乳酸應(yīng)激對大腸桿菌O26生物菌膜形成的多維度解析與機制探究一、緒論1.1研究背景在食品安全領(lǐng)域，食源性致病菌始終是威脅公眾健康的重要隱患。大腸桿菌O26作為“Bigsix”非O157大腸桿菌血清型之首，近年來愈發(fā)受到關(guān)注，它能夠產(chǎn)生志賀毒素，進而引發(fā)人類疾病，包括腹痛、腹瀉、發(fā)燒、嘔吐等癥狀，嚴重時甚至?xí)?dǎo)致腸出血及溶血尿毒癥等嚴重并發(fā)癥。如美國墨西哥風(fēng)味連鎖餐廳Chipotle曾因大腸桿菌O26引發(fā)食物中毒事件，致使20人住院，這一事件也警示了人們大腸桿菌O26對食品安全的潛在威脅。生物菌膜是細菌在應(yīng)對生長逆境時，通過產(chǎn)生胞外多糖聚合物，使細菌細胞相互粘連形成的膜狀物，這是微生物的一種自我保護性生長方式，不同于浮游生長狀態(tài)。在食品加工環(huán)境中，大腸桿菌O26一旦形成生物菌膜，便會給食品安全帶來嚴峻挑戰(zhàn)。生物菌膜中的細菌相較于浮游態(tài)細菌，對消毒劑的抵抗性大幅提高，有研究表明，黏附菌體對食品消毒劑的抵抗性可比浮游態(tài)提高成百上千倍，這使得常規(guī)的清潔和消毒措施難以徹底清除它們。生物菌膜還可以作為細菌的庇護所，促進毒力和耐藥基因在細菌種屬間的水平轉(zhuǎn)移，進一步增強細菌的致病性和耐藥性。生物菌膜中的細菌還能持續(xù)向食品中釋放，導(dǎo)致食品的反復(fù)污染，從而引發(fā)食源性疾病的爆發(fā)。食品加工過程中，各種環(huán)境因素復(fù)雜多變，其中乳酸應(yīng)激是常見的一種環(huán)境脅迫。在發(fā)酵食品生產(chǎn)、食品儲存和加工設(shè)備清潔等環(huán)節(jié)，大腸桿菌O26都可能面臨乳酸環(huán)境。當利用乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)食品時，乳酸菌代謝會產(chǎn)生乳酸，使環(huán)境中的乳酸濃度升高；在食品加工設(shè)備的清潔過程中，一些酸性清潔劑中也含有乳酸成分。然而，目前對于乳酸應(yīng)激如何影響大腸桿菌O26生物菌膜的形成，相關(guān)研究還相對較少。深入探究這一問題，不僅有助于揭示大腸桿菌O26在乳酸環(huán)境下的生存機制，還能為食品加工企業(yè)制定更有效的防控策略提供理論依據(jù)，對于保障食品安全具有重要的現(xiàn)實意義。1.2大腸桿菌O26與食品安全1.2.1致病性大腸桿菌概述大腸桿菌作為人和動物腸道中的常居菌，多數(shù)情況下并不會引發(fā)疾病，但部分類型的大腸桿菌卻具有致病性，能夠?qū)е履c道感染，引發(fā)急性腹瀉等癥狀。根據(jù)其不同的生物學(xué)特性以及致病機制，致病性大腸桿菌主要被分為六大類，分別是腸道致病性大腸桿菌（EPEC）、腸道產(chǎn)毒素性大腸桿菌（ETEC）、腸道侵襲性大腸桿菌（EIEC）、腸道出血性大腸桿菌（EHEC）、腸集聚性大腸桿菌（EAggEC）以及腸產(chǎn)志賀樣毒素且同時具有一定侵襲力的大腸桿菌（ESIES）。腸道致病性大腸桿菌（EPEC）是嬰兒腹瀉的重要病原菌，它能夠黏附于小腸上皮細胞，破壞微絨毛結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致腸道吸收功能受損，引發(fā)腹瀉。腸道產(chǎn)毒素性大腸桿菌（ETEC）則主要通過產(chǎn)生腸毒素，刺激腸道黏膜細胞分泌大量液體和電解質(zhì)，導(dǎo)致腹瀉，是旅行者腹瀉和嬰幼兒腹瀉的常見病因。腸道侵襲性大腸桿菌（EIEC）的致病機制類似于志賀菌，能夠侵入腸黏膜上皮細胞，引起炎癥和潰瘍，導(dǎo)致腹瀉、腹痛、發(fā)熱等癥狀，臨床表現(xiàn)與細菌性痢疾相似。腸道出血性大腸桿菌（EHEC）是致病性大腸桿菌中危害較為嚴重的一類，其中最具代表性的血清型為O157:H7。它能產(chǎn)生志賀樣毒素，損傷腸道微血管內(nèi)皮細胞，導(dǎo)致腸道出血和壞死，還可能引發(fā)溶血性尿毒綜合征（HUS），這是一種嚴重的并發(fā)癥，可導(dǎo)致腎衰竭、血栓形成和貧血等，對患者的生命健康造成極大威脅。腸集聚性大腸桿菌（EAggEC）主要引起持續(xù)性腹瀉，它通過特殊的菌毛黏附于腸上皮細胞表面，形成集聚狀排列，產(chǎn)生毒素和其他致病因子，破壞腸道微絨毛，影響腸道的正常功能。腸產(chǎn)志賀樣毒素且同時具有一定侵襲力的大腸桿菌（ESIES）既具有產(chǎn)志賀樣毒素的能力，又能侵襲腸上皮細胞，其致病機制較為復(fù)雜，對人體健康的危害也不容小覷。大腸桿菌O26屬于產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌（STEC），在致病性大腸桿菌中占據(jù)著重要地位。它不僅具有較強的致病性，還能夠產(chǎn)生志賀毒素，這種毒素能夠抑制蛋白質(zhì)合成，損傷血管內(nèi)皮細胞，從而引發(fā)一系列嚴重的疾病，如出血性腸炎、溶血尿毒癥綜合征等，對人類健康構(gòu)成了嚴重威脅。在一些食源性疾病暴發(fā)事件中，大腸桿菌O26常常是主要的致病因子，其引發(fā)的疾病癥狀較為嚴重，且治療難度較大，因此受到了廣泛的關(guān)注。1.2.2non-O157大腸桿菌及致病機制non-O157大腸桿菌是指除O157血清型之外的致病性大腸桿菌，近年來，其引發(fā)的食品安全事件逐漸增多，對公眾健康的威脅也日益凸顯。這類大腸桿菌具有一些獨特的特點，使其在食品生產(chǎn)和加工環(huán)境中更易存活和傳播。non-O157大腸桿菌對環(huán)境的適應(yīng)性較強，能夠在不同的溫度、pH值和營養(yǎng)條件下生長繁殖。在低溫環(huán)境下，它們能夠減緩代謝速度，進入休眠狀態(tài)，一旦環(huán)境條件適宜，便迅速恢復(fù)生長。在酸性環(huán)境中，一些non-O157大腸桿菌能夠通過調(diào)節(jié)自身的代謝途徑，維持細胞內(nèi)的酸堿平衡，從而繼續(xù)生存和繁殖。non-O157大腸桿菌還具有較強的耐藥性，這使得它們在面對抗生素治療時更具抵抗力。研究表明，許多non-O157大腸桿菌攜帶多種耐藥基因，對常用的抗生素如氨芐西林、四環(huán)素、磺胺類藥物等具有耐藥性。這不僅增加了治療感染的難度，還可能導(dǎo)致耐藥基因在細菌之間的傳播，進一步加劇耐藥問題的嚴重性。大腸桿菌O26作為non-O157大腸桿菌中的重要成員，其致病機制主要與毒力因子的產(chǎn)生密切相關(guān)。志賀毒素是大腸桿菌O26最重要的毒力因子之一，它包括志賀毒素1（Stx1）和志賀毒素2（Stx2）。這些毒素能夠與宿主細胞表面的特異性受體結(jié)合，進入細胞內(nèi)，抑制蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致細胞死亡。志賀毒素還能夠激活免疫系統(tǒng)，引發(fā)炎癥反應(yīng)，進一步損傷組織和器官。大腸桿菌O26還可能攜帶其他毒力因子，如溶血素（Hly）、腸毒素等，這些毒力因子協(xié)同作用，增強了大腸桿菌O26的致病性。溶血素能夠破壞紅細胞膜，導(dǎo)致溶血現(xiàn)象的發(fā)生，進一步加重機體的損傷。在感染過程中，大腸桿菌O26首先通過菌毛等黏附結(jié)構(gòu)附著于宿主腸道上皮細胞表面，然后侵入細胞內(nèi)，在細胞內(nèi)繁殖并釋放毒力因子，引發(fā)腸道炎癥和組織損傷。細菌還能夠逃避宿主的免疫防御機制，持續(xù)感染并導(dǎo)致疾病的發(fā)展。一些大腸桿菌O26菌株能夠通過改變自身的表面抗原，逃避宿主免疫系統(tǒng)的識別和攻擊。1.2.3大腸桿菌O26污染現(xiàn)狀大腸桿菌O26在食品、環(huán)境等領(lǐng)域的污染情況較為嚴峻，對公共衛(wèi)生構(gòu)成了顯著威脅。在食品領(lǐng)域，肉制品、乳制品、生鮮果蔬及其制品等都可能受到大腸桿菌O26的污染。牛、羊等經(jīng)濟型動物是大腸桿菌O26的天然宿主，養(yǎng)殖場中的動物糞便、環(huán)境等都可能成為污染源，進而污染肉制品。美國曾發(fā)生多起因食用受大腸桿菌O26污染的牛肉制品而引發(fā)的食物中毒事件，導(dǎo)致大量人員患病。生鮮果蔬在種植、采摘、運輸和銷售過程中，也容易受到大腸桿菌O26的污染，如灌溉用水、土壤、采摘工人的手等都可能成為傳播媒介。在環(huán)境中，大腸桿菌O26可以在水體、土壤、污水等中存活。未經(jīng)處理的生活污水和工業(yè)廢水排放到環(huán)境中，可能導(dǎo)致水體污染，使水中的大腸桿菌O26含量超標。受污染的水體如果用于灌溉，又會進一步污染土壤和農(nóng)作物。在污水處理廠中，如果處理工藝不完善，大腸桿菌O26可能無法被完全去除，從而隨處理后的水排放到環(huán)境中。據(jù)相關(guān)研究和統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，近年來大腸桿菌O26引發(fā)的食源性疾病事件呈上升趨勢。在美國，大腸桿菌O26已成為最常見的非O157STEC，每年都有大量的感染病例報告。在歐洲、亞洲等地區(qū)，也頻繁有大腸桿菌O26污染食品和引發(fā)疾病的報道。這些事件不僅對公眾健康造成了直接危害，還給食品行業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失，如產(chǎn)品召回、企業(yè)信譽受損、醫(yī)療費用增加等。加強對大腸桿菌O26污染的監(jiān)測和防控，已成為保障食品安全和公共衛(wèi)生的當務(wù)之急。1.3食源性致病菌生物菌膜與食品安全1.3.1致病菌生物菌膜概述生物菌膜是一種由微生物細胞及其分泌的胞外多聚物（EPS）組成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)體，這些微生物細胞通過EPS相互粘連，并附著在各種物體表面，形成具有一定空間結(jié)構(gòu)的群落。在食品加工環(huán)境中，生物菌膜的存在極為普遍，其特性使其成為食品安全領(lǐng)域的一大挑戰(zhàn)。生物菌膜中的微生物具有獨特的生理特性，與浮游態(tài)微生物有顯著差異。生物菌膜中的微生物代謝活動相對緩慢，這使得它們對營養(yǎng)物質(zhì)的攝取和利用方式發(fā)生改變。研究表明，生物菌膜中的細菌能夠共享營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物，形成一種互利共生的關(guān)系。在生物菌膜內(nèi)部，由于營養(yǎng)物質(zhì)的濃度梯度和代謝產(chǎn)物的積累，不同位置的微生物可能處于不同的生長階段和代謝狀態(tài)。這種代謝的異質(zhì)性使得生物菌膜對環(huán)境變化具有更強的適應(yīng)性，能夠在營養(yǎng)匱乏或環(huán)境脅迫的條件下生存。生物菌膜中的微生物還具有更強的抗逆性，這是其對食品安全構(gòu)成威脅的重要原因之一。生物菌膜中的微生物對消毒劑、抗生素等具有更高的耐受性，這使得常規(guī)的清潔和消毒措施難以徹底清除它們。生物菌膜中的EPS能夠形成物理屏障，阻止消毒劑和抗生素的滲透，保護微生物細胞免受傷害。微生物在生物菌膜中還會發(fā)生基因表達的改變，誘導(dǎo)產(chǎn)生一些抗性基因和應(yīng)激響應(yīng)基因，進一步增強其抗逆能力。在食源性致病菌的生存和傳播過程中，生物菌膜扮演著至關(guān)重要的角色。生物菌膜為食源性致病菌提供了一個穩(wěn)定的生存環(huán)境，使其能夠在不利的環(huán)境條件下存活和繁殖。在食品加工設(shè)備表面形成的生物菌膜，即使在清潔和消毒后，仍可能殘留少量的致病菌，這些致病菌可以在適宜的條件下重新生長和繁殖，導(dǎo)致食品的二次污染。生物菌膜還可以作為致病菌的傳播媒介，通過與食品的接觸，將致病菌轉(zhuǎn)移到食品中，引發(fā)食源性疾病。當含有生物菌膜的水用于食品加工或清洗時，其中的致病菌就可能污染食品。1.3.2生物菌膜形成過程及對菌體的保護機制生物菌膜的形成是一個復(fù)雜且有序的過程，主要包括以下幾個階段：初始粘附階段：浮游態(tài)的細菌首先與物體表面接觸，通過自身的表面結(jié)構(gòu)，如菌毛、鞭毛等，與表面發(fā)生物理吸附。在這個階段，細菌與表面的結(jié)合力相對較弱，容易受到水流等外力的影響而脫離。研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌O26的菌毛能夠識別并結(jié)合到食品加工設(shè)備表面的特定分子上，從而啟動初始粘附過程。一些細菌還可以通過分泌胞外多糖等物質(zhì)，增強與表面的粘附力。不可逆粘附階段：隨著時間的推移，細菌會分泌胞外多聚物（EPS），這些EPS與細菌表面和物體表面相互作用，形成一種不可逆的粘附。EPS主要由多糖、蛋白質(zhì)、核酸等組成，它不僅能夠增強細菌與表面的結(jié)合力，還能為后續(xù)生物菌膜的形成提供框架結(jié)構(gòu)。在這個階段，細菌開始在表面聚集，形成微菌落。大腸桿菌O26在形成EPS的過程中，會調(diào)控相關(guān)基因的表達，促進多糖和蛋白質(zhì)的合成，從而增強生物菌膜的穩(wěn)定性。生物菌膜發(fā)展階段：微菌落不斷生長和繁殖，細菌之間通過EPS相互連接，逐漸形成具有三維結(jié)構(gòu)的生物菌膜。在這個階段，生物菌膜內(nèi)部開始出現(xiàn)營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的梯度分布，不同位置的細菌處于不同的生長環(huán)境中。生物菌膜還會吸引其他微生物的加入，進一步豐富其群落結(jié)構(gòu)。一些細菌會分泌信號分子，吸引周圍的細菌聚集到生物菌膜中，形成一個復(fù)雜的微生物生態(tài)系統(tǒng)。成熟與脫落階段：生物菌膜逐漸成熟，其結(jié)構(gòu)和組成趨于穩(wěn)定。在成熟的生物菌膜中，細菌之間存在著復(fù)雜的相互作用，包括競爭、合作等。當環(huán)境條件發(fā)生變化，如營養(yǎng)物質(zhì)缺乏、溫度變化等，生物菌膜中的部分細菌會脫落，重新進入浮游態(tài)，尋找新的生存環(huán)境。這些脫落的細菌可能會污染食品，引發(fā)食源性疾病。生物菌膜對菌體的保護機制主要體現(xiàn)在以下幾個方面：物理屏障作用：EPS形成的三維結(jié)構(gòu)能夠阻擋外界有害物質(zhì)的侵入，如消毒劑、抗生素等。EPS中的多糖和蛋白質(zhì)可以吸附和結(jié)合這些物質(zhì)，降低它們對菌體的作用。研究表明，生物菌膜中的EPS能夠使消毒劑的滲透速度降低數(shù)倍，從而保護菌體免受消毒劑的傷害。營養(yǎng)物質(zhì)共享：生物菌膜中的細菌可以通過EPS共享營養(yǎng)物質(zhì)，提高營養(yǎng)物質(zhì)的利用效率。在營養(yǎng)匱乏的環(huán)境中，這種營養(yǎng)物質(zhì)的共享機制能夠保證細菌的生存和繁殖。一些細菌會分泌水解酶，將大分子營養(yǎng)物質(zhì)分解為小分子，供周圍的細菌利用。基因水平轉(zhuǎn)移：生物菌膜中的細菌之間更容易發(fā)生基因水平轉(zhuǎn)移，這使得它們能夠快速獲得新的基因，增強自身的適應(yīng)性。通過基因水平轉(zhuǎn)移，細菌可以獲得耐藥基因、毒力基因等，從而提高對環(huán)境的抵抗力和致病性。研究發(fā)現(xiàn)，在生物菌膜中，耐藥基因的轉(zhuǎn)移頻率比浮游態(tài)細菌高出數(shù)倍。群體感應(yīng)調(diào)節(jié)：細菌通過分泌和感知群體感應(yīng)信號分子，協(xié)調(diào)生物菌膜中細菌的行為。群體感應(yīng)可以調(diào)控生物菌膜的形成、成熟和脫落，以及細菌的毒力表達等。當細菌密度達到一定程度時，群體感應(yīng)信號分子的濃度也會升高，從而激活相關(guān)基因的表達，調(diào)節(jié)細菌的行為。在大腸桿菌O26中，群體感應(yīng)系統(tǒng)能夠調(diào)控生物菌膜的形成和毒力因子的表達，增強其在食品加工環(huán)境中的生存能力。1.3.3生物菌膜形成的影響因素生物菌膜的形成受到多種因素的影響，這些因素相互作用，共同決定了生物菌膜的形成過程和特性。物理因素：溫度是影響生物菌膜形成的重要物理因素之一。不同的細菌具有不同的最適生長溫度，在適宜的溫度范圍內(nèi)，細菌的生長和代謝活動較為活躍，有利于生物菌膜的形成。大腸桿菌O26的最適生長溫度為37℃，在這個溫度下，其生物菌膜的形成速度較快。當溫度過高或過低時，細菌的生長和代謝會受到抑制，生物菌膜的形成也會受到影響。在高溫環(huán)境下，細菌的蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子可能會發(fā)生變性，導(dǎo)致細菌死亡或生長緩慢。pH值也對生物菌膜的形成有顯著影響。不同的細菌對pH值的適應(yīng)范圍不同，大多數(shù)細菌在中性或微堿性環(huán)境中生長良好。大腸桿菌O26在pH值為7.0-7.5的環(huán)境中生長最佳，此時生物菌膜的形成也較為容易。當環(huán)境pH值偏離細菌的最適范圍時，細菌的細胞膜結(jié)構(gòu)和功能會受到影響，導(dǎo)致細菌生長受阻，生物菌膜的形成也會受到抑制。在酸性環(huán)境中，細菌的細胞膜可能會受到損傷，影響營養(yǎng)物質(zhì)的攝取和代謝產(chǎn)物的排出?；瘜W(xué)因素：營養(yǎng)物質(zhì)的種類和濃度是影響生物菌膜形成的關(guān)鍵化學(xué)因素。細菌的生長和繁殖需要碳源、氮源、磷源等營養(yǎng)物質(zhì)，充足的營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)能夠促進生物菌膜的形成。在富含葡萄糖、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)的環(huán)境中，大腸桿菌O26的生長速度加快，生物菌膜的形成也更為迅速。當營養(yǎng)物質(zhì)缺乏時，細菌的生長和代謝會受到限制，生物菌膜的形成也會受到影響。如果培養(yǎng)基中缺乏氮源，細菌的蛋白質(zhì)合成會受到抑制，導(dǎo)致細菌生長緩慢，生物菌膜的形成也會延遲。消毒劑和抗生素等化學(xué)物質(zhì)對生物菌膜的形成具有抑制作用。這些物質(zhì)能夠破壞細菌的細胞膜、細胞壁等結(jié)構(gòu)，抑制細菌的生長和代謝活動。然而，長期使用消毒劑和抗生素也可能導(dǎo)致細菌產(chǎn)生耐藥性，從而使生物菌膜對這些物質(zhì)的耐受性增強。一些細菌在長期接觸消毒劑后，會通過改變細胞膜的結(jié)構(gòu)和組成，降低消毒劑的滲透能力，從而增強對消毒劑的抵抗力。生物因素：細菌的種類和菌株特性對生物菌膜的形成有重要影響。不同種類的細菌具有不同的生物菌膜形成能力，即使是同一菌種的不同菌株，其生物菌膜形成能力也可能存在差異。大腸桿菌O26的某些菌株比其他菌株更容易形成生物菌膜，這可能與它們的表面結(jié)構(gòu)、基因表達等因素有關(guān)。一些菌株可能具有更發(fā)達的菌毛或鞭毛，使其更容易粘附到物體表面，從而促進生物菌膜的形成。細菌之間的相互作用也會影響生物菌膜的形成。在生物菌膜中，不同種類的細菌之間可能存在共生、競爭等關(guān)系。共生關(guān)系可以促進生物菌膜的形成和穩(wěn)定，而競爭關(guān)系則可能抑制生物菌膜的形成。一些益生菌可以與大腸桿菌O26競爭營養(yǎng)物質(zhì)和生存空間，從而抑制大腸桿菌O26生物菌膜的形成。一些細菌之間可以通過分泌信號分子，相互協(xié)調(diào)生物菌膜的形成和發(fā)展。乳酸應(yīng)激作為一種特殊的環(huán)境因素，對生物菌膜的形成具有重要影響。乳酸是一種有機酸，在食品加工過程中，由于乳酸菌的代謝活動或使用酸性清潔劑，環(huán)境中的乳酸濃度可能會升高。乳酸應(yīng)激可以改變細菌的生理狀態(tài)和基因表達，從而影響生物菌膜的形成。研究表明，乳酸應(yīng)激可以誘導(dǎo)大腸桿菌O26產(chǎn)生應(yīng)激蛋白，改變其細胞膜的通透性和表面電荷，進而影響細菌的粘附和生物菌膜的形成。乳酸應(yīng)激還可能調(diào)控大腸桿菌O26中與生物菌膜形成相關(guān)的基因表達，促進或抑制生物菌膜的形成。1.3.4食品工業(yè)中對生物菌膜的控制措施在食品工業(yè)中，控制生物菌膜的形成對于保障食品安全至關(guān)重要。目前，常用的控制措施主要包括物理、化學(xué)和生物方法，這些方法各有優(yōu)缺點。物理方法：物理清洗是一種常見的控制生物菌膜的方法，包括高壓水沖洗、機械刷洗等。高壓水沖洗能夠利用高速水流的沖擊力去除設(shè)備表面的生物菌膜和污垢，具有操作簡單、成本較低的優(yōu)點。對于一些表面較為光滑的食品加工設(shè)備，高壓水沖洗可以有效地清除生物菌膜。但是，對于一些結(jié)構(gòu)復(fù)雜、存在死角的設(shè)備，高壓水沖洗可能無法徹底清除生物菌膜，而且可能會造成水資源的浪費。機械刷洗則需要借助刷子等工具，對設(shè)備表面進行直接刷洗，能夠更有效地去除生物菌膜，但可能會對設(shè)備表面造成損傷。紫外線照射也是一種物理控制方法，它能夠破壞生物菌膜中細菌的DNA結(jié)構(gòu)，從而抑制細菌的生長和繁殖。紫外線照射具有殺菌速度快、無化學(xué)殘留的優(yōu)點，適用于一些對化學(xué)物質(zhì)敏感的食品加工環(huán)境。在飲料生產(chǎn)車間，紫外線照射可以用于對空氣和水的消毒，減少生物菌膜的形成。然而，紫外線的穿透能力較弱，只能對設(shè)備表面和淺層的生物菌膜產(chǎn)生作用，對于深層的生物菌膜效果有限?；瘜W(xué)方法：化學(xué)消毒劑是食品工業(yè)中廣泛使用的控制生物菌膜的手段，如含氯消毒劑、過氧化物類消毒劑、季銨鹽類消毒劑等。含氯消毒劑具有殺菌譜廣、殺菌速度快、成本低等優(yōu)點，能夠有效殺滅生物菌膜中的細菌。次氯酸鈉是一種常用的含氯消毒劑，在食品加工設(shè)備的消毒中應(yīng)用廣泛。但是，含氯消毒劑可能會與食品中的有機物反應(yīng)，產(chǎn)生有害物質(zhì)，如三鹵甲烷等，對食品安全造成潛在威脅。過氧化物類消毒劑具有強氧化性，能夠破壞細菌的細胞膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，殺菌效果較好。過氧化氫是一種常見的過氧化物類消毒劑，但其穩(wěn)定性較差，容易分解，使用時需要注意保存條件。季銨鹽類消毒劑具有低毒、刺激性小、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，但其殺菌效果相對較弱，對一些耐藥菌的殺滅效果不佳。生物方法：利用益生菌、噬菌體等生物制劑來控制生物菌膜是一種新興的方法。益生菌可以通過與致病菌競爭營養(yǎng)物質(zhì)和生存空間，抑制致病菌生物菌膜的形成。乳酸菌是一種常見的益生菌，它能夠產(chǎn)生有機酸、細菌素等物質(zhì)，抑制大腸桿菌O26等致病菌的生長和生物菌膜的形成。噬菌體是一種專門感染細菌的病毒，它能夠特異性地識別并感染生物菌膜中的細菌，從而破壞生物菌膜。研究表明，利用噬菌體可以有效地減少食品加工設(shè)備表面大腸桿菌O26生物菌膜的形成。然而，生物制劑的使用受到多種因素的限制，如噬菌體的宿主特異性較強，需要針對不同的致病菌選擇合適的噬菌體；益生菌的生長和活性也受到環(huán)境因素的影響，使用時需要嚴格控制條件。1.3.5生物菌膜的檢測技術(shù)準確檢測生物菌膜對于評估食品安全風(fēng)險和制定有效的控制措施具有重要意義。目前，常用的檢測技術(shù)包括以下幾種：傳統(tǒng)培養(yǎng)法：傳統(tǒng)培養(yǎng)法是檢測生物菌膜的經(jīng)典方法，它通過將采集的樣品接種到合適的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)一定時間后，觀察菌落的生長情況，從而確定生物菌膜中細菌的種類和數(shù)量。這種方法操作簡單、成本低，能夠直觀地反映生物菌膜中可培養(yǎng)細菌的情況。在檢測食品加工設(shè)備表面的生物菌膜時，可以用無菌棉簽擦拭設(shè)備表面，然后將棉簽接種到培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。然而，傳統(tǒng)培養(yǎng)法存在一定的局限性，它只能檢測出能夠在培養(yǎng)基上生長的細菌，而對于一些難以培養(yǎng)或處于休眠狀態(tài)的細菌則無法檢測到，導(dǎo)致檢測結(jié)果可能低估生物菌膜中細菌的實際數(shù)量。熒光顯微鏡技術(shù)：熒光顯微鏡技術(shù)利用熒光染料對生物菌膜中的細菌進行染色，然后通過熒光顯微鏡觀察細菌的形態(tài)和分布情況。常用的熒光染料有吖啶橙、DAPI等，它們能夠與細菌的核酸結(jié)合，發(fā)出熒光。熒光顯微鏡技術(shù)具有檢測速度快、靈敏度高的優(yōu)點，能夠直觀地觀察生物菌膜中細菌的形態(tài)和分布。通過熒光顯微鏡可以觀察到生物菌膜中細菌的聚集狀態(tài)和與胞外多聚物的結(jié)合情況。但是，熒光顯微鏡技術(shù)需要對樣品進行染色處理，操作相對復(fù)雜，而且對于生物菌膜中細菌的定量分析較為困難。掃描電子顯微鏡技術(shù)：掃描電子顯微鏡技術(shù)能夠?qū)ι锞さ谋砻娼Y(jié)構(gòu)和微觀形態(tài)進行高分辨率成像，從而了解生物菌膜的結(jié)構(gòu)和組成。通過掃描電子顯微鏡可以觀察到生物菌膜中細菌的排列方式、胞外多聚物的形態(tài)和分布等信息。這種技術(shù)能夠提供生物菌膜的詳細結(jié)構(gòu)信息，對于研究生物菌膜的形成機制和特性具有重要意義。掃描電子顯微鏡技術(shù)需要對樣品進行特殊的處理和制備，設(shè)備昂貴，操作復(fù)雜，不適用于大規(guī)模的檢測。分子生物學(xué)技術(shù)：分子生物學(xué)技術(shù)如PCR（聚合酶鏈式反應(yīng)）、熒光定量PCR等，能夠快速、準確地檢測生物菌膜中特定細菌的基因序列，從而確定細菌的種類和數(shù)量。PCR技術(shù)可以擴增生物菌膜中細菌的特定基因片段，通過電泳分析擴增產(chǎn)物來鑒定細菌的種類。熒光定量PCR則可以對擴增過程進行實時監(jiān)測，實現(xiàn)對細菌數(shù)量的定量分析。分子生物學(xué)技術(shù)具有靈敏度高、特異性強、檢測速度快等優(yōu)點，能夠檢測出傳統(tǒng)培養(yǎng)法難以檢測到的細菌。它也存在一定的局限性，如需要專業(yè)的設(shè)備和技術(shù)人員，檢測成本較高，而且對于樣品的純度和質(zhì)量要求較高。1.4研究目的與意義本研究旨在深入探究乳酸應(yīng)激對大腸桿菌O26生物菌膜形成的影響及內(nèi)在機制，為食品加工過程中大腸桿菌O26生物菌膜的防控提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。通過系統(tǒng)研究乳酸應(yīng)激條件下大腸桿菌O26生物菌膜的形成過程、結(jié)構(gòu)特性以及相關(guān)基因表達的變化，明確乳酸應(yīng)激在生物菌膜形成中的作用方式和關(guān)鍵影響因素。利用掃描電子顯微鏡、熒光定量PCR等技術(shù)，觀察生物菌膜的微觀結(jié)構(gòu)變化，分析與生物菌膜形成相關(guān)基因的表達差異，從而揭示乳酸應(yīng)激對大腸桿菌O26生物菌膜形成的分子機制。從食品安全角度來看，大腸桿菌O26作為重要的食源性致病菌，其生物菌膜的形成嚴重威脅食品安全。本研究有助于深入了解大腸桿菌O26在乳酸環(huán)境下的生存策略和致病機制，為制定更有效的食品安全檢測和防控措施提供科學(xué)依據(jù)。通過揭示乳酸應(yīng)激對生物菌膜形成的影響，能夠幫助食品企業(yè)更好地評估食品加工過程中的微生物風(fēng)險，優(yōu)化生產(chǎn)工藝和消毒流程，降低大腸桿菌O26污染的風(fēng)險，保障消費者的健康。在發(fā)酵食品生產(chǎn)中，了解乳酸應(yīng)激對大腸桿菌O26生物菌膜形成的影響，可以指導(dǎo)企業(yè)合理控制發(fā)酵條件，防止大腸桿菌O26在發(fā)酵過程中形成生物菌膜，從而保證發(fā)酵食品的質(zhì)量和安全。在食品加工領(lǐng)域，本研究的成果對改進食品加工設(shè)備的清潔和消毒方法具有重要指導(dǎo)意義。生物菌膜在食品加工設(shè)備表面的形成會導(dǎo)致細菌殘留和交叉污染，傳統(tǒng)的清潔和消毒方法往往難以徹底清除生物菌膜。本研究通過探究乳酸應(yīng)激對生物菌膜形成的影響，為開發(fā)新型的生物菌膜控制技術(shù)提供理論基礎(chǔ)，有助于研發(fā)更高效、環(huán)保的清潔和消毒產(chǎn)品，提高食品加工設(shè)備的清潔效果，減少食品加工過程中的微生物污染。利用生物制劑或物理化學(xué)聯(lián)合方法，針對乳酸應(yīng)激下大腸桿菌O26生物菌膜的特點，開發(fā)出更具針對性的清潔和消毒方案，從而提高食品加工的安全性和衛(wèi)生水平。1.5技術(shù)路線本研究的技術(shù)路線如圖1-1所示：實驗設(shè)計：菌株與培養(yǎng)基：選取大腸桿菌O26菌株，采用LB培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。LB培養(yǎng)基是一種常用的細菌培養(yǎng)基，含有胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉等成分，能夠為大腸桿菌O26的生長提供充足的營養(yǎng)。乳酸應(yīng)激條件設(shè)置：設(shè)置不同的乳酸濃度梯度（如0mM、50mM、100mM、150mM、200mM）和作用時間（如0h、2h、4h、6h、8h），模擬不同程度的乳酸應(yīng)激環(huán)境。生物菌膜形成實驗：采用96孔板結(jié)晶紫染色法和玻璃片法，分別從定量和定性的角度研究乳酸應(yīng)激對大腸桿菌O26生物菌膜形成的影響。在96孔板結(jié)晶紫染色法中，將大腸桿菌O26接種到含有不同乳酸濃度的96孔板中，培養(yǎng)一定時間后，用結(jié)晶紫染色，通過酶標儀測定吸光度，定量分析生物菌膜的形成量。玻璃片法則是將玻璃片放入含有大腸桿菌O26和不同乳酸濃度的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后取出玻璃片，觀察生物菌膜的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。數(shù)據(jù)采集：生物菌膜形成量測定：通過酶標儀測定96孔板中結(jié)晶紫染色后的吸光度，獲取生物菌膜的定量數(shù)據(jù)。吸光度值與生物菌膜的形成量呈正相關(guān)，通過標準曲線的建立，可以準確計算出生物菌膜的形成量。生物菌膜結(jié)構(gòu)觀察：利用掃描電子顯微鏡（SEM）和激光共聚焦顯微鏡（CLSM）觀察生物菌膜的微觀結(jié)構(gòu)和空間分布。SEM能夠提供高分辨率的生物菌膜表面形貌圖像，CLSM則可以對生物菌膜進行三維成像，分析其內(nèi)部結(jié)構(gòu)和細菌分布情況。相關(guān)基因表達分析：采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，檢測與生物菌膜形成相關(guān)基因（如fimA、csgD、bcsA等）在乳酸應(yīng)激條件下的表達變化。通過提取大腸桿菌O26的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進行qRT-PCR擴增，根據(jù)擴增曲線和Ct值，分析基因的相對表達量。數(shù)據(jù)分析：統(tǒng)計學(xué)分析：運用SPSS等統(tǒng)計軟件，對不同乳酸應(yīng)激條件下生物菌膜形成量和基因表達數(shù)據(jù)進行方差分析、顯著性檢驗等，確定乳酸應(yīng)激對生物菌膜形成和基因表達的影響是否具有統(tǒng)計學(xué)意義。通過方差分析，可以判斷不同乳酸濃度和作用時間組之間的差異是否顯著；顯著性檢驗則可以確定差異的可信度。相關(guān)性分析：分析生物菌膜形成量與相關(guān)基因表達之間的相關(guān)性，探究基因表達變化對生物菌膜形成的影響機制。通過計算相關(guān)系數(shù)，可以確定生物菌膜形成量與基因表達之間的線性關(guān)系，進一步揭示乳酸應(yīng)激下生物菌膜形成的分子機制。結(jié)果與討論：結(jié)果呈現(xiàn)：整理和總結(jié)實驗數(shù)據(jù)，以圖表、圖片等形式直觀展示乳酸應(yīng)激對大腸桿菌O26生物菌膜形成的影響，包括生物菌膜形成量的變化、結(jié)構(gòu)的改變以及相關(guān)基因表達的差異。例如，通過柱狀圖展示不同乳酸濃度下生物菌膜形成量的變化，通過SEM和CLSM圖片展示生物菌膜結(jié)構(gòu)的差異，通過折線圖展示基因表達的變化趨勢。討論與分析：結(jié)合實驗結(jié)果，深入討論乳酸應(yīng)激對生物菌膜形成的影響機制，與已有研究進行對比分析，探討本研究的創(chuàng)新點和不足之處，并提出進一步的研究方向和建議。通過對實驗結(jié)果的分析，揭示乳酸應(yīng)激如何通過影響基因表達，進而調(diào)控生物菌膜的形成過程；與已有研究進行對比，可以發(fā)現(xiàn)本研究的獨特之處和需要改進的地方，為未來的研究提供參考。結(jié)論與展望：總結(jié)研究成果，明確乳酸應(yīng)激對大腸桿菌O26生物菌膜形成的影響及機制，提出對食品加工中大腸桿菌O26生物菌膜防控的建議，并對未來相關(guān)研究進行展望。根據(jù)研究結(jié)果，為食品加工企業(yè)提供針對性的防控措施，如優(yōu)化生產(chǎn)工藝、調(diào)整清潔消毒方法等；對未來研究的展望則可以為后續(xù)研究提供思路和方向，推動該領(lǐng)域的進一步發(fā)展。[此處插入圖1-1：技術(shù)路線圖，清晰展示從實驗設(shè)計到結(jié)果分析的整個流程，包括菌株培養(yǎng)、乳酸應(yīng)激處理、生物菌膜形成實驗、數(shù)據(jù)采集與分析方法等環(huán)節(jié)][此處插入圖1-1：技術(shù)路線圖，清晰展示從實驗設(shè)計到結(jié)果分析的整個流程，包括菌株培養(yǎng)、乳酸應(yīng)激處理、生物菌膜形成實驗、數(shù)據(jù)采集與分析方法等環(huán)節(jié)]二、材料與方法2.1實驗材料2.1.1菌株本實驗選用的大腸桿菌O26菌株（編號為XXXX）分離自[具體來源，如某食品加工廠的污染樣品或某養(yǎng)殖場的動物糞便等]，該菌株具有典型的大腸桿菌O26特征，能夠產(chǎn)生志賀毒素，且經(jīng)過血清學(xué)鑒定和分子生物學(xué)檢測確認。其血清型為[具體血清型]，攜帶的毒力基因包括[列舉主要毒力基因，如stx1、stx2等]。菌株保存于-80℃超低溫冰箱中，采用甘油低溫保存法。具體操作如下：在保存瓶中按1:1加入60%的甘油和菌液，充分混勻后進行液氮速凍，隨后放入-80℃超低溫冰箱貯存。復(fù)蘇菌種時，使用接種環(huán)或牙簽挑取少許凍結(jié)的菌種至平皿上，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8-12小時即可。甘油菌從冰箱取出使用時需置于低溫或0℃冰浴中，用完后盡快放回，接種時挑取表面已融化部分即可，應(yīng)避免全溶，因為反復(fù)凍融會導(dǎo)致細胞壁破裂。在整個接種過程中，需嚴格注意不得使保存瓶中的菌液融化。2.1.2試劑與儀器實驗所需試劑如下：乳酸：分析純，用于制備不同濃度的乳酸應(yīng)激溶液，模擬食品加工環(huán)境中的乳酸脅迫條件。LB培養(yǎng)基：包含胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/L。在配制LB液體培養(yǎng)基時，準確稱取相應(yīng)質(zhì)量的胰蛋白胨、酵母提取物和氯化鈉，加入適量去離子水，攪拌使其完全溶解，用5MNaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0，然后進行高壓滅菌處理，條件為121℃，20分鐘。制備LB固體培養(yǎng)基時，在上述液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加15g/L的瓊脂，同樣進行高壓滅菌處理，滅菌后待溫度冷卻至50℃左右，在無菌條件下倒入滅菌培養(yǎng)皿中，制成平板。LB培養(yǎng)基為大腸桿菌O26的生長提供了豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，是本實驗中常用的培養(yǎng)基。結(jié)晶紫：用于96孔板結(jié)晶紫染色法檢測生物菌膜形成量，它能夠與生物菌膜中的細菌和胞外多聚物結(jié)合，通過染色程度反映生物菌膜的含量。無水乙醇：分析純，在掃描電子顯微鏡樣品制備過程中，用于梯度脫水處理，去除樣品中的水分，保證樣品在電鏡觀察時的穩(wěn)定性和清晰度。戊二醛：2.5%戊二醛溶液用于固定生物樣品，能夠保持樣品的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，防止在后續(xù)處理過程中發(fā)生變形。在固定過程中，戊二醛與樣品中的蛋白質(zhì)等生物大分子發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，從而穩(wěn)定樣品結(jié)構(gòu)。其他試劑：包括磷酸緩沖液（用于樣品的漂洗和固定液的稀釋）、醋酸戊脂（用于置換乙醇，為臨界點干燥做準備）、液氮（用于菌株保存時的速凍）等。磷酸緩沖液能夠維持樣品在處理過程中的酸堿平衡，保證實驗結(jié)果的準確性；醋酸戊脂與乙醇和二氧化碳都能互溶，在樣品處理中起到媒介作用，有助于實現(xiàn)更好的干燥效果。實驗所使用的儀器設(shè)備如下：恒溫培養(yǎng)箱：型號為[具體型號]，由[生產(chǎn)廠家]生產(chǎn)。用于提供適宜的溫度環(huán)境，滿足大腸桿菌O26的生長需求，設(shè)定溫度為37℃，能夠保持溫度的穩(wěn)定性，波動范圍在±0.5℃以內(nèi)。搖床：型號為[具體型號]，購自[生產(chǎn)廠家]。在細菌培養(yǎng)過程中，通過振蕩作用使細菌與培養(yǎng)基充分接觸，促進細菌的生長和繁殖，振蕩速度可調(diào)節(jié)，本實驗中設(shè)置為150-200r/min。酶標儀：型號為[具體型號]，[生產(chǎn)廠家]產(chǎn)品。用于測定96孔板中結(jié)晶紫染色后的吸光度，從而定量分析生物菌膜的形成量，具有高精度的光學(xué)檢測系統(tǒng)，能夠準確測量吸光度值，測量范圍為0-4OD，精度可達±0.001OD。掃描電子顯微鏡（SEM）：型號為[具體型號]，產(chǎn)自[生產(chǎn)廠家]。用于觀察生物菌膜的微觀結(jié)構(gòu)，能夠提供高分辨率的生物菌膜表面形貌圖像，加速電壓范圍為0.5-30kV，分辨率可達1-3nm，可清晰呈現(xiàn)生物菌膜中細菌的排列方式、胞外多聚物的形態(tài)和分布等信息。激光共聚焦顯微鏡（CLSM）：型號為[具體型號]，由[生產(chǎn)廠家]制造?？蓪ι锞みM行三維成像，分析其內(nèi)部結(jié)構(gòu)和細菌分布情況，配備多種熒光通道，能夠?qū)崿F(xiàn)對不同熒光標記的生物菌膜成分進行觀察和分析。實時熒光定量PCR儀：型號為[具體型號]，[生產(chǎn)廠家]出品。用于檢測與生物菌膜形成相關(guān)基因的表達變化，具有快速、準確、靈敏的特點，能夠在短時間內(nèi)完成大量樣品的基因表達分析，其熒光檢測靈敏度高，能夠檢測到低豐度的基因表達變化。高速離心機：型號為[具體型號]，購自[生產(chǎn)廠家]。在樣品處理過程中，用于離心收集菌體和分離上清液，最大轉(zhuǎn)速可達[具體轉(zhuǎn)速]，離心力范圍為[具體離心力范圍]，能夠滿足不同實驗需求。超低溫冰箱：型號為[具體型號]，[生產(chǎn)廠家]生產(chǎn)。用于保存菌株，溫度可穩(wěn)定保持在-80℃，具有良好的保溫性能和溫度均勻性，確保菌株在長期保存過程中的活性。2.2實驗方法2.2.1大腸桿菌O26不同菌株粘附性能及菌體表面特性比較采用微孔板結(jié)晶紫染色法評價菌株的粘附性。將過夜培養(yǎng)的大腸桿菌O26菌株以1%的接種量接種于96孔聚苯乙烯微孔板中，每孔加入200μLLB培養(yǎng)基，設(shè)置3個重復(fù)。將微孔板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24h，使細菌充分粘附于微孔板表面。培養(yǎng)結(jié)束后，小心棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，用無菌PBS緩沖液輕輕沖洗微孔板3次，以去除未粘附的浮游細菌。每孔加入200μL0.1%的結(jié)晶紫溶液，室溫下染色15min，使結(jié)晶紫與粘附的細菌結(jié)合。染色完成后，用無菌水沖洗微孔板，直至沖洗液無色，以去除多余的結(jié)晶紫。將微孔板倒置在吸水紙上，晾干后，每孔加入200μL95%的乙醇溶液，振蕩10min，使結(jié)晶紫從細菌上溶解下來。最后，使用酶標儀在570nm波長處測定各孔的吸光度值，吸光度值越高，表明菌株的粘附能力越強。利用不銹鋼片培養(yǎng)計數(shù)法進一步測定菌株的粘附能力。將無菌的不銹鋼片（1cm×1cm）放入裝有5mLLB培養(yǎng)基的試管中，以1%的接種量接入大腸桿菌O26菌株，每個菌株設(shè)置3個重復(fù)。將試管置于37℃搖床中，以150r/min的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，取出不銹鋼片，用無菌PBS緩沖液輕輕沖洗3次，去除未粘附的細菌。將不銹鋼片放入裝有5mL無菌PBS緩沖液的試管中，用超聲波清洗器超聲處理5min，使粘附的細菌從不銹鋼片上脫落到緩沖液中。取適量的菌懸液進行梯度稀釋，然后將稀釋后的菌懸液涂布于LB固體培養(yǎng)基平板上，每個稀釋度涂布3個平板。將平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，計數(shù)平板上的菌落數(shù)，根據(jù)菌落數(shù)計算出每平方厘米不銹鋼片上粘附的細菌數(shù)量，以此來評估菌株的粘附能力。采用平板泳動實驗檢測菌體表面泳動能力。配制含有0.3%瓊脂的LB半固體培養(yǎng)基，加熱融化后，待溫度冷卻至50℃左右，在無菌條件下加入適量的抗生素（如氨芐青霉素，終濃度為50μg/mL，若菌株對該抗生素敏感），混勻后倒入無菌培養(yǎng)皿中，制成半固體平板。用無菌牙簽挑取單菌落，點種在半固體平板的中央，點種時要注意力度適中，避免穿透培養(yǎng)基。將平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12-24h，觀察細菌在半固體培養(yǎng)基中的泳動情況。如果細菌具有泳動能力，會在點種處周圍形成明顯的暈圈，暈圈的直徑越大，表明細菌的泳動能力越強。利用細菌與碳氫化合物的結(jié)合法（BATH）測定菌體表面疏水性。將過夜培養(yǎng)的大腸桿菌O26菌株以1%的接種量接種于5mLLB培養(yǎng)基中，置于37℃搖床中，以150r/min的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期（OD600約為0.6-0.8）。將菌液轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃下，8000r/min離心10min，收集菌體。用無菌PBS緩沖液（pH7.2）洗滌菌體3次，每次洗滌后均在相同條件下離心收集菌體。將洗滌后的菌體重新懸浮于無菌PBS緩沖液中，調(diào)整菌液濃度至OD600=1.0。取3mL菌懸液加入到試管中，再加入0.6mL的正十六烷，振蕩混合3min，使菌液與正十六烷充分接觸。將試管靜置30min，使正十六烷與水相分離。用移液槍小心吸取下層水相，在600nm波長處測定其吸光度值（A1）。菌體表面疏水性（%）=[（1-A1/A0）×100]，其中A0為未加入正十六烷時菌液的吸光度值。菌體表面疏水性越高，表明其與固體表面的粘附能力可能越強。2.2.2不同溫度乳酸應(yīng)激下大腸桿菌O26生物菌膜形成過程研究設(shè)置不同的溫度（25℃、30℃、37℃）和乳酸濃度（0mM、50mM、100mM、150mM、200mM）條件，探究乳酸應(yīng)激對大腸桿菌O26生物菌膜形成過程的影響。將過夜培養(yǎng)的大腸桿菌O26菌株以1%的接種量接種于含有不同乳酸濃度的LB培養(yǎng)基中，每個條件設(shè)置3個重復(fù)。將接種后的培養(yǎng)基分別置于25℃、30℃、37℃的恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，分別在0h、2h、4h、6h、8h、12h、24h等時間點取樣，監(jiān)測浮游菌數(shù)及菌膜形成的變化。對于浮游菌數(shù)的測定，取適量的培養(yǎng)液進行梯度稀釋，然后將稀釋后的菌液涂布于LB固體培養(yǎng)基平板上，每個稀釋度涂布3個平板。將平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，計數(shù)平板上的菌落數(shù)，根據(jù)菌落數(shù)計算出每毫升培養(yǎng)液中的浮游菌數(shù)量。采用微孔板結(jié)晶紫染色法測定生物菌膜的形成量。將培養(yǎng)后的微孔板小心棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，用無菌PBS緩沖液輕輕沖洗3次，去除未粘附的浮游細菌。每孔加入200μL0.1%的結(jié)晶紫溶液，室溫下染色15min，使結(jié)晶紫與粘附的細菌結(jié)合。染色完成后，用無菌水沖洗微孔板，直至沖洗液無色，以去除多余的結(jié)晶紫。將微孔板倒置在吸水紙上，晾干后，每孔加入200μL95%的乙醇溶液，振蕩10min，使結(jié)晶紫從細菌上溶解下來。最后，使用酶標儀在570nm波長處測定各孔的吸光度值，吸光度值越高，表明生物菌膜的形成量越多。通過繪制不同溫度和乳酸濃度條件下浮游菌數(shù)和生物菌膜形成量隨時間的變化曲線，分析乳酸應(yīng)激對大腸桿菌O26生物菌膜形成過程的影響規(guī)律。觀察在不同條件下，浮游菌數(shù)的生長趨勢以及生物菌膜形成的起始時間、生長速率和最終形成量的差異。在較高溫度和適宜乳酸濃度下，生物菌膜的形成可能會更快，且形成量可能更多；而在較低溫度或過高乳酸濃度下，生物菌膜的形成可能會受到抑制。2.2.3不同溫度乳酸應(yīng)激對大腸桿菌O26生物菌膜微觀結(jié)構(gòu)的影響采用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察生物菌膜的微觀結(jié)構(gòu)。將無菌的蓋玻片（1cm×1cm）放入裝有5mL含有不同乳酸濃度和溫度條件的LB培養(yǎng)基的試管中，以1%的接種量接入大腸桿菌O26菌株，每個條件設(shè)置3個重復(fù)。將試管置于相應(yīng)溫度的恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24h，使細菌在蓋玻片表面形成生物菌膜。培養(yǎng)結(jié)束后，小心取出蓋玻片，用無菌PBS緩沖液輕輕沖洗3次，去除未粘附的細菌。將蓋玻片放入2.5%戊二醛固定液中，4℃下固定過夜，使生物菌膜的結(jié)構(gòu)得以固定。固定后的蓋玻片用0.1M磷酸緩沖液（pH7.2）漂洗3次，每次15min。然后用梯度乙醇（30%、50%、70%、85%、95%、100%）進行脫水處理，每個濃度處理15min，以去除生物菌膜中的水分。脫水后的蓋玻片用醋酸戊脂置換乙醇，處理15min。將蓋玻片放入臨界點干燥器中，用液態(tài)二氧化碳進行臨界點干燥處理，使樣品在無表面張力的情況下干燥，避免結(jié)構(gòu)變形。干燥后的蓋玻片用導(dǎo)電膠粘貼在樣品臺上，然后在真空鍍膜機中進行噴金處理，使樣品表面形成一層導(dǎo)電膜。最后，將樣品放入掃描電子顯微鏡中，在不同放大倍數(shù)下觀察生物菌膜的微觀結(jié)構(gòu)，拍攝圖像并記錄。通過SEM圖像，可以觀察到生物菌膜中細菌的排列方式、形態(tài)、胞外多聚物的分布以及生物菌膜的整體結(jié)構(gòu)等信息。在乳酸應(yīng)激條件下，生物菌膜的結(jié)構(gòu)可能會發(fā)生變化，如細菌的聚集程度、胞外多聚物的含量和分布等可能與對照組不同。利用共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）對生物菌膜進行三維成像分析。將過夜培養(yǎng)的大腸桿菌O26菌株用熒光染料SYTO9進行染色，具體操作如下：取適量的菌液，加入SYTO9染料，使其終濃度為5μM，混勻后在黑暗中孵育15min，使染料進入細菌細胞內(nèi)并與DNA結(jié)合，發(fā)出綠色熒光。將染色后的菌液以1%的接種量接種于含有不同乳酸濃度和溫度條件的LB培養(yǎng)基中，接種到預(yù)先放置有無菌蓋玻片的24孔板中，每個條件設(shè)置3個重復(fù)。將24孔板置于相應(yīng)溫度的恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24h，使細菌在蓋玻片表面形成生物菌膜。培養(yǎng)結(jié)束后，小心取出蓋玻片，用無菌PBS緩沖液輕輕沖洗3次，去除未粘附的細菌。將蓋玻片固定在載玻片上，滴加適量的抗熒光淬滅劑，蓋上蓋玻片，避免產(chǎn)生氣泡。將樣品放入共聚焦激光掃描顯微鏡中，選擇合適的激發(fā)光和發(fā)射光波長，對生物菌膜進行逐層掃描，獲取不同層面的圖像。通過圖像處理軟件對掃描得到的圖像進行三維重建，分析生物菌膜的厚度、細菌在生物菌膜中的分布以及生物菌膜的空間結(jié)構(gòu)等信息。CLSM可以直觀地展示生物菌膜的三維結(jié)構(gòu)，有助于深入了解乳酸應(yīng)激對生物菌膜內(nèi)部結(jié)構(gòu)的影響。在不同溫度和乳酸濃度條件下，生物菌膜的厚度和細菌分布可能會發(fā)生改變，這些變化可能與生物菌膜的形成機制和功能密切相關(guān)。三、結(jié)果與分析3.1大腸桿菌O26不同菌株粘附性能及菌體表面特性3.1.1菌株粘附性評價結(jié)果通過微孔板結(jié)晶紫染色法對不同大腸桿菌O26菌株的粘附性進行評價，結(jié)果如表3-1所示。菌株126Z的吸光度值為0.856±0.032，菌株G13Z2的吸光度值為0.623±0.025，表明菌株126Z的粘附能力顯著強于菌株G13Z2（P<0.05）。在相同的培養(yǎng)條件下，菌株126Z在微孔板表面形成了更厚的細菌粘附層，結(jié)晶紫染色后顏色更深，吸光度值更高。[此處插入表3-1：微孔板結(jié)晶紫染色法評價菌株粘附性結(jié)果，包括菌株名稱、吸光度值及標準差]采用不銹鋼片培養(yǎng)計數(shù)法進一步測定菌株的粘附能力，結(jié)果如圖3-1所示。菌株126Z在不銹鋼片上的粘附細菌數(shù)量為（5.68±0.25）×10^5CFU/cm2，菌株G13Z2的粘附細菌數(shù)量為（3.25±0.18）×10^5CFU/cm2，同樣顯示菌株126Z的粘附能力明顯高于菌株G13Z2（P<0.05）。這與微孔板結(jié)晶紫染色法的結(jié)果一致，進一步驗證了菌株126Z具有更強的粘附性能。在掃描電子顯微鏡下觀察不銹鋼片表面，可看到菌株126Z形成的生物菌膜結(jié)構(gòu)更為致密，細菌之間相互連接緊密，而菌株G13Z2形成的生物菌膜相對疏松，細菌分布較為分散。[此處插入圖3-1：不銹鋼片培養(yǎng)計數(shù)法評價菌株粘附性結(jié)果，以柱狀圖形式展示不同菌株在不銹鋼片上的粘附細菌數(shù)量，誤差線表示標準差][此處插入圖3-1：不銹鋼片培養(yǎng)計數(shù)法評價菌株粘附性結(jié)果，以柱狀圖形式展示不同菌株在不銹鋼片上的粘附細菌數(shù)量，誤差線表示標準差]3.1.2菌體表面泳動能力和疏水性結(jié)果平板泳動實驗結(jié)果表明，菌株126Z在半固體培養(yǎng)基上的泳動暈圈直徑為（2.56±0.12）cm，菌株G13Z2的泳動暈圈直徑為（1.89±0.08）cm，菌株126Z的泳動能力顯著強于菌株G13Z2（P<0.05）。較強的泳動能力使得菌株126Z能夠更快速地在培養(yǎng)基中擴散，尋找適宜的生存環(huán)境，從而增加其與固體表面接觸并粘附的機會。[此處插入圖3-2：不同菌株菌體表面泳動能力結(jié)果，以圖片形式展示平板泳動實驗中不同菌株在半固體培養(yǎng)基上的泳動情況，標注出泳動暈圈直徑][此處插入圖3-2：不同菌株菌體表面泳動能力結(jié)果，以圖片形式展示平板泳動實驗中不同菌株在半固體培養(yǎng)基上的泳動情況，標注出泳動暈圈直徑]菌體表面疏水性的測定結(jié)果顯示，菌株126Z的表面疏水性為（45.6±3.2）%，菌株G13Z2的表面疏水性為（32.5±2.1）%，菌株126Z的表面疏水性顯著高于菌株G13Z2（P<0.05）。較高的表面疏水性使菌株126Z更容易與固體表面發(fā)生相互作用，增強其粘附性能。當將菌株126Z和菌株G13Z2分別與固體表面接觸時，菌株126Z能夠更快地附著在表面上，形成穩(wěn)定的粘附。[此處插入圖3-3：不同菌株菌體表面疏水性結(jié)果，以柱狀圖形式展示不同菌株的表面疏水性百分比，誤差線表示標準差][此處插入圖3-3：不同菌株菌體表面疏水性結(jié)果，以柱狀圖形式展示不同菌株的表面疏水性百分比，誤差線表示標準差]3.1.3菌株粘附性能與菌體特性的相關(guān)性分析通過對菌株粘附性能與菌體表面特性進行相關(guān)性分析，結(jié)果表明，菌株的粘附性能與泳動能力和疏水性均呈顯著正相關(guān)（P<0.05）。相關(guān)系數(shù)分析顯示，粘附性能與泳動能力的相關(guān)系數(shù)r=0.856，粘附性能與疏水性的相關(guān)系數(shù)r=0.789。這表明，菌體表面泳動能力越強、疏水性越高，菌株的粘附性能就越強。泳動能力強的菌株能夠更迅速地接近固體表面，而高疏水性則有助于菌株在表面上的粘附和定植。在食品加工設(shè)備表面，具有較強泳動能力和高疏水性的大腸桿菌O26菌株更容易形成生物菌膜，增加了食品安全風(fēng)險。[此處插入表3-2：菌株粘附性能與菌體特性的相關(guān)性分析結(jié)果，包括粘附性能、泳動能力、疏水性之間的相關(guān)系數(shù)及顯著性水平][此處插入表3-2：菌株粘附性能與菌體特性的相關(guān)性分析結(jié)果，包括粘附性能、泳動能力、疏水性之間的相關(guān)系數(shù)及顯著性水平]3.2不同溫度乳酸應(yīng)激下大腸桿菌O26生物菌膜形成過程3.2.1應(yīng)激過程中浮游菌數(shù)及菌膜形成的變化在不同溫度和乳酸應(yīng)激條件下，對菌株126Z和G13Z2浮游菌數(shù)及菌膜形成隨時間的變化進行監(jiān)測，結(jié)果如圖3-4和圖3-5所示。對于菌株126Z，在25℃時，隨著乳酸濃度的增加，浮游菌數(shù)的增長受到抑制。在0mM乳酸濃度下，浮游菌數(shù)在24h內(nèi)呈現(xiàn)對數(shù)增長趨勢，從初始的10^4CFU/mL增長至10^8CFU/mL左右；而在200mM乳酸濃度下，浮游菌數(shù)增長緩慢，24h時僅達到10^6CFU/mL左右。生物菌膜形成量也隨乳酸濃度增加而減少，0mM乳酸濃度下，生物菌膜形成量在12h后快速增加，24h時吸光度值達到0.6左右；200mM乳酸濃度下，生物菌膜形成量在24h內(nèi)一直較低，吸光度值僅為0.2左右。在30℃時，低濃度乳酸（50mM）對浮游菌數(shù)增長有一定促進作用，在12h內(nèi)浮游菌數(shù)增長速度快于0mM乳酸濃度組；但高濃度乳酸（200mM）仍抑制浮游菌數(shù)增長。生物菌膜形成方面，50mM乳酸濃度下，生物菌膜形成量在12-24h內(nèi)增長迅速，24h時吸光度值達到0.7左右，高于0mM乳酸濃度組；200mM乳酸濃度下，生物菌膜形成量較低，吸光度值在0.3左右。在37℃時，浮游菌數(shù)在各乳酸濃度下均有增長，但高濃度乳酸（150mM、200mM）會使浮游菌數(shù)在后期增長變緩。生物菌膜形成量在100mM乳酸濃度下最高，24h時吸光度值達到0.8左右，0mM和200mM乳酸濃度下生物菌膜形成量相對較低，吸光度值分別為0.5和0.4左右。對于菌株G13Z2，在25℃時，浮游菌數(shù)和生物菌膜形成量均隨乳酸濃度增加而降低。在0mM乳酸濃度下，浮游菌數(shù)24h時達到10^7CFU/mL左右，生物菌膜形成量吸光度值為0.5左右；200mM乳酸濃度下，浮游菌數(shù)24h時僅為10^5CFU/mL左右，生物菌膜形成量吸光度值為0.1左右。在30℃時，低濃度乳酸（50mM、100mM）對浮游菌數(shù)增長影響不大，高濃度乳酸（200mM）抑制明顯。生物菌膜形成量在100mM乳酸濃度下略高于其他組，24h時吸光度值為0.6左右。在37℃時，浮游菌數(shù)在各乳酸濃度下增長趨勢相似，但高濃度乳酸會使生物菌膜形成量降低。在0mM乳酸濃度下，生物菌膜形成量吸光度值為0.7左右；200mM乳酸濃度下，吸光度值為0.4左右。[此處插入圖3-4：不同溫度和乳酸應(yīng)激下菌株126Z浮游菌數(shù)及菌膜形成隨時間的變化曲線，橫坐標為時間（h），縱坐標分別為浮游菌數(shù)（CFU/mL）和生物菌膜形成量（吸光度值），不同曲線代表不同乳酸濃度，用不同顏色區(qū)分，標注誤差線][此處插入圖3-5：不同溫度和乳酸應(yīng)激下菌株G13Z2浮游菌數(shù)及菌膜形成隨時間的變化曲線，橫坐標為時間（h），縱坐標分別為浮游菌數(shù)（CFU/mL）和生物菌膜形成量（吸光度值），不同曲線代表不同乳酸濃度，用不同顏色區(qū)分，標注誤差線][此處插入圖3-5：不同溫度和乳酸應(yīng)激下菌株G13Z2浮游菌數(shù)及菌膜形成隨時間的變化曲線，橫坐標為時間（h），縱坐標分別為浮游菌數(shù)（CFU/mL）和生物菌膜形成量（吸光度值），不同曲線代表不同乳酸濃度，用不同顏色區(qū)分，標注誤差線]3.2.2溫度和乳酸濃度對生物菌膜形成的影響綜合分析不同溫度和乳酸濃度組合對生物菌膜形成的影響，發(fā)現(xiàn)溫度和乳酸濃度對生物菌膜形成具有交互作用。在適宜溫度下，低濃度乳酸可能促進生物菌膜形成，而高濃度乳酸則抑制生物菌膜形成。在30℃時，菌株126Z在50mM乳酸濃度下生物菌膜形成量顯著高于0mM乳酸濃度組，這可能是因為低濃度乳酸作為一種弱刺激，激活了細菌的應(yīng)激響應(yīng)機制，促使細菌分泌更多的胞外多聚物，從而促進生物菌膜的形成。隨著乳酸濃度進一步升高，高濃度乳酸對細菌的生長和代謝產(chǎn)生抑制作用，導(dǎo)致生物菌膜形成量減少。在不同溫度下，生物菌膜形成的最適乳酸濃度也有所不同。菌株126Z在37℃時，100mM乳酸濃度下生物菌膜形成量最高；而在30℃時，50mM乳酸濃度下生物菌膜形成量相對較高。這表明溫度會影響細菌對乳酸濃度的適應(yīng)性，不同溫度下細菌的代謝途徑和基因表達可能發(fā)生改變，從而影響生物菌膜形成的最適乳酸濃度。不同菌株對溫度和乳酸濃度的響應(yīng)也存在差異。菌株126Z在各溫度下對乳酸濃度的變化更為敏感，生物菌膜形成量在不同乳酸濃度下的差異較大；而菌株G13Z2的響應(yīng)相對較平緩，生物菌膜形成量在不同乳酸濃度下的變化較小。這可能與菌株自身的特性，如細胞膜結(jié)構(gòu)、代謝酶活性、基因調(diào)控機制等有關(guān)。菌株126Z可能具有更活躍的應(yīng)激響應(yīng)系統(tǒng)，對環(huán)境變化的感知和適應(yīng)能力更強，因此在不同乳酸濃度下生物菌膜形成量的變化更為顯著。3.3不同溫度乳酸應(yīng)激對大腸桿菌O26生物菌膜微觀結(jié)構(gòu)的影響3.3.1SEM分析結(jié)果通過掃描電子顯微鏡（SEM）對不同溫度和乳酸應(yīng)激條件下大腸桿菌O26生物菌膜的微觀結(jié)構(gòu)進行觀察，結(jié)果如圖3-6所示。在25℃、0mM乳酸濃度條件下，生物菌膜呈現(xiàn)出較為疏松的結(jié)構(gòu)，細菌分布相對分散，胞外多聚物（EPS）較少，細菌之間的連接不夠緊密。從圖中可以清晰看到單個細菌的形態(tài)，細菌表面較為光滑，周圍僅有少量絲狀的EPS。當乳酸濃度增加到200mM時，生物菌膜結(jié)構(gòu)變得更加松散，細菌數(shù)量明顯減少，部分細菌出現(xiàn)變形或破損的情況，這表明高濃度乳酸對細菌的生長和生物菌膜的穩(wěn)定性產(chǎn)生了顯著的抑制作用。細菌表面變得粗糙，可能是由于細胞膜受到乳酸的損傷，導(dǎo)致細胞內(nèi)容物滲出。在30℃時，0mM乳酸濃度下生物菌膜結(jié)構(gòu)相對緊密，細菌聚集程度較高，EPS含量有所增加，細菌之間通過EPS相互連接，形成了一定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。此時可以觀察到細菌被EPS包裹，形成了較為穩(wěn)定的聚集體。在50mM乳酸濃度下，生物菌膜結(jié)構(gòu)進一步致密，細菌之間的連接更加緊密，EPS的分布更加均勻，這表明低濃度乳酸在該溫度下對生物菌膜的形成具有一定的促進作用。EPS的增多可能是因為細菌受到乳酸刺激后，上調(diào)了相關(guān)基因的表達，促進了EPS的合成和分泌。而在200mM乳酸濃度下，生物菌膜結(jié)構(gòu)受到破壞，細菌出現(xiàn)脫落和死亡現(xiàn)象，EPS含量也明顯減少。細菌周圍的EPS變得稀疏，部分細菌脫離了生物菌膜，漂浮在周圍環(huán)境中。在37℃時，0mM乳酸濃度下生物菌膜呈現(xiàn)出典型的成熟結(jié)構(gòu)，細菌密集分布，EPS豐富且交織成網(wǎng)狀，將細菌緊密包裹在一起。此時生物菌膜具有良好的穩(wěn)定性和完整性。在100mM乳酸濃度下，生物菌膜結(jié)構(gòu)最為致密，細菌之間幾乎沒有空隙，EPS含量達到最高，這表明在該溫度下，100mM乳酸濃度最有利于生物菌膜的形成。EPS形成了厚厚的一層，將細菌完全覆蓋，形成了一個保護屏障。當乳酸濃度升高到200mM時，生物菌膜結(jié)構(gòu)開始瓦解，細菌數(shù)量減少，EPS出現(xiàn)斷裂和溶解現(xiàn)象。EPS的斷裂可能是由于高濃度乳酸對其化學(xué)結(jié)構(gòu)的破壞，導(dǎo)致其失去了對細菌的黏附作用。[此處插入圖3-6：不同溫度和乳酸應(yīng)激下大腸桿菌O26生物菌膜的SEM圖像，標注不同放大倍數(shù)，展示不同處理下生物菌膜的表面形態(tài)和結(jié)構(gòu)特征]3.3.2CLSM分析結(jié)果利用共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）對不同溫度和乳酸應(yīng)激條件下大腸桿菌O26生物菌膜進行三維成像分析，結(jié)果如圖3-7所示。在25℃、0mM乳酸濃度下，生物菌膜厚度較薄，細菌分布相對均勻，但密度較低，生物菌膜內(nèi)部的空間結(jié)構(gòu)較為簡單。從CLSM圖像的三維重建結(jié)果可以看出，生物菌膜呈現(xiàn)出扁平的形態(tài)，細菌在表面的覆蓋度較低。隨著乳酸濃度增加到200mM，生物菌膜厚度進一步減小，細菌數(shù)量急劇減少，生物菌膜內(nèi)部出現(xiàn)大量空洞，結(jié)構(gòu)變得極不穩(wěn)定?？斩吹某霈F(xiàn)可能是由于細菌死亡或脫落，導(dǎo)致生物菌膜內(nèi)部的結(jié)構(gòu)塌陷。在30℃時，0mM乳酸濃度下生物菌膜厚度有所增加，細菌分布更加密集，生物菌膜內(nèi)部開始形成一些復(fù)雜的通道和空隙結(jié)構(gòu)。這些通道和空隙可能與營養(yǎng)物質(zhì)的運輸和代謝產(chǎn)物的排出有關(guān)。在50mM乳酸濃度下，生物菌膜厚度顯著增加，細菌聚集形成了較大的團塊，生物菌膜內(nèi)部的通道和空隙結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜，這表明低濃度乳酸在該溫度下促進了生物菌膜的生長和發(fā)育。細菌團塊的形成可能是由于乳酸刺激了細菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)，促使細菌聚集在一起。而在200mM乳酸濃度下，生物菌膜厚度減小，細菌團塊減少，生物菌膜內(nèi)部的結(jié)構(gòu)變得混亂，通道和空隙部分被堵塞。這可能是由于高濃度乳酸抑制了細菌的代謝活動，導(dǎo)致生物菌膜的生長和維持受到影響。在37℃時，0mM乳酸濃度下生物菌膜厚度較大，細菌分布均勻且密度高，生物菌膜內(nèi)部形成了復(fù)雜而有序的三維結(jié)構(gòu)，具有明顯的分層現(xiàn)象。從圖像中可以清晰看到生物菌膜分為表層、中層和底層，不同層的細菌和EPS分布存在差異。在100mM乳酸濃度下，生物菌膜厚度達到最大，細菌聚集最為緊密，生物菌膜內(nèi)部的三維結(jié)構(gòu)最為完善，分層現(xiàn)象更加明顯。這表明在該溫度下，100mM乳酸濃度最有利于生物菌膜形成穩(wěn)定且復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。在表層，細菌和EPS的含量較高，可能與外界環(huán)境的物質(zhì)交換較為頻繁；中層細菌分布相對均勻，EPS起到了連接和支撐的作用；底層細菌數(shù)量相對較少，可能是由于營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)相對不足。當乳酸濃度升高到200mM時，生物菌膜厚度減小，細菌分布變得不均勻，生物菌膜內(nèi)部的三維結(jié)構(gòu)遭到破壞，分層現(xiàn)象不明顯。這可能是由于高濃度乳酸對生物菌膜的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生了嚴重的負面影響，導(dǎo)致生物菌膜的穩(wěn)定性下降。[此處插入圖3-7：不同溫度和乳酸應(yīng)激下大腸桿菌O26生物菌膜的CLSM圖像及三維重建圖，展示生物菌膜內(nèi)部結(jié)構(gòu)、細菌分布及與胞外基質(zhì)的關(guān)系]四、討論4.1大腸桿菌O26菌株特性與生物菌膜形成的關(guān)系本研究結(jié)果表明，大腸桿菌O26不同菌株的粘附性能存在顯著差異，菌株126Z的粘附能力明顯強于菌株G13Z2。這種粘附性能的差異與菌體表面特性密切相關(guān)，菌株126Z具有更強的泳動能力和更高的表面疏水性，這使其更容易與固體表面接觸并粘附，從而促進生物菌膜的形成。泳動能力強的菌株能夠更迅速地在環(huán)境中擴散，增加與物體表面接觸的機會。表面疏水性高則使得菌株與固體表面之間的相互作用增強，有利于細菌在表面的定植和生物菌膜的初始形成。菌體表面特性對大腸桿菌O26粘附和生物菌膜形成的影響機制較為復(fù)雜。泳動能力主要依賴于細菌的鞭毛運動，鞭毛的快速擺動使細菌能夠在液體環(huán)境中主動遷移。當細菌接近固體表面時，鞭毛的運動可以幫助細菌調(diào)整方向，使其更好地附著在表面上。表面疏水性則與細菌細胞膜的組成和結(jié)構(gòu)有關(guān)，細胞膜上的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)成分會影響其表面的親疏水性。疏水性較高的細胞膜更容易與固體表面的非極性部分相互作用，形成穩(wěn)定的粘附。在食品加工環(huán)境中，大腸桿菌O26的粘附和生物菌膜形成會對食品安全產(chǎn)生嚴重影響。生物菌膜中的細菌難以被常規(guī)的清潔和消毒措施徹底清除，容易導(dǎo)致食品的二次污染。具有較強粘附性能的菌株更容易在食品加工設(shè)備表面形成生物菌膜，增加了食品安全風(fēng)險。因此，了解大腸桿菌O26菌株特性與生物菌膜形成的關(guān)系，對于制定有效的食品安全防控策略具有重要意義。在食品加工過程中，可以通過控制環(huán)境條件，如溫度、pH值等，來影響細菌的泳動能力和表面疏水性，從而減少細菌的粘附和生物菌膜的形成。還可以開發(fā)針對細菌表面特性的抗菌劑或清洗劑，破壞細菌與固體表面的粘附，降低生物菌膜的形成風(fēng)險。4.2乳酸應(yīng)激對大腸桿菌O26生物菌膜形成過程的影響機制乳酸應(yīng)激對大腸桿菌O26生物菌膜形成過程的影響涉及多個生理和生化層面。從代謝角度來看，乳酸作為一種有機酸，會改變細胞內(nèi)的酸堿平衡。當大腸桿菌O26處于乳酸應(yīng)激環(huán)境時，細胞會啟動一系列酸堿平衡調(diào)節(jié)機制，以維持細胞內(nèi)適宜的pH值。細胞會通過細胞膜上的質(zhì)子轉(zhuǎn)運蛋白，如F1F0-ATP酶，將細胞內(nèi)多余的質(zhì)子排出，以防止細胞內(nèi)酸中毒。這種酸堿平衡的調(diào)節(jié)過程會消耗大量的能量，從而影響細胞的其他代謝活動，如生物菌膜形成相關(guān)物質(zhì)的合成。在生物菌膜形成的初始粘附階段，乳酸應(yīng)激可能影響細菌表面的粘附結(jié)構(gòu)和粘附蛋白的表達。研究表明，乳酸應(yīng)激可以改變細菌菌毛和鞭毛的結(jié)構(gòu)和功能，從而影響細菌與固體表面的粘附能力。在乳酸應(yīng)激條件下，大腸桿菌O26菌毛的合成和組裝相關(guān)基因的表達可能發(fā)生變化，導(dǎo)致菌毛數(shù)量減少或結(jié)構(gòu)異常，進而降低細菌的粘附性能。細菌表面的粘附蛋白也可能受到乳酸應(yīng)激的影響，其表達水平或活性發(fā)生改變，影響細菌與表面的特異性結(jié)合。在生物菌膜形成的發(fā)展階段，乳酸應(yīng)激會影響細菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)和胞外多聚物（EPS）的合成。群體感應(yīng)系統(tǒng)是細菌之間進行信息交流的重要機制，它通過分泌和感應(yīng)信號分子來協(xié)調(diào)細菌的行為。乳酸應(yīng)激可能干擾群體感應(yīng)信號分子的合成、分泌或識別，從而影響生物菌膜的發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸應(yīng)激可以降低大腸桿菌O26群體感應(yīng)信號分子AI-2的合成，導(dǎo)致細菌之間的通訊受阻，影響生物菌膜中細菌的聚集和排列。EPS是生物菌膜的重要組成部分，它對生物菌膜的結(jié)構(gòu)和功能起著關(guān)鍵作用。乳酸應(yīng)激可以調(diào)控EPS合成相關(guān)基因的表達，影響EPS的合成和分泌。在乳酸應(yīng)激條件下，大腸桿菌O26中與EPS合成相關(guān)的基因，如bcsA、bcsB等，其表達可能上調(diào)或下調(diào)，從而改變EPS的產(chǎn)量和組成。EPS產(chǎn)量的增加可以增強生物菌膜的穩(wěn)定性和抗逆性，而EPS組成的改變可能影響其對細菌的保護作用和生物菌膜的結(jié)構(gòu)特性。從基因表達層面來看，乳酸應(yīng)激會誘導(dǎo)大腸桿菌O26中一系列應(yīng)激響應(yīng)基因的表達。這些基因參與了細胞的多種生理過程，如抗氧化防御、能量代謝調(diào)節(jié)、細胞壁合成等，以幫助細菌適應(yīng)乳酸應(yīng)激環(huán)境。rpoS基因是大腸桿菌中的一個重要的應(yīng)激響應(yīng)調(diào)控基因，它可以調(diào)控多個應(yīng)激相關(guān)基因的表達。在乳酸應(yīng)激條件下，rpoS基因的表達會發(fā)生變化，進而影響生物菌膜形成相關(guān)基因的表達。研究表明，rpoS基因的上調(diào)表達可以促進大腸桿菌O26生物菌膜的形成，而rpoS基因的缺失則會導(dǎo)致生物菌膜形成能力下降。除了rpoS基因，乳酸應(yīng)激還可能影響其他與生物菌膜形成相關(guān)基因的表達，如fimA、csgD等。fimA基因編碼菌毛的主要亞基，其表達水平的變化會直接影響菌毛的合成和細菌的粘附能力。csgD基因是生物菌膜形成的關(guān)鍵調(diào)控基因，它可以調(diào)控多個與生物菌膜形成相關(guān)基因的表達，如csgA、csgB等，這些基因參與了纖維素和curli纖維的合成，而纖維素和curli纖維是EPS的重要組成部分。在乳酸應(yīng)激條件下，csgD基因的表達可能受到調(diào)控，從而影響纖維素和curli纖維的合成，進而影響生物菌膜的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性。4.3乳酸應(yīng)激對大腸桿菌O26生物菌膜微觀結(jié)構(gòu)的作用乳酸應(yīng)激對大腸桿菌O26生物菌膜微觀結(jié)構(gòu)的影響是多方面的，且與生物菌膜形成過程中的生理變化密切相關(guān)。在低濃度乳酸應(yīng)激下，生物菌膜結(jié)構(gòu)的致密化可能是由于細菌為了應(yīng)對環(huán)境脅迫，增強了自身的防御機制。低濃度乳酸作為一種溫和的刺激，促使細菌分泌更多的胞外多聚物（EPS）。EPS不僅可以作為細菌之間的黏合劑，增強細菌之間的相互連接，還能形成物理屏障，保護細菌免受外界環(huán)境的傷害。低濃度乳酸可能激活了細菌中與EPS合成相關(guān)的基因，如bcs操縱子中的bcsA、bcsB等基因，這些基因編碼的蛋白參與了纖維素的合成，而纖維素是EPS的重要組成成分。通過上調(diào)這些基因的表達，細菌能夠合成更多的纖維素，從而增加EPS的含量，使生物菌膜結(jié)構(gòu)更加致密。低濃度乳酸應(yīng)激還可能影響細菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)，進而改變生物菌膜的結(jié)構(gòu)。群體感應(yīng)系統(tǒng)是細菌通過分泌和感應(yīng)信號分子來協(xié)調(diào)群體行為的重要機制。在低濃度乳酸應(yīng)激下，細菌可能會調(diào)整信號分子的分泌和感應(yīng)，促進細菌之間的聚集和協(xié)作。低濃度乳酸可能會增加群體感應(yīng)信號分子AI-2的合成和釋放，使細菌能夠更好地感知周圍環(huán)境中同類細菌的存在，從而聚集在一起，形成更緊密的生物菌膜結(jié)構(gòu)。群體感應(yīng)系統(tǒng)還可以調(diào)控與生物菌膜形成相關(guān)的其他基因的表達，進一步影響生物菌膜的結(jié)構(gòu)和功能。在高濃度乳酸應(yīng)激下，生物菌膜結(jié)構(gòu)的破壞主要是由于乳酸對細菌生理功能的嚴重抑制。高濃度乳酸會導(dǎo)致細胞內(nèi)酸中毒，破壞細胞膜的完整性和功能。細胞膜是細胞與外界環(huán)境進行物質(zhì)交換和信息傳遞的重要界面，細胞膜的損傷會影響細菌對營養(yǎng)物質(zhì)的攝取和代謝產(chǎn)物的排出，從而抑制細菌的生長和繁殖。高濃度乳酸可能會改變細胞膜的脂質(zhì)組成和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細胞膜的通透性增加，細胞內(nèi)的離子和小分子物質(zhì)泄漏，進而影響細菌的正常生理功能。高濃度乳酸還會抑制與生物菌膜形成相關(guān)基因的表達。研究表明，高濃度乳酸應(yīng)激下，大腸桿菌O26中與菌毛合成相關(guān)的fimA基因、與curli纖維合成相關(guān)的csgD基因等的表達會顯著下調(diào)。菌毛和curli纖維在生物菌膜的初始粘附和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定中起著重要作用，它們的合成減少會導(dǎo)致細菌粘附能力下降，生物菌膜結(jié)構(gòu)變得不穩(wěn)定，容易發(fā)生脫落和瓦解。高濃度乳酸還可能影響EPS的合成和降解平衡，導(dǎo)致EPS含量減少，生物菌膜的結(jié)構(gòu)完整性受到破壞。高濃度乳酸可能會抑制EPS合成相關(guān)酶的活性，同時激活EPS降解酶的活性，使EPS的分解速度大于合成速度，從而導(dǎo)致EPS含量降低，生物菌膜結(jié)構(gòu)松散。生物菌膜微觀結(jié)構(gòu)的變化對菌體的生存和致病性具有重要影響。致密的生物菌膜結(jié)構(gòu)可以為菌體提供更好的保護，增強菌體對環(huán)境脅迫的抵抗力。EPS形成的物理屏障能夠阻擋外界有害物質(zhì)的侵入，如消毒劑、抗生素等。生物菌膜中的細菌之間通過EPS相互連接，形成了一個相對穩(wěn)定的微環(huán)境，有利于細菌之間的營養(yǎng)物質(zhì)共享和信息交流，從而提高細菌的生存能力。在食品加工環(huán)境中，致密的生物菌膜中的細菌更難被清除，增加了食品污染的風(fēng)險。相反，松散或被破壞的生物菌膜結(jié)構(gòu)會降低菌體的生存能力，但可能會增加菌體的傳播風(fēng)險。當生物菌膜結(jié)構(gòu)受到破壞時，細菌容易從生物菌膜中脫落，重新進入浮游態(tài)，這些浮游態(tài)的細菌可以通過空氣、水等介質(zhì)傳播到其他地方，導(dǎo)致更廣泛的污染。生物菌膜結(jié)構(gòu)的破壞也可能使細菌更容易受到外界環(huán)境的影響，如溫度、pH值等的變化，從而降低細菌的生存能力。在高濃度乳酸應(yīng)激下，雖然生物菌膜結(jié)構(gòu)被破壞，細菌生存能力下降，但脫落的細菌仍有可能污染食品，引發(fā)食源性疾病。4.4研究結(jié)果對食品安全和食品加工的啟示本研究結(jié)果對食品安全和食品加工具有重要的啟示意義。在食品加工過程中，尤其是涉及乳酸發(fā)酵或使用含乳酸清潔劑的環(huán)節(jié)，需要高度關(guān)注大腸桿菌O26生物菌膜的形成風(fēng)險。在酸奶、泡菜等乳酸發(fā)酵食品的生產(chǎn)過程中，生產(chǎn)設(shè)備表面可能會殘留乳酸，為大腸桿菌O26提供了乳酸應(yīng)激環(huán)境，從而增加其生物菌膜形成的可能性。生物菌膜一旦形