MLCK經(jīng)miR-92a調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞增殖與遷移的機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義心血管疾病嚴(yán)重威脅人類健康，是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡和殘疾的主要原因之一。血管重構(gòu)是多種心血管疾病，如動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、血管成形術(shù)后再狹窄等共同的病理學(xué)特征。在血管重構(gòu)過(guò)程中，血管平滑肌細(xì)胞（VascularSmoothMuscleCells,VSMCs）的增殖與遷移起著關(guān)鍵作用，其異常變化會(huì)導(dǎo)致血管壁增厚、管腔狹窄，進(jìn)而影響血管的正常功能。因此，深入了解VSMCs增殖與遷移的調(diào)控機(jī)制，對(duì)于揭示心血管疾病的發(fā)病機(jī)制及開(kāi)發(fā)有效的治療策略具有重要意義。肌球蛋白輕鏈激酶（MyosinLightChainKinase,MLCK）是一種在細(xì)胞收縮和運(yùn)動(dòng)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的酶。在VSMCs中，MLCK通過(guò)磷酸化肌球蛋白輕鏈，調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白與肌球蛋白之間的相互作用，從而影響細(xì)胞的收縮、增殖和遷移等生物學(xué)行為。研究表明，MLCK的異常表達(dá)或活性改變與多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。例如，在動(dòng)脈粥樣硬化病變中，MLCK的表達(dá)和活性顯著升高，促進(jìn)了VSMCs的增殖和遷移，加速了斑塊的形成和發(fā)展。然而，目前關(guān)于MLCK在VSMCs增殖與遷移過(guò)程中的具體調(diào)控機(jī)制尚未完全明確。微小核糖核酸（MicroRNA,miRNA）是一類內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸。它們通過(guò)與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、遷移等多種生物學(xué)過(guò)程。miR-92a作為miRNA家族的重要成員，在心血管系統(tǒng)中廣泛表達(dá)，并且與心血管疾病的病理生理學(xué)過(guò)程密切相關(guān)。已有研究發(fā)現(xiàn)，miR-92a在高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病患者的血清或組織中表達(dá)異常，其通過(guò)靶向多個(gè)與血管功能相關(guān)的基因，如Krüppel樣因子2（KLF2）、KLF4和sirtuin1（SIRT1）等，影響血管內(nèi)皮細(xì)胞和VSMCs的功能。在VSMCs中，miR-92a的表達(dá)變化可調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與遷移能力，但其具體的作用機(jī)制以及與其他信號(hào)通路之間的相互關(guān)系仍有待進(jìn)一步深入研究。近年來(lái)的研究表明，MLCK和miR-92a在VSMCs的增殖與遷移過(guò)程中可能存在相互作用，共同參與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。然而，目前關(guān)于MLCK是否通過(guò)miR-92a調(diào)控VSMCs的增殖與遷移，以及其中潛在的分子機(jī)制尚不清楚。深入研究這一調(diào)控機(jī)制，不僅有助于揭示心血管疾病的發(fā)病機(jī)制，為心血管疾病的早期診斷和治療提供新的理論依據(jù)，還可能為開(kāi)發(fā)新型的心血管疾病治療靶點(diǎn)和藥物提供新的思路。1.2研究目的與問(wèn)題提出本研究旨在深入揭示MLCK通過(guò)miR-92a調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞增殖與遷移的具體分子機(jī)制，為心血管疾病的發(fā)病機(jī)制研究提供新的理論依據(jù)，并為心血管疾病的治療提供潛在的新靶點(diǎn)和治療策略。圍繞這一總體目標(biāo)，本研究擬解決以下關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題：MLCK與miR-92a在血管平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)關(guān)系：在正常生理狀態(tài)和心血管疾病相關(guān)的病理狀態(tài)下，明確MLCK和miR-92a在血管平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)模式，探究?jī)烧叩谋磉_(dá)是否存在相關(guān)性，以及這種相關(guān)性在不同生理病理?xiàng)l件下的變化規(guī)律。例如，通過(guò)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化模型動(dòng)物或心血管疾病患者的血管組織樣本進(jìn)行檢測(cè)，分析MLCK和miR-92a的表達(dá)水平，并與正常對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比，從而揭示它們?cè)诩膊“l(fā)生發(fā)展過(guò)程中的表達(dá)變化趨勢(shì)。MLCK對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖與遷移的直接影響：運(yùn)用細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)，如細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（如CCK-8法、EdU摻入實(shí)驗(yàn)）和細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)（如Transwell遷移實(shí)驗(yàn)、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)），研究在不同條件下（如添加MLCK激動(dòng)劑或抑制劑），MLCK的活性改變?nèi)绾沃苯佑绊懷芷交〖?xì)胞的增殖和遷移能力，確定MLCK在這兩個(gè)生物學(xué)過(guò)程中的作用方向和強(qiáng)度。例如，在體外培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞中，分別過(guò)表達(dá)或敲低MLCK，觀察細(xì)胞增殖和遷移能力的變化，以明確MLCK對(duì)這些過(guò)程的調(diào)控作用。miR-92a對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖與遷移的調(diào)控作用：利用分子生物學(xué)技術(shù)，如轉(zhuǎn)染miR-92a模擬物或抑制劑，改變血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)miR-92a的表達(dá)水平，通過(guò)細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增殖和遷移能力的影響，同時(shí)檢測(cè)相關(guān)增殖和遷移標(biāo)志物（如PCNA、Ki-67、MMP-2、MMP-9等）的表達(dá)變化，深入探究miR-92a調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞增殖與遷移的具體作用機(jī)制。比如，在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染miR-92a模擬物使細(xì)胞內(nèi)miR-92a表達(dá)升高，觀察細(xì)胞增殖和遷移相關(guān)指標(biāo)的變化，從而明確miR-92a的調(diào)控作用。MLCK是否通過(guò)miR-92a調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞增殖與遷移：通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，如熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證MLCK是否為miR-92a的直接作用靶點(diǎn)；采用基因敲降或過(guò)表達(dá)技術(shù)，在改變MLCK表達(dá)的同時(shí)，調(diào)節(jié)miR-92a的表達(dá)，觀察血管平滑肌細(xì)胞增殖與遷移能力的變化，從而確定MLCK是否通過(guò)miR-92a來(lái)調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞的增殖與遷移過(guò)程。例如，構(gòu)建MLCK3'-UTR熒光素酶報(bào)告基因載體，與miR-92a模擬物或抑制劑共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，檢測(cè)熒光素酶活性，判斷MLCK是否為miR-92a的直接靶點(diǎn)；同時(shí)，在敲低MLCK的細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-92a，觀察細(xì)胞增殖和遷移能力的恢復(fù)情況，進(jìn)一步驗(yàn)證兩者之間的調(diào)控關(guān)系。MLCK通過(guò)miR-92a調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞增殖與遷移的分子信號(hào)通路：在確定MLCK通過(guò)miR-92a調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞增殖與遷移的基礎(chǔ)上，深入研究這一調(diào)控過(guò)程中涉及的下游分子信號(hào)通路。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）、實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）等技術(shù)，檢測(cè)相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵分子（如ERK1/2、PI3K/Akt、NF-κB等）的表達(dá)和活性變化，揭示MLCK/miR-92a調(diào)控軸在血管平滑肌細(xì)胞增殖與遷移過(guò)程中的具體分子作用機(jī)制，為心血管疾病的治療提供更精準(zhǔn)的分子靶點(diǎn)。例如，在實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)在MLCK和miR-92a表達(dá)改變的情況下，ERK1/2信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平變化，從而明確該信號(hào)通路是否參與了MLCK通過(guò)miR-92a對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖與遷移的調(diào)控過(guò)程。1.3研究方法與技術(shù)路線1.3.1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)：選用人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞（HASMCs）或大鼠胸主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞（A7r5）進(jìn)行培養(yǎng)。將細(xì)胞置于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM或RPMI1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，定期換液，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%-90%融合時(shí)進(jìn)行傳代或?qū)嶒?yàn)處理。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法或電穿孔法，將MLCK過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、MLCKsiRNA、miR-92a模擬物、miR-92a抑制劑及相應(yīng)的對(duì)照序列轉(zhuǎn)染至血管平滑肌細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞接種于6孔板或24孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至50%-60%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。按照轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)配制轉(zhuǎn)染復(fù)合物，將其加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，孵育一定時(shí)間后更換為正常培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：采用CCK-8法和EdU摻入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。CCK-8法：將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于96孔板，每組設(shè)置多個(gè)復(fù)孔，分別在不同時(shí)間點(diǎn)（如24h、48h、72h）加入CCK-8試劑，孵育1-4小時(shí)后，用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的吸光度值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，評(píng)估細(xì)胞增殖情況。EdU摻入實(shí)驗(yàn)：按照EdU試劑盒說(shuō)明書(shū)，在細(xì)胞培養(yǎng)的特定時(shí)間點(diǎn)加入EdU工作液，孵育后進(jìn)行細(xì)胞固定、通透和染色，通過(guò)熒光顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例，反映細(xì)胞增殖活性。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：運(yùn)用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)：在Transwell小室的上室接種轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，下室加入含血清的培養(yǎng)基作為趨化因子。培養(yǎng)一定時(shí)間后，取出小室，擦去上室未遷移的細(xì)胞，對(duì)遷移到下室的細(xì)胞進(jìn)行固定、染色，在顯微鏡下計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)，評(píng)估細(xì)胞遷移能力。劃痕愈合實(shí)驗(yàn)：在細(xì)胞單層上用無(wú)菌槍頭劃一條直線劃痕，用PBS沖洗去除劃下的細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在不同時(shí)間點(diǎn)（如0h、12h、24h）于顯微鏡下拍照，測(cè)量劃痕寬度，計(jì)算劃痕愈合率，以評(píng)價(jià)細(xì)胞的遷移能力。1.3.2分子生物學(xué)技術(shù)RNA提取與定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（qRT-PCR）：使用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，通過(guò)核酸定量?jī)x測(cè)定RNA濃度和純度。取適量RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。以cDNA為模板，使用特異性引物和SYBRGreen熒光染料，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，檢測(cè)MLCK、miR-92a及相關(guān)靶基因mRNA的表達(dá)水平。采用2^-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，以U6或GAPDH作為內(nèi)參基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）：收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉膜1-2小時(shí)，然后加入一抗（如抗MLCK抗體、抗PCNA抗體、抗MMP-2抗體等），4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10-15分鐘，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1-2小時(shí)。再次洗滌膜后，用化學(xué)發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光，分析目的蛋白的表達(dá)水平，以β-actin作為內(nèi)參蛋白進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)：預(yù)測(cè)MLCK是否為miR-92a的潛在靶點(diǎn)，構(gòu)建含有MLCK3'-UTR野生型和突變型序列的熒光素酶報(bào)告基因載體。將熒光素酶報(bào)告基因載體與miR-92a模擬物或抑制劑共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞或血管平滑肌細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染48-72小時(shí)后，按照熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光素酶活性。若miR-92a能夠與MLCK3'-UTR結(jié)合，則會(huì)導(dǎo)致熒光素酶活性降低，從而驗(yàn)證MLCK是否為miR-92a的直接作用靶點(diǎn)。1.3.3技術(shù)路線圖本研究的技術(shù)路線圖如下所示：樣本采集與細(xì)胞培養(yǎng)：收集心血管疾病患者和健康對(duì)照者的血管組織樣本（如動(dòng)脈粥樣硬化斑塊組織和正常動(dòng)脈組織），同時(shí)進(jìn)行血管平滑肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)和細(xì)胞系（如A7r5、HASMCs）的培養(yǎng)。檢測(cè)MLCK與miR-92a的表達(dá)：運(yùn)用qRT-PCR和Westernblot技術(shù)檢測(cè)血管組織樣本和細(xì)胞中MLCK和miR-92a的表達(dá)水平，分析兩者在正常和病理狀態(tài)下的表達(dá)差異及相關(guān)性。細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)：對(duì)血管平滑肌細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理，分別過(guò)表達(dá)或敲低MLCK、轉(zhuǎn)染miR-92a模擬物或抑制劑。通過(guò)CCK-8法、EdU摻入實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和劃痕愈合實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)細(xì)胞增殖和遷移能力的變化。靶點(diǎn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：構(gòu)建MLCK3'-UTR熒光素酶報(bào)告基因載體，與miR-92a模擬物或抑制劑共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，檢測(cè)熒光素酶活性，驗(yàn)證MLCK是否為miR-92a的直接作用靶點(diǎn)。信號(hào)通路研究：采用Westernblot和qRT-PCR技術(shù)，檢測(cè)MLCK/miR-92a調(diào)控軸下游相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵分子（如ERK1/2、PI3K/Akt、NF-κB等）的表達(dá)和活性變化，深入探究其分子作用機(jī)制。數(shù)據(jù)分析與結(jié)果總結(jié)：對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，總結(jié)研究結(jié)果，撰寫(xiě)論文，繪制技術(shù)路線圖（圖1），以清晰展示整個(gè)研究過(guò)程和邏輯關(guān)系。graphTD;A[樣本采集與細(xì)胞培養(yǎng)]-->B[檢測(cè)MLCK與miR-92a的表達(dá)];B-->C[細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)];C-->D[靶點(diǎn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)];D-->E[信號(hào)通路研究];E-->F[數(shù)據(jù)分析與結(jié)果總結(jié)];A[樣本采集與細(xì)胞培養(yǎng)]-->B[檢測(cè)MLCK與miR-92a的表達(dá)];B-->C[細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)];C-->D[靶點(diǎn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)];D-->E[信號(hào)通路研究];E-->F[數(shù)據(jù)分析與結(jié)果總結(jié)];B-->C[細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)];C-->D[靶點(diǎn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)];D-->E[信號(hào)通路研究];E-->F[數(shù)據(jù)分析與結(jié)果總結(jié)];C-->D[靶點(diǎn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)];D-->E[信號(hào)通路研究];E-->F[數(shù)據(jù)分析與結(jié)果總結(jié)];D-->E[信號(hào)通路研究];E-->F[數(shù)據(jù)分析與結(jié)果總結(jié)];E-->F[數(shù)據(jù)分析與結(jié)果總結(jié)];圖1：研究技術(shù)路線圖二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1血管平滑肌細(xì)胞概述血管平滑肌細(xì)胞（VascularSmoothMuscleCells，VSMCs）作為構(gòu)成血管壁中膜的主要細(xì)胞成分，在維持血管正常生理功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著舉足輕重的作用。從結(jié)構(gòu)上看，VSMCs呈長(zhǎng)梭形，單個(gè)細(xì)胞體積較小，長(zhǎng)約20-500μm，直徑約5-10μm。細(xì)胞內(nèi)富含肌絲，包括肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白等，這些肌絲相互交織形成細(xì)胞骨架，賦予細(xì)胞收縮和舒張的能力。此外，VSMCs還含有豐富的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等細(xì)胞器，以滿足細(xì)胞的能量需求和物質(zhì)合成、加工與運(yùn)輸。在血管壁中，VSMCs呈環(huán)形或螺旋形排列，與彈性纖維、膠原纖維等細(xì)胞外基質(zhì)成分緊密結(jié)合，共同維持血管的結(jié)構(gòu)完整性和力學(xué)性能。在功能方面，VSMCs具有多種重要的生物學(xué)功能。首先，其最主要的功能是調(diào)節(jié)血管的收縮和舒張。通過(guò)肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白之間的相互作用，在神經(jīng)、體液等多種因素的調(diào)節(jié)下，VSMCs能夠發(fā)生收縮或舒張反應(yīng)，從而精確調(diào)節(jié)血管的內(nèi)徑和血壓，以滿足機(jī)體不同生理狀態(tài)下的血液供應(yīng)需求。當(dāng)機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，交感神經(jīng)興奮釋放去甲腎上腺素，與VSMCs上的α1-腎上腺素受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，促使VSMCs收縮，血管口徑減小，血壓升高，以增加重要器官的血液灌注；而當(dāng)機(jī)體處于休息狀態(tài)時(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放一氧化氮（NO）等舒張因子，激活VSMCs內(nèi)的鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶，使細(xì)胞內(nèi)cGMP水平升高，導(dǎo)致VSMCs舒張，血管口徑增大，血壓降低。其次，VSMCs還參與細(xì)胞外基質(zhì)的合成與分泌。它們能夠合成和分泌多種細(xì)胞外基質(zhì)成分，如膠原蛋白、彈性蛋白、纖連蛋白等，這些成分對(duì)于維持血管壁的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、彈性和韌性至關(guān)重要。在血管發(fā)育和生長(zhǎng)過(guò)程中，VSMCs通過(guò)不斷合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)，構(gòu)建和完善血管壁的結(jié)構(gòu)；在血管損傷修復(fù)過(guò)程中，VSMCs也會(huì)增加細(xì)胞外基質(zhì)的合成，以促進(jìn)損傷部位的愈合和血管功能的恢復(fù)。再者，VSMCs在維持血管穩(wěn)態(tài)方面起著關(guān)鍵作用。它們與血管內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞等相互作用，共同調(diào)節(jié)血管的生理功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。血管內(nèi)皮細(xì)胞可以分泌多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，如血小板源性生長(zhǎng)因子（PDGF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等，這些因子可以作用于VSMCs，調(diào)節(jié)其增殖、遷移和表型轉(zhuǎn)換等生物學(xué)行為。同時(shí)，VSMCs也可以分泌一些細(xì)胞因子和趨化因子，如單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，參與血管局部的炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)。在正常生理狀態(tài)下，VSMCs處于相對(duì)靜止的收縮型表型，具有低增殖、高收縮的特點(diǎn)，能夠維持血管的正常張力和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。然而，在多種病理因素的刺激下，如高血壓、高血脂、高血糖、炎癥等，VSMCs會(huì)發(fā)生表型轉(zhuǎn)換，從收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚?。合成型VSMCs具有高增殖、高遷移和低收縮的特點(diǎn)，它們會(huì)大量增殖并遷移到血管內(nèi)膜下，同時(shí)分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致血管壁增厚、管腔狹窄，進(jìn)而引發(fā)血管重構(gòu)。這種異常的血管重構(gòu)是多種心血管疾病，如動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、血管成形術(shù)后再狹窄等發(fā)生發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)。在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，血液中的低密度脂蛋白（LDL）等脂質(zhì)成分會(huì)侵入血管內(nèi)膜下，被氧化修飾后形成氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）。ox-LDL會(huì)激活血管內(nèi)皮細(xì)胞，使其分泌多種炎癥因子和趨化因子，吸引單核細(xì)胞等免疫細(xì)胞進(jìn)入血管內(nèi)膜下，并分化為巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞通過(guò)吞噬ox-LDL形成泡沫細(xì)胞，同時(shí)釋放更多的炎癥因子和細(xì)胞因子，進(jìn)一步刺激VSMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)換和增殖、遷移。合成型VSMCs在血管內(nèi)膜下大量增殖并分泌細(xì)胞外基質(zhì)，逐漸形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，隨著斑塊的不斷增大和不穩(wěn)定，可導(dǎo)致血管狹窄、阻塞或破裂，引發(fā)嚴(yán)重的心血管事件。2.2MLCK的結(jié)構(gòu)與功能肌球蛋白輕鏈激酶（MyosinLightChainKinase，MLCK）是一種在細(xì)胞收縮和運(yùn)動(dòng)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的酶，其結(jié)構(gòu)和功能的特殊性決定了它在細(xì)胞生理活動(dòng)中的重要地位。MLCK的分子結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，它是一種由多個(gè)結(jié)構(gòu)域組成的蛋白質(zhì)。以平滑肌型MLCK為例，其相對(duì)分子質(zhì)量約為130-150kDa，主要包含以下幾個(gè)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域：催化結(jié)構(gòu)域：位于MLCK的N端，約由300個(gè)氨基酸殘基組成，具有典型的蛋白激酶結(jié)構(gòu)特征。該結(jié)構(gòu)域含有ATP結(jié)合位點(diǎn)和底物結(jié)合位點(diǎn)，能夠結(jié)合ATP并將其γ-磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到底物肌球蛋白輕鏈（MyosinLightChain，MLC）的特定絲氨酸殘基上，從而催化MLC的磷酸化反應(yīng)，這是MLCK發(fā)揮生物學(xué)功能的關(guān)鍵步驟。ATP結(jié)合位點(diǎn)通過(guò)與ATP的特異性結(jié)合，為磷酸化反應(yīng)提供能量；底物結(jié)合位點(diǎn)則精確識(shí)別并結(jié)合MLC，確保磷酸化反應(yīng)的準(zhǔn)確性和高效性。鈣調(diào)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域：緊接催化結(jié)構(gòu)域之后，由約100個(gè)氨基酸殘基組成。鈣調(diào)蛋白（Calmodulin，CaM）是一種廣泛存在于真核細(xì)胞中的鈣離子感受器，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高時(shí)，CaM與鈣離子結(jié)合并發(fā)生構(gòu)象變化，進(jìn)而與MLCK的鈣調(diào)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域緊密結(jié)合。這種結(jié)合能夠激活MLCK的催化活性，使MLCK從無(wú)活性狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚誀顟B(tài)，從而啟動(dòng)對(duì)MLC的磷酸化過(guò)程。鈣調(diào)蛋白與MLCK的結(jié)合是一個(gè)動(dòng)態(tài)且精細(xì)調(diào)控的過(guò)程，其結(jié)合親和力和結(jié)合穩(wěn)定性受到多種因素的影響，如鈣離子濃度、細(xì)胞內(nèi)其他信號(hào)分子等。肌動(dòng)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域：位于MLCK分子的中部或C端區(qū)域，其具體位置和氨基酸組成在不同類型的MLCK中可能存在一定差異。該結(jié)構(gòu)域能夠與肌動(dòng)蛋白相互作用，使MLCK定位到細(xì)胞骨架附近，促進(jìn)肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白之間的相互作用，從而在細(xì)胞收縮和運(yùn)動(dòng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。通過(guò)與肌動(dòng)蛋白的結(jié)合，MLCK能夠?qū)⒓∏虻鞍椎氖湛s力傳遞到細(xì)胞骨架上，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的形態(tài)改變和運(yùn)動(dòng)。例如，在血管平滑肌細(xì)胞收縮過(guò)程中，MLCK與肌動(dòng)蛋白結(jié)合后，能夠調(diào)節(jié)肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白的結(jié)合和解離速率，從而控制細(xì)胞的收縮強(qiáng)度和速度。其他結(jié)構(gòu)域：除了上述主要結(jié)構(gòu)域外，MLCK還可能包含一些其他的結(jié)構(gòu)域或功能基序，如自身抑制結(jié)構(gòu)域、富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域等。自身抑制結(jié)構(gòu)域在MLCK未被激活時(shí)，能夠通過(guò)與催化結(jié)構(gòu)域相互作用，抑制MLCK的活性，防止其在不需要時(shí)過(guò)度激活；富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域則可能參與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，與其他信號(hào)分子或調(diào)節(jié)蛋白相互結(jié)合，進(jìn)一步調(diào)節(jié)MLCK的功能和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路。在某些細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中，富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域能夠與含有SH3結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)相互作用，形成蛋白質(zhì)復(fù)合物，從而激活或抑制下游信號(hào)通路。MLCK具有多種重要的生物學(xué)功能，在平滑肌收縮、細(xì)胞增殖和遷移等過(guò)程中均發(fā)揮著不可或缺的作用。在平滑肌收縮過(guò)程中，MLCK起著核心調(diào)控作用。當(dāng)血管平滑肌細(xì)胞接收到收縮信號(hào)，如去甲腎上腺素、血管緊張素II等神經(jīng)遞質(zhì)或激素的刺激時(shí)，細(xì)胞膜上的受體被激活，通過(guò)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高。升高的鈣離子與鈣調(diào)蛋白結(jié)合，激活的鈣調(diào)蛋白-鈣離子復(fù)合物進(jìn)而與MLCK結(jié)合，解除MLCK自身抑制結(jié)構(gòu)域?qū)Υ呋Y(jié)構(gòu)域的抑制作用，使MLCK活化?；罨腗LCK催化肌球蛋白輕鏈（MLC）的磷酸化，磷酸化的MLC與肌動(dòng)蛋白結(jié)合能力增強(qiáng)，促使肌動(dòng)蛋白與肌球蛋白之間發(fā)生相對(duì)滑動(dòng)，產(chǎn)生收縮力，最終導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞收縮，血管口徑減小。在高血壓患者中，體內(nèi)的腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）過(guò)度激活，血管緊張素II水平升高，刺激血管平滑肌細(xì)胞，使MLCK活性增強(qiáng)，導(dǎo)致血管平滑肌過(guò)度收縮，血壓升高。在細(xì)胞增殖方面，MLCK也參與其中。研究表明，MLCK的活性改變與細(xì)胞周期的調(diào)控密切相關(guān)。在細(xì)胞周期的G1期向S期轉(zhuǎn)變過(guò)程中，MLCK的表達(dá)和活性會(huì)發(fā)生變化，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組和細(xì)胞形態(tài)的改變，為DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂做準(zhǔn)備。具體來(lái)說(shuō)，MLCK可能通過(guò)磷酸化一些與細(xì)胞骨架相關(guān)的蛋白質(zhì)，如微管相關(guān)蛋白、肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白等，影響細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性和動(dòng)力學(xué)，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖。在腫瘤細(xì)胞中，MLCK的高表達(dá)往往與細(xì)胞的快速增殖相關(guān)，抑制MLCK的活性可以有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖能力。此外，MLCK在細(xì)胞遷移過(guò)程中同樣發(fā)揮著重要作用。細(xì)胞遷移是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)重組、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附和解黏附等多個(gè)環(huán)節(jié)。MLCK通過(guò)磷酸化MLC，調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白與肌球蛋白之間的相互作用，產(chǎn)生細(xì)胞遷移所需的驅(qū)動(dòng)力。同時(shí)，MLCK還可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的黏附分子的表達(dá)和活性，影響細(xì)胞的黏附能力，從而促進(jìn)細(xì)胞的遷移。在傷口愈合過(guò)程中，成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等會(huì)發(fā)生遷移，MLCK在這一過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其活性的增強(qiáng)有助于細(xì)胞快速遷移到傷口部位，促進(jìn)傷口的愈合。在動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)展過(guò)程中，血管平滑肌細(xì)胞從血管中膜向內(nèi)膜遷移，MLCK的異常激活促進(jìn)了這一遷移過(guò)程，加速了動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成。2.3miR-92a的特性與作用機(jī)制miR-92a是一種在生物體內(nèi)廣泛表達(dá)且功能多樣的微小核糖核酸，其序列和結(jié)構(gòu)具有獨(dú)特的特征，這些特征決定了它在基因表達(dá)調(diào)控中的重要作用。miR-92a的成熟序列長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸，在人類中，其成熟序列為5'-UAAAGUGCUUACAGUGCAGGUU-3'。miR-92a基因位于13號(hào)染色體上的MIR17HG基因簇中，該基因簇還包含miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a和miR-19b-1等多個(gè)miRNA成員。miR-92a基因最初轉(zhuǎn)錄形成的是具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本（pri-miR-92a），pri-miR-92a在細(xì)胞核內(nèi)被核酸酶Drosha及其輔助因子DGCR8組成的復(fù)合物識(shí)別并切割，產(chǎn)生長(zhǎng)度約為70-100個(gè)核苷酸的前體miRNA（pre-miR-92a）。pre-miR-92a呈發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，包含不完全互補(bǔ)的雙鏈區(qū)和單鏈環(huán)區(qū)。隨后，pre-miR-92a在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin-5的作用下從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞質(zhì)中被另一種核酸酶Dicer識(shí)別并切割，最終形成成熟的miR-92a。成熟的miR-92a與AGO蛋白等組成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC），發(fā)揮其對(duì)靶基因的調(diào)控作用。在基因表達(dá)調(diào)控方面，miR-92a主要通過(guò)與靶mRNA的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補(bǔ)配對(duì)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。當(dāng)miR-92a與靶mRNA的3'-UTR完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，RISC中的AGO蛋白會(huì)切割靶mRNA，導(dǎo)致其降解，從而抑制基因的表達(dá)。在細(xì)胞周期調(diào)控過(guò)程中，miR-92a可以通過(guò)與細(xì)胞周期相關(guān)基因的mRNA3'-UTR完全互補(bǔ)配對(duì)，使其被切割降解，進(jìn)而影響細(xì)胞周期的進(jìn)程。當(dāng)miR-92a與靶mRNA的3'-UTR不完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，RISC則會(huì)抑制靶mRNA的翻譯過(guò)程，使mRNA無(wú)法正常翻譯成蛋白質(zhì)，但并不影響mRNA的穩(wěn)定性。在細(xì)胞分化過(guò)程中，miR-92a可能通過(guò)不完全互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合到某些分化相關(guān)基因的mRNA3'-UTR上，抑制其翻譯，從而調(diào)控細(xì)胞的分化方向。miR-92a還可以通過(guò)與靶mRNA的5'-UTR或編碼區(qū)相互作用，影響mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率，但其具體作用機(jī)制相對(duì)復(fù)雜，目前尚未完全明確。大量研究表明，miR-92a與心血管疾病之間存在著密切的潛在關(guān)聯(lián)。在動(dòng)脈粥樣硬化疾病中，miR-92a的表達(dá)水平在病變血管組織和患者血清中均顯著升高。miR-92a通過(guò)靶向多個(gè)與血管穩(wěn)態(tài)相關(guān)的基因，如Krüppel樣因子2（KLF2）、Krüppel樣因子4（KLF4）和sirtuin1（SIRT1）等，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換。miR-92a通過(guò)抑制KLF2和KLF4的表達(dá)，減少一氧化氮（NO）的釋放，促進(jìn)炎癥因子的分泌，從而破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞的正常功能，增加血管壁的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激。miR-92a還可以通過(guò)抑制SIRT1的表達(dá)，影響細(xì)胞內(nèi)的代謝和抗氧化防御機(jī)制，進(jìn)一步加重血管損傷。這些作用共同促進(jìn)了動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成和發(fā)展。在高血壓患者中，循環(huán)血液中的miR-92a水平明顯升高，且與血壓水平、頸動(dòng)脈內(nèi)膜-中膜厚度等高血壓相關(guān)指標(biāo)呈正相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，血管緊張素II（AngII）可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞中miR-92a的表達(dá)上調(diào)。上調(diào)的miR-92a通過(guò)抑制eNOS等基因的表達(dá)，減少NO的生成，導(dǎo)致血管收縮功能增強(qiáng)，血壓升高。miR-92a還可以通過(guò)調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移能力，參與高血壓引起的血管重構(gòu)過(guò)程。在心肌梗死等缺血性心血管疾病中，miR-92a也發(fā)揮著重要作用。心肌梗死后，梗死區(qū)周圍心肌組織中的miR-92a表達(dá)顯著增加。miR-92a通過(guò)抑制血管生成相關(guān)基因的表達(dá)，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等，阻礙梗死心肌的血管新生和修復(fù)，加重心肌缺血和損傷。綜上所述，miR-92a在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著重要角色，深入研究其作用機(jī)制對(duì)于心血管疾病的防治具有重要意義。三、MLCK與血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的關(guān)系3.1MLCK對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響3.1.1體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)為了深入探究MLCK對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響，眾多研究以常用的血管平滑肌細(xì)胞系為研究對(duì)象，開(kāi)展了一系列體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。在一項(xiàng)具有代表性的研究中，研究人員選用大鼠胸主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞（A7r5）作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。首先，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將MLCK過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至A7r5細(xì)胞中，成功構(gòu)建了MLCK過(guò)表達(dá)的細(xì)胞模型；同時(shí)，利用RNA干擾技術(shù)，將針對(duì)MLCK的小干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了對(duì)MLCK表達(dá)的有效敲低。在細(xì)胞增殖檢測(cè)方面，采用了EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶）摻入實(shí)驗(yàn)和CCK-8（CellCountingKit-8）實(shí)驗(yàn)。EdU摻入實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛑庇^地反映細(xì)胞DNA合成的情況，進(jìn)而準(zhǔn)確評(píng)估細(xì)胞的增殖活性。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，將過(guò)表達(dá)或敲低MLCK的A7r5細(xì)胞接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，加入EdU工作液孵育一段時(shí)間。隨后，按照EdU試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行細(xì)胞固定、通透和染色處理。最后，在熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，MLCK過(guò)表達(dá)組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著增加，表明細(xì)胞增殖活性明顯增強(qiáng)；而MLCK敲低組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例則顯著降低，細(xì)胞增殖受到明顯抑制。CCK-8實(shí)驗(yàn)則是基于細(xì)胞線粒體中的脫氫酶能夠?qū)CK-8試劑中的WST-8還原為具有高度水溶性的橙黃色甲瓚產(chǎn)物這一原理，通過(guò)檢測(cè)甲瓚產(chǎn)物的生成量來(lái)間接反映細(xì)胞的增殖情況。將轉(zhuǎn)染后的A7r5細(xì)胞接種于96孔板，每組設(shè)置多個(gè)復(fù)孔，分別在24h、48h、72h等不同時(shí)間點(diǎn)加入CCK-8試劑，孵育1-4小時(shí)后，用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的吸光度值。繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線后發(fā)現(xiàn)，MLCK過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線斜率明顯大于對(duì)照組，說(shuō)明細(xì)胞增殖速度更快；而MLCK敲低組的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線斜率則小于對(duì)照組，細(xì)胞增殖速度減緩。此外，為了進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，研究人員還檢測(cè)了細(xì)胞增殖相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)變化。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MLCK過(guò)表達(dá)組中增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）和Ki-67等增殖標(biāo)志物的蛋白表達(dá)水平顯著升高；而在MLCK敲低組中，這些標(biāo)志物的蛋白表達(dá)水平則明顯降低。PCNA是一種僅在增殖細(xì)胞中合成和表達(dá)的蛋白質(zhì)，在DNA合成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，其表達(dá)水平的高低與細(xì)胞增殖活性密切相關(guān)。Ki-67同樣是一種與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的核抗原，其在細(xì)胞周期的G1、S、G2和M期均有表達(dá)，而在G0期不表達(dá)，因此常被用作評(píng)估細(xì)胞增殖狀態(tài)的重要指標(biāo)。綜上所述，這些體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致表明，MLCK能夠顯著促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖，其表達(dá)水平的變化與細(xì)胞增殖活性呈正相關(guān)。3.1.2體內(nèi)動(dòng)物模型驗(yàn)證為了進(jìn)一步驗(yàn)證MLCK對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響，除了體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)外，研究人員還構(gòu)建了相關(guān)的體內(nèi)動(dòng)物模型進(jìn)行深入探究。以小鼠頸動(dòng)脈損傷模型為例，該模型是通過(guò)手術(shù)方法對(duì)小鼠頸動(dòng)脈進(jìn)行機(jī)械損傷，從而誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，模擬人類血管損傷后的病理生理過(guò)程。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、MLCK激活劑處理組和MLCK抑制劑處理組。對(duì)照組小鼠僅接受假手術(shù)處理，即僅暴露頸動(dòng)脈而不進(jìn)行實(shí)質(zhì)性損傷；MLCK激活劑處理組小鼠在頸動(dòng)脈損傷后，通過(guò)腹腔注射或局部給藥的方式給予MLCK激活劑，以增強(qiáng)MLCK的活性；MLCK抑制劑處理組小鼠則在頸動(dòng)脈損傷后，給予MLCK抑制劑，抑制MLCK的活性。在手術(shù)后的不同時(shí)間點(diǎn)（如7天、14天、21天等），處死小鼠并取頸動(dòng)脈組織進(jìn)行分析。通過(guò)免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測(cè)血管組織中平滑肌細(xì)胞增殖標(biāo)志物PCNA和Ki-67的表達(dá)情況。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，MLCK激活劑處理組小鼠頸動(dòng)脈組織中PCNA和Ki-67陽(yáng)性的平滑肌細(xì)胞數(shù)量顯著增加，表明MLCK活性的增強(qiáng)能夠促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖；而在MLCK抑制劑處理組中，PCNA和Ki-67陽(yáng)性的平滑肌細(xì)胞數(shù)量則明顯減少，說(shuō)明抑制MLCK的活性可以有效抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖。為了更直觀地觀察血管平滑肌細(xì)胞的增殖情況，研究人員還采用了BrdU（5-溴-2'-脫氧尿嘧啶）摻入實(shí)驗(yàn)。BrdU是一種胸腺嘧啶核苷類似物，在細(xì)胞增殖過(guò)程中，BrdU能夠替代胸腺嘧啶摻入到新合成的DNA中。通過(guò)對(duì)BrdU進(jìn)行免疫熒光染色，就可以標(biāo)記出增殖的細(xì)胞。在實(shí)驗(yàn)中，在小鼠處死前一定時(shí)間內(nèi)給予BrdU腹腔注射，使正在增殖的細(xì)胞攝取BrdU。然后取頸動(dòng)脈組織進(jìn)行冰凍切片，進(jìn)行BrdU免疫熒光染色。熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，MLCK激活劑處理組中BrdU陽(yáng)性的平滑肌細(xì)胞數(shù)量明顯多于對(duì)照組，而MLCK抑制劑處理組中BrdU陽(yáng)性的平滑肌細(xì)胞數(shù)量則顯著少于對(duì)照組。這進(jìn)一步證實(shí)了MLCK對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。除了小鼠頸動(dòng)脈損傷模型外，研究人員還利用其他動(dòng)物模型進(jìn)行了驗(yàn)證，如大鼠腹主動(dòng)脈縮窄模型等。在大鼠腹主動(dòng)脈縮窄模型中，通過(guò)手術(shù)縮窄大鼠腹主動(dòng)脈，造成血管狹窄，引發(fā)高血壓和血管重構(gòu)，從而導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移。在該模型中，同樣發(fā)現(xiàn)MLCK表達(dá)水平和活性的變化與血管平滑肌細(xì)胞的增殖密切相關(guān)。給予MLCK激活劑能夠加重血管平滑肌細(xì)胞的增殖和血管重構(gòu)程度，而給予MLCK抑制劑則可以減輕血管平滑肌細(xì)胞的增殖和血管重構(gòu)。這些體內(nèi)動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果與體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果相互印證，充分表明MLCK在血管平滑肌細(xì)胞增殖過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，其活性的改變能夠顯著影響血管平滑肌細(xì)胞的增殖能力，進(jìn)而參與血管重構(gòu)等病理生理過(guò)程。3.2MLCK對(duì)血管平滑肌細(xì)胞遷移的影響3.2.1劃痕實(shí)驗(yàn)與Transwell實(shí)驗(yàn)劃痕實(shí)驗(yàn)作為一種經(jīng)典且操作相對(duì)簡(jiǎn)便的細(xì)胞遷移檢測(cè)方法，在探究MLCK對(duì)血管平滑肌細(xì)胞遷移的影響中發(fā)揮了重要作用。在相關(guān)研究中，以人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞（HASMCs）為研究對(duì)象開(kāi)展劃痕實(shí)驗(yàn)。首先，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HASMCs接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%-90%融合時(shí)，用無(wú)菌的200μl移液器槍頭在細(xì)胞單層上垂直劃一條直線劃痕。劃痕完成后，用PBS輕輕沖洗細(xì)胞3次，以去除劃下的細(xì)胞碎片和未附著的細(xì)胞。隨后，向孔板中加入含不同處理因素的無(wú)血清培養(yǎng)基，其中一組加入MLCK激動(dòng)劑以增強(qiáng)MLCK的活性，另一組加入MLCK抑制劑以抑制MLCK的活性，同時(shí)設(shè)置不加任何處理因素的對(duì)照組。將6孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。在培養(yǎng)后的0h、12h、24h等不同時(shí)間點(diǎn)，于倒置顯微鏡下對(duì)劃痕區(qū)域進(jìn)行拍照記錄。利用圖像分析軟件（如ImageJ）測(cè)量劃痕寬度，并計(jì)算劃痕愈合率。計(jì)算公式為：劃痕愈合率=（0h劃痕寬度-th劃痕寬度）/0h劃痕寬度×100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，加入MLCK激動(dòng)劑處理組的細(xì)胞在相同時(shí)間內(nèi)劃痕愈合率顯著提高，表明細(xì)胞遷移速度加快；而加入MLCK抑制劑處理組的細(xì)胞劃痕愈合率明顯降低，細(xì)胞遷移速度減緩。這初步說(shuō)明MLCK活性的增強(qiáng)能夠促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的遷移，而抑制MLCK的活性則會(huì)抑制細(xì)胞遷移。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)則從另一個(gè)角度，更精確地評(píng)估了MLCK對(duì)血管平滑肌細(xì)胞遷移能力的影響。該實(shí)驗(yàn)利用Transwell小室，其底部為一層具有通透性的聚碳酸酯膜，將小室放入24孔培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱為上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱為下室。實(shí)驗(yàn)時(shí)，先將Matrigel基質(zhì)膠鋪于Transwell小室的上室底部，待其凝固后，形成一層類似細(xì)胞外基質(zhì)的薄膜，模擬體內(nèi)細(xì)胞遷移的微環(huán)境。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的血管平滑肌細(xì)胞（如大鼠胸主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞A7r5）用胰蛋白酶消化并制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?個(gè)/ml。取100μl細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室中，而下室則加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子。同時(shí)設(shè)置不同處理組，一組在細(xì)胞懸液中加入MLCK過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，另一組加入MLCKsiRNA，以分別實(shí)現(xiàn)MLCK的過(guò)表達(dá)和敲低，對(duì)照組則加入空載質(zhì)?；蜿幮詫?duì)照siRNA。將24孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育24-48小時(shí)。孵育結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞。然后將小室放入4%多聚甲醛中固定15-20分鐘，再用0.1%結(jié)晶紫溶液染色10-15分鐘。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移到下室膜表面的細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MLCK過(guò)表達(dá)組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量顯著多于對(duì)照組，說(shuō)明MLCK過(guò)表達(dá)能夠增強(qiáng)血管平滑肌細(xì)胞的遷移能力；而MLCK敲低組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量則明顯少于對(duì)照組，表明敲低MLCK會(huì)抑制細(xì)胞的遷移能力。綜合劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以明確MLCK在血管平滑肌細(xì)胞遷移過(guò)程中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用，其表達(dá)水平和活性的改變能夠顯著影響細(xì)胞的遷移能力。3.2.2體內(nèi)血管損傷模型為了進(jìn)一步驗(yàn)證MLCK在體內(nèi)對(duì)血管平滑肌細(xì)胞遷移的影響，研究人員構(gòu)建了血管損傷動(dòng)物模型，其中小鼠頸動(dòng)脈損傷模型是常用的研究模型之一。在該模型的構(gòu)建過(guò)程中，首先將小鼠進(jìn)行麻醉處理，然后通過(guò)頸部正中切口暴露頸動(dòng)脈。采用絲線結(jié)扎或球囊損傷等方法對(duì)頸動(dòng)脈進(jìn)行損傷，模擬血管受到外界刺激后的損傷狀態(tài)，從而誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖。在損傷后，將小鼠隨機(jī)分為不同處理組，包括對(duì)照組、MLCK激活劑處理組和MLCK抑制劑處理組。對(duì)照組小鼠僅接受假手術(shù)處理，即暴露頸動(dòng)脈但不進(jìn)行實(shí)質(zhì)性損傷。MLCK激活劑處理組小鼠在頸動(dòng)脈損傷后，通過(guò)腹腔注射或局部給藥的方式給予MLCK激活劑，以增強(qiáng)MLCK的活性；MLCK抑制劑處理組小鼠則在頸動(dòng)脈損傷后，給予MLCK抑制劑，抑制MLCK的活性。在手術(shù)后的不同時(shí)間點(diǎn)（如7天、14天、21天等），處死小鼠并取頸動(dòng)脈組織進(jìn)行分析。通過(guò)免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測(cè)血管組織中平滑肌細(xì)胞遷移標(biāo)志物的表達(dá)情況，如基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）等。MMP-2和MMP-9能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，為血管平滑肌細(xì)胞的遷移提供空間，其表達(dá)水平與細(xì)胞遷移能力密切相關(guān)。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，MLCK激活劑處理組小鼠頸動(dòng)脈組織中MMP-2和MMP-9陽(yáng)性的平滑肌細(xì)胞數(shù)量顯著增加，表明MLCK活性的增強(qiáng)能夠促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的遷移；而在MLCK抑制劑處理組中，MMP-2和MMP-9陽(yáng)性的平滑肌細(xì)胞數(shù)量則明顯減少，說(shuō)明抑制MLCK的活性可以有效抑制血管平滑肌細(xì)胞的遷移。為了更直觀地觀察血管平滑肌細(xì)胞的遷移情況，研究人員還采用了免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)。將血管組織切片進(jìn)行處理后，分別用針對(duì)平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）和增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）的抗體進(jìn)行孵育。α-SMA是血管平滑肌細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，PCNA則是細(xì)胞增殖的標(biāo)志物。通過(guò)免疫熒光顯微鏡觀察，可以同時(shí)標(biāo)記出遷移到血管內(nèi)膜的平滑肌細(xì)胞（α-SMA陽(yáng)性）以及處于增殖狀態(tài)的細(xì)胞（PCNA陽(yáng)性）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MLCK激活劑處理組中α-SMA和PCNA雙陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量明顯多于對(duì)照組，表明MLCK活性增強(qiáng)不僅促進(jìn)了血管平滑肌細(xì)胞的遷移，還增加了遷移到內(nèi)膜的平滑肌細(xì)胞的增殖活性；而MLCK抑制劑處理組中α-SMA和PCNA雙陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量則顯著少于對(duì)照組。這進(jìn)一步證實(shí)了MLCK在體內(nèi)對(duì)血管平滑肌細(xì)胞遷移的促進(jìn)作用。除了小鼠頸動(dòng)脈損傷模型外，研究人員還利用大鼠腹主動(dòng)脈損傷模型等進(jìn)行了驗(yàn)證。在大鼠腹主動(dòng)脈損傷模型中，同樣發(fā)現(xiàn)MLCK表達(dá)水平和活性的變化與血管平滑肌細(xì)胞的遷移密切相關(guān)。這些體內(nèi)血管損傷模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果與體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果相互補(bǔ)充，充分表明MLCK在體內(nèi)血管損傷修復(fù)過(guò)程中，對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的遷移起著重要的調(diào)控作用，其活性的改變能夠顯著影響血管平滑肌細(xì)胞的遷移能力，進(jìn)而參與血管重構(gòu)等病理生理過(guò)程。四、miR-92a與血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的關(guān)系4.1miR-92a在血管平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)特征在正常生理狀態(tài)下，血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）中miR-92a呈現(xiàn)出一定水平的基礎(chǔ)表達(dá)。研究人員通過(guò)對(duì)健康個(gè)體的血管組織進(jìn)行檢測(cè)，以及對(duì)體外培養(yǎng)的正常VSMCs進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)miR-92a在這些細(xì)胞中均有表達(dá)。利用定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（qRT-PCR）技術(shù)對(duì)人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞（HASMCs）和大鼠胸主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞（A7r5）進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，在正常培養(yǎng)條件下，miR-92a在HASMCs和A7r5細(xì)胞中均能穩(wěn)定表達(dá)，其表達(dá)水平維持在一個(gè)相對(duì)恒定的范圍內(nèi)。這種基礎(chǔ)表達(dá)對(duì)于維持VSMCs的正常生理功能具有重要意義，它可能參與調(diào)節(jié)VSMCs的生長(zhǎng)、代謝、收縮等多種生物學(xué)過(guò)程，通過(guò)與一系列靶基因相互作用，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和基因表達(dá)的平衡。然而，在多種病理?xiàng)l件下，VSMCs中miR-92a的表達(dá)水平會(huì)發(fā)生顯著變化。以動(dòng)脈粥樣硬化疾病為例，大量研究表明，在動(dòng)脈粥樣硬化病變的血管組織中，VSMCs內(nèi)miR-92a的表達(dá)水平明顯升高。通過(guò)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化患者的頸動(dòng)脈斑塊組織和正常頸動(dòng)脈組織進(jìn)行對(duì)比分析，采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)miR-92a的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)斑塊組織中VSMCs的miR-92a表達(dá)量相較于正常組織顯著上調(diào)。在動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型中，給予高脂飲食誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化形成，然后取主動(dòng)脈組織進(jìn)行檢測(cè)，同樣發(fā)現(xiàn)VSMCs中miR-92a的表達(dá)顯著增加。這種表達(dá)上調(diào)與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，它可能通過(guò)調(diào)節(jié)VSMCs的增殖、遷移和表型轉(zhuǎn)換等過(guò)程，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成和進(jìn)展。在高血壓病理狀態(tài)下，VSMCs中miR-92a的表達(dá)也會(huì)出現(xiàn)異常改變。研究發(fā)現(xiàn)，高血壓患者的血管平滑肌細(xì)胞中miR-92a的表達(dá)水平顯著高于血壓正常人群。一項(xiàng)針對(duì)高血壓患者和健康對(duì)照者的研究中，采集外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）和血管平滑肌細(xì)胞，利用qRT-PCR檢測(cè)miR-92a的表達(dá)，結(jié)果顯示高血壓患者PBMCs和血管平滑肌細(xì)胞中miR-92a的表達(dá)均明顯升高，且與血壓水平呈正相關(guān)。在血管緊張素II（AngII）誘導(dǎo)的高血壓動(dòng)物模型中，給予小鼠或大鼠腹腔注射AngII，一段時(shí)間后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞中miR-92a的表達(dá)顯著上調(diào)。這種表達(dá)變化可能參與了高血壓引起的血管重構(gòu)過(guò)程，通過(guò)影響VSMCs的增殖、遷移和收縮功能，導(dǎo)致血管壁增厚、管腔狹窄，進(jìn)一步加重高血壓病情。此外，在血管損傷修復(fù)過(guò)程中，VSMCs中miR-92a的表達(dá)同樣會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)變化。當(dāng)血管受到機(jī)械損傷（如球囊損傷、手術(shù)損傷等）后，損傷部位的VSMCs會(huì)被激活，發(fā)生增殖和遷移，以修復(fù)受損的血管組織。研究表明，在血管損傷后的早期階段，VSMCs中miR-92a的表達(dá)會(huì)迅速升高。以小鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型為例，在損傷后的1-3天內(nèi)，損傷部位的VSMCs中miR-92a的表達(dá)明顯上調(diào)，隨后隨著時(shí)間的推移，表達(dá)水平逐漸下降。這種早期的表達(dá)上調(diào)可能是機(jī)體對(duì)血管損傷的一種應(yīng)激反應(yīng)，通過(guò)調(diào)節(jié)VSMCs的生物學(xué)行為，促進(jìn)血管損傷的修復(fù)。然而，如果miR-92a的表達(dá)異常升高或持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能會(huì)導(dǎo)致VSMCs過(guò)度增殖和遷移，引發(fā)血管再狹窄等并發(fā)癥。miR-92a在VSMCs中的表達(dá)受到多種因素的調(diào)控，其中轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)通路起著關(guān)鍵作用。一些轉(zhuǎn)錄因子能夠直接結(jié)合到miR-92a基因的啟動(dòng)子區(qū)域，調(diào)控其轉(zhuǎn)錄過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，核因子-κB（NF-κB）是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥等病理?xiàng)l件下被激活。激活的NF-κB可以結(jié)合到miR-92a基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)miR-92a的轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致VSMCs中miR-92a的表達(dá)升高。在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中，由于炎癥反應(yīng)的存在，NF-κB被持續(xù)激活，進(jìn)而上調(diào)miR-92a的表達(dá)，影響VSMCs的功能。一些信號(hào)通路也參與了miR-92a表達(dá)的調(diào)控。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、分化和應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。研究表明，在血管緊張素II刺激VSMCs時(shí)，會(huì)激活MAPK信號(hào)通路，進(jìn)而上調(diào)miR-92a的表達(dá)。具體來(lái)說(shuō)，血管緊張素II與VSMCs表面的受體結(jié)合，激活下游的Ras-Raf-MEK-ERK1/2信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，ERK1/2磷酸化后進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性，最終促進(jìn)miR-92a的表達(dá)。4.2miR-92a對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖的調(diào)控作用4.2.1功能獲得與缺失實(shí)驗(yàn)為了深入探究miR-92a對(duì)血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）增殖的調(diào)控作用，研究人員開(kāi)展了一系列功能獲得與缺失實(shí)驗(yàn)。在功能獲得實(shí)驗(yàn)中，選用人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞（HASMCs）作為研究對(duì)象。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miR-92a模擬物轉(zhuǎn)染至HASMCs中，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)miR-92a表達(dá)水平的上調(diào)。同時(shí)設(shè)置轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照模擬物（mimics-NC）的對(duì)照組，以排除轉(zhuǎn)染試劑及其他非特異性因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。轉(zhuǎn)染后，通過(guò)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（qRT-PCR）技術(shù)對(duì)miR-92a的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，以確保miR-92a模擬物轉(zhuǎn)染成功并有效提高了細(xì)胞內(nèi)miR-92a的表達(dá)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR-92a模擬物轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中miR-92a的表達(dá)水平顯著升高，表明轉(zhuǎn)染效果良好。隨后，采用CCK-8實(shí)驗(yàn)和EdU摻入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-92a模擬物轉(zhuǎn)染組細(xì)胞在24h、48h、72h等不同時(shí)間點(diǎn)的吸光度值均顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)。EdU摻入實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣顯示，miR-92a模擬物轉(zhuǎn)染組中EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著增加，進(jìn)一步證實(shí)了miR-92a能夠促進(jìn)HASMCs的增殖。在功能缺失實(shí)驗(yàn)中，將miR-92a抑制劑轉(zhuǎn)染至HASMCs中，以降低細(xì)胞內(nèi)miR-92a的表達(dá)水平。同樣設(shè)置轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照抑制劑（inhibitor-NC）的對(duì)照組。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-92a抑制劑轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中miR-92a的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-92a抑制劑轉(zhuǎn)染組細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)的吸光度值均顯著低于對(duì)照組，細(xì)胞增殖能力受到明顯抑制。EdU摻入實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，miR-92a抑制劑轉(zhuǎn)染組中EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著降低，表明抑制miR-92a的表達(dá)能夠有效抑制HASMCs的增殖。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-92a對(duì)VSMCs增殖的調(diào)控作用，研究人員還檢測(cè)了細(xì)胞增殖相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)變化。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在miR-92a模擬物轉(zhuǎn)染組中，增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）和Ki-67等增殖標(biāo)志物的蛋白表達(dá)水平顯著升高；而在miR-92a抑制劑轉(zhuǎn)染組中，這些標(biāo)志物的蛋白表達(dá)水平則明顯降低。這些結(jié)果與CCK-8實(shí)驗(yàn)和EdU摻入實(shí)驗(yàn)結(jié)果相互印證，充分表明miR-92a能夠正向調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞的增殖，其表達(dá)水平的升高能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，而表達(dá)水平的降低則會(huì)抑制細(xì)胞增殖。4.2.2下游靶基因預(yù)測(cè)與驗(yàn)證為了深入探究miR-92a調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，研究人員利用生物信息學(xué)工具對(duì)miR-92a的下游靶基因進(jìn)行了預(yù)測(cè)。常用的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)，如TargetScan、miRDB和miRWalk等，這些數(shù)據(jù)庫(kù)基于不同的算法和原理，通過(guò)分析miR-92a的序列與靶mRNA3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）的互補(bǔ)配對(duì)情況，預(yù)測(cè)可能受miR-92a調(diào)控的靶基因。綜合多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的預(yù)測(cè)結(jié)果，篩選出了多個(gè)潛在的靶基因，其中Krüppel樣因子4（KLF4）因其在細(xì)胞增殖、分化和血管生理功能調(diào)節(jié)中的重要作用，成為重點(diǎn)研究對(duì)象。KLF4是一種鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子，在血管平滑肌細(xì)胞中，它參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、遷移和表型轉(zhuǎn)換等生物學(xué)過(guò)程。研究表明，KLF4能夠抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其向收縮型表型轉(zhuǎn)變，對(duì)維持血管的正常結(jié)構(gòu)和功能具有重要意義。為了驗(yàn)證KLF4是否為miR-92a的直接作用靶點(diǎn)，研究人員進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。首先，構(gòu)建了含有KLF43'-UTR野生型序列的熒光素酶報(bào)告基因載體（KLF4-WT），同時(shí)構(gòu)建了含有KLF43'-UTR突變型序列的熒光素酶報(bào)告基因載體（KLF4-MUT），突變型序列中miR-92a與KLF43'-UTR的結(jié)合位點(diǎn)被破壞。將KLF4-WT或KLF4-MUT熒光素酶報(bào)告基因載體分別與miR-92a模擬物或miR-92a抑制劑共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)置相應(yīng)的對(duì)照組。轉(zhuǎn)染48-72小時(shí)后，按照熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光素酶活性。結(jié)果顯示，當(dāng)KLF4-WT熒光素酶報(bào)告基因載體與miR-92a模擬物共轉(zhuǎn)染時(shí)，熒光素酶活性顯著降低，表明miR-92a能夠與KLF43'-UTR的野生型序列結(jié)合，抑制熒光素酶的表達(dá)；而當(dāng)KLF4-WT熒光素酶報(bào)告基因載體與miR-92a抑制劑共轉(zhuǎn)染時(shí)，熒光素酶活性顯著升高。當(dāng)KLF4-MUT熒光素酶報(bào)告基因載體與miR-92a模擬物或miR-92a抑制劑共轉(zhuǎn)染時(shí)，熒光素酶活性與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化，說(shuō)明miR-92a對(duì)KLF4的調(diào)控作用依賴于其與KLF43'-UTR特定結(jié)合位點(diǎn)的相互作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-92a對(duì)KLF4的調(diào)控作用，研究人員在血管平滑肌細(xì)胞中進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)。將miR-92a模擬物或miR-92a抑制劑轉(zhuǎn)染至人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞（HASMCs）中，通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）和定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)KLF4蛋白和mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，miR-92a模擬物轉(zhuǎn)染組中KLF4蛋白和mRNA的表達(dá)水平均顯著降低，而miR-92a抑制劑轉(zhuǎn)染組中KLF4蛋白和mRNA的表達(dá)水平則明顯升高。這些結(jié)果表明，miR-92a能夠通過(guò)與KLF43'-UTR結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制KLF4的表達(dá)，從而調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞的增殖。4.3miR-92a對(duì)血管平滑肌細(xì)胞遷移的調(diào)控作用4.3.1細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證為了深入探究miR-92a對(duì)血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）遷移的調(diào)控作用，研究人員采用了劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。在劃痕實(shí)驗(yàn)中，以人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞（HASMCs）為研究對(duì)象。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HASMCs接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%-90%融合時(shí)，用無(wú)菌的200μl移液器槍頭在細(xì)胞單層上垂直劃一條直線劃痕。劃痕完成后，用PBS輕輕沖洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞碎片和未附著的細(xì)胞。隨后，向孔板中加入含不同處理因素的無(wú)血清培養(yǎng)基，將細(xì)胞分為三組，一組加入miR-92a模擬物以提高miR-92a的表達(dá)水平，一組加入miR-92a抑制劑以降低miR-92a的表達(dá)水平，另一組作為對(duì)照組加入陰性對(duì)照模擬物。將6孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。在培養(yǎng)后的0h、12h、24h等不同時(shí)間點(diǎn)，于倒置顯微鏡下對(duì)劃痕區(qū)域進(jìn)行拍照記錄。利用圖像分析軟件（如ImageJ）測(cè)量劃痕寬度，并計(jì)算劃痕愈合率。計(jì)算公式為：劃痕愈合率=（0h劃痕寬度-th劃痕寬度）/0h劃痕寬度×100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR-92a模擬物處理組的細(xì)胞在相同時(shí)間內(nèi)劃痕愈合率顯著提高，表明細(xì)胞遷移速度加快；而miR-92a抑制劑處理組的細(xì)胞劃痕愈合率明顯降低，細(xì)胞遷移速度減緩。這初步說(shuō)明miR-92a表達(dá)水平的升高能夠促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的遷移，而降低miR-92a的表達(dá)則會(huì)抑制細(xì)胞遷移。在Transwell實(shí)驗(yàn)中，進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-92a對(duì)VSMCs遷移的影響。該實(shí)驗(yàn)利用Transwell小室，其底部為一層具有通透性的聚碳酸酯膜，將小室放入24孔培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱為上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱為下室。實(shí)驗(yàn)時(shí)，先將Matrigel基質(zhì)膠鋪于Transwell小室的上室底部，待其凝固后，形成一層類似細(xì)胞外基質(zhì)的薄膜，模擬體內(nèi)細(xì)胞遷移的微環(huán)境。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HASMCs用胰蛋白酶消化并制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?個(gè)/ml。取100μl細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室中，而下室則加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子。同時(shí)設(shè)置不同處理組，一組在細(xì)胞懸液中加入miR-92a模擬物，另一組加入miR-92a抑制劑，對(duì)照組則加入陰性對(duì)照模擬物。將24孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育24-48小時(shí)。孵育結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞。然后將小室放入4%多聚甲醛中固定15-20分鐘，再用0.1%結(jié)晶紫溶液染色10-15分鐘。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移到下室膜表面的細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-92a模擬物處理組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量顯著多于對(duì)照組，說(shuō)明miR-92a過(guò)表達(dá)能夠增強(qiáng)血管平滑肌細(xì)胞的遷移能力；而miR-92a抑制劑處理組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量則明顯少于對(duì)照組，表明抑制miR-92a的表達(dá)會(huì)抑制細(xì)胞的遷移能力。綜合劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以明確miR-92a在血管平滑肌細(xì)胞遷移過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，其表達(dá)水平的變化能夠顯著影響細(xì)胞的遷移能力。4.3.2相關(guān)信號(hào)通路分析在明確miR-92a對(duì)血管平滑肌細(xì)胞遷移具有調(diào)控作用的基礎(chǔ)上，研究人員進(jìn)一步深入研究了其調(diào)控過(guò)程中涉及的相關(guān)信號(hào)通路。通過(guò)對(duì)已有文獻(xiàn)的綜合分析以及前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路中的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）信號(hào)通路在miR-92a調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞遷移中可能發(fā)揮重要作用。ERK1/2是MAPK信號(hào)通路中的關(guān)鍵成員，其在細(xì)胞增殖、遷移、分化和存活等多種生物學(xué)過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。為了驗(yàn)證ERK1/2信號(hào)通路是否參與miR-92a對(duì)血管平滑肌細(xì)胞遷移的調(diào)控，研究人員進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)。首先，在人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞（HASMCs）中，將miR-92a模擬物或miR-92a抑制劑轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，然后利用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)ERK1/2的磷酸化水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR-92a模擬物轉(zhuǎn)染組中ERK1/2的磷酸化水平顯著升高，表明miR-92a過(guò)表達(dá)能夠激活ERK1/2信號(hào)通路；而在miR-92a抑制劑轉(zhuǎn)染組中，ERK1/2的磷酸化水平明顯降低，說(shuō)明抑制miR-92a的表達(dá)會(huì)抑制ERK1/2信號(hào)通路的激活。為了進(jìn)一步驗(yàn)證ERK1/2信號(hào)通路在miR-92a調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞遷移中的作用，研究人員使用了ERK1/2信號(hào)通路的特異性抑制劑U0126。在轉(zhuǎn)染miR-92a模擬物的HASMCs中，加入U(xiǎn)0126處理，然后進(jìn)行Transwell遷移實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與僅轉(zhuǎn)染miR-92a模擬物的細(xì)胞相比，加入U(xiǎn)0126處理后，細(xì)胞遷移到下室的數(shù)量顯著減少。這表明抑制ERK1/2信號(hào)通路能夠阻斷miR-92a對(duì)血管平滑肌細(xì)胞遷移的促進(jìn)作用。研究人員還檢測(cè)了ERK1/2信號(hào)通路下游與細(xì)胞遷移相關(guān)的分子表達(dá)變化。基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）是兩種重要的細(xì)胞外基質(zhì)降解酶，它們?cè)诩?xì)胞遷移過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，為細(xì)胞遷移提供空間。通過(guò)qRT-PCR和Westernblot技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在miR-92a模擬物轉(zhuǎn)染組中，MMP-2和MMP-9的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高；而在miR-92a抑制劑轉(zhuǎn)染組中，MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平則明顯降低。當(dāng)使用U0126抑制ERK1/2信號(hào)通路后，miR-92a模擬物轉(zhuǎn)染組中MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平也顯著下降。這進(jìn)一步說(shuō)明miR-92a可能通過(guò)激活ERK1/2信號(hào)通路，上調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)，從而促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的遷移。綜上所述，miR-92a對(duì)血管平滑肌細(xì)胞遷移的調(diào)控作用可能是通過(guò)激活ERK1/2信號(hào)通路，并進(jìn)一步調(diào)節(jié)其下游與細(xì)胞遷移相關(guān)的分子（如MMP-2和MMP-9）的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。五、MLCK通過(guò)miR-92a調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的機(jī)制5.1MLCK與miR-92a的相互作用關(guān)系5.1.1實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證兩者的關(guān)聯(lián)為了驗(yàn)證MLCK與miR-92a是否存在直接或間接的相互作用，研究人員采用了熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。首先，通過(guò)生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)MLCK基因的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）可能存在與miR-92a互補(bǔ)配對(duì)的序列，這提示MLCK有可能是miR-92a的潛在作用靶點(diǎn)?；诖祟A(yù)測(cè)，構(gòu)建了含有MLCK3'-UTR野生型序列的熒光素酶報(bào)告基因載體（MLCK-WT），同時(shí)構(gòu)建了含有突變型MLCK3'-UTR序列的熒光素酶報(bào)告基因載體（MLCK-MUT），在突變型序列中，將預(yù)測(cè)的miR-92a結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了突變，使其無(wú)法與miR-92a互補(bǔ)配對(duì)。將MLCK-WT或MLCK-MUT熒光素酶報(bào)告基因載體分別與miR-92a模擬物或miR-92a抑制劑共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)置相應(yīng)的對(duì)照組，對(duì)照組轉(zhuǎn)染空載熒光素酶報(bào)告基因載體和陰性對(duì)照模擬物或抑制劑。轉(zhuǎn)染48-72小時(shí)后，按照熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光素酶活性。結(jié)果顯示，當(dāng)MLCK-WT熒光素酶報(bào)告基因載體與miR-92a模擬物共轉(zhuǎn)染時(shí)，熒光素酶活性顯著降低，表明miR-92a能夠與MLCK3'-UTR的野生型序列結(jié)合，抑制熒光素酶的表達(dá)，進(jìn)而推測(cè)miR-92a可能通過(guò)與MLCK3'-UTR結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制MLCK的表達(dá)。而當(dāng)MLCK-WT熒光素酶報(bào)告基因載體與miR-92a抑制劑共轉(zhuǎn)染時(shí)，熒光素酶活性顯著升高。當(dāng)MLCK-MUT熒光素酶報(bào)告基因載體與miR-92a模擬物或miR-92a抑制劑共轉(zhuǎn)染時(shí)，熒光素酶活性與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化，說(shuō)明miR-92a對(duì)MLCK的調(diào)控作用依賴于其與MLCK3'-UTR特定結(jié)合位點(diǎn)的相互作用。這一結(jié)果初步驗(yàn)證了MLCK與miR-92a之間存在直接的相互作用，miR-92a能夠直接靶向MLCK基因的3'-UTR，對(duì)其表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。為了進(jìn)一步驗(yàn)證MLCK與miR-92a的相互作用關(guān)系，研究人員還進(jìn)行了RNA免疫沉淀（RIP）實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)利用特異性抗體富集與目標(biāo)蛋白結(jié)合的RNA分子，從而研究RNA與蛋白質(zhì)的相互作用。在實(shí)驗(yàn)中，首先培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞（如人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞HASMCs），然后使用針對(duì)AGO2蛋白的抗體進(jìn)行免疫沉淀，AGO2蛋白是RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）的核心組成部分，miR-92a與靶mRNA結(jié)合形成RISC后，AGO2蛋白參與對(duì)靶mRNA的識(shí)別和調(diào)控。免疫沉淀后，提取與AGO2蛋白結(jié)合的RNA，通過(guò)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)其中MLCKmRNA和miR-92a的含量。結(jié)果顯示，與對(duì)照組（使用IgG抗體進(jìn)行免疫沉淀）相比，使用AGO2抗體進(jìn)行免疫沉淀后，共沉淀的RNA中MLCKmRNA和miR-92a的含量均顯著增加。這表明在血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)，MLCKmRNA與miR-92a能夠結(jié)合到AGO2蛋白上，形成RNA-蛋白復(fù)合物，進(jìn)一步證實(shí)了MLCK與miR-92a之間存在相互作用，且這種相互作用可能是通過(guò)RISC介導(dǎo)的。5.1.2調(diào)控途徑的初步探索在證實(shí)MLCK與miR-92a存在相互作用的基礎(chǔ)上，研究人員進(jìn)一步對(duì)MLCK影響miR-92a表達(dá)或活性的可能途徑展開(kāi)探索，主要聚焦于轉(zhuǎn)錄調(diào)控和蛋白修飾這兩個(gè)關(guān)鍵方面。在轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面，研究人員首先通過(guò)生物信息學(xué)分析，對(duì)miR-92a基因的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行研究，尋找可能與MLCK相互作用的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，核因子-κB（NF-κB）的結(jié)合位點(diǎn)存在于miR-92a基因啟動(dòng)子區(qū)域。NF-κB是一種在炎癥和細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用的轉(zhuǎn)錄因子，它能夠被多種信號(hào)通路激活，進(jìn)而調(diào)控下游基因的表達(dá)。為了驗(yàn)證MLCK是否通過(guò)NF-κB調(diào)控miR-92a的轉(zhuǎn)錄，研究人員在血管平滑肌細(xì)胞中進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)。首先，使用MLCK激動(dòng)劑處理細(xì)胞，以增強(qiáng)MLCK的活性，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)NF-κB的活化水平，結(jié)果顯示，MLCK激動(dòng)劑處理組中NF-κB的磷酸化水平顯著升高，表明MLCK的激活能夠促進(jìn)NF-κB的活化。接著，利用定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)miR-92a的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)MLCK激動(dòng)劑處理組中miR-92a的表達(dá)也顯著上調(diào)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證NF-κB在其中的作用，研究人員使用了NF-κB的抑制劑PDTC。在加入PDTC預(yù)處理細(xì)胞后，再用MLCK激動(dòng)劑處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NF-κB的活化被抑制，同時(shí)miR-92a的表達(dá)上調(diào)也被顯著抑制。這表明MLCK可能通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路，促進(jìn)NF-κB與miR-92a基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合，從而上調(diào)miR-92a的轉(zhuǎn)錄水平，最終影響miR-92a的表達(dá)。在蛋白修飾方面，研究人員推測(cè)MLCK自身的磷酸化修飾可能影響其與miR-92a的相互作用或?qū)iR-92a活性的調(diào)控。為了驗(yàn)證這一推測(cè)，研究人員首先通過(guò)激酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)了在不同條件下MLCK的激酶活性變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞受到某些刺激（如血小板源性生長(zhǎng)因子BB，PDGF-BB刺激）時(shí)，MLCK的激酶活性顯著增強(qiáng)，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)miR-92a的表達(dá)也明顯上調(diào)。接著，研究人員使用特異性的蛋白磷酸酶抑制劑，抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白的去磷酸化過(guò)程。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在蛋白磷酸酶抑制劑處理后，MLCK的磷酸化水平升高，同時(shí)miR-92a的表達(dá)也進(jìn)一步增加。為了確定MLCK磷酸化修飾的具體位點(diǎn)及其對(duì)miR-92a的影響，研究人員構(gòu)建了MLCK的磷酸化位點(diǎn)突變體。將野生型MLCK和磷酸化位點(diǎn)突變體分別轉(zhuǎn)染至血管平滑肌細(xì)胞中，檢測(cè)miR-92a的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，野生型MLCK轉(zhuǎn)染組中miR-92a的表達(dá)明顯高于磷酸化位點(diǎn)突變體轉(zhuǎn)染組。這表明MLCK的磷酸化修飾可能影響其對(duì)miR-92a表達(dá)的調(diào)控作用，具體機(jī)制可能是MLCK的磷酸化改變了其蛋白構(gòu)象，使其能夠更好地與其他調(diào)控