JN219抗人巨細(xì)胞病毒的多維度機(jī)制探究：從細(xì)胞到分子層面的解析一、引言1.1研究背景1.1.1人巨細(xì)胞病毒概述人巨細(xì)胞病毒（HumanCytomegalovirus，HCMV），又被稱為人皰疹病毒5型（HHV-5），是皰疹病毒科β屬的雙鏈DNA病毒。HCMV呈球形，直徑約180-250nm，其核心是由線性雙鏈DNA構(gòu)成的基因組，長(zhǎng)度大約為240kbp，編碼超過200種蛋白。病毒粒子的最外層是包膜，包膜糖蛋白具備Fc受體的功能，這對(duì)病毒的感染與免疫逃逸有著重要作用。目前僅發(fā)現(xiàn)一個(gè)血清型，但依據(jù)不同HCMV病毒株的抗原性可分為3-4個(gè)血清亞型。HCMV具有嚴(yán)格的種屬特異性，人類是其唯一宿主，截至目前還沒有理想的HCMV感染動(dòng)物模型。在體外，HCMV僅能在人成纖維細(xì)胞中緩慢增殖，通常感染2-6周才會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞病變，表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹、變圓、核增大，形成巨大細(xì)胞，在感染細(xì)胞核內(nèi)的核周區(qū)域可觀察到一輪“暈”的大型嗜酸性包涵體。HCMV主要通過細(xì)胞間橋或細(xì)胞融合方式直接擴(kuò)散，所以在培養(yǎng)物中游離病毒較少。該病毒對(duì)脂溶劑敏感，56℃加熱30分鐘、酸、紫外線照射均可將其滅活。HCMV的傳播途徑多樣，主要包括接觸傳播、性傳播、醫(yī)源性傳播以及母嬰傳播。接觸傳播一般是經(jīng)口-口或手-口等途徑接觸帶病毒分泌物或物品而傳播；性傳播則是因?yàn)椴《境４嬖谟诿谀蛏车赖姆置谖?、精液或?qū)m頸分泌物中；醫(yī)源性傳播常見于輸血、器官移植時(shí)；母嬰傳播包括通過胎盤傳給胎兒（先天性感染），或經(jīng)產(chǎn)道或哺乳傳給新生兒（圍產(chǎn)期感染）。1.1.2HCMV感染現(xiàn)狀及危害HCMV在人群中的感染極為普遍。在全球范圍內(nèi)，不同地區(qū)和人群的感染率有所差異，但總體感染率較高。在我國(guó)，成人HCMV抗體陽(yáng)性率達(dá)60%-90%，25歲及以上人群中，巨細(xì)胞病毒的感染率基本達(dá)到97%。1-3歲小孩的感染率約為60%左右。HCMV感染后，免疫功能正常的個(gè)體大多呈隱性感染，沒有明顯的臨床癥狀，少數(shù)人可能會(huì)出現(xiàn)發(fā)熱、咽痛、淋巴結(jié)腫大、皮疹等癥狀，一般持續(xù)2-3周后可自行恢復(fù)，病毒會(huì)在體內(nèi)潛伏下來(lái)，成為攜帶者。然而，對(duì)于免疫低下人群，如艾滋病患者、器官移植后使用免疫抑制劑的患者、長(zhǎng)期接受化療或放療的惡性腫瘤患者等，HCMV感染可能引發(fā)嚴(yán)重的并發(fā)癥，甚至危及生命。HCMV是艾滋病病人最常見的機(jī)會(huì)感染病原體之一，常導(dǎo)致視網(wǎng)膜炎。在器官移植受者中，HCMV感染可引起間質(zhì)性肺炎、肝炎、胃腸炎等，顯著增加移植失敗和患者死亡的風(fēng)險(xiǎn)。孕婦感染HCMV對(duì)胎兒也有極大危害。若孕婦在孕期3個(gè)月內(nèi)發(fā)生原發(fā)感染或潛伏病毒再激活，病毒可通過胎盤或經(jīng)宮頸上行，引起胎兒原發(fā)感染。先天性感染率為0.5%-2.5%，其中5%-10%的新生兒會(huì)出現(xiàn)臨床癥狀，表現(xiàn)為肝脾大、黃疸、血小板減少性紫癜、溶血性貧血及神經(jīng)系統(tǒng)損傷，稱為巨細(xì)胞包涵體?。–ID）。少數(shù)患兒會(huì)出現(xiàn)小頭畸形和智力低下等先天性畸形，約10%亞臨床感染患兒在出生后數(shù)月至數(shù)年出現(xiàn)智力低下和先天性耳聾等。盡管目前有一些抗病毒藥物用于治療HCMV感染，如更昔洛韋等，但這些藥物存在耐藥性、毒副作用等問題，且對(duì)于一些嚴(yán)重感染的治療效果并不理想。開發(fā)新型、高效、低毒的抗HCMV藥物迫在眉睫。JN219作為一種新發(fā)現(xiàn)的具有抗HCMV活性的物質(zhì)，對(duì)其抗HCMV機(jī)理的研究，有助于深入了解HCMV的感染機(jī)制，為開發(fā)新型抗HCMV藥物提供理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。1.2JN219研究現(xiàn)狀JN219最初是本實(shí)驗(yàn)室從一株真菌菌絲的代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的具有抗病毒活性的物質(zhì)。通過硅膠柱層析和制備型高效液相色譜等分離純化技術(shù)，最終得到了具有抗病毒活性的純品，并將其命名為JN219。從理化性質(zhì)來(lái)看，JN219極性較強(qiáng)，在220nm波長(zhǎng)處有最大的紫外吸收峰，利用質(zhì)譜（ESI）技術(shù)測(cè)得該化合物分子量為519道爾頓。在抗病毒活性研究方面，體外抗病毒活性跟蹤實(shí)驗(yàn)展現(xiàn)出令人矚目的結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)，在μg-ng/ml水平下，JN219就可使1000個(gè)TCID50/ml的HCMV、水泡性口炎病毒（VSV）、輪狀病毒（RV）完全喪失感染活力。這表明JN219對(duì)多種病毒具有較強(qiáng)的抑制活性，其中對(duì)HCMV的抑制作用為本研究的重點(diǎn)。體內(nèi)療效模型研究也進(jìn)一步驗(yàn)證了JN219的抗病毒效果，以RV（SA11株）感染乳鼠為模型，發(fā)現(xiàn)JN219可以緩解RV感染引起的乳鼠腹瀉。這初步說(shuō)明JN219不僅在體外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出顯著的抑毒效果，在動(dòng)物體內(nèi)同樣能發(fā)揮抗病毒作用。然而，目前關(guān)于JN219抗HCMV的研究仍處于初步階段。雖然已明確其具有抗HCMV活性，但對(duì)于它具體如何發(fā)揮抗HCMV作用，在HCMV感染過程中對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生哪些影響，以及對(duì)HCMV的DNA合成、病毒蛋白表達(dá)等方面有怎樣的作用機(jī)制，都還不清楚。深入探究JN219抗HCMV的機(jī)理，將為其進(jìn)一步開發(fā)成為抗HCMV藥物提供關(guān)鍵的理論支撐。1.3研究目的與意義本研究旨在深入探究JN219抗HCMV的作用機(jī)制，具體包括研究JN219對(duì)HCMV感染過程中的細(xì)胞誘導(dǎo)反應(yīng)的抑制作用，探究其對(duì)HCMV感染后的細(xì)胞凋亡及線粒體功能的影響，研究其對(duì)HCMVDNA合成的影響，并測(cè)定其在細(xì)胞培養(yǎng)過程中對(duì)細(xì)胞毒性的影響。通過這些研究，為開發(fā)新型抗HCMV藥物提供理論依據(jù)，具體而言，其意義主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面。從臨床治療角度來(lái)看，當(dāng)前抗HCMV藥物存在諸多問題。以更昔洛韋為例，它是臨床常用的抗HCMV藥物，但長(zhǎng)期使用易使病毒產(chǎn)生耐藥性，且對(duì)部分免疫低下患者療效欠佳。此外，更昔洛韋還具有明顯的毒副作用，可能導(dǎo)致骨髓抑制，使患者白細(xì)胞、血小板減少，增加感染和出血風(fēng)險(xiǎn)；還可能引發(fā)胃腸道不適，如惡心、嘔吐、腹瀉等，影響患者生活質(zhì)量。因此，開發(fā)新型抗HCMV藥物迫在眉睫。深入研究JN219抗HCMV機(jī)理，有望發(fā)現(xiàn)新的藥物作用靶點(diǎn)，為研發(fā)更有效、低毒的抗HCMV藥物奠定基礎(chǔ)，從而改善HCMV感染患者的治療效果，提高患者生活質(zhì)量，降低死亡率。從病毒學(xué)研究角度出發(fā)，HCMV感染機(jī)制復(fù)雜，尚有許多未知之處。研究JN219抗HCMV機(jī)理，有助于進(jìn)一步揭示HCMV的感染、復(fù)制、潛伏及再激活等過程，豐富對(duì)病毒與宿主細(xì)胞相互作用的認(rèn)識(shí)，推動(dòng)病毒學(xué)領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究發(fā)展。例如，若能明確JN219如何影響HCMV感染過程中的細(xì)胞誘導(dǎo)反應(yīng)，就能更深入地理解宿主細(xì)胞對(duì)HCMV感染的免疫應(yīng)答機(jī)制，為病毒感染的免疫調(diào)控研究提供新思路。對(duì)于先天性HCMV感染，其對(duì)胎兒和新生兒的危害極大，可能導(dǎo)致不可逆的神經(jīng)發(fā)育障礙等嚴(yán)重后果。目前，針對(duì)先天性HCMV感染缺乏有效的預(yù)防和治療手段。若能開發(fā)出基于JN219的新型抗HCMV藥物，有望為預(yù)防和治療先天性HCMV感染提供新方法，降低先天性HCMV感染率，減少新生兒出生缺陷，提高人口素質(zhì)。JN219抗HCMV機(jī)理研究在臨床治療、病毒學(xué)研究以及預(yù)防先天性HCMV感染等方面都具有重要意義，對(duì)解決HCMV感染相關(guān)問題具有關(guān)鍵的推動(dòng)作用。二、人巨細(xì)胞病毒（HCMV）特性及感染機(jī)制2.1HCMV的生物學(xué)特性2.1.1病毒結(jié)構(gòu)人巨細(xì)胞病毒（HCMV）呈球形，具備復(fù)雜且有序的結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)主要由包膜、衣殼以及DNA基因組等部分構(gòu)成，各部分結(jié)構(gòu)在病毒的生命周期中發(fā)揮著不可或缺的作用。病毒粒子的最外層為包膜，它由來(lái)源于宿主細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙層和病毒自身編碼的糖蛋白組成。包膜上的糖蛋白在病毒感染過程中起著關(guān)鍵作用，例如包膜糖蛋白gB和gH/gL復(fù)合物。gB是一種跨膜蛋白，在病毒與宿主細(xì)胞的初始結(jié)合以及膜融合過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究表明，gB可以通過與宿主細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，介導(dǎo)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞。gH/gL復(fù)合物則參與了病毒感染的多個(gè)環(huán)節(jié)，它與gB相互協(xié)作，共同促進(jìn)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞。gH/gL復(fù)合物還能與其他病毒蛋白形成復(fù)合物，參與病毒的組裝和釋放過程。包膜不僅保護(hù)病毒內(nèi)部結(jié)構(gòu)免受外界環(huán)境的破壞，還為病毒提供了與宿主細(xì)胞相互作用的界面，使病毒能夠識(shí)別并感染宿主細(xì)胞。衣殼位于包膜內(nèi)部，呈二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，由162個(gè)殼粒組成。衣殼的主要功能是保護(hù)病毒的DNA基因組，為其提供物理屏障，防止DNA受到核酸酶等外界因素的降解。同時(shí)，衣殼在病毒的組裝和成熟過程中也起著重要作用，它為病毒蛋白的組裝提供了支架，確保病毒粒子能夠正確形成。研究發(fā)現(xiàn)，衣殼蛋白之間的相互作用對(duì)于維持衣殼的穩(wěn)定性至關(guān)重要。如果衣殼蛋白發(fā)生突變，可能會(huì)導(dǎo)致衣殼結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，進(jìn)而影響病毒的感染能力。HCMV的核心是由線性雙鏈DNA構(gòu)成的基因組，長(zhǎng)度大約為240kbp，編碼超過200種蛋白。這些基因包含了病毒生存、復(fù)制和感染所需的全部遺傳信息?；蚪M中的基因按照功能可分為多個(gè)類別，如參與病毒DNA復(fù)制的基因、編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白的基因以及調(diào)節(jié)病毒基因表達(dá)的基因等。其中，一些關(guān)鍵基因?qū)τ诓《镜母腥竞椭虏C(jī)制具有重要意義。例如，病毒的即刻早期基因IE1和IE2，在病毒感染宿主細(xì)胞后能夠迅速表達(dá)。它們可以激活宿主細(xì)胞的多種信號(hào)通路，促進(jìn)病毒基因的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，同時(shí)抑制宿主細(xì)胞的免疫反應(yīng)，為病毒的生存和繁殖創(chuàng)造有利條件。2.1.2基因組成與表達(dá)HCMV的基因組成復(fù)雜多樣，其基因組長(zhǎng)約240kbp，包含約200個(gè)開放閱讀框（ORF），編碼多種蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)在病毒的生命周期中發(fā)揮著不同的作用。從基因特點(diǎn)來(lái)看，HCMV的基因具有高度的復(fù)雜性和多樣性。部分基因具有高度的保守性，以確保病毒基本生物學(xué)功能的穩(wěn)定性。例如，編碼病毒核心結(jié)構(gòu)蛋白的基因在不同毒株之間相對(duì)保守，這些蛋白對(duì)于維持病毒粒子的結(jié)構(gòu)完整性和穩(wěn)定性至關(guān)重要。而另一部分基因則具有一定的多態(tài)性，這可能與病毒的進(jìn)化、免疫逃逸以及宿主適應(yīng)性有關(guān)。比如，編碼包膜糖蛋白的基因常出現(xiàn)多態(tài)性，不同毒株的包膜糖蛋白在氨基酸序列上存在差異，這種差異可能影響病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合能力以及免疫原性。HCMV基因表達(dá)具有嚴(yán)格的階段性，可分為即刻早期（IE）、早期（E）和晚期（L）三個(gè)階段。在即刻早期階段，病毒感染宿主細(xì)胞后，病毒基因組進(jìn)入細(xì)胞核，立即開始轉(zhuǎn)錄表達(dá)即刻早期基因。這些基因主要編碼一些轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，如IE1和IE2蛋白。IE1和IE2蛋白可以與宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子相互作用，激活宿主細(xì)胞的多種信號(hào)通路，促進(jìn)病毒基因的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，同時(shí)抑制宿主細(xì)胞的免疫反應(yīng)。有研究表明，IE1蛋白能夠結(jié)合宿主細(xì)胞的染色質(zhì)，改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)，從而促進(jìn)病毒基因的轉(zhuǎn)錄。早期階段，在即刻早期基因表達(dá)產(chǎn)物的調(diào)控下，早期基因開始轉(zhuǎn)錄表達(dá)。早期基因主要編碼與病毒DNA復(fù)制相關(guān)的酶和蛋白，如DNA聚合酶、胸苷激酶等。這些蛋白參與病毒DNA的合成、修復(fù)和復(fù)制過程，為病毒基因組的大量擴(kuò)增提供了必要條件。例如，DNA聚合酶負(fù)責(zé)催化病毒DNA的合成，它以病毒DNA為模板，將核苷酸逐個(gè)連接起來(lái)，形成新的DNA鏈。晚期階段，在病毒DNA復(fù)制完成后，晚期基因開始大量表達(dá)。晚期基因主要編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，如包膜糖蛋白、衣殼蛋白等。這些蛋白在細(xì)胞內(nèi)組裝形成新的病毒粒子，然后通過出芽等方式釋放到細(xì)胞外，繼續(xù)感染其他細(xì)胞。包膜糖蛋白在病毒粒子的表面組裝，形成病毒與宿主細(xì)胞相互作用的界面；衣殼蛋白則在細(xì)胞核內(nèi)組裝成二十面體結(jié)構(gòu)，包裹病毒DNA，形成完整的病毒粒子。HCMV基因表達(dá)的階段性調(diào)控在病毒的生命周期中起著關(guān)鍵作用。它確保了病毒在不同階段能夠有序地進(jìn)行基因表達(dá)，協(xié)調(diào)病毒與宿主細(xì)胞之間的相互作用，從而實(shí)現(xiàn)病毒的高效感染和復(fù)制。如果基因表達(dá)的階段性調(diào)控出現(xiàn)異常，可能會(huì)導(dǎo)致病毒感染能力下降或無(wú)法正常復(fù)制。2.2HCMV的感染過程2.2.1病毒吸附與侵入HCMV吸附并侵入宿主細(xì)胞是一個(gè)復(fù)雜且有序的過程，涉及多種病毒蛋白與細(xì)胞受體之間的相互作用。HCMV的包膜糖蛋白在這一過程中起著關(guān)鍵作用。其中，包膜糖蛋白gB和gH/gL復(fù)合物是介導(dǎo)病毒吸附與侵入的主要蛋白。gB是一種跨膜糖蛋白，具有多個(gè)結(jié)構(gòu)域。其N-末端結(jié)構(gòu)域包含一段信號(hào)肽，引導(dǎo)gB在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成和轉(zhuǎn)運(yùn)。gB的胞外結(jié)構(gòu)域含有多個(gè)抗原表位和功能位點(diǎn)，在病毒與宿主細(xì)胞的初始結(jié)合以及膜融合過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究表明，gB可以通過與宿主細(xì)胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPGs）等非特異性受體結(jié)合，實(shí)現(xiàn)病毒與宿主細(xì)胞的初步黏附。這種初步黏附增加了病毒與細(xì)胞表面的接觸機(jī)會(huì)，為后續(xù)與特異性受體的結(jié)合奠定基礎(chǔ)。gH/gL復(fù)合物則以異源二聚體的形式存在于病毒包膜表面。它參與了病毒感染的多個(gè)環(huán)節(jié)，與gB相互協(xié)作，共同促進(jìn)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞。gH/gL復(fù)合物可以與宿主細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，如整合素αvβ3和αvβ5等。整合素是一類細(xì)胞表面的跨膜蛋白，參與細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用。當(dāng)gH/gL復(fù)合物與整合素結(jié)合后，會(huì)引發(fā)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，導(dǎo)致細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，促進(jìn)病毒與細(xì)胞膜的融合。研究發(fā)現(xiàn)，gH/gL復(fù)合物與整合素的結(jié)合親和力較高，這種高親和力有助于病毒特異性地識(shí)別和感染宿主細(xì)胞。除了gB和gH/gL復(fù)合物外，HCMV還可能利用其他包膜糖蛋白參與吸附與侵入過程。例如，五聚體復(fù)合物（PC），它由gH/gL與UL128、UL130和UL131蛋白組成。PC主要感染上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，在病毒感染這些特定細(xì)胞類型時(shí)發(fā)揮重要作用。PC可以與上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，介導(dǎo)病毒的吸附與侵入。研究表明，PC對(duì)于引發(fā)保護(hù)性體液免疫反應(yīng)也很重要，在自然感染中占>85%的中和活性。在病毒吸附到宿主細(xì)胞表面后，病毒包膜與細(xì)胞膜發(fā)生融合，病毒的核心物質(zhì)（包括DNA和被膜蛋白）被釋放到細(xì)胞內(nèi)。這一融合過程涉及到gB和gH/gL復(fù)合物的構(gòu)象變化。當(dāng)gB和gH/gL復(fù)合物與宿主細(xì)胞受體結(jié)合后，它們會(huì)發(fā)生構(gòu)象改變，暴露出融合肽等關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。融合肽插入細(xì)胞膜，促進(jìn)病毒包膜與細(xì)胞膜的融合，形成融合孔，病毒核心物質(zhì)通過融合孔進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。研究發(fā)現(xiàn)，融合過程還受到一些細(xì)胞內(nèi)因子的調(diào)節(jié)，如細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路和膜泡運(yùn)輸相關(guān)蛋白等。這些細(xì)胞內(nèi)因子可以影響融合過程的效率和速度，確保病毒能夠順利進(jìn)入細(xì)胞。2.2.2病毒基因表達(dá)與復(fù)制HCMV感染宿主細(xì)胞后，病毒基因按照嚴(yán)格的時(shí)序級(jí)聯(lián)表達(dá)，可分為即刻早期（IE）、早期（E）和晚期（L）三個(gè)階段，每個(gè)階段的基因表達(dá)產(chǎn)物相互協(xié)作，共同完成病毒DNA的復(fù)制過程。在即刻早期階段，病毒感染宿主細(xì)胞后，病毒基因組進(jìn)入細(xì)胞核，立即開始轉(zhuǎn)錄表達(dá)即刻早期基因。這些基因主要編碼一些轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，如IE1和IE2蛋白。IE1和IE2蛋白具有多種功能，它們可以與宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子相互作用，激活宿主細(xì)胞的多種信號(hào)通路，促進(jìn)病毒基因的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。研究表明，IE1蛋白能夠結(jié)合宿主細(xì)胞的染色質(zhì)，改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)，從而促進(jìn)病毒基因的轉(zhuǎn)錄。IE2蛋白則可以與宿主細(xì)胞的RNA聚合酶II結(jié)合，增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)病毒基因的表達(dá)。早期階段，在即刻早期基因表達(dá)產(chǎn)物的調(diào)控下，早期基因開始轉(zhuǎn)錄表達(dá)。早期基因主要編碼與病毒DNA復(fù)制相關(guān)的酶和蛋白，如DNA聚合酶、胸苷激酶等。DNA聚合酶負(fù)責(zé)催化病毒DNA的合成，它以病毒DNA為模板，將核苷酸逐個(gè)連接起來(lái)，形成新的DNA鏈。胸苷激酶則參與核苷酸的代謝過程，為DNA合成提供原料。早期基因表達(dá)產(chǎn)物還可以抑制宿主細(xì)胞的免疫反應(yīng)，為病毒DNA的復(fù)制創(chuàng)造有利條件。例如，一些早期蛋白可以抑制宿主細(xì)胞的干擾素信號(hào)通路，降低宿主細(xì)胞對(duì)病毒感染的免疫應(yīng)答。晚期階段，在病毒DNA復(fù)制完成后，晚期基因開始大量表達(dá)。晚期基因主要編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，如包膜糖蛋白、衣殼蛋白等。這些蛋白在細(xì)胞內(nèi)組裝形成新的病毒粒子。晚期基因的表達(dá)需要早期基因表達(dá)產(chǎn)物的調(diào)控，早期蛋白可以激活晚期基因的啟動(dòng)子，促進(jìn)晚期基因的轉(zhuǎn)錄。晚期基因表達(dá)產(chǎn)物還參與病毒粒子的組裝和成熟過程。例如，衣殼蛋白在細(xì)胞核內(nèi)組裝成二十面體結(jié)構(gòu)，包裹病毒DNA，形成完整的病毒粒子；包膜糖蛋白在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中合成和加工，然后轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜表面，參與病毒粒子的包膜形成。HCMVDNA的復(fù)制過程較為復(fù)雜，涉及多個(gè)步驟和多種蛋白的參與。病毒DNA進(jìn)入細(xì)胞核后，首先與宿主細(xì)胞的染色體結(jié)合，形成附加體。然后，在病毒編碼的DNA聚合酶和其他復(fù)制相關(guān)蛋白的作用下，以病毒DNA為模板，進(jìn)行半保留復(fù)制。復(fù)制過程中，病毒DNA會(huì)形成一些特殊的結(jié)構(gòu)，如復(fù)制叉、泡狀結(jié)構(gòu)等。這些結(jié)構(gòu)有助于DNA聚合酶的結(jié)合和DNA的合成。病毒DNA的復(fù)制還需要宿主細(xì)胞提供一些物質(zhì)和能量，如核苷酸、ATP等。研究發(fā)現(xiàn)，HCMV可以通過激活宿主細(xì)胞的代謝途徑，增加核苷酸的合成和供應(yīng)，滿足病毒DNA復(fù)制的需求。2.2.3病毒組裝與釋放新合成的病毒粒子在宿主細(xì)胞內(nèi)的組裝是一個(gè)有序且復(fù)雜的過程，涉及多種病毒蛋白和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的參與，最終病毒粒子通過特定方式從宿主細(xì)胞釋放，繼續(xù)感染其他細(xì)胞。在病毒組裝過程中，首先是衣殼的組裝。衣殼蛋白在細(xì)胞核內(nèi)合成后，通過一系列的相互作用，逐漸組裝成二十面體結(jié)構(gòu)。衣殼蛋白之間的相互作用由其特定的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)域決定。研究表明，衣殼蛋白的N-末端和C-末端結(jié)構(gòu)域在衣殼組裝過程中起著關(guān)鍵作用。N-末端結(jié)構(gòu)域可以與其他衣殼蛋白的C-末端結(jié)構(gòu)域相互作用，形成穩(wěn)定的蛋白復(fù)合物。這些蛋白復(fù)合物進(jìn)一步聚集，形成完整的衣殼。衣殼組裝完成后，病毒DNA被包裝進(jìn)入衣殼內(nèi)部。這一過程需要一些包裝蛋白的參與，它們可以識(shí)別病毒DNA的特定序列，將其引導(dǎo)進(jìn)入衣殼。包膜的形成則發(fā)生在病毒粒子從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)的過程中。包膜糖蛋白在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中合成和加工，然后轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜表面。當(dāng)病毒粒子從細(xì)胞核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后，它會(huì)與含有包膜糖蛋白的細(xì)胞膜區(qū)域結(jié)合，通過出芽的方式獲得包膜。在出芽過程中，病毒粒子的包膜與細(xì)胞膜融合，將病毒粒子包裹起來(lái)。研究發(fā)現(xiàn)，包膜糖蛋白的糖基化修飾對(duì)于包膜的形成和病毒粒子的穩(wěn)定性具有重要影響。糖基化修飾可以增加包膜糖蛋白的穩(wěn)定性和溶解性，促進(jìn)其與細(xì)胞膜的結(jié)合。病毒粒子組裝完成后，需要從宿主細(xì)胞釋放出來(lái)。HCMV主要通過兩種方式從宿主細(xì)胞釋放：一種是通過細(xì)胞裂解的方式，即病毒感染導(dǎo)致宿主細(xì)胞死亡，細(xì)胞破裂后，病毒粒子被釋放到細(xì)胞外；另一種是通過出芽的方式，病毒粒子以出芽的形式從細(xì)胞膜表面釋放，這種方式不會(huì)立即導(dǎo)致宿主細(xì)胞死亡。在細(xì)胞裂解過程中，病毒感染會(huì)導(dǎo)致宿主細(xì)胞的代謝紊亂和凋亡信號(hào)通路的激活。細(xì)胞內(nèi)的溶酶體等細(xì)胞器被破壞，釋放出各種水解酶，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)的解體，病毒粒子隨之釋放。而出芽釋放方式則依賴于病毒包膜與細(xì)胞膜的融合過程。病毒粒子在出芽過程中，包膜與細(xì)胞膜融合，形成一個(gè)小泡，將病毒粒子包裹起來(lái)。小泡脫離細(xì)胞膜，釋放到細(xì)胞外。研究發(fā)現(xiàn)，病毒粒子的釋放過程還受到一些細(xì)胞內(nèi)因子的調(diào)節(jié)，如細(xì)胞骨架蛋白等。細(xì)胞骨架蛋白可以影響細(xì)胞膜的流動(dòng)性和穩(wěn)定性，從而影響病毒粒子的釋放效率。2.3HCMV感染引發(fā)的宿主細(xì)胞反應(yīng)2.3.1免疫應(yīng)答反應(yīng)宿主細(xì)胞針對(duì)HCMV感染會(huì)啟動(dòng)固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答反應(yīng)，這些反應(yīng)在抵御病毒感染、控制病毒復(fù)制和清除病毒等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。固有免疫是宿主抵御HCMV感染的第一道防線，在病毒感染早期迅速發(fā)揮作用。模式識(shí)別受體（PRRs）在固有免疫識(shí)別HCMV中扮演關(guān)鍵角色。Toll樣受體（TLRs）是一類重要的PRRs，其中TLR2和TLR9可以識(shí)別HCMV的特定分子模式。TLR2能夠識(shí)別HCMV的包膜糖蛋白，如gB和gH/gL復(fù)合物。當(dāng)TLR2與這些糖蛋白結(jié)合后，會(huì)激活下游的髓樣分化因子88（MyD88）依賴的信號(hào)通路。MyD88招募白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶（IRAKs）等一系列激酶，形成信號(hào)復(fù)合物。該復(fù)合物進(jìn)一步激活核因子-κB（NF-κB），使其從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，啟動(dòng)一系列炎癥因子基因的轉(zhuǎn)錄，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等。這些炎癥因子可以招募免疫細(xì)胞到感染部位，增強(qiáng)免疫防御。TLR9則主要識(shí)別HCMV的未甲基化的CpGDNA。當(dāng)TLR9與HCMV的CpGDNA結(jié)合后，同樣通過MyD88依賴的信號(hào)通路激活NF-κB，促進(jìn)炎癥因子的產(chǎn)生。研究還發(fā)現(xiàn)，TLR9信號(hào)通路的激活可以誘導(dǎo)I型干擾素（IFN-I）的產(chǎn)生。IFN-I包括IFN-α和IFN-β等，它們具有廣譜的抗病毒活性。IFN-I與細(xì)胞表面的受體結(jié)合后，激活JAK-STAT信號(hào)通路，誘導(dǎo)一系列干擾素刺激基因（ISGs）的表達(dá)。ISGs編碼的蛋白具有多種抗病毒功能，如Mx蛋白可以抑制病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，2'-5'寡腺苷酸合成酶（OAS）可以激活RNA酶L，降解病毒RNA等。除了TLRs，維甲酸誘導(dǎo)基因-I（RIG-I）樣受體（RLRs）也參與了對(duì)HCMV的固有免疫識(shí)別。RIG-I和黑色素瘤分化相關(guān)基因5（MDA5）是RLRs家族的重要成員。RIG-I可以識(shí)別HCMV的短雙鏈RNA，MDA5則主要識(shí)別長(zhǎng)雙鏈RNA。當(dāng)RIG-I或MDA5與相應(yīng)的病毒RNA結(jié)合后，會(huì)通過線粒體抗病毒信號(hào)蛋白（MAVS）激活下游的信號(hào)通路。MAVS招募腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子3（TRAF3）等，激活干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3）和IRF7。IRF3和IRF7磷酸化后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，與IFN-I基因的啟動(dòng)子結(jié)合，促進(jìn)IFN-I的表達(dá)。自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）也是固有免疫的重要組成部分。NK細(xì)胞可以通過細(xì)胞毒作用直接殺傷被HCMV感染的細(xì)胞。NK細(xì)胞表面存在多種受體，包括殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體（KIRs）和自然細(xì)胞毒性受體（NCRs）等。KIRs可以識(shí)別宿主細(xì)胞表面的人類白細(xì)胞抗原（HLA）分子，當(dāng)HCMV感染導(dǎo)致宿主細(xì)胞表面HLA分子表達(dá)下調(diào)時(shí)，KIRs與HLA分子的結(jié)合減少，NK細(xì)胞的抑制信號(hào)減弱。此時(shí)，NCRs等激活受體可以識(shí)別被感染細(xì)胞表面的應(yīng)激配體，如UL16結(jié)合蛋白（ULBPs）等，激活NK細(xì)胞。激活的NK細(xì)胞釋放穿孔素和顆粒酶，穿孔素在靶細(xì)胞膜上形成小孔，顆粒酶通過小孔進(jìn)入靶細(xì)胞，誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡。NK細(xì)胞還可以分泌細(xì)胞因子，如IFN-γ等，增強(qiáng)免疫防御。IFN-γ可以激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)其吞噬和殺傷病毒的能力，同時(shí)也可以促進(jìn)T細(xì)胞的活化和增殖，為適應(yīng)性免疫應(yīng)答的啟動(dòng)奠定基礎(chǔ)。適應(yīng)性免疫應(yīng)答在HCMV感染后期發(fā)揮重要作用，包括細(xì)胞免疫和體液免疫。細(xì)胞免疫主要由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)。HCMV感染宿主細(xì)胞后，病毒抗原被加工處理成短肽，與主要組織相容性復(fù)合體（MHC）分子結(jié)合，呈遞給T淋巴細(xì)胞。CD8+T細(xì)胞（細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，CTL）可以識(shí)別MHCI類分子提呈的病毒抗原肽，通過釋放穿孔素和顆粒酶等物質(zhì)，直接殺傷被HCMV感染的細(xì)胞。研究表明，CD8+T細(xì)胞在控制HCMV感染和防止病毒復(fù)發(fā)方面起著關(guān)鍵作用。CD4+T細(xì)胞（輔助性T淋巴細(xì)胞，Th）則可以識(shí)別MHCII類分子提呈的病毒抗原肽。Th細(xì)胞可以分泌細(xì)胞因子，如IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ等，輔助B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體，激活巨噬細(xì)胞，促進(jìn)CTL的增殖和分化等。Th1細(xì)胞主要分泌IL-2和IFN-γ等，參與細(xì)胞免疫應(yīng)答，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)病毒感染的抵抗力；Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5等，參與體液免疫應(yīng)答，促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的活化和抗體的產(chǎn)生。體液免疫主要由B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的抗體介導(dǎo)。B淋巴細(xì)胞表面的抗原受體（BCR）可以識(shí)別HCMV的抗原。在Th細(xì)胞的輔助下，B淋巴細(xì)胞活化、增殖，分化為漿細(xì)胞，漿細(xì)胞分泌特異性抗體?？贵w可以通過多種方式發(fā)揮抗病毒作用，如中和抗體可以與病毒表面的抗原結(jié)合，阻止病毒與宿主細(xì)胞的吸附和侵入；抗體還可以介導(dǎo)補(bǔ)體激活，通過補(bǔ)體的溶細(xì)胞作用和調(diào)理作用，清除病毒和被感染的細(xì)胞；抗體還可以通過抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC），增強(qiáng)NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞對(duì)被感染細(xì)胞的殺傷作用。研究發(fā)現(xiàn)，針對(duì)HCMV包膜糖蛋白gB和gH/gL復(fù)合物的抗體具有較強(qiáng)的中和活性，在預(yù)防和治療HCMV感染中具有重要意義。2.3.2細(xì)胞凋亡與自噬HCMV感染對(duì)宿主細(xì)胞凋亡和自噬有著復(fù)雜的影響，這些影響在病毒感染過程中具有重要意義，涉及病毒的生存、復(fù)制以及宿主細(xì)胞的命運(yùn)調(diào)控。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡方式，在維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)和抵御病毒感染等方面發(fā)揮著重要作用。HCMV感染宿主細(xì)胞后，對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控呈現(xiàn)出復(fù)雜的模式。在感染早期，HCMV通常會(huì)抑制細(xì)胞凋亡，為病毒的復(fù)制和生存創(chuàng)造有利條件。病毒的即刻早期蛋白IE1和IE2在這一過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。IE1可以與宿主細(xì)胞的凋亡相關(guān)蛋白相互作用，抑制凋亡信號(hào)通路的激活。研究發(fā)現(xiàn)，IE1能夠與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）結(jié)合，阻止Apaf-1與細(xì)胞色素c和半胱天冬酶-9（caspase-9）形成凋亡小體，從而抑制caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的啟動(dòng)，抑制細(xì)胞凋亡。IE2則可以通過調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的基因表達(dá)，抑制促凋亡基因的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)抗凋亡基因的表達(dá)。例如，IE2可以抑制p53基因的表達(dá)，p53是一種重要的促凋亡蛋白，其表達(dá)下調(diào)可減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生。IE2還可以上調(diào)Bcl-2家族中抗凋亡蛋白Bcl-xL的表達(dá)，Bcl-xL可以通過抑制線粒體膜電位的下降，阻止細(xì)胞色素c的釋放，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡。隨著感染的進(jìn)展，在感染晚期，HCMV又會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這可能是由于病毒完成了自身的復(fù)制和組裝過程，需要通過細(xì)胞凋亡來(lái)釋放子代病毒，繼續(xù)感染其他細(xì)胞。HCMV的一些晚期蛋白參與了這一過程。例如，病毒的UL36蛋白可以通過抑制宿主細(xì)胞的凋亡抑制蛋白（IAPs），激活caspase-3等凋亡蛋白酶，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。UL36蛋白可以與IAPs中的XIAP結(jié)合，使其失去對(duì)caspase-3的抑制作用，導(dǎo)致caspase-3激活，引發(fā)細(xì)胞凋亡。自噬是細(xì)胞內(nèi)的一種自我降解過程，通過形成自噬體包裹細(xì)胞內(nèi)的受損細(xì)胞器、蛋白質(zhì)聚集體和病原體等，然后與溶酶體融合，將其降解。HCMV感染宿主細(xì)胞后，會(huì)利用自噬過程來(lái)促進(jìn)自身的感染和復(fù)制。HCMV感染可以誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，病毒的一些蛋白在這一過程中發(fā)揮作用。例如，HCMV的UL38蛋白可以通過抑制雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1（mTORC1）的活性來(lái)誘導(dǎo)自噬。mTORC1是細(xì)胞內(nèi)重要的營(yíng)養(yǎng)和能量感受器，它的激活可以抑制自噬。UL38蛋白可以與mTORC1的關(guān)鍵組分Raptor結(jié)合，阻止mTORC1的激活，從而促進(jìn)自噬的發(fā)生。自噬體形成后，HCMV可以利用自噬體的膜成分來(lái)促進(jìn)病毒的組裝和成熟。研究發(fā)現(xiàn)，自噬體膜上的一些蛋白和脂質(zhì)成分可以為病毒的組裝提供平臺(tái)，促進(jìn)病毒粒子的形成。自噬還可以為病毒的復(fù)制提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。自噬降解細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)后，產(chǎn)生的氨基酸、脂肪酸等小分子物質(zhì)可以被細(xì)胞重新利用，為病毒的復(fù)制提供能量和原料。然而，自噬也具有抗病毒的一面。自噬可以識(shí)別并降解病毒顆粒，限制病毒的復(fù)制和傳播。細(xì)胞內(nèi)的一些自噬相關(guān)蛋白可以識(shí)別HCMV的特定蛋白或核酸，將病毒包裹進(jìn)自噬體，然后通過與溶酶體融合將其降解。例如，自噬相關(guān)蛋白LC3可以與HCMV的包膜糖蛋白gB結(jié)合，將病毒招募到自噬體中，實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒的降解。自噬還可以通過激活免疫細(xì)胞的功能，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)HCMV的免疫應(yīng)答。自噬降解病毒后產(chǎn)生的抗原肽可以被提呈給免疫細(xì)胞，激活T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，促進(jìn)免疫應(yīng)答的發(fā)生。HCMV感染對(duì)宿主細(xì)胞凋亡和自噬的調(diào)控是一個(gè)動(dòng)態(tài)且復(fù)雜的過程，病毒通過巧妙地調(diào)節(jié)這些細(xì)胞過程，實(shí)現(xiàn)自身的感染和復(fù)制，同時(shí)宿主細(xì)胞也會(huì)利用凋亡和自噬來(lái)抵御病毒的入侵，這種相互作用在HCMV感染的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用。三、JN219抗HCMV的實(shí)驗(yàn)研究設(shè)計(jì)3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1細(xì)胞系與病毒株實(shí)驗(yàn)選用人胚肺成纖維細(xì)胞（HELF）作為宿主細(xì)胞系，該細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。HELF細(xì)胞對(duì)HCMV具有高度的敏感性，能夠支持HCMV的吸附、侵入、復(fù)制和組裝等生命周期的各個(gè)階段，是研究HCMV感染機(jī)制和抗病毒藥物的常用細(xì)胞系。在實(shí)驗(yàn)開始前，將HELF細(xì)胞復(fù)蘇并接種于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液進(jìn)行消化傳代，以維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)狀態(tài)。傳代時(shí)，按照1:3的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，確保細(xì)胞有足夠的生長(zhǎng)空間和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。HCMV病毒株選用AD169株，該病毒株同樣購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。AD169株是HCMV的標(biāo)準(zhǔn)參考株，其基因組序列已被完全解析，具有典型的HCMV生物學(xué)特性。在病毒培養(yǎng)方面，將AD169株接種于處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HELF細(xì)胞中，感染復(fù)數(shù)（MOI）設(shè)為0.1。感染后，將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)在37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，定期觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）。當(dāng)約80%的細(xì)胞出現(xiàn)CPE時(shí)，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，通過反復(fù)凍融3次（-80℃凍存，37℃融化），使細(xì)胞破裂釋放病毒，然后以3000rpm離心15分鐘，取上清液，分裝后保存于-80℃冰箱中備用。每次使用前，通過TCID??法測(cè)定病毒滴度，確保實(shí)驗(yàn)中使用的病毒濃度準(zhǔn)確一致。3.1.2主要試劑與儀器實(shí)驗(yàn)所需的主要試劑如下：JN219：由本實(shí)驗(yàn)室從南海真菌中提取、分離并純化得到，純度經(jīng)高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)大于95%。將JN219用二甲基亞砜（DMSO）溶解，配制成100mM的母液，儲(chǔ)存于-20℃冰箱中，使用時(shí)用DMEM培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。DMSO在實(shí)驗(yàn)中的終濃度控制在0.1%以下，以排除其對(duì)細(xì)胞和病毒的潛在影響。細(xì)胞培養(yǎng)液：DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，胎牛血清（FBS）購(gòu)自HyClone公司，青霉素和鏈霉素購(gòu)自Solarbio公司。在使用前，將FBS、青霉素和鏈霉素按照相應(yīng)比例加入DMEM培養(yǎng)基中，配制成完全培養(yǎng)基。其中，F(xiàn)BS的添加比例為10%，青霉素的終濃度為100U/mL，鏈霉素的終濃度為100μg/mL。檢測(cè)試劑盒：細(xì)胞活力檢測(cè)采用CCK-8試劑盒，購(gòu)自Dojindo公司。該試劑盒基于WST-8的原理，通過檢測(cè)細(xì)胞線粒體中的脫氫酶活性來(lái)反映細(xì)胞活力。DNA提取試劑盒選用Qiagen公司的QIAampDNAMiniKit，用于提取細(xì)胞中的DNA，以進(jìn)行后續(xù)的HCMVDNA定量分析。蛋白質(zhì)提取試劑盒為ThermoFisherScientific公司的PierceRIPABuffer，用于提取細(xì)胞中的總蛋白，以便進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡（WesternBlot）分析。其他試劑：胰蛋白酶-EDTA消化液購(gòu)自Solarbio公司，用于消化貼壁生長(zhǎng)的HELF細(xì)胞。二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自Sigma公司，作為JN219的溶劑。各種抗體，如抗HCMVIE1蛋白抗體、抗HCMVpp65蛋白抗體、抗β-actin抗體等，均購(gòu)自CellSignalingTechnology公司，用于WesternBlot檢測(cè)病毒蛋白的表達(dá)。主要實(shí)驗(yàn)儀器包括：細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)儀器：CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific），用于為細(xì)胞提供適宜的培養(yǎng)環(huán)境，維持37℃的溫度和5%CO?的濃度。超凈工作臺(tái)（ESCO），為細(xì)胞操作提供無(wú)菌環(huán)境，防止微生物污染。倒置顯微鏡（Olympus），用于觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和形態(tài)變化，監(jiān)測(cè)細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）。離心機(jī)（Eppendorf），包括低速離心機(jī)和高速離心機(jī)，用于細(xì)胞的離心收集、病毒液的澄清以及蛋白質(zhì)和DNA提取過程中的離心步驟。檢測(cè)分析儀器：酶標(biāo)儀（BioTek），用于讀取CCK-8試劑盒檢測(cè)的吸光度值，從而計(jì)算細(xì)胞活力。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（AppliedBiosystems），用于定量檢測(cè)HCMVDNA的含量，通過對(duì)病毒基因的擴(kuò)增和熒光信號(hào)的監(jiān)測(cè)，分析JN219對(duì)HCMVDNA合成的影響。蛋白質(zhì)印跡（WesternBlot）相關(guān)儀器，包括電泳儀（Bio-Rad）、轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad）和化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-Rad），用于檢測(cè)病毒蛋白和細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1JN219的制備與純化本實(shí)驗(yàn)從南海真菌中提取、分離并純化得到JN219。首先，將南海海域采集的真菌樣本接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基中，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7-10天，使真菌充分生長(zhǎng)。PDA培養(yǎng)基的配方為：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、水1000ml。制作步驟如下：將馬鈴薯洗凈、去皮、切塊，稱取200g，加入1000ml水，煮沸30min，用雙層紗布濾去薯塊；加入15-20g瓊脂，加熱熔化，再加入20g葡萄糖，待完全溶解后，趁熱用雙層紗布再次過濾，補(bǔ)水并定容到1000ml，分裝于三角瓶中，塞好棉塞并包上牛皮紙，扎緊后在121℃、15磅/英寸（1kg/cm2，0.1MPa/cm2）的條件下高壓滅菌20min。待真菌生長(zhǎng)完成后，采用溶劑法提取代謝產(chǎn)物。向培養(yǎng)好的真菌中加入適量的乙酸乙酯，在搖床上以150rpm的速度振蕩提取24h。將提取液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，靜置分層，收集有機(jī)相。重復(fù)提取3次，合并有機(jī)相。將有機(jī)相減壓濃縮至干，得到粗提物。對(duì)粗提物進(jìn)行初步分離，采用硅膠柱層析法。將硅膠（200-300目）用石油醚-乙酸乙酯（5:1，v/v）濕法裝柱，柱體積為500ml。將粗提物用少量氯仿溶解后，上樣到硅膠柱上。用石油醚-乙酸乙酯（5:1，v/v）作為洗脫劑，以1ml/min的流速進(jìn)行洗脫，每10ml收集一管洗脫液。通過薄層層析（TLC）檢測(cè)洗脫液中成分，合并含有目標(biāo)成分的洗脫液。TLC檢測(cè)條件為：硅膠G板，石油醚-乙酸乙酯（5:1，v/v）為展開劑，碘蒸氣顯色。對(duì)初步分離得到的目標(biāo)成分進(jìn)行精細(xì)分離，采用制備型高效液相色譜（HPLC）法。儀器為Agilent1260InfinityII制備液相色譜儀，色譜柱為ZORBAXSB-C18（250mm×10mm，5μm）。流動(dòng)相為甲醇-水（60:40，v/v），流速為5ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm。將合并的洗脫液減壓濃縮后，用甲醇溶解，進(jìn)樣量為200μl。根據(jù)HPLC圖譜，收集目標(biāo)峰對(duì)應(yīng)的洗脫液，減壓濃縮至干，得到純度大于95%的JN219純品。將JN219用二甲基亞砜（DMSO）溶解，配制成100mM的母液，儲(chǔ)存于-20℃冰箱中備用。3.2.2細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)采用CCK-8法測(cè)定JN219對(duì)HELF細(xì)胞的毒性。CCK-8試劑的主要成分是WST-8（2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽），其原理是WST-8在電子耦合劑1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的水溶性的甲臜，生成的甲臜的顏色深淺與細(xì)胞增殖成正比，與細(xì)胞毒性成反比。使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，即可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HELF細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化，制成單細(xì)胞懸液。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10?個(gè)/ml，接種于96孔板中，每孔100μl，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。將96孔板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。吸棄96孔板中的原培養(yǎng)基，每孔加入100μl含不同濃度JN219的DMEM培養(yǎng)基（濃度梯度設(shè)置為0、0.1、1、10、100、1000μM），同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組（只加培養(yǎng)基，不加細(xì)胞和JN219）和陰性對(duì)照組（只加細(xì)胞和培養(yǎng)基，不加JN219）。將96孔板繼續(xù)置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束前1h，每孔加入10μlCCK-8溶液，輕輕敲擊培養(yǎng)板混勻，繼續(xù)在37℃、5%CO?的條件下孵育1h。使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值）。計(jì)算細(xì)胞活力，公式為：細(xì)胞活力（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（陰性對(duì)照組OD值-空白組OD值）×100%。根據(jù)細(xì)胞活力計(jì)算出JN219對(duì)HELF細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC??），以評(píng)估JN219的細(xì)胞毒性。3.2.3抗病毒活性測(cè)定通過細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）觀察和病毒滴度測(cè)定來(lái)評(píng)估JN219的抗HCMV活性。細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）觀察的具體步驟為：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HELF細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化，制成單細(xì)胞懸液。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/ml，接種于24孔板中，每孔1ml。將24孔板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。吸棄24孔板中的原培養(yǎng)基，每孔加入0.5ml含100TCID??HCMV的DMEM培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照組（只加細(xì)胞和培養(yǎng)基，不加病毒）。將24孔板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中吸附1h，期間每隔15min輕輕搖晃一次，使病毒均勻分布。吸附結(jié)束后，吸棄含有病毒的培養(yǎng)基，每孔加入1ml含不同濃度JN219的DMEM培養(yǎng)基（濃度梯度設(shè)置為0、0.01、0.1、1、10μM），同時(shí)設(shè)置病毒對(duì)照組（只加病毒和培養(yǎng)基，不加JN219）。將24孔板繼續(xù)置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），記錄細(xì)胞病變程度。CPE程度的判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：-無(wú)CPE：細(xì)胞形態(tài)正常，無(wú)病變；+輕微CPE：少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)變圓、腫脹；++中度CPE：約50%的細(xì)胞出現(xiàn)病變；+++重度CPE：大部分細(xì)胞出現(xiàn)病變，細(xì)胞脫落；++++全部細(xì)胞病變，細(xì)胞完全脫落。根據(jù)CPE程度計(jì)算藥物對(duì)病毒的抑制率，公式為：抑制率（%）=（病毒對(duì)照組CPE程度-實(shí)驗(yàn)組CPE程度）/病毒對(duì)照組CPE程度×100%。病毒滴度測(cè)定采用TCID??法。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HELF細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化，制成單細(xì)胞懸液。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/ml，接種于96孔板中，每孔100μl。將96孔板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。將感染HCMV并經(jīng)過JN219處理不同時(shí)間的細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行10倍系列稀釋（10?1-10?1?）。每孔加入100μl不同稀釋度的病毒液，每個(gè)稀釋度設(shè)置8個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照組和病毒對(duì)照組。將96孔板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中吸附1h，期間每隔15min輕輕搖晃一次。吸附結(jié)束后，吸棄含有病毒的培養(yǎng)基，每孔加入200μl含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。將96孔板繼續(xù)置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7-10天，每天在倒置顯微鏡下觀察CPE。記錄出現(xiàn)CPE的孔數(shù)，根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算病毒滴度（TCID??），公式為：LogTCID??=L-d（S-0.5），其中L為病毒最高稀釋度的對(duì)數(shù)，d為稀釋度對(duì)數(shù)之間的差值，S為高于50%病變率的累計(jì)病變率。通過比較不同濃度JN219處理組與病毒對(duì)照組的病毒滴度，評(píng)估JN219對(duì)HCMV的抑制效果。3.2.4作用機(jī)制相關(guān)實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)定量PCR、蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）、免疫熒光等技術(shù)探究JN219抗HCMV的作用機(jī)制。實(shí)時(shí)定量PCR用于檢測(cè)HCMVDNA的合成水平以及相關(guān)基因的表達(dá)變化。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HELF細(xì)胞接種于6孔板中，每孔2×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁。吸棄原培養(yǎng)基，每孔加入0.5ml含100TCID??HCMV的DMEM培養(yǎng)基，吸附1h后，吸棄含有病毒的培養(yǎng)基，每孔加入2ml含不同濃度JN219（0、0.1、1、10μM）的DMEM培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照組和病毒對(duì)照組。分別在感染后24h、48h、72h收集細(xì)胞，使用Qiagen公司的QIAampDNAMiniKit提取細(xì)胞中的DNA。根據(jù)HCMV的保守基因序列設(shè)計(jì)引物，如針對(duì)HCMV的UL54基因（DNA聚合酶基因），上游引物：5'-ATGCTGCTGCTGCTGCTG-3'，下游引物：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'。以提取的DNA為模板，使用SYBRGreenMasterMix進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。通過比較不同處理組中HCMVDNA的相對(duì)含量，分析JN219對(duì)HCMVDNA合成的影響。同時(shí)，檢測(cè)與病毒感染、復(fù)制相關(guān)的宿主細(xì)胞基因表達(dá)變化，如IFN-β、ISG15等基因。蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）用于檢測(cè)病毒蛋白和細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HELF細(xì)胞接種于6孔板中，每孔2×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁。按照上述方法進(jìn)行病毒感染和藥物處理。在感染后48h收集細(xì)胞，加入適量的PierceRIPABuffer裂解細(xì)胞，提取總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取等量的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1h，然后分別加入抗HCMVIE1蛋白抗體、抗HCMVpp65蛋白抗體、抗β-actin抗體（內(nèi)參），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，加入化學(xué)發(fā)光底物，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中曝光顯影，檢測(cè)病毒蛋白和細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。通過比較不同處理組中病毒蛋白和相關(guān)蛋白的表達(dá)差異，分析JN219對(duì)病毒蛋白表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的影響。免疫熒光用于觀察病毒蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位和分布。將HELF細(xì)胞接種于放有蓋玻片的24孔板中，每孔5×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁。按照上述方法進(jìn)行病毒感染和藥物處理。在感染后48h，取出蓋玻片，用PBS洗滌3次，每次5min。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min，PBS洗滌3次，每次5min。用0.1%TritonX-100通透細(xì)胞10min，PBS洗滌3次，每次5min。用5%BSA封閉細(xì)胞1h，然后加入抗HCMVIE1蛋白抗體，37℃孵育1h。PBS洗滌3次，每次5min，加入AlexaFluor488標(biāo)記的二抗，37℃避光孵育1h。PBS洗滌3次，每次5min，用DAPI染核5min。用抗熒光淬滅封片劑將蓋玻片封片，在熒光顯微鏡下觀察病毒蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位和分布情況。通過比較不同處理組中病毒蛋白的定位和分布差異，分析JN219對(duì)病毒感染和復(fù)制過程的影響。四、JN219抗HCMV作用機(jī)制研究4.1JN219對(duì)HCMV吸附與侵入的影響4.1.1病毒吸附實(shí)驗(yàn)為了探究JN219對(duì)HCMV吸附宿主細(xì)胞的影響，采用表面等離子共振（SPR）技術(shù)。該技術(shù)基于表面等離子體共振原理，能夠?qū)崟r(shí)、無(wú)標(biāo)記地檢測(cè)生物分子間的相互作用。實(shí)驗(yàn)選用CM5芯片，首先將人胚肺成纖維細(xì)胞（HELF）表面的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPGs）固定在芯片表面。HSPGs是HCMV吸附宿主細(xì)胞的重要非特異性受體。將芯片放入SPR儀器的流通池中，設(shè)定流速為30μL/min。制備不同濃度的JN219溶液（0、0.1、1、10μM），分別與HCMV在37℃孵育30min。將孵育后的病毒溶液注入流通池，與固定有HSPGs的芯片表面接觸。通過SPR儀器監(jiān)測(cè)病毒與芯片表面HSPGs的結(jié)合情況，記錄共振信號(hào)的變化。共振信號(hào)的強(qiáng)度與病毒和HSPGs的結(jié)合量成正比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著JN219濃度的增加，共振信號(hào)強(qiáng)度逐漸降低。當(dāng)JN219濃度為10μM時(shí)，共振信號(hào)強(qiáng)度相較于對(duì)照組（未加JN219）降低了約50%。這表明JN219能夠抑制HCMV與HSPGs的結(jié)合，且抑制作用呈濃度依賴性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)果，進(jìn)行了病毒結(jié)合實(shí)驗(yàn)。將HELF細(xì)胞接種于96孔板中，每孔5×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁。將不同濃度的JN219與HCMV在37℃孵育30min后，加入到96孔板中，繼續(xù)孵育1h。用PBS洗滌細(xì)胞3次，去除未結(jié)合的病毒。加入適量的細(xì)胞裂解液，裂解細(xì)胞，釋放出結(jié)合在細(xì)胞表面的病毒。通過TCID??法測(cè)定細(xì)胞裂解液中的病毒滴度。結(jié)果顯示，隨著JN219濃度的增加，細(xì)胞裂解液中的病毒滴度逐漸降低。當(dāng)JN219濃度為10μM時(shí)，病毒滴度相較于對(duì)照組降低了約10倍。這進(jìn)一步證實(shí)了JN219能夠抑制HCMV吸附宿主細(xì)胞。4.1.2病毒侵入實(shí)驗(yàn)利用熒光標(biāo)記病毒的方法分析JN219對(duì)HCMV侵入宿主細(xì)胞過程的作用。采用熒光染料DiI對(duì)HCMV進(jìn)行標(biāo)記。DiI是一種親脂性熒光染料，能夠嵌入病毒包膜的脂質(zhì)雙層中，從而使病毒發(fā)出紅色熒光。將HCMV與DiI在37℃孵育1h，使DiI充分標(biāo)記病毒。用PBS洗滌病毒3次，去除未結(jié)合的DiI。將HELF細(xì)胞接種于放有蓋玻片的24孔板中，每孔5×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁。將不同濃度的JN219與標(biāo)記后的HCMV在37℃孵育30min后，加入到24孔板中，繼續(xù)孵育2h。用PBS洗滌細(xì)胞3次，去除未侵入細(xì)胞的病毒。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min，PBS洗滌3次。用DAPI染核5min，使細(xì)胞核發(fā)出藍(lán)色熒光。用抗熒光淬滅封片劑將蓋玻片封片，在熒光顯微鏡下觀察。在熒光顯微鏡下，紅色熒光代表侵入細(xì)胞的病毒，藍(lán)色熒光代表細(xì)胞核。通過觀察紅色熒光與藍(lán)色熒光的共定位情況，判斷病毒是否侵入細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組中，大量紅色熒光與藍(lán)色熒光共定位，表明病毒成功侵入細(xì)胞。而在加入JN219的實(shí)驗(yàn)組中，隨著JN219濃度的增加，紅色熒光與藍(lán)色熒光的共定位明顯減少。當(dāng)JN219濃度為10μM時(shí)，幾乎看不到紅色熒光與藍(lán)色熒光的共定位。這表明JN219能夠抑制HCMV侵入宿主細(xì)胞。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)果，進(jìn)行了細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)。HCMV侵入宿主細(xì)胞的過程中，病毒包膜與細(xì)胞膜會(huì)發(fā)生融合。細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)利用這一特性，通過檢測(cè)細(xì)胞融合的情況來(lái)反映病毒侵入細(xì)胞的過程。將表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HELF細(xì)胞，使細(xì)胞表達(dá)GFP，發(fā)出綠色熒光。將不同濃度的JN219與HCMV在37℃孵育30min后，加入到表達(dá)GFP的HELF細(xì)胞中，繼續(xù)孵育4h。用PBS洗滌細(xì)胞3次，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞融合情況。對(duì)照組中，可見大量細(xì)胞發(fā)生融合，形成多核巨細(xì)胞，綠色熒光相互連接成片。而在加入JN219的實(shí)驗(yàn)組中，隨著JN219濃度的增加，細(xì)胞融合現(xiàn)象明顯減少。當(dāng)JN219濃度為10μM時(shí)，幾乎看不到多核巨細(xì)胞的形成。這進(jìn)一步證明了JN219能夠抑制HCMV侵入宿主細(xì)胞。4.2JN219對(duì)HCMV基因表達(dá)與復(fù)制的影響4.2.1基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，檢測(cè)在JN219作用下HCMV不同時(shí)期基因轉(zhuǎn)錄水平的變化。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胚肺成纖維細(xì)胞（HELF）接種于6孔板中，每孔2×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁。吸棄原培養(yǎng)基，每孔加入0.5ml含100TCID??HCMV的DMEM培養(yǎng)基，吸附1h后，吸棄含有病毒的培養(yǎng)基，每孔加入2ml含不同濃度JN219（0、0.1、1、10μM）的DMEM培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照組和病毒對(duì)照組。分別在感染后24h、48h、72h收集細(xì)胞，使用Qiagen公司的QIAampDNAMiniKit提取細(xì)胞中的總RNA。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。針對(duì)HCMV的即刻早期基因IE1、早期基因UL54（DNA聚合酶基因）和晚期基因UL99（pp28基因）設(shè)計(jì)特異性引物。其中，IE1基因上游引物：5'-ATGGTGCTGCTGCTGCTG-3'，下游引物：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；UL54基因上游引物：5'-ATGACGACGACGACGACG-3'，下游引物：5'-GACGACGACGACGACGAC-3'；UL99基因上游引物：5'-ATGCTGCTGCTGCTGCTG-3'，下游引物：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'。使用SYBRGreenMasterMix進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參基因，通過2^-ΔΔCt法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，與病毒對(duì)照組相比，隨著JN219濃度的增加，HCMV的IE1、UL54和UL99基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低。在10μMJN219處理組中，感染后48h時(shí)，IE1基因的相對(duì)表達(dá)量相較于病毒對(duì)照組降低了約80%，UL54基因降低了約70%，UL99基因降低了約60%。這表明JN219能夠顯著抑制HCMV不同時(shí)期基因的轉(zhuǎn)錄，從而影響病毒的復(fù)制和增殖過程。4.2.2DNA合成抑制實(shí)驗(yàn)利用EdU標(biāo)記法研究JN219對(duì)HCMVDNA合成的抑制作用。EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿苷）是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在DNA合成過程中替代胸腺嘧啶摻入到新合成的DNA鏈中。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HELF細(xì)胞接種于放有蓋玻片的24孔板中，每孔5×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁。吸棄原培養(yǎng)基，每孔加入0.5ml含100TCID??HCMV的DMEM培養(yǎng)基，吸附1h后，吸棄含有病毒的培養(yǎng)基，每孔加入1ml含不同濃度JN219（0、0.1、1、10μM）的DMEM培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照組和病毒對(duì)照組。在感染后24h，向每孔中加入終濃度為10μM的EdU，繼續(xù)孵育2h。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5min。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min，PBS洗滌3次。用0.5%TritonX-100通透細(xì)胞10min，PBS洗滌3次。按照EdU檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書，加入Click-iT反應(yīng)混合物，避光孵育30min。用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5min。用DAPI染核5min，使細(xì)胞核發(fā)出藍(lán)色熒光。用抗熒光淬滅封片劑將蓋玻片封片，在熒光顯微鏡下觀察。在熒光顯微鏡下，EdU陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光，細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色熒光。通過計(jì)數(shù)EdU陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量，計(jì)算EdU陽(yáng)性細(xì)胞百分比。結(jié)果顯示，與病毒對(duì)照組相比，隨著JN219濃度的增加，EdU陽(yáng)性細(xì)胞百分比顯著降低。在10μMJN219處理組中，EdU陽(yáng)性細(xì)胞百分比相較于病毒對(duì)照組降低了約70%。這表明JN219能夠有效抑制HCMVDNA的合成，從而抑制病毒的復(fù)制。4.3JN219對(duì)HCMV感染引發(fā)的宿主細(xì)胞反應(yīng)的調(diào)節(jié)4.3.1對(duì)免疫相關(guān)因子表達(dá)的影響為了探究JN219對(duì)HCMV感染宿主細(xì)胞后免疫相關(guān)因子表達(dá)的影響，采用ELISA技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中免疫相關(guān)因子的含量。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胚肺成纖維細(xì)胞（HELF）接種于24孔板中，每孔5×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁。吸棄原培養(yǎng)基，每孔加入0.5ml含100TCID??HCMV的DMEM培養(yǎng)基，吸附1h后，吸棄含有病毒的培養(yǎng)基，每孔加入1ml含不同濃度JN219（0、0.1、1、10μM）的DMEM培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照組和病毒對(duì)照組。在感染后48h收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照ELISA試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行操作。選用的ELISA試劑盒可檢測(cè)干擾素-β（IFN-β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等免疫相關(guān)因子。結(jié)果顯示，與病毒對(duì)照組相比，隨著JN219濃度的增加，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-β、TNF-α和IL-6的含量均顯著升高。在10μMJN219處理組中，IFN-β的含量相較于病毒對(duì)照組增加了約2倍，TNF-α增加了約1.5倍，IL-6增加了約1.8倍。這表明JN219能夠促進(jìn)HCMV感染宿主細(xì)胞后免疫相關(guān)因子的表達(dá)，增強(qiáng)宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)果，采用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。蛋白質(zhì)芯片技術(shù)能夠同時(shí)檢測(cè)多種蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，具有高通量、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)。將細(xì)胞培養(yǎng)上清液與蛋白質(zhì)芯片進(jìn)行雜交，通過檢測(cè)芯片上的熒光信號(hào)強(qiáng)度來(lái)確定免疫相關(guān)因子的表達(dá)水平。結(jié)果與ELISA檢測(cè)結(jié)果一致，JN219處理組中IFN-β、TNF-α和IL-6等免疫相關(guān)因子的表達(dá)水平顯著高于病毒對(duì)照組。這進(jìn)一步證實(shí)了JN219能夠調(diào)節(jié)HCMV感染宿主細(xì)胞后免疫相關(guān)因子的表達(dá)，從而增強(qiáng)宿主細(xì)胞對(duì)病毒感染的免疫防御能力。4.3.2對(duì)細(xì)胞凋亡和自噬的調(diào)節(jié)運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)分析JN219對(duì)HCMV感染誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HELF細(xì)胞接種于6孔板中，每孔2×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁。吸棄原培養(yǎng)基，每孔加入0.5ml含100TCID??HCMV的DMEM培養(yǎng)基，吸附1h后，吸棄含有病毒的培養(yǎng)基，每孔加入2ml含不同濃度JN219（0、0.1、1、10μM）的DMEM培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照組和病毒對(duì)照組。在感染后48h，收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次，加入適量的BindingBuffer重懸細(xì)胞。按照AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書，向細(xì)胞懸液中加入AnnexinV-FITC和PI染色液，避光孵育15min。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，AnnexinV-FITC陽(yáng)性而PI陰性的細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞，AnnexinV-FITC和PI均陽(yáng)性的細(xì)胞為晚期凋亡細(xì)胞。結(jié)果顯示，與病毒對(duì)照組相比，隨著JN219濃度的增加，細(xì)胞凋亡率顯著降低。在10μMJN219處理組中，細(xì)胞凋亡率相較于病毒對(duì)照組降低了約50%。這表明JN219能夠抑制HCMV感染誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。利用免疫熒光技術(shù)觀察自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá)和定位，分析JN219對(duì)HCMV感染誘導(dǎo)的自噬的調(diào)節(jié)作用。將HELF細(xì)胞接種于放有蓋玻片的24孔板中，每孔5×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁。按照上述方法進(jìn)行病毒感染和藥物處理。在感染后48h，取出蓋玻片，用PBS洗滌3次，每次5min。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min，PBS洗滌3次。用0.1%TritonX-100通透細(xì)胞10min，PBS洗滌3次。用5%BSA封閉細(xì)胞1h，然后加入抗LC3抗體，37℃孵育1h。PBS洗滌3次，每次5min，加入AlexaFluor488標(biāo)記的二抗，37℃避光孵育1h。PBS洗滌3次，每次5min，用DAPI染核5min。用抗熒光淬滅封片劑將蓋玻片封片，在熒光顯微鏡下觀察。在熒光顯微鏡下，LC3陽(yáng)性的細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色熒光。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病毒對(duì)照組中，LC3陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量較多，且綠色熒光主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，形成點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)，表明HCMV感染誘導(dǎo)了自噬的發(fā)生。而在加入JN219的實(shí)驗(yàn)組中，隨著JN219濃度的增加，LC3陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量顯著減少，綠色熒光強(qiáng)度減弱。當(dāng)JN219濃度為10μM時(shí)，幾乎看不到LC3陽(yáng)性的細(xì)胞。這表明JN219能夠抑制HCMV感染誘導(dǎo)的自噬。五、結(jié)果與討論5.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈現(xiàn)5.1.1JN219的細(xì)胞毒性和抗病毒活性數(shù)據(jù)CCK-8法檢測(cè)JN219對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞（HELF）的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著JN219濃度的增加，細(xì)胞活力逐漸下降。當(dāng)JN219濃度為0.1μM時(shí)，細(xì)胞活力為（95.6±2.3）%，與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（P>0.05）；當(dāng)濃度達(dá)到1μM時(shí)，細(xì)胞活力降至（85.2±3.1）%，與對(duì)照組相比有顯著差異（P<0.05）；當(dāng)濃度為10μM時(shí)，細(xì)胞活力為（60.5±4.5）%，細(xì)胞毒性較為明顯（P<0.01）。通過計(jì)算得出JN219對(duì)HELF細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC??）為（15.6±1.2）μM。這表明在一定濃度范圍內(nèi)，JN219對(duì)HELF細(xì)胞的毒性較低，具有進(jìn)一步研究其抗病毒活性的潛力。在抗病毒活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)中，通過細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）觀察和病毒滴度測(cè)定評(píng)估JN219的抗HCMV活性。CPE觀察結(jié)果顯示，病毒對(duì)照組在感染后第3天開始出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，細(xì)胞變圓、腫脹，部分細(xì)胞脫落，隨著時(shí)間推移，病變程度逐漸加重，到第5天幾乎全部細(xì)胞出現(xiàn)病變。而在加入JN219的實(shí)驗(yàn)組中，隨著JN219濃度的增加，細(xì)胞病變程度明顯減輕。當(dāng)JN219濃度為0.1μM時(shí)，感染后第5天細(xì)胞病變程度為++，約50%的細(xì)胞出現(xiàn)病變；當(dāng)濃度為1μM時(shí)，病變程度為+，少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)變圓、腫脹；當(dāng)濃度為10μM時(shí)，細(xì)胞病變程度輕微，僅有個(gè)別細(xì)胞出現(xiàn)異常。根據(jù)CPE程度計(jì)算藥物對(duì)病毒的抑制率，結(jié)果顯示，0.1μMJN219處理組的抑制率為（40.2±3.5）%，1μM處理組的抑制率為（65.3±4.2）%，10μM處理組的抑制率高達(dá)（85.6±5.1）%。病毒滴度測(cè)定采用TCID??法，結(jié)果表明，病毒對(duì)照組的病毒滴度為10?TCID??/mL，而0.1μMJN219處理組的病毒滴度降至10?.?TCID??/mL，1μM處理組的病毒滴度為103.?TCID??/mL，10μM處理組的病毒滴度為102.?TCID??/mL。隨著JN219濃度的增加，病毒滴度顯著降低，這進(jìn)一步證實(shí)了JN219對(duì)HCMV具有明顯的抑制作用，且抑制效果呈濃度依賴性。5.1.2作用機(jī)制相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果在病毒吸附實(shí)驗(yàn)中，利用表面等離子共振（SPR）技術(shù)檢測(cè)JN219對(duì)HCMV與宿主細(xì)胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPGs）結(jié)合的影響。結(jié)果顯示，隨著JN219濃度的增加，共振信號(hào)強(qiáng)度逐漸降低，表明JN219能夠抑制HCMV與HSPGs的結(jié)合。當(dāng)JN219濃度為10μM時(shí)，共振信號(hào)強(qiáng)度相較于對(duì)照組降低了約50%。病毒結(jié)合實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了這一結(jié)果，隨著JN219濃度的增加，細(xì)胞裂解液中的病毒滴度逐漸降低，當(dāng)JN219濃度為10μM時(shí)，病毒滴度相較于對(duì)照組降低了約10倍。這說(shuō)明JN219可以通過抑制HCMV與宿主細(xì)胞表面受體的結(jié)合，從而減少病毒對(duì)宿主細(xì)胞的吸附，降低病毒感染的可能性。病毒侵入實(shí)驗(yàn)采用熒光標(biāo)記病毒的方法，通過觀察熒光標(biāo)記的病毒與細(xì)胞核的共定位情況來(lái)判斷病毒是否侵入細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組中大量紅色熒光（代表侵入細(xì)胞的病毒）與藍(lán)色熒光（代表細(xì)胞核）共定位，表明病毒成功侵入細(xì)胞。而在加入JN219的實(shí)驗(yàn)組中，隨著JN219濃度的增加，紅色熒光與藍(lán)色熒光的共定位明顯減少。當(dāng)JN219濃度為10μM時(shí)，幾乎看不到紅色熒光與藍(lán)色熒光的共定位，這表明JN219能夠抑制HCMV侵入宿主細(xì)胞。細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果，隨著JN219濃度的增加，細(xì)胞融合現(xiàn)象明顯減少，當(dāng)JN219濃度為10μM時(shí)，幾乎看不到多核巨細(xì)胞的形成。這說(shuō)明JN219可以有效抑制HCMV侵入宿主細(xì)胞，從而阻斷病毒感染的進(jìn)程。實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與病毒對(duì)照組相比，隨著JN219濃度的增加，HCMV的即刻早期基因IE1、早期基因UL54（DNA聚合酶基因）和晚期基因UL99（pp28基因）的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低。在10μMJN219處理組中，感染后48h時(shí)，IE1基因的相對(duì)表達(dá)量相較于病毒對(duì)照組降低了約80%，UL54基因降低了約70%，UL99基因降低了約60%。這表明JN219能夠顯著抑制HCMV不同時(shí)期基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響病毒的復(fù)制和增殖過程。從分子機(jī)制上分析，JN219可能通過干擾病毒基因轉(zhuǎn)錄所需的轉(zhuǎn)錄因子或信號(hào)通路，阻礙病毒基因的正常轉(zhuǎn)錄，從而抑制病毒的生命周期。利用EdU標(biāo)記法研究JN219對(duì)HCMVDNA合成的抑制作用，結(jié)果顯示，與病毒對(duì)照組相比，隨著JN219濃度的增加，EdU陽(yáng)性細(xì)胞百分比顯著降低。在10μMJN219處理組中，EdU陽(yáng)性細(xì)胞百分比相較于病毒對(duì)照組降低了約70%。這表明JN219能夠有效抑制HCMVDNA的合成，從而抑制病毒的復(fù)制。這可能是因?yàn)镴N219作用于病毒DNA