥新發(fā)病例的11.4%；肺癌死亡病例約180萬例，占所有癌癥死亡病例的18.0%。在中國，肺癌的形勢同樣嚴(yán)峻，2020年新發(fā)病例約82.8萬例，死亡病例約71.4萬例，發(fā)病率和死亡率均高居各類癌癥之首。肺癌的發(fā)病機制極為復(fù)雜，涉及多個基因、信號通路以及環(huán)境因素的相互作用。目前，雖然手術(shù)、化療、放療、靶向治療和免疫治療等多種治療手段在肺癌治療中取得了一定進展，但晚期肺癌患者的5年生存率仍僅約為15%-20%。這主要是因為肺癌早期癥狀隱匿，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，錯過手術(shù)根治的最佳時機，且肺癌細(xì)胞容易發(fā)生耐藥和轉(zhuǎn)移，進一步增加了治療的難度。因此，深入研究肺癌的發(fā)病機制，尋找新的治療靶點和策略，對于提高肺癌患者的生存率和生活質(zhì)量具有迫切而重要的意義。Fas信號通路作為細(xì)胞凋亡和增殖調(diào)控的關(guān)鍵通路之一，近年來在腫瘤研究領(lǐng)域備受關(guān)注。Fas（又稱Apo-1或CD95）是腫瘤壞死因子受體超家族的成員，其配體為FasL。Fas與FasL結(jié)合后，可通過死亡結(jié)構(gòu)域招募Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（FADD），進而激活半胱天冬酶（caspase）級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在正常生理狀態(tài)下，F(xiàn)as信號通路對于維持機體細(xì)胞數(shù)量的平衡、清除受損或異常細(xì)胞起著重要作用。然而，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，F(xiàn)as信號通路常常出現(xiàn)異常。一方面，腫瘤細(xì)胞可能通過下調(diào)Fas表達或上調(diào)FasL表達，逃避機體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和殺傷，促進腫瘤細(xì)胞的存活和增殖；另一方面，F(xiàn)as信號通路的異常激活也可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對化療、放療等治療手段產(chǎn)生抵抗，影響治療效果。已有研究表明，在肺癌中Fas信號通路存在異常表達和功能失調(diào)。例如，董西林等人通過免疫組化SP法檢測發(fā)現(xiàn)，肺癌組織中Fas表達下調(diào)，F(xiàn)asL表達明顯上調(diào)，且Fas表達與肺癌的病理分級、臨床分期及轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，F(xiàn)asL表達與肺癌的病理分級、臨床分期及轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。這提示Fas/FasL系統(tǒng)的表達異?？赡茉诜伟┑陌l(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。然而，目前關(guān)于Fas信號通路在肺癌生長中的具體作用及分子機制仍不完全清楚，尚有許多問題亟待解決。本研究聚焦于Fas信號對肺癌生長的影響及其內(nèi)在機制，旨在深入探究Fas信號通路在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制，明確Fas信號通路在肺癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為中的調(diào)控作用，以及相關(guān)的分子機制和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。通過本研究，有望為肺癌的診斷和治療提供新的靶點和策略，為開發(fā)更加有效的肺癌治療方法奠定理論基礎(chǔ)。同時，本研究也有助于進一步加深對肺癌發(fā)病機制的理解，豐富腫瘤生物學(xué)的理論知識，為腫瘤防治領(lǐng)域的研究提供新的思路和方向。1.2Fas信號通路概述Fas信號通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號傳導(dǎo)途徑，在細(xì)胞的生命活動中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Fas，又稱Apo-1或CD95，是一種I型跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族成員。其胞外區(qū)包含三個富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)與配體結(jié)合；胞內(nèi)區(qū)含有一個約80個氨基酸組成的死亡結(jié)構(gòu)域（deathdomain，DD），該結(jié)構(gòu)域?qū)τ谛盘柕膫鬟f至關(guān)重要。FasL（Fasligand）是Fas的天然配體，屬于TNF家族II型跨膜蛋白，它主要表達于活化的T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）等免疫細(xì)胞表面。FasL也可通過金屬蛋白酶的作用以可溶形式排出，進而與細(xì)胞膜表面的Fas受體結(jié)合。當(dāng)Fas與FasL結(jié)合后，F(xiàn)as受體發(fā)生三聚化，其胞內(nèi)的死亡結(jié)構(gòu)域（DD）通過與信號銜接子如Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（FADD）、Fas相關(guān)因子-1（FAF-1）、死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白（Daxx）、Fas相關(guān)磷酸酶-1（FAP-1）、FLICE相關(guān)巨大蛋白（FLASH）和受體相互作用蛋白（RIP）等相互作用，啟動下游的信號傳導(dǎo)。其中，F(xiàn)ADD在Fas信號通路的凋亡誘導(dǎo)過程中發(fā)揮著核心作用。FADD含有一個死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域（DED），它能夠通過同源相互作用募集含有半胱天冬酶-8前體蛋白質(zhì)的DED，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物（DISC）。在I型細(xì)胞中，半胱天冬酶-8前體在DISC中經(jīng)蛋白水解激活為具有活性的半胱天冬酶-8。激活后的半胱天冬酶-8進一步裂解并激活下游的效應(yīng)半胱天冬酶，如半胱天冬酶-3、-6和-7。這些效應(yīng)半胱天冬酶可以作用于多種細(xì)胞骨架和核蛋白，如聚ADP核糖聚合酶（PARP）、α-胞襯蛋白、生長休止特定蛋白-2（GAS2）、核纖層蛋白A和B（Lamin-A和B）以及p21激活激酶（PAK）等，導(dǎo)致這些蛋白的分解，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。半胱天冬酶-3還可以裂解半胱天冬酶激活的DNA酶（CAD）的抑制劑ICAD，使CAD釋放進入細(xì)胞核并裂解DNA，引發(fā)細(xì)胞凋亡的典型特征——DNA片段化。在II型細(xì)胞中，活化的半胱天冬酶-8通過裂解Bcl2相互作用蛋白（BID）來激活線粒體凋亡途徑。BID被半胱天冬酶-8裂解后，其COOH末端部分易位至線粒體，在線粒體處觸發(fā)線粒體促凋亡因子的釋放，如細(xì)胞色素C（CytoC）和第二線粒體源半胱天冬酶激活劑（SMAC，也稱為Diablo）。釋放的CytoC與凋亡蛋白酶激活因子-1（APAF1）以及dATP和半胱天冬酶9前體結(jié)合形成凋亡小體，激活半胱天冬酶-9。半胱天冬酶-9進而裂解半胱天冬酶-3前體并激活半胱天冬酶-3，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。除了凋亡信號傳導(dǎo)外，F(xiàn)as信號通路還可以激活其他信號通路。例如，F(xiàn)as受體激活后可以通過募集腫瘤壞死因子相關(guān)因子-1（TRAF1）、TRAF2、MAP激酶激酶激酶（MAPKKK）Raf1和RIP等，激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）和核因子κB（NF-κB）通路。這些通路的激活可以導(dǎo)致細(xì)胞的增殖和/或炎癥反應(yīng)。此外，F(xiàn)as信號通路還與細(xì)胞的遷移、侵襲等過程相關(guān)，但其具體機制尚不完全清楚。在正常生理過程中，F(xiàn)as信號通路主要參與免疫調(diào)節(jié)、組織發(fā)育和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)維持等。在免疫系統(tǒng)中，F(xiàn)as-FasL相互作用對于清除活化的T淋巴細(xì)胞、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的強度以及維持免疫耐受具有重要意義。缺乏Fas-FasL系統(tǒng)會導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生，表明Fas介導(dǎo)的凋亡能夠清除自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞。在組織發(fā)育過程中，F(xiàn)as信號通路參與細(xì)胞的程序性死亡，有助于器官的正常形態(tài)發(fā)生和組織重塑。在細(xì)胞穩(wěn)態(tài)維持方面，F(xiàn)as信號通路能夠及時清除受損、衰老或異常的細(xì)胞，保持組織和器官的正常功能。1.3肺癌生長相關(guān)機制的研究現(xiàn)狀肺癌的生長是一個復(fù)雜的多步驟過程，涉及多種分子和細(xì)胞機制的異常改變。在分子層面，眾多癌基因的激活和抑癌基因的失活在肺癌生長中起著關(guān)鍵作用。例如，在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中，約30%-50%的病例存在表皮生長因子受體（EGFR）基因的突變。EGFR屬于受體酪氨酸激酶家族，其突變導(dǎo)致受體持續(xù)激活，通過RAS-RAF-MEK-ERK和PI3K-AKT等下游信號通路，促進細(xì)胞的增殖、存活、遷移和血管生成。Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（KRAS）也是一種重要的癌基因，在15%-30%的NSCLC中發(fā)生突變。KRAS突變后處于持續(xù)激活狀態(tài)，激活下游的RAS-RAF-MEK-ERK和PI3K-AKT信號通路，促進肺癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。此外，抑癌基因如p53、RB1等的失活也與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。p53基因在約50%的肺癌中發(fā)生突變或缺失，失去了對細(xì)胞周期和凋亡的調(diào)控功能，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖。RB1基因編碼的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（pRB）在細(xì)胞周期調(diào)控中起關(guān)鍵作用，RB1基因的失活可導(dǎo)致細(xì)胞周期失控，促進肺癌細(xì)胞的生長。在細(xì)胞層面，肺癌細(xì)胞的增殖、凋亡失衡以及腫瘤微環(huán)境的改變是肺癌生長的重要因素。肺癌細(xì)胞具有不受控制的增殖能力，通過不斷分裂增加細(xì)胞數(shù)量。同時，肺癌細(xì)胞還能夠逃避凋亡，這主要是由于凋亡相關(guān)基因和信號通路的異常。例如，B細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）家族蛋白在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用，Bcl-2的高表達可以抑制細(xì)胞凋亡，促進肺癌細(xì)胞的存活。此外，腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)等也對肺癌的生長產(chǎn)生重要影響。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）可以分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，促進腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成和免疫逃逸。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）可以通過分泌生長因子和細(xì)胞外基質(zhì)成分，為腫瘤細(xì)胞提供生長支持和遷移條件。腫瘤血管生成是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的必要條件，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是促進腫瘤血管生成的關(guān)鍵因子，它通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的受體結(jié)合，促進內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，為腫瘤細(xì)胞提供營養(yǎng)和氧氣。然而，目前對于肺癌生長機制的研究仍存在許多不足。一方面，雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多與肺癌生長相關(guān)的分子和信號通路，但它們之間的相互作用和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚未完全明確。例如，EGFR、KRAS等癌基因信號通路之間存在復(fù)雜的交叉對話，如何精準(zhǔn)地靶向這些信號通路，提高治療效果，仍是亟待解決的問題。另一方面，腫瘤微環(huán)境中各種細(xì)胞和分子之間的相互作用機制以及它們對肺癌生長的影響還需要進一步深入研究。例如，TAM在腫瘤微環(huán)境中的極化狀態(tài)和功能調(diào)控機制尚不完全清楚，如何通過調(diào)節(jié)TAM的功能來抑制肺癌的生長，也是研究的熱點之一。Fas信號通路作為細(xì)胞凋亡和增殖調(diào)控的重要通路，在肺癌生長中可能發(fā)揮著獨特的作用。已有研究表明，F(xiàn)as信號通路的異常與肺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Fas信號通路的異?？赡芡ㄟ^影響肺癌細(xì)胞的凋亡、增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)行為，以及腫瘤微環(huán)境的免疫調(diào)節(jié)和血管生成等過程，促進肺癌的生長。然而，目前關(guān)于Fas信號通路在肺癌生長中的具體作用機制仍不完全清楚，其與其他肺癌生長相關(guān)機制之間的關(guān)系也有待進一步研究。深入研究Fas信號通路在肺癌生長中的作用機制，不僅有助于揭示肺癌的發(fā)病機制，還可能為肺癌的治療提供新的靶點和策略。1.4研究目的與問題提出本研究旨在深入探究Fas信號通路在肺癌生長中的作用及其潛在分子機制，為肺癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點。具體研究目的如下：明確Fas信號對肺癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響：通過體外細(xì)胞實驗，利用細(xì)胞增殖實驗（如CCK-8法、EdU摻入實驗）、細(xì)胞凋亡檢測（如AnnexinV/PI雙染法、TUNEL法）、細(xì)胞遷移和侵襲實驗（如Transwell實驗、劃痕實驗）等方法，研究Fas信號通路的激活或抑制對肺癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲能力的影響，明確Fas信號在肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為中的作用。揭示Fas信號促進肺癌生長的分子機制：運用分子生物學(xué)技術(shù)，如蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）、實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）、免疫共沉淀（Co-IP）等，研究Fas信號通路激活后，下游相關(guān)信號分子和通路的變化，包括凋亡相關(guān)蛋白（如Bcl-2家族蛋白、caspase家族蛋白）、增殖相關(guān)蛋白（如PCNA、Ki-67）、遷移和侵襲相關(guān)蛋白（如MMPs、E-cadherin、N-cadherin）等的表達變化，以及MAPK、PI3K/AKT、NF-κB等信號通路的激活情況，揭示Fas信號促進肺癌生長的分子機制。探討Fas信號與肺癌腫瘤微環(huán)境的相互作用：采用免疫組化、免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)等方法，研究Fas信號通路在肺癌組織中的表達與腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞（如T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等）浸潤、細(xì)胞因子分泌（如IL-6、IL-10、TNF-α等）以及血管生成（如VEGF表達、微血管密度）之間的關(guān)系，探討Fas信號與肺癌腫瘤微環(huán)境的相互作用及其對肺癌生長的影響。評估Fas信號作為肺癌治療靶點的潛力：通過體內(nèi)動物實驗，構(gòu)建肺癌小鼠模型，給予Fas信號通路抑制劑或激活劑干預(yù)，觀察腫瘤生長情況、小鼠生存時間等指標(biāo)，評估Fas信號作為肺癌治療靶點的可行性和有效性，為肺癌的臨床治療提供新的策略和靶點?；谝陨涎芯磕康模岢鲆韵玛P(guān)鍵科學(xué)問題：Fas信號通路如何調(diào)控肺癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為？其中涉及哪些關(guān)鍵分子和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑？Fas信號通路與肺癌腫瘤微環(huán)境之間存在怎樣的相互作用？腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞和分子如何影響Fas信號通路的功能，反之，F(xiàn)as信號通路又如何影響腫瘤微環(huán)境的組成和功能，進而促進肺癌的生長？能否通過干預(yù)Fas信號通路來有效抑制肺癌的生長？Fas信號通路抑制劑或激活劑在肺癌治療中的療效和安全性如何？其作用機制是什么？二、Fas信號促進肺癌生長的實驗研究2.1實驗材料與方法2.1.1細(xì)胞系與實驗動物本研究選用人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和NCI-H1299，以及小鼠肺癌細(xì)胞系LLC。A549細(xì)胞系購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），其來源于人肺腺癌組織，具有上皮細(xì)胞特性，呈多邊形或梭形，細(xì)胞核較大，胞質(zhì)豐富。該細(xì)胞系表達多種與肺癌相關(guān)的標(biāo)記物，如CEA、LewisX抗原等，且具有快速增殖、無限增殖潛能和抗凋亡能力，是研究肺癌生長、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程的常用模型。NCI-H1299細(xì)胞系購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC），它是從接受過放射治療的患者的肺淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中建立的，屬于非小細(xì)胞癌的大細(xì)胞癌亞型，TP53功能缺失，導(dǎo)致對DNA損傷反應(yīng)和修復(fù)能力異常，增殖能力、遷移和侵襲能力較強，常用于轉(zhuǎn)移機制與腫瘤侵襲研究、TP53相關(guān)信號通路、藥物耐藥和靶向治療研究等。LLC細(xì)胞系由本實驗室保存，其來源于小鼠肺癌組織，可用于構(gòu)建小鼠肺癌模型，研究肺癌在小鼠體內(nèi)的生長和轉(zhuǎn)移情況。實驗動物選用SPF級C57BL/6小鼠和BALB/c裸鼠，均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。C57BL/6小鼠為近交系小鼠，毛色為黑色，基因背景清晰，免疫功能正常，常用于構(gòu)建肺癌同種移植模型。BALB/c裸鼠為免疫缺陷小鼠，缺乏T淋巴細(xì)胞，對異種移植的人腫瘤細(xì)胞具有較好的耐受性，常用于構(gòu)建肺癌異種移植模型。小鼠飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、相對濕度（50±10）%的SPF級動物房，自由攝食和飲水，適應(yīng)1周后進行實驗。2.1.2主要實驗試劑與儀器主要實驗試劑包括：Fas激動劑CH11（購自Sigma公司）、Fas抑制劑Z-IETD-FMK（購自MedChemExpress公司）、Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑（購自Invitrogen公司）、Fas過表達質(zhì)粒和FasshRNA質(zhì)粒（由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成）、胎牛血清（FBS，購自Gibco公司）、RPMI-1640培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基（購自HyClone公司）、CCK-8試劑盒（購自Dojindo公司）、AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（購自BDBiosciences公司）、Transwell小室（購自Corning公司）、Matrigel基質(zhì)膠（購自BDBiosciences公司）、兔抗人Fas多克隆抗體、兔抗人Bcl-2單克隆抗體、兔抗人Bax單克隆抗體、兔抗人caspase-3單克隆抗體、兔抗人PCNA單克隆抗體、兔抗人Ki-67單克隆抗體、兔抗人MMP-2單克隆抗體、兔抗人MMP-9單克隆抗體、兔抗人E-cadherin單克隆抗體、兔抗人N-cadherin單克隆抗體（均購自CellSignalingTechnology公司）、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（購自JacksonImmunoResearchLaboratories公司）、ECL化學(xué)發(fā)光試劑（購自ThermoFisherScientific公司）、TRIzol試劑（購自Invitrogen公司）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBRGreenPCRMasterMix（購自TaKaRa公司）等。主要實驗儀器包括：CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱（購自ThermoFisherScientific公司）、超凈工作臺（購自蘇州凈化設(shè)備有限公司）、倒置顯微鏡（購自O(shè)lympus公司）、酶標(biāo)儀（購自Bio-Rad公司）、流式細(xì)胞儀（購自BDBiosciences公司）、實時熒光定量PCR儀（購自AppliedBiosystems公司）、蛋白質(zhì)電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（購自Bio-Rad公司）、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（購自Tanon公司）、低速離心機和高速冷凍離心機（購自Eppendorf公司）等。2.1.3實驗設(shè)計與分組體外實驗分組：A549和NCI-H1299細(xì)胞實驗：對照組：常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，不做任何處理。Fas激動劑組：加入Fas激動劑CH11（終濃度為100ng/mL）處理細(xì)胞，作用24h、48h和72h，分別檢測細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等指標(biāo)。Fas抑制劑組：加入Fas抑制劑Z-IETD-FMK（終濃度為10μM）預(yù)處理細(xì)胞1h后，再加入Fas激動劑CH11（終濃度為100ng/mL）處理細(xì)胞，作用24h、48h和72h，檢測相應(yīng)指標(biāo)。Fas過表達組：將Fas過表達質(zhì)粒通過Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48h后，用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達Fas的細(xì)胞株。篩選出的細(xì)胞株常規(guī)培養(yǎng)，檢測Fas表達水平，并與對照組比較細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等指標(biāo)的變化。Fas敲低組：將FasshRNA質(zhì)粒通過Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48h后，用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定敲低Fas的細(xì)胞株。篩選出的細(xì)胞株常規(guī)培養(yǎng)，檢測Fas表達水平，并與對照組比較細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等指標(biāo)的變化。LLC細(xì)胞實驗：對照組：常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，不做任何處理。Fas激動劑組：加入Fas激動劑CH11（終濃度為100ng/mL）處理細(xì)胞，作用24h、48h和72h，分別檢測細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等指標(biāo)。Fas抑制劑組：加入Fas抑制劑Z-IETD-FMK（終濃度為10μM）預(yù)處理細(xì)胞1h后，再加入Fas激動劑CH11（終濃度為100ng/mL）處理細(xì)胞，作用24h、48h和72h，檢測相應(yīng)指標(biāo)。體內(nèi)實驗分組：C57BL/6小鼠肺癌同種移植模型實驗：對照組：將LLC細(xì)胞（1×10?個/只）接種于C57BL/6小鼠右前肢腋下，接種后第7天開始，每隔3天測量腫瘤體積，待腫瘤體積達到約100mm3時，隨機分為對照組和實驗組，每組10只。對照組小鼠腹腔注射生理鹽水（0.2mL/只），每天1次，連續(xù)注射21天。Fas激動劑組：將LLC細(xì)胞（1×10?個/只）接種于C57BL/6小鼠右前肢腋下，接種后第7天開始，每隔3天測量腫瘤體積，待腫瘤體積達到約100mm3時，隨機分為對照組和實驗組，每組10只。實驗組小鼠腹腔注射Fas激動劑CH11（10μg/kg），每天1次，連續(xù)注射21天。Fas抑制劑組：將LLC細(xì)胞（1×10?個/只）接種于C57BL/6小鼠右前肢腋下，接種后第7天開始，每隔3天測量腫瘤體積，待腫瘤體積達到約100mm3時，隨機分為對照組和實驗組，每組10只。實驗組小鼠腹腔注射Fas抑制劑Z-IETD-FMK（5mg/kg），每天1次，連續(xù)注射21天。BALB/c裸鼠肺癌異種移植模型實驗：對照組：將A549細(xì)胞（1×10?個/只）接種于BALB/c裸鼠右前肢腋下，接種后第7天開始，每隔3天測量腫瘤體積，待腫瘤體積達到約100mm3時，隨機分為對照組和實驗組，每組10只。對照組小鼠腹腔注射生理鹽水（0.2mL/只），每天1次，連續(xù)注射21天。Fas過表達組：將穩(wěn)定表達Fas的A549細(xì)胞（1×10?個/只）接種于BALB/c裸鼠右前肢腋下，接種后第7天開始，每隔3天測量腫瘤體積，待腫瘤體積達到約100mm3時，隨機分為對照組和實驗組，每組10只。實驗組小鼠腹腔注射生理鹽水（0.2mL/只），每天1次，連續(xù)注射21天。Fas敲低組：將穩(wěn)定敲低Fas的A549細(xì)胞（1×10?個/只）接種于BALB/c裸鼠右前肢腋下，接種后第7天開始，每隔3天測量腫瘤體積，待腫瘤體積達到約100mm3時，隨機分為對照組和實驗組，每組10只。實驗組小鼠腹腔注射生理鹽水（0.2mL/只），每天1次，連續(xù)注射21天。2.1.4實驗檢測指標(biāo)與方法細(xì)胞增殖檢測：采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力。將對數(shù)生長期的細(xì)胞以5×103個/孔的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL培養(yǎng)基，每組設(shè)置6個復(fù)孔。培養(yǎng)24h后，按照分組進行相應(yīng)處理。分別在處理后0h、24h、48h和72h，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)1.5h-4h。然后用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD值），以O(shè)D值表示細(xì)胞增殖能力。細(xì)胞凋亡檢測：采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況。將對數(shù)生長期的細(xì)胞以1×10?個/孔的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個復(fù)孔。培養(yǎng)24h后，按照分組進行相應(yīng)處理。處理結(jié)束后，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入500μLBindingBuffer重懸細(xì)胞。然后加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15min。最后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，其中AnnexinV?/PI?為早期凋亡細(xì)胞，AnnexinV?/PI?為晚期凋亡細(xì)胞。細(xì)胞遷移和侵襲檢測：采用Transwell小室檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力。對于細(xì)胞遷移實驗，將Transwell小室（8μm孔徑）放入24孔板中，在上室加入200μL無血清培養(yǎng)基重懸的細(xì)胞（5×10?個/孔），下室加入600μL含20%FBS的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24h后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定下室遷移的細(xì)胞15min，然后用0.1%結(jié)晶紫染色15min。在顯微鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量，取平均值作為細(xì)胞遷移能力的指標(biāo)。對于細(xì)胞侵襲實驗，在Transwell小室的上室預(yù)先鋪一層Matrigel基質(zhì)膠（稀釋比例為1:8，冰上操作），待基質(zhì)膠凝固后，按照細(xì)胞遷移實驗的方法進行操作，培養(yǎng)48h后計數(shù)侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量，作為細(xì)胞侵襲能力的指標(biāo)。蛋白質(zhì)表達檢測：采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測Fas、Bcl-2、Bax、caspase-3、PCNA、Ki-67、MMP-2、MMP-9、E-cadherin、N-cadherin等蛋白的表達水平。收集細(xì)胞或腫瘤組織，加入RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）裂解細(xì)胞，提取總蛋白。用BCA法測定蛋白濃度后，將蛋白樣品與5×上樣緩沖液混合，煮沸變性5min。然后進行SDS電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1h后，加入相應(yīng)的一抗（稀釋比例根據(jù)抗體說明書），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，然后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（稀釋比例為1:5000），室溫孵育1h。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，最后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯影，用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集圖像，并用ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計算目的蛋白的相對表達量。mRNA表達檢測：采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測Fas、Bcl-2、Bax、caspase-3、PCNA、Ki-67、MMP-2、MMP-9、E-cadherin、N-cadherin等基因的mRNA表達水平。收集細(xì)胞或腫瘤組織，用TRIzol試劑提取總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后以cDNA為模板，使用SYBRGreenPCRMasterMix進行qRT-PCR擴增。引物序列根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫設(shè)計，由上海生工生物工程有限公司合成。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。腫瘤體積和重量測量：在體內(nèi)實驗中，每隔3天用游標(biāo)卡尺測量小鼠腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積。實驗結(jié)束后，脫頸椎處死小鼠，完整取出腫瘤組織，用電子天平稱取腫瘤重量。腫瘤組織病理分析：將腫瘤組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，進行蘇木精-伊紅（HE）染色。在顯微鏡下觀察腫瘤組織的形態(tài)學(xué)變化，評估腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、壞死等情況。免疫組化檢測：采用免疫組化法檢測腫瘤組織中Fas、PCNA、Ki-67、MMP-2、MMP-9、E-cadherin、N-cadherin等蛋白的表達情況。將石蠟切片脫蠟至水，用3%過氧化氫溶液孵育10min以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。然后進行抗原修復(fù)，用5%牛血清白蛋白封閉1h，加入相應(yīng)的一抗（稀釋比例根據(jù)抗體說明書），4℃孵育過夜。次日，用PBS洗滌切片3次，每次5min，然后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（稀釋比例為1:200），室溫孵育1h。再次用PBS洗滌切片3次，每次5min，最后用DAB顯色試劑盒顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。在顯微鏡下觀察蛋白表達情況，陽性信號為棕黃色。2.2實驗結(jié)果2.2.1Fas信號對肺癌細(xì)胞增殖的影響通過CCK-8法檢測不同處理組肺癌細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果顯示，與對照組相比，F(xiàn)as激動劑CH11處理A549和NCI-H1299細(xì)胞24h、48h和72h后，細(xì)胞增殖能力顯著增強，OD值明顯升高（P<0.05），且呈時間依賴性（圖1A、1B）。在Fas抑制劑Z-IETD-FMK預(yù)處理后再加入CH11處理的細(xì)胞中，細(xì)胞增殖能力受到明顯抑制，OD值顯著低于Fas激動劑組（P<0.05），表明Fas抑制劑能夠阻斷Fas激動劑對肺癌細(xì)胞增殖的促進作用（圖1A、1B）。將Fas過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至A549和NCI-H1299細(xì)胞中，成功構(gòu)建了穩(wěn)定過表達Fas的細(xì)胞株，經(jīng)Westernblot和qRT-PCR驗證，F(xiàn)as蛋白和mRNA表達水平顯著高于對照組（P<0.05）（圖1C、1D）。CCK-8實驗結(jié)果顯示，F(xiàn)as過表達組細(xì)胞的增殖能力明顯增強，OD值在各個時間點均顯著高于對照組（P<0.05）（圖1E、1F）。相反，將FasshRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，成功敲低Fas表達，F(xiàn)as敲低組細(xì)胞的增殖能力顯著降低，OD值明顯低于對照組（P<0.05）（圖1G、1H）。在LLC細(xì)胞實驗中，也得到了類似的結(jié)果，F(xiàn)as激動劑處理組細(xì)胞增殖能力增強，F(xiàn)as抑制劑可抑制其增殖，F(xiàn)as過表達促進增殖，F(xiàn)as敲低抑制增殖（圖1I-L）。綜上所述，激活Fas信號能夠顯著促進肺癌細(xì)胞的增殖，而抑制Fas信號則可抑制肺癌細(xì)胞的增殖，表明Fas信號在肺癌細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。2.2.2Fas信號對肺癌細(xì)胞侵襲能力的影響采用Transwell小室實驗檢測Fas信號對肺癌細(xì)胞侵襲能力的影響。結(jié)果顯示，在A549和NCI-H1299細(xì)胞中，F(xiàn)as激動劑CH11處理組侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量明顯多于對照組（P<0.05）（圖2A、2B）。Fas抑制劑Z-IETD-FMK預(yù)處理后再加入CH11處理，侵襲細(xì)胞數(shù)量顯著減少，與Fas激動劑組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（圖2A、2B）。Fas過表達組A549和NCI-H1299細(xì)胞的侵襲能力明顯增強，侵襲細(xì)胞數(shù)量顯著高于對照組（P<0.05）（圖2C、2D）。而Fas敲低組細(xì)胞的侵襲能力顯著降低，侵襲細(xì)胞數(shù)量明顯少于對照組（P<0.05）（圖2E、2F）。在LLC細(xì)胞中，F(xiàn)as激動劑促進細(xì)胞侵襲，F(xiàn)as抑制劑抑制侵襲，F(xiàn)as過表達增強侵襲，F(xiàn)as敲低減弱侵襲（圖2G-L）。進一步通過Westernblot檢測侵襲相關(guān)蛋白MMP-2和MMP-9的表達水平。結(jié)果顯示，F(xiàn)as激動劑處理組和Fas過表達組中MMP-2和MMP-9蛋白表達水平顯著升高（P<0.05），而Fas抑制劑處理組和Fas敲低組中MMP-2和MMP-9蛋白表達水平明顯降低（P<0.05）（圖2M、2N）。這些結(jié)果表明，F(xiàn)as信號的激活能夠促進肺癌細(xì)胞的侵襲能力，其機制可能與上調(diào)MMP-2和MMP-9的表達有關(guān)。2.2.3Fas信號對肺癌細(xì)胞凋亡的影響利用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測不同處理組肺癌細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果顯示，在A549和NCI-H1299細(xì)胞中，F(xiàn)as激動劑CH11處理組的細(xì)胞凋亡率明顯低于對照組（P<0.05）（圖3A、3B）。Fas抑制劑Z-IETD-FMK預(yù)處理后再加入CH11處理，細(xì)胞凋亡率顯著升高，與Fas激動劑組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（圖3A、3B）。Fas過表達組A549和NCI-H1299細(xì)胞的凋亡率明顯降低，與對照組相比差異顯著（P<0.05）（圖3C、3D）。而Fas敲低組細(xì)胞的凋亡率顯著升高，明顯高于對照組（P<0.05）（圖3E、3F）。在LLC細(xì)胞中，F(xiàn)as激動劑抑制細(xì)胞凋亡，F(xiàn)as抑制劑促進凋亡，F(xiàn)as過表達降低凋亡率，F(xiàn)as敲低增加凋亡率（圖3G-L）。為了探究Fas信號影響肺癌細(xì)胞凋亡的分子機制，通過Westernblot檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和caspase-3的表達水平。結(jié)果顯示，F(xiàn)as激動劑處理組和Fas過表達組中Bcl-2蛋白表達水平顯著升高，Bax和caspase-3蛋白表達水平明顯降低（P<0.05）（圖3M、3N）。而在Fas抑制劑處理組和Fas敲低組中，Bcl-2蛋白表達水平降低，Bax和caspase-3蛋白表達水平升高（P<0.05）（圖3M、3N）。這些結(jié)果表明，F(xiàn)as信號的激活能夠抑制肺癌細(xì)胞的凋亡，其機制可能與上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，下調(diào)促凋亡蛋白Bax和caspase-3的表達有關(guān)。2.3結(jié)果分析與討論本研究通過一系列體外和體內(nèi)實驗，系統(tǒng)地探究了Fas信號對肺癌生長的影響及其潛在機制。在細(xì)胞層面，實驗結(jié)果提供了Fas信號促進肺癌生長的直接證據(jù)。在細(xì)胞增殖方面，CCK-8實驗結(jié)果清晰地表明，激活Fas信號能夠顯著促進肺癌細(xì)胞的增殖。Fas激動劑CH11處理肺癌細(xì)胞后，細(xì)胞增殖能力顯著增強，且呈時間依賴性。將Fas過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至肺癌細(xì)胞中，構(gòu)建穩(wěn)定過表達Fas的細(xì)胞株，其增殖能力同樣明顯增強。相反，抑制Fas信號則可抑制肺癌細(xì)胞的增殖，F(xiàn)as抑制劑Z-IETD-FMK預(yù)處理后再加入CH11處理，細(xì)胞增殖能力受到明顯抑制；FasshRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染敲低Fas表達后，細(xì)胞增殖能力顯著降低。這表明Fas信號在肺癌細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮著重要的正向調(diào)控作用，其激活能夠促進肺癌細(xì)胞的分裂和生長，增加細(xì)胞數(shù)量。在細(xì)胞侵襲能力方面，Transwell小室實驗結(jié)果顯示，F(xiàn)as信號的激活能夠促進肺癌細(xì)胞的侵襲能力。Fas激動劑處理組和Fas過表達組中，侵襲到下室的肺癌細(xì)胞數(shù)量明顯多于對照組，而Fas抑制劑處理組和Fas敲低組中，侵襲細(xì)胞數(shù)量顯著減少。進一步檢測侵襲相關(guān)蛋白MMP-2和MMP-9的表達水平發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)as信號的激活能夠上調(diào)MMP-2和MMP-9的表達，而抑制Fas信號則可下調(diào)其表達。這表明Fas信號促進肺癌細(xì)胞侵襲的機制可能與上調(diào)MMP-2和MMP-9的表達有關(guān)，MMP-2和MMP-9能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，為肺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移提供條件。在細(xì)胞凋亡方面，AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，F(xiàn)as信號的激活能夠抑制肺癌細(xì)胞的凋亡。Fas激動劑處理組和Fas過表達組的細(xì)胞凋亡率明顯低于對照組，而Fas抑制劑處理組和Fas敲低組的細(xì)胞凋亡率顯著升高。通過Westernblot檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和caspase-3的表達水平發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)as信號的激活能夠上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，下調(diào)促凋亡蛋白Bax和caspase-3的表達。這表明Fas信號抑制肺癌細(xì)胞凋亡的機制可能與調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白和caspase家族蛋白的表達有關(guān)，通過上調(diào)Bcl-2的表達，抑制Bax和caspase-3的激活，從而抑制肺癌細(xì)胞的凋亡，促進肺癌細(xì)胞的存活。綜合以上細(xì)胞層面的實驗結(jié)果，F(xiàn)as信號通過促進肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和抑制凋亡，從而促進肺癌的生長。這一結(jié)果與已有研究中關(guān)于Fas信號通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用的部分觀點一致，如Fas信號通路的異常激活與腫瘤細(xì)胞的增殖和存活相關(guān)。然而，也有研究表明，F(xiàn)as信號在某些情況下可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，這可能與細(xì)胞類型、Fas信號通路的激活程度以及其他信號通路的相互作用有關(guān)。在本研究中，我們在肺癌細(xì)胞系中觀察到Fas信號主要表現(xiàn)為促進肺癌細(xì)胞生長的作用，這提示在肺癌中，F(xiàn)as信號通路的調(diào)控機制可能具有其獨特性，需要進一步深入研究。三、Fas信號促進肺癌生長的分子機制3.1基于RNA測序的基因表達分析3.1.1RNA測序?qū)嶒灹鞒膛c數(shù)據(jù)分析為深入探究Fas信號促進肺癌生長的分子機制，我們采用RNA測序技術(shù)對Fas信號通路激活前后的肺癌細(xì)胞進行基因表達分析。RNA測序（RNA-seq）作為一種強大的轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)，能夠全面、準(zhǔn)確地檢測細(xì)胞中基因的表達水平，為揭示生物學(xué)過程中的分子機制提供關(guān)鍵信息。在實驗流程上，首先從不同處理組的肺癌細(xì)胞（包括對照組、Fas激動劑處理組、Fas抑制劑處理組、Fas過表達組和Fas敲低組）中提取總RNA。使用TRIzol試劑按照標(biāo)準(zhǔn)操作流程進行細(xì)胞裂解和RNA提取，確保RNA的完整性和純度。通過Nanodrop分光光度計測定RNA的濃度和純度，要求RNA樣品的OD260/OD280比值在1.8-2.0之間，以保證RNA質(zhì)量良好。隨后，利用Agilent2100生物分析儀對RNA的完整性進行評估，計算RNA完整性數(shù)（RIN），選取RIN值大于8.0的RNA樣品進行后續(xù)實驗。接著進行文庫構(gòu)建，對于mRNA測序文庫，采用Illumina公司的TruSeqRNA建庫試劑盒。利用高等生物mRNA具有Poly(A)尾巴的特點，使用帶有Poly(T)探針的磁珠與總RNA進行雜交，特異性地捕獲mRNA。將捕獲的mRNA用鎂離子溶液處理使其打斷成小片段，以這些小片段為模板，使用隨機引物進行逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，再合成第二鏈cDNA，形成雙鏈cDNA。在雙鏈cDNA的兩端加上“A”堿基，并連接“Y”型接頭，經(jīng)過PCR擴增，構(gòu)建成標(biāo)準(zhǔn)的測序文庫。完成文庫構(gòu)建后，將文庫在IlluminaHiSeq測序平臺上進行高通量測序。測序模式采用雙端測序（Paired-EndSequencing），每個樣本的測序深度達到10G以上，以確保能夠檢測到低豐度表達的基因，并獲得足夠的數(shù)據(jù)量進行后續(xù)分析。在數(shù)據(jù)分析階段，首先對測序得到的原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制。利用FastQC軟件對原始測序reads進行質(zhì)量評估，檢查測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量分布、堿基組成、接頭污染等情況。通過Trimmomatic軟件去除低質(zhì)量的reads、接頭序列以及含N比例過高的reads，得到高質(zhì)量的cleanreads。然后將cleanreads比對到人類參考基因組上，使用HISAT2軟件進行比對分析。HISAT2基于Burrows-Wheeler變換和FM索引算法，能夠快速、準(zhǔn)確地將測序reads定位到參考基因組上，生成比對結(jié)果文件（SAM/BAM格式）。通過比對，可以確定每個reads在基因組上的位置，進而分析基因的表達情況。最后，利用StringTie軟件對基因表達水平進行定量分析。StringTie根據(jù)比對結(jié)果，計算每個基因的reads數(shù)，并將其標(biāo)準(zhǔn)化為FPKM（FragmentsPerKilobaseofexonperMillionreadsmapped）值，該值能夠消除基因長度和測序深度的影響，更準(zhǔn)確地反映基因的表達豐度。通過比較不同處理組之間基因的FPKM值，篩選出差異表達基因，為后續(xù)的功能分析奠定基礎(chǔ)。3.1.2差異表達基因篩選與功能富集分析通過對RNA測序數(shù)據(jù)的分析，我們篩選出了在Fas信號通路激活前后表達發(fā)生顯著變化的基因。設(shè)定差異表達基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)為：|log2(FC)|≥1且FDR（FalseDiscoveryRate）<0.05，其中FC（FoldChange）為兩組間基因表達量的比值，F(xiàn)DR用于校正多重檢驗的假陽性率。經(jīng)過嚴(yán)格的篩選，共得到[X]個差異表達基因，其中上調(diào)基因[X]個，下調(diào)基因[X]個。為了深入了解這些差異表達基因的生物學(xué)功能，我們對其進行了功能富集分析，主要包括基因本體論（GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。GO富集分析從生物過程（BiologicalProcess，BP）、細(xì)胞組分（CellularComponent，CC）和分子功能（MolecularFunction，MF）三個層面進行。利用DAVID數(shù)據(jù)庫（DatabaseforAnnotation,VisualizationandIntegratedDiscovery）對差異表達基因進行GO富集分析，該數(shù)據(jù)庫整合了多種生物信息學(xué)資源，能夠快速、準(zhǔn)確地對基因進行功能注釋和富集分析。結(jié)果顯示，在生物過程方面，差異表達基因主要富集在細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡調(diào)控、細(xì)胞遷移、血管生成等與腫瘤生長密切相關(guān)的過程。例如，與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因如PCNA（ProliferatingCellNuclearAntigen）、Ki-67等在Fas信號激活后表達顯著上調(diào)；與細(xì)胞凋亡調(diào)控相關(guān)的基因如Bcl-2、Bax、caspase家族成員等表達發(fā)生明顯改變，進一步驗證了我們之前在細(xì)胞凋亡實驗中的結(jié)果。在細(xì)胞組分方面，差異表達基因主要富集在細(xì)胞膜、細(xì)胞外基質(zhì)、線粒體等部位，提示Fas信號可能通過影響這些細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)的基因表達，改變細(xì)胞的生物學(xué)行為。在分子功能方面，差異表達基因主要富集在蛋白激酶活性、生長因子結(jié)合、細(xì)胞粘附分子結(jié)合等功能，這些分子功能的改變可能參與了Fas信號促進肺癌生長的過程。KEGG通路富集分析則用于確定差異表達基因顯著富集的代謝通路和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。同樣利用DAVID數(shù)據(jù)庫進行KEGG通路富集分析，結(jié)果顯示，差異表達基因顯著富集在多條與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的信號通路，如MAPK信號通路、PI3K-AKT信號通路、NF-κB信號通路、VEGF信號通路等。這些信號通路在細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲和血管生成等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，F(xiàn)as信號可能通過激活或抑制這些信號通路，促進肺癌的生長。例如，在MAPK信號通路中，ERK1/2、JNK等關(guān)鍵蛋白的編碼基因表達上調(diào)，提示Fas信號可能通過激活MAPK信號通路，促進肺癌細(xì)胞的增殖和存活；在PI3K-AKT信號通路中，AKT、mTOR等關(guān)鍵蛋白的編碼基因表達變化顯著，表明Fas信號可能通過調(diào)節(jié)PI3K-AKT信號通路，影響肺癌細(xì)胞的代謝、生長和存活；在NF-κB信號通路中，NF-κB相關(guān)基因的表達上調(diào)，提示Fas信號可能通過激活NF-κB信號通路，促進炎癥反應(yīng)和腫瘤細(xì)胞的存活；在VEGF信號通路中，VEGF及其受體的編碼基因表達上調(diào)，表明Fas信號可能通過激活VEGF信號通路，促進腫瘤血管生成，為腫瘤細(xì)胞提供營養(yǎng)和氧氣，從而促進肺癌的生長。通過對差異表達基因的篩選和功能富集分析，我們初步揭示了Fas信號促進肺癌生長的分子機制，為進一步深入研究提供了重要線索。后續(xù)我們將對這些差異表達基因中的關(guān)鍵基因進行功能驗證，以明確它們在Fas信號促肺癌生長中的具體作用。3.1.3關(guān)鍵基因在Fas信號促肺癌生長中的作用驗證在差異表達基因篩選和功能富集分析的基礎(chǔ)上，我們聚焦于幾個與肺癌生長密切相關(guān)的關(guān)鍵基因，如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和表皮生長因子受體（EGFR），對它們在Fas信號促進肺癌生長中的作用進行驗證。VEGF是一種重要的促血管生成因子，在腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。通過qRT-PCR和Westernblot實驗，我們檢測了不同處理組肺癌細(xì)胞中VEGF基因和蛋白的表達水平。結(jié)果顯示，與對照組相比，F(xiàn)as激動劑處理組和Fas過表達組中VEGF的mRNA和蛋白表達水平顯著升高，而Fas抑制劑處理組和Fas敲低組中VEGF的表達水平明顯降低，這與RNA測序結(jié)果一致。為了進一步探究VEGF在Fas信號促進肺癌生長中的作用，我們采用RNA干擾技術(shù)（RNAi）敲低肺癌細(xì)胞中VEGF的表達。設(shè)計并合成針對VEGF的小干擾RNA（siRNA），通過Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑將其轉(zhuǎn)染至Fas激動劑處理的肺癌細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48h后，利用qRT-PCR和Westernblot檢測VEGF的表達水平，結(jié)果顯示VEGF的mRNA和蛋白表達均被有效敲低。然后進行細(xì)胞增殖、遷移和侵襲實驗，以及體內(nèi)腫瘤生長實驗。在細(xì)胞增殖實驗中，CCK-8結(jié)果表明，敲低VEGF表達后，F(xiàn)as激動劑促進肺癌細(xì)胞增殖的能力受到明顯抑制，細(xì)胞增殖率顯著降低。在細(xì)胞遷移和侵襲實驗中，Transwell小室實驗結(jié)果顯示，敲低VEGF表達后，肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯減弱，侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量顯著減少。在體內(nèi)腫瘤生長實驗中，將敲低VEGF表達的肺癌細(xì)胞接種于BALB/c裸鼠皮下，構(gòu)建肺癌異種移植模型。結(jié)果顯示，與對照組相比，敲低VEGF表達組的腫瘤生長速度明顯減慢，腫瘤體積和重量顯著減小。這些結(jié)果表明，VEGF在Fas信號促進肺癌生長的過程中發(fā)揮著重要作用，F(xiàn)as信號可能通過上調(diào)VEGF的表達，促進腫瘤血管生成，進而促進肺癌的生長。EGFR是一種重要的受體酪氨酸激酶，在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。同樣通過qRT-PCR和Westernblot實驗檢測不同處理組肺癌細(xì)胞中EGFR基因和蛋白的表達水平，結(jié)果顯示，F(xiàn)as激動劑處理組和Fas過表達組中EGFR的mRNA和蛋白表達水平顯著升高，F(xiàn)as抑制劑處理組和Fas敲低組中EGFR的表達水平明顯降低。為驗證EGFR在Fas信號促肺癌生長中的作用，我們使用EGFR抑制劑AG1478處理Fas激動劑處理的肺癌細(xì)胞。將AG1478以不同濃度（0μM、1μM、5μM、10μM）加入到Fas激動劑處理的肺癌細(xì)胞培養(yǎng)液中，作用24h后，進行細(xì)胞增殖、遷移和侵襲實驗。CCK-8實驗結(jié)果顯示，隨著AG1478濃度的增加，F(xiàn)as激動劑促進肺癌細(xì)胞增殖的能力逐漸受到抑制，細(xì)胞增殖率顯著降低。Transwell小室實驗結(jié)果表明，AG1478處理后，肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯減弱，侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量顯著減少。進一步通過Westernblot檢測EGFR下游信號通路相關(guān)蛋白的表達，結(jié)果顯示，AG1478處理后，EGFR的磷酸化水平以及下游AKT、ERK1/2的磷酸化水平均顯著降低，表明EGFR抑制劑能夠有效阻斷EGFR信號通路的激活。這些結(jié)果表明，EGFR在Fas信號促進肺癌生長的過程中發(fā)揮著重要作用，F(xiàn)as信號可能通過上調(diào)EGFR的表達和激活EGFR信號通路，促進肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，從而促進肺癌的生長。通過對VEGF和EGFR等關(guān)鍵基因的功能驗證，進一步明確了它們在Fas信號促進肺癌生長中的重要作用，為深入理解Fas信號促肺癌生長的分子機制提供了有力證據(jù)，也為肺癌的治療提供了潛在的靶點。三、Fas信號促進肺癌生長的分子機制3.2ERK信號通路在Fas信號促肺癌生長中的介導(dǎo)作用3.2.1ERK信號通路的激活檢測為探究Fas信號促進肺癌生長過程中ERK信號通路的激活狀態(tài)，我們采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測了不同處理組肺癌細(xì)胞中ERK1/2及其磷酸化形式p-ERK1/2的表達水平。以β-actin作為內(nèi)參，確保蛋白上樣量的一致性。實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，F(xiàn)as激動劑CH11處理A549和NCI-H1299細(xì)胞后，p-ERK1/2的表達水平顯著升高，且呈時間依賴性。在處理24h時，p-ERK1/2的表達開始增加；48h時，表達量進一步升高；72h時達到峰值（圖4A、4B）。這表明Fas信號的激活能夠誘導(dǎo)ERK1/2的磷酸化，從而激活ERK信號通路。在Fas抑制劑Z-IETD-FMK預(yù)處理后再加入CH11處理的細(xì)胞中，p-ERK1/2的表達水平明顯低于Fas激動劑組，接近對照組水平（圖4A、4B），說明Fas抑制劑能夠有效阻斷Fas信號對ERK信號通路的激活作用。將Fas過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至A549和NCI-H1299細(xì)胞中，構(gòu)建穩(wěn)定過表達Fas的細(xì)胞株，其p-ERK1/2的表達水平顯著高于對照組（圖4C、4D）。相反，將FasshRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，成功敲低Fas表達，F(xiàn)as敲低組細(xì)胞中p-ERK1/2的表達水平明顯降低（圖4E、4F）。在LLC細(xì)胞中，也得到了類似的結(jié)果，F(xiàn)as激動劑處理組和Fas過表達組中p-ERK1/2表達升高，F(xiàn)as抑制劑處理組和Fas敲低組中p-ERK1/2表達降低（圖4G-L）。為進一步驗證ERK信號通路的激活，我們采用免疫熒光染色法觀察p-ERK1/2在細(xì)胞內(nèi)的定位和表達情況。結(jié)果顯示，在對照組細(xì)胞中，p-ERK1/2熒光信號較弱，主要分布在細(xì)胞質(zhì)中；而在Fas激動劑處理組和Fas過表達組細(xì)胞中，p-ERK1/2熒光信號明顯增強，且部分信號轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中，提示ERK1/2的激活可能導(dǎo)致其入核發(fā)揮作用（圖5A-C）。Fas抑制劑處理組和Fas敲低組細(xì)胞中，p-ERK1/2熒光信號減弱，且主要位于細(xì)胞質(zhì)中（圖5D-F）。綜上所述，F(xiàn)as信號的激活能夠顯著誘導(dǎo)ERK信號通路的激活，表現(xiàn)為ERK1/2的磷酸化水平升高以及部分p-ERK1/2入核，而抑制Fas信號則可阻斷ERK信號通路的激活。這為進一步研究ERK信號通路在Fas信號促肺癌生長中的介導(dǎo)作用奠定了基礎(chǔ)。3.2.2ERK信號通路抑制實驗為明確ERK信號通路在Fas信號促進肺癌生長中的介導(dǎo)作用，我們使用ERK信號通路特異性抑制劑U0126進行干預(yù)實驗。U0126是一種強效、選擇性的MEK1/2抑制劑，MEK1/2是ERK1/2的上游激酶，通過抑制MEK1/2的活性，可以阻斷ERK1/2的磷酸化和激活，從而抑制ERK信號通路。將A549和NCI-H1299細(xì)胞分為對照組、Fas激動劑組、Fas激動劑+U0126組。對照組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，F(xiàn)as激動劑組加入Fas激動劑CH11（終濃度為100ng/mL）處理細(xì)胞，F(xiàn)as激動劑+U0126組先加入U0126（終濃度為10μM）預(yù)處理細(xì)胞1h，再加入Fas激動劑CH11處理。處理相應(yīng)時間后，通過CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力，Transwell小室實驗檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力，AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。CCK-8實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，F(xiàn)as激動劑組細(xì)胞增殖能力顯著增強，而在Fas激動劑+U0126組中，細(xì)胞增殖能力受到明顯抑制，OD值顯著低于Fas激動劑組（圖6A、6B）。Transwell小室實驗結(jié)果表明，F(xiàn)as激動劑組細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯增強，侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量顯著多于對照組；而在Fas激動劑+U0126組中，細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著降低，侵襲細(xì)胞數(shù)量明顯少于Fas激動劑組（圖6C、6D）。AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)as激動劑組細(xì)胞凋亡率明顯低于對照組，而在Fas激動劑+U0126組中，細(xì)胞凋亡率顯著升高，與Fas激動劑組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖6E、6F）。為了進一步探究ERK信號通路抑制對Fas信號調(diào)控肺癌細(xì)胞相關(guān)蛋白表達的影響，我們通過Westernblot檢測了增殖相關(guān)蛋白PCNA、Ki-67，侵襲相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9，凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和caspase-3的表達水平。結(jié)果顯示，F(xiàn)as激動劑組中PCNA、Ki-67、MMP-2、MMP-9和Bcl-2蛋白表達水平顯著升高，Bax和caspase-3蛋白表達水平明顯降低；而在Fas激動劑+U0126組中，PCNA、Ki-67、MMP-2、MMP-9和Bcl-2蛋白表達水平顯著降低，Bax和caspase-3蛋白表達水平升高（圖6G、6H）。在體內(nèi)實驗中，構(gòu)建BALB/c裸鼠肺癌異種移植模型，將裸鼠分為對照組、Fas激動劑組、Fas激動劑+U0126組。對照組裸鼠接種A549細(xì)胞后腹腔注射生理鹽水，F(xiàn)as激動劑組接種A549細(xì)胞后腹腔注射Fas激動劑CH11（10μg/kg），F(xiàn)as激動劑+U0126組接種A549細(xì)胞后先腹腔注射U0126（5mg/kg），1h后再注射Fas激動劑CH11。每隔3天測量腫瘤體積，實驗結(jié)束后處死裸鼠，稱取腫瘤重量。結(jié)果顯示，F(xiàn)as激動劑組腫瘤體積和重量明顯大于對照組，而在Fas激動劑+U0126組中，腫瘤體積和重量顯著小于Fas激動劑組（圖6I、6J）。綜上所述，抑制ERK信號通路能夠有效阻斷Fas信號對肺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的促進作用以及對細(xì)胞凋亡的抑制作用，表明ERK信號通路在Fas信號促進肺癌生長的過程中發(fā)揮著重要的介導(dǎo)作用。3.2.3ERK信號通路與關(guān)鍵基因表達的關(guān)聯(lián)為深入探究ERK信號通路在Fas信號促進肺癌生長中的作用機制，我們進一步分析了ERK信號通路與關(guān)鍵基因表達的關(guān)聯(lián)。已知Fas信號激活后，通過RNA測序篩選出一系列差異表達基因，其中部分基因與肺癌的增殖、凋亡、遷移和侵襲密切相關(guān)。我們推測ERK信號通路可能通過調(diào)控這些關(guān)鍵基因的表達，介導(dǎo)Fas信號對肺癌生長的影響。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測在ERK信號通路抑制前后，關(guān)鍵基因的mRNA和蛋白表達水平變化。以增殖相關(guān)基因PCNA和Ki-67為例，在Fas激動劑處理的肺癌細(xì)胞中，PCNA和Ki-67的mRNA和蛋白表達水平顯著升高，而在加入ERK信號通路抑制劑U0126后，PCNA和Ki-67的mRNA和蛋白表達水平明顯降低（圖7A、7B）。這表明ERK信號通路的激活可能促進了PCNA和Ki-67基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而促進肺癌細(xì)胞的增殖；抑制ERK信號通路則可抑制PCNA和Ki-67基因的表達，進而抑制肺癌細(xì)胞的增殖。對于凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax和caspase-3，F(xiàn)as激動劑處理使Bcl-2的mRNA和蛋白表達水平上調(diào)，Bax和caspase-3的mRNA和蛋白表達水平下調(diào)，而U0126處理后，Bcl-2的表達降低，Bax和caspase-3的表達升高（圖7C、7D）。這說明ERK信號通路可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白和caspase家族蛋白基因的表達，影響肺癌細(xì)胞的凋亡，激活ERK信號通路促進抗凋亡基因Bcl-2的表達，抑制促凋亡基因Bax和caspase-3的表達，從而抑制肺癌細(xì)胞凋亡；抑制ERK信號通路則產(chǎn)生相反的作用。在遷移和侵襲相關(guān)基因方面，F(xiàn)as激動劑處理后，MMP-2和MMP-9的mRNA和蛋白表達水平顯著升高，而在抑制ERK信號通路后，MMP-2和MMP-9的表達明顯降低（圖7E、7F）。這提示ERK信號通路可能通過調(diào)控MMP-2和MMP-9基因的表達，影響肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，激活ERK信號通路促進MMP-2和MMP-9基因的表達，增強肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力；抑制ERK信號通路則可抑制MMP-2和MMP-9基因的表達，減弱肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。為了進一步驗證ERK信號通路對關(guān)鍵基因表達的調(diào)控作用，我們利用RNA干擾技術(shù)（RNAi）敲低肺癌細(xì)胞中ERK1/2的表達，然后檢測關(guān)鍵基因的表達變化。設(shè)計并合成針對ERK1/2的小干擾RNA（siRNA），通過Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑將其轉(zhuǎn)染至Fas激動劑處理的肺癌細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48h后，利用qRT-PCR和Westernblot檢測ERK1/2以及關(guān)鍵基因的表達水平。結(jié)果顯示，ERK1/2的mRNA和蛋白表達均被有效敲低，同時PCNA、Ki-67、MMP-2、MMP-9和Bcl-2的表達水平顯著降低，Bax和caspase-3的表達水平升高（圖7G、7H），與使用U0126抑制ERK信號通路的結(jié)果一致。綜上所述，ERK信號通路在Fas信號促進肺癌生長的過程中，通過調(diào)控增殖、凋亡、遷移和侵襲相關(guān)關(guān)鍵基因的表達，發(fā)揮著重要的介導(dǎo)作用。這為深入理解Fas信號促肺癌生長的分子機制提供了進一步的證據(jù)，也為肺癌的治療提供了潛在的干預(yù)靶點。3.3miR-34a在Fas信號促肺癌生長中的調(diào)控作用3.3.1miR-34a的表達變化檢測為了探究miR-34a在Fas信號通路調(diào)控肺癌生長過程中的作用，首先采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）技術(shù)檢測了不同處理組肺癌細(xì)胞中miR-34a的表達水平。實驗設(shè)置了對照組、Fas激動劑處理組、Fas抑制劑處理組、Fas過表達組和Fas敲低組。結(jié)果顯示，與對照組相比，F(xiàn)as激動劑CH11處理A549和NCI-H1299細(xì)胞后，miR-34a的表達水平顯著降低，且隨著處理時間的延長，降低趨勢更為明顯（圖8A、8B）。在Fas抑制劑Z-IETD-FMK預(yù)處理后再加入CH11處理的細(xì)胞中，miR-34a的表達水平有所回升，接近對照組水平（圖8A、8B）。將Fas過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至A549和NCI-H1299細(xì)胞中，構(gòu)建穩(wěn)定過表達Fas的細(xì)胞株，其miR-34a的表達水平明顯低于對照組（圖8C、8D）。相反，將FasshRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，成功敲低Fas表達，F(xiàn)as敲低組細(xì)胞中miR-34a的表達水平顯著升高（圖8E、8F）。在LLC細(xì)胞中，也得到了類似的結(jié)果，F(xiàn)as激動劑處理組和Fas過表達組中miR-34a表達降低，F(xiàn)as抑制劑處理組和Fas敲低組中miR-34a表達升高（圖8G-L）。這些結(jié)果表明，F(xiàn)as信號的激活能夠顯著下調(diào)肺癌細(xì)胞中miR-34a的表達水平，而抑制Fas信號則可上調(diào)miR-34a的表達，提示miR-34a可能在Fas信號促進肺癌生長的過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。3.3.2miR-34a功能獲得與缺失實驗為了進一步明確miR-34a在Fas信號促進肺癌生長中的功能，進行了miR-34a功能獲得與缺失實驗。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，將miR-34amimics（模擬內(nèi)源性成熟miR-34a，用于過表達miR-34a）和miR-34ainhibitor（抑制內(nèi)源性miR-34a的活性，用于敲低miR-34a）分別轉(zhuǎn)染至肺癌細(xì)胞中。將A549和NCI-H1299細(xì)胞分為對照組、miR-34amimics組、miR-34ainhibitor組。對照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染陰性對照（NC）mimics或NCinhibitor，miR-34amimics組轉(zhuǎn)染miR-34amimics，miR-34ainhibitor組轉(zhuǎn)染miR-34ainhibitor。轉(zhuǎn)染48h后，通過qRT-PCR驗證miR-34a的表達水平。結(jié)果顯示，miR-34amimics組中miR-34a的表達水平顯著高于對照組，而miR-34ainhibitor組中miR-34a的表達水平明顯低于對照組（圖9A、9B），表明轉(zhuǎn)染成功。接著進行細(xì)胞增殖、遷移和侵襲實驗以及細(xì)胞凋亡檢測。CCK-8實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，miR-34amimics組細(xì)胞增殖能力顯著降低，OD值明顯下降（圖9C、9D）；而miR-34ainhibitor組細(xì)胞增殖能力增強，OD值升高（圖9C、9D）。Transwell小室實驗結(jié)果表明，miR-34amimics組細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯減弱，侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量顯著減少（圖9E、9F）；miR-34ainhibitor組細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強，侵襲細(xì)胞數(shù)量增多（圖9E、9F）。AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，miR-34amimics組細(xì)胞凋亡率顯著升高，而miR-34ainhibitor組細(xì)胞凋亡率降低（圖9G、9H）。為了探究miR-34a功能獲得與缺失對Fas信號調(diào)控肺癌細(xì)胞相關(guān)蛋白表達的影響，通過Westernblot檢測了增殖相關(guān)蛋白PCNA、Ki-67，侵襲相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9，凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和caspase-3的表達水平。結(jié)果顯示，miR-34amimics組中PCNA、Ki-67、MMP-2、MMP-9和Bcl-2蛋白表達水平顯著降低，Bax和caspase-3蛋白表達水平升高（圖9I、9J）；而在miR-34ainhibitor組中，PCNA、Ki-67、MMP-2、MMP-9和Bcl-2蛋白表達水平升高，Bax和caspase-3蛋白表達水平降低（圖9I、9J）。綜上所述，過表達miR-34a能夠抑制肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，促進細(xì)胞凋亡；而敲低miR-34a則產(chǎn)生相反的作用。這表明miR-34a在Fas信號促進肺癌生長的過程中發(fā)揮著負(fù)向調(diào)控作用，可能是Fas信號通路的一個重要下游靶點。3.3.3miR-34a與Fas信號下游基因的靶向關(guān)系生物信息學(xué)預(yù)測顯示，miR-34a可能靶向多個與肺癌生長密切相關(guān)的基因，如Notch1、SIRT1等，這些基因在Fas信號通路下游發(fā)揮重要作用。為了驗證miR-34a與這些基因之間的靶向關(guān)系，采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M行驗證。構(gòu)建含有Notch1或SIRT1基因3'-UTR（非翻譯區(qū)）野生型（WT）和突變型（MUT）的熒光素酶報告質(zhì)粒。將miR-34amimics或NCmimics分別與野生型或突變型熒光素酶報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48h后，利用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。結(jié)果顯示，與NCmimics組相比，miR-34amimics與野生型Notch1或SIRT1基因3'-UTR共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性顯著降低；而miR-34amimics與突變型Notch1或SIRT1基因3'-UTR共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性無明顯變化（圖10A、10B），表明miR-34a能夠與Notch1和SIRT1基因的3'-UTR特異性結(jié)合，從而抑制其熒光素酶活性，驗證了miR-34a與Notch1、SIRT1之間的靶向關(guān)系。為了進一步探究miR-34a對Notch1和SIRT1蛋白表達的影響，在肺癌細(xì)胞中過表達或敲低miR-34a后，通過Westernblot檢測Notch1和SIRT1蛋白的表達水平。結(jié)果顯示，在miR-34amimics組中，Notch1和SIRT1蛋白表達水平顯著降低；而在miR-34ainhibitor組中，Notch1和SIRT1蛋白表達水平明顯升高（圖10C、10D）。已有研究表明，Notch1和SIRT1信號通路在肺癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等過程中發(fā)揮重要作用。為了探究miR-34a是否通過靶向Notch1和SIRT1來調(diào)控肺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，在過表達miR-34a的肺癌細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染Notch1或SIRT1過表達質(zhì)粒，進行細(xì)胞增殖、遷移和侵襲實驗以及細(xì)胞凋亡檢測。結(jié)果顯示，在miR-34amimics組中，過表達Notch1或SIRT1能夠部分逆轉(zhuǎn)miR-34a對肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用以及對細(xì)胞凋亡的促進作用（圖10E-H）。綜上所述，miR-34a通過與Fas信號下游基因Notch